UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640nm no modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos

desnutridos.

MÁRCIO PARENTE

SÃO PAULO, SP 2012

1

MÁRCIO PARENTE

Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos

desnutridos.

Dissertação apresentada à

Universidade Nove de Julho, para

obtenção do Titulo de Mestre em

Ciências da Reabilitação.

Orientador: Prof. Dra. Regiane

Albertini de Carvalho

SÃO PAULO 2012

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FICHA CATALOGRÁFICA

Parente, Márcio.

“Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no modelo

experimental de tendinopatia traumática em ratos desnutridos”. / Márcio Parente.

2012.

100 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo,

2012. Prof. Dra. Regiane Albertini de Carvalho.

1. Inflamação. 2. Colágeno. 3. LED. 4. Tendinite 5. Citocinas.

I. Carvalho, Regiane Albertini de. II. Titulo

3

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DEDICATÓRIA

“Mantenha o foco e o alvo de sua vida em Jesus Cristo, pois, este é o melhor e

mais fascinante projeto de vida que se pode ter” (Orlando Bispo de Souza). As pessoas a quem eu vou dedicar essa obra são: Minha Esposa Zuleide,

companheira, auxiliadora, guerreira, amorosa, são tantas as qualidades, que essa

página não daria expressar todos os meus sentimentos, meus filhos, Gabriel presente

de Deus, garoto que me faz esquecer os problemas, motivo de eu sempre lutar e

conquistar meus objetivos, Samuel mais um varão que Deus me abençoou ainda está

no 7 mês de gestação e creio que virá a este mundo para trazer alegria e louvar a

Cristo; ao Meu Pastor Márcio Fernandes e a Igreja Evangélica Congregacional de

Pedro José Nunes pela paciência e amor dos irmãos em Cristo por mim e pela minha

família.

Ao meu pai Marco um grande profissional de quem sempre me orgulhei,

quantas foram as correções pois sem isso não chegaria a esse patamar. Pai te amo;

mãe talvez faltem palavras para te agradecer o quanto você e especial para mim,

minha mãe Célia que Deus te abençoe, aos meus irmãos Felipe e Adriano pai do meu

sobrinho Kawan por toda a compreensão e amizade, tempos bons quando éramos

crianças, sinto falta dos momentos das alegrias e tristezas que compartilhávamos

juntos pois agora a correria da vida nos distanciou, creio que teremos estes momentos

novamente. Luciana minha irmã, mãe do meu sobrinho Leonardo, tu ès guerreira e

vitoriosa.

Além desses não posso esquecer-me da minha sogra Dulce, pelo pouco que

convivi com ela pude aprender o significado da vida, a entender momentos de alegria

e de tristezas e nestes momentos aprendi que o amor é quem supera as dificuldades.

Dulce minha memórias vão além dessas palavras que Deus a tenha, sentimos

saudades.

Aos meus amigos Edson, Lindiano, Luciano, João Sardinha, Marcelo de Paula,

Adriano Maria, Carlos Cale, Agnelo, Camila, Nadia, Felipe, Andréa, Patrícia, Eduardo,

Alexandre, Douglas, Mariana, Aliny, Juliana, Bianca, Carolina, Michel, Guilherme,

Janete, Priscila, Torres, Ana, Evela, Dora, Fernando.

A todos vocês dedico este projeto!

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por me guardar e direcionar nos momentos vivenciados em minha

vida.

Minha Esposa Zuleide pela paciência, compreensão e dedicação, pois os momentos de ausência foram muitos com minha família.

Aos meus irmãos Congregacionais pelo apoio e ensinamento da Palavra de

Deus. A minha Orientadora Professora Doutora Regiane Albertini de Carvalho, pelo respeito, ensino, paciência, compromisso e confiança. Agradeço-te por todos os momentos em que me orientou, pela pessoa incrível e dedicada que Deus

continue abençoando você e sua família.

Aos meus Professores Paulo de Tarso Camillo de Carvalho, Rodrigo Álvaro Brandão Lopes Martins e Rodolfo de Paula Vieira. Ao longo dessa

caminhada foram tantos os problemas, mas graças a Deus sempre que precisei vocês foram atenciosos e presentes para me ajudar. Obrigado!

Aos Professores colaboradores; Andreia Bonsi, José Antonio, Rodrigo Labat, Ernesto Cesar, Daniele de Fátima, Ana Paula, Raquel Mesquita, Stela Regina,

Sandra Kalil, Kristianne Porta, Cristiane França, Andrey Serra e Kátia De Angeli.

Aos funcionários do departamento de Pesquisa da Pós-Graduação da UNINOVE; João Felipe Sardinha Leonardo e Alexandre Santos na

Universidade Nove de Julho e aos funcionários do Laboratório de Investigação Médica 59 (LIM59); Nilsa Regina Damaceno-Rodrigues e Iris Amorim por

todo o auxilio.

A todos os alunos de Iniciação Científica (IC) que participaram desse projeto em especial Douglas Rodrigues da Silva, Mariana de Souza Vasconcellos,

Nilce Tamae, Aliny Borges Orle, Juliana Salles, Márcia Tomoya, Anna Cristina, Evela Aparecida e Bárbara Malachias.

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RESUMO

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da LED no processo de

reparação da tendinite do calcâneo em ratos desnutridos. A desnutrição foi

induzida nos animais por uma ração com baixo teor de proteína (6% proteína).

A tendinite foi induzida no tendão calcâneo da pata esquerda por meio de

trauma. Foram utilizados 120 ratos, sendo 60 animais desnutridos (160 ± 20g)

e 60 animais nutridos (300 ± 20g) distribuídos em 8 grupos (n=15/grupo), 4

grupos para animais nutridos CONTNUTRI (controle), TENNUTR (lesão),

LEDNUTR (lesão + LED) e DROGNUTR (lesão + Fármaco), e 4 grupos para

animais desnutridos CONTDESN (controle), TENDESN (lesão), LEDDESN

(lesão + LED) e DROGDESN (lesão + Fármaco), cada grupo conteve três

subgrupos com 3 períodos experimentais (7, 14 e 21 dias). Os grupos definidos

como DROG receberam tratamento com diclofenaco de sódio 1mg/Kg/dia/IP.

Foram realizadas análises histopatológicas para células inflamatórias, teor de

colágeno e imunohistoquímica para TNF-β e IL1-β. Os grupos tratados com

LED apresentaram diminuição nas células inflamatórias, colágeno do tipo III e

IL 1-β e aumento no colágeno do tipo I e TGF-β. Assim conclui-se que a LED

de baixa intensidade, nos parâmetros estudados tem efeito reparador em

processo de tendinopatia (tendinite) traumática.

Palavras-chave: Inflamação, Desnutrição, Tendinite, Colágeno, Citocínas.

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ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the LED effects in the repair process of

the calcaneal tendinitis in malnourished rats. The malnourished was induced by

diets for low protein (6% protein) in animals fed normal chow consumed (22%

protein). Calcaneal tendinitis was induced in the left paw through trauma. A total

of 120 rats, 60 malnourished animals (160 ± 20g) and 60 fed animals (300 ±

20g) distributed in 8 groups (n = 15 per group), 4 groups for CONTNUTRI

nourished animals (control), TENNUTR (injury) LEDNUTR (lesion + LED) and

DROGNUTR (lesion + Drug), and 4 groups for CONTDESN malnourished

animals (control), TENDESN (injury), LEDDESN (lesion + LED) and

DROGDESN (lesion + Drug), each group contained three subgroups 3

experimental periods (7, 14 and 21 days). The groups defined as Drog received

treatment with diclofenac sodium 1mg/Kg/day/IP. Histopathological analyzes

were performed for inflammatory cells, collagen content and

immunohistochemistry for TGF-β and IL-1-β. For the treated LED groups there

was a decrease in the inflammatory cells, type III collagen and IL 1-β, increased

type I collagen and TGF-β. Thus, it is concluded that the low-intensity LED in

the studied parameters has an effect on repair process tendinopathy

(tendonitis).traumatic.

Keywords: Inflammation, malnutrition, Tendinitis, Collagen, cytokines.

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Sumário

Dedicatória 4 Agradecimentos 5 Resumo 6 Abstract 7 Sumário 8 Lista de quadros e tabelas 10 Lista de figuras 11 Lista de abreviaturas 11 1. Contextualização 14 1.1 Desnutrição 14

1.2 Tendinopatia 15

1.3 Anatomia do tendão e colágeno 16

1.4 Reparo do tendão 16

1.5 Citocinas no processo inflamatório 18

1.5.1 Interleucina1 Beta (IL1-β) 20

1.5.2 Fator de transformação do crescimento Beta (TGF–β) 21

1.6 Justificativa 23

1.7 LED (Light Emitting Diode) fototerapia de baixa potência 24

2. Objetivo geral 29 2.1 Objetivos específicos 29

3. Material e métodos 29 3.1 Protocolo de desnutrição 29

3.1.1 Dieta para desnutrição 30

3.2 Protocolo para induzir a tendinite 32

3.3 Grupos e Experimentais “in vivo” 32

3.4 Terapias/Tratamento - LED e Fármaco 32

3.5 Eutanásia e coletas das amostras 34

3.6 Processamento das amostras 35

3.6.1 Protocolo para coloração com Hematoxilina e Eosina 36

3.6.2 Coloração com picrossírius red 36

3.6.3 Imunohistoquímica 36

9

3.7 Coleta das imagens e análise 38

3.8 Análise estatística 41

4. Resultados (artigos) 42 5. Considerações finais 88 6. Referências 89

10

Lista de quadros e tabelas Tabela 1 – Componentes utilizados para formulação da ração hipoprotéica,

comparada as normas para adequação da AIN-93G. Pag. 30

Tabela 2: Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de energia

(DE) é dada por AEDE = ou

AtPDE .

= , cuja unidade é [J/cm2], onde E é a

energia [Joule], A é a área [cm2], P é a potência [Watt] e t é o tempo [segundos]. Pag. 33 Tabela 3: Anticorpos utilizados para análise imunohistoquímica Pag. 37

11

Lista de figuras

FIGURA 1 – Estrutura do tendão, tanto a imagem (a) e (b) demonstram minuciosamente anatomia do tendão da parte externa até parte interna; Epitendão e/ou Paratendão (feixe de fibras terciárias), endotendão (feixe de fibras secundárias (fascículo)), endotendão (feixe de fibras primárias (subfascículo)), fibras colágenas e fibrilas colágenas. Pag. 16 FIGURA 2 – Ação das citocinas pode ser local ou sistêmica. Autócrina (ação sobre a própria célula), parácrina (ação sobre células próximas) e Endócrina (ação sobre células distantes) Goldsby et al. (2002). Pag. 19

FIGURA 3 – O TGF-beta ao se ligar ao seu receptor provoca uma cascata de reações provocando a síntese de proteínas. Pag. 22 FIGURA 4 – Diversos estudos com a fototerapia de baixa potência. Pag. 27 FIGURA 5 - Da gestação até eutanásia dos animais foram seis etapas, na 1ª etapa o período de 21 dias de gestação, a 2ª etapa após o nascimento dos animais os mesmo tiveram um período de 28 dias para amamentação (lactação), a 3ª etapa foi induzido à desnutrição, os animais consumiram ração hipoproteica por um período de no mínimo 32 dias na 4ª etapa foi induzida à lesão traumática nos animais, nesse período os animais continuaram a receber ração hipoproteica até o período da eutanásia, na 5ª etapa foi determinado os períodos experimentais (7, 14 e 21 dias) de tratamento e por último a 6a etapa que representa eutanásia referente a cada período experimental, os animais foram eutanasiados sempre após 24hs da última terapia/tratamento). Pag. 30 FIGURA 6 – Aparelho utilizado para induzir a lesão no tendão calcâneo da pata esquerda dos animais, na imagem (a) demonstra aparelho em descanso, enquanto imagem (b) demonstra o aparelho com sua massa de 220g a 25cm do ponto de partida. Pag. 31 FIGURA 7 – Desenho experimental dos grupos, cada grupo com três subgrupos totalizando 15 animais Pag. 32 FIGURA 8 – Aparelho do LED de 640nm utilizado no experimento. Pag. 34 FIGURA 9 – Retirada do tendão, tenotomia realizada na junção miotendinosa e ostiotendinosa. Pag. 35 FIGURA 10 – Software (Image-Pro Plus) utilizado para fotografar as imagens das laminas em HE e quantificar antígeno para citocinas IL 1 Beta e TGF Beta. O resultado utilizado para imunohistoquimica foi emitido em estatística expresso em somatória (Sum) conforme representado na figura. Pag. 39 FIGURA 11 – Software utilizado para caputurar imagens das lâminas de imunohistoquimica. Pag. 39

12

FIGURA 12 – Software (Image J) na função Cell Counter, foi utilizado para contagem de células inflamatórias e fibroblastos. Pag. 40 FIGURA 13 – Software (Image J) na função Color Histogram foi utilizado para quantificar colágeno. Pag. 40

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Lista de Abreviaturas

C: Celsius cm: Centímetro

CONTDESN: Controle desnutrido

CONTNUTRI: Controle nutrido

COX: ciclooxigenase DROGDESN: Droga (fármaco) desnutrido

DROGNUTR: Droga (fármaco) nutrido

g: grama

H2O: água HE: Hematoxilina Eosina

Hs: horas IL1-β: Interleucina1-Beta IP: Intraperitoneal

J: Joule

Kg: quilo grama LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

LED: Light Emitting Diode

LEDDESN: Light Emitting Diode desnutrido

LEDNUTR: Light Emitting Diode nutrido

mg: miligrama

mm: milímetro

mW: miliwatt

n: número

nm: nanômetro pH: peróxido de hidrogênio

RNAm: ácido ribonucléico mensageiro TENDESN: Tendinite desnutrido

TENNUTR: Tendinite nutrido

TGF-β: Fator de transformação de crescimento Beta

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1. Contextualização. 1.1 – Desnutrição.

A desnutrição é considerada um problema social e de saúde pública,

devido a sua natureza multicausal. Ocorre quando o organismo não recebe os

nutrientes necessários para o seu metabolismo fisiológico, devido à falta de

alimentos ou problema na absorção, podendo também estar relacionada com

algumas doenças ou às vezes deriva de fatores desconhecidos. Por esse

motivo a desnutrição pode ser observada no contexto familiar, cultural e

socioeconômico, afetando o estilo de vida da criança Frota et al. (2007).

O principal determinante do estado nutricional é a renda per capita, pois

se houver um declínio no crescimento econômico e uma maior taxa de

desemprego, a população irá piorar nutricionalmente Frota et al. (2007). Está

bem estabelecido que a desnutrição em crianças têm efeitos adversos para o

desenvolvimento, ocasionando doenças crônicos degenerativas, redução de

números de células em alguns órgãos, hipertensão Barker et al. (1990),

deficiências na manutenção, reparação tecidual, processo inflamatório e

funções imunológicas Carvalho et al. (2006), doenças coronarianas Barker et

al. (1993), diabetes tipo I e doenças renais Nakamura et al. (2007),

esquizofrenia e aumento de doenças cardiovasculares Susse et al. (2008) e

afeta também as funções fisiológicas e as alterações nas capacidades

metabólicas musculares. Estes alterações ocorrem por ausência de

aminoácidos, carboidratos, lipídios, sais minerais e vitaminas na dieta, pois

estes são essenciais para diversas sínteses em nosso organismo. Toscano et

al. (2010) e Chaves et al (2003).

Outro ponto importante a se considerar é que atletas e praticantes de

atividade física em quadro de desnutrição estão mais suscetíveis as lesões

constantes, a falta de nutrientes essenciais no organismo deixa o mesmo

vulnerável a qualquer atividade de leve impacto e consumo de energia Chaves

& Mello (2003) e Alves & Mello (2005).

Estudos sobre a desnutrição em ratos apresentam menor peso e

tamanho comparado aos animais normo peso Hegsted & Chang (1967). No

15

estudo de Dobbing (1976) os animais desnutridos apresentaram crises

convulsivas. Em outro estudo quando os animais foram expostos ao quadro de

desnutrição os mesmos apresentaram dificuldade de cicatrização em diversos

tecidos Ferreira (2006).

Segundo Buker & Tsaris (1974) e Carvalho et al. (2006) em seus

respectivos estudos apresentaram redução no numero de fibras colágenas,

além de retardamento na diferenciação das características morfológicas e

processo degenerativo em tecidos.

1.2 – Tendinopatia

A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença que

afete os tendões. Na literatura encontramos os termos tendinose e tendinite,

estes formam a tendinopatia, sendo que a tendinose se refere aos processos

degenerativos (destrutivos) crônicos progressivos e a tendinite refere-se a

processos inflamatórios (que, por definição, incluem os cinco sinais e sintomas

de inflamação – tumor (inchaço), calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação

dos vasos na zona inflamada), dor e impotência funcional) Khan et al. (2000).

A tendinopatia pode ocorrer por traumatismo, excesso por repetições de

movimentos, infecções e desnutrição, estas ocorrências desencadeiam todo

um processo de degeneração, inflamação e até os rompimentos dos tendões.

Dentro destas ocorrências a desnutrição pode ser apontada como importante

causador da tendinopatia, pois impede a manutenção e uma perfeita

regeneração dos tendões, pois é relevante considerar que uma dieta com

ausência de diversos nutrientes essenciais vem a prejudicar a síntese de novas

células e tração (resistência) para uma determinada função Carvalho (2006).

1.3 – Anatomia do tendão e colágeno

Os tendões normais são brancos, brilhantes e possuem uma textura

fibroelástica, são ricos em colágeno do tipo I e menores presença de colágeno

do tipo III, IV,V e VI. Segundo Junqueira e Carneiro (2004) o colágeno é a

16

principal proteína estrutural do corpo e o maior componente da matriz

extracelular do tendão. Os tendões são formados por tecido conjuntivo, fibras

de colágeno que se entrelaçam para permitir as forças geradas pelos

músculos. O colágeno é muito estudado, na literatura é apresentado tipos de

protocolos para verificar o tipo de colágeno, por exemplo, alguns autores

determinaram que o colágeno do tipo I em coloração por Picrossirius Red para

diferenciar o colágeno I do colágeno III Montes & Junqueira (1992).

FIGURA 1 – Estrutura do tendão, tanto a imagem (a) e (b) demonstram minuciosamente anatomia do tendão da parte externa até parte interna; Epitendão e/ou Paratendão (feixe de fibras terciárias), endotendão (feixe de fibras secundárias (fascículo)), endotendão (feixe de fibras primárias (subfascículo)), fibras colágenas e fibrilas colágenas.

Fontes: (a)http://skillbuilders.patientsites.com/mobile/Injuries-Conditions/Ankle/Ankle-

Anatomy/a~47/article.html (b)http://www.pponline.co.uk/encyc/achilles-tendon-muscle-structure-

and-injury-rehabilitation-40869. (acesso ao site dia18/12/2012)

1.4 - Reparo do Tendão.

Segundo Chan et al. (1997) o processo de reparo dos tendões é similar

aos processos de reparação que ocorrem com outros tecidos biológicos. Na

ocorrência de um trauma ou lesão no tendão, ocorre às respostas para

reparação tecidual, sendo que no estágio agudo observa-se uma

vasoconstrição e instantes depois, ocorre vasodilatação. Essas respostas

atraem células inflamatórias para o local lesionado, estas células são:

17

leucócitos, plaquetas e eritrócitos, a função das células é provocar uma

diminuição do extravasamento de sangue no local. A histamina presente altera

a permeabilidade vascular, essa alteração provoca formação do edema local

Baxter (1994). Fatores de crescimento e citocinas estimulam a migração e

proliferação dos fibroblastos, parcialmente derivadas dos macrófagos

inflamatórios. Segundo Contran, Kumar e Collins (2000) descrevem a formação

do tecido de granulação, os fibroblastos adquirem características estruturais,

funcionais, imunológicas e químicas diferentes dos tecidos fibroblásticos

normais sendo chamados de miofibroblastos.

A regeneração ou renovação dos tendões são praticamente estável, por

ser um tecido pouco vascularizado esta regeneração acaba sendo prejudicado,

em alguns órgãos o processo é um pouco mais rápido. As renovações neste

tecido são iniciadas pela degradação de proteínas por enzimas específicas, as

colagenases. As funções destas enzimas é catabolizar as moléculas em dois

pedaços, assim serão capazes de receber ao ataque de proteases não

específicas Junqueira e Carneiro (2004). Uma arquitetura de um tendão após

sua regeneração poderá ser normal, porém, dificilmente retornará às suas

propriedades mecânicas originais de deslizamento sobre os tecidos vizinhos

Machado (2000). Uma das modificações bioquímicas da cadeia polipeptídica que ocorre

no organismo é a síntese de colágeno, estas modificações pode ocorrer

alguma falha durante o processo de reparo, as enzimas não trabalham

conforme suas funções assim podendo alterar o processo patológico, por

exemplo, a lenta renovação de colágeno são uma das conseqüências. Jaques

et al. (2006).

Simões et al. (1996), argumentam que o elemento fundamental para o

sucesso da reparação de uma ferida é a organização das fibras de colágeno e

não a quantidade das fibras na lesão. Ressalta-se também a importância dos

primeiros dias para a qualidade do processo de regeneração do tecido

tendinoso, momento em que se ocorrem a proliferação e remodelamento, onde

ocorre o processo de síntese de fibras de colágeno e alinhamento das mesmas

no eixo longitudinal do tendão Dong (2006).

18

Perez et al. (2005), afirmam que a produção de colágeno e regeneração

do tendão é possível avaliar por concentração de hidroxiprolina, pois em

estudos realizados por Reddy e Enwemeka (1996), observou-se que houve

aumento de 14% da síntese de colágeno com a presença de hidroxiprolina.

Diversos fatores como a limitada vascularização, provoca uma

diminuição da oferta nutricional e de oxigênio, isso atrasa a capacidade

regenerativa. Já é demonstrado que quando este tecido é estimulado por meios

biofísicos, o processo de regeneração se dá de forma satisfatória Enwemeka

(1989).

Para uma boa reabilitação funcional do individuo na região calcânea,

uma vasta literatura visa o desenvolvimento de técnicas para tratamento a fim

de melhorar o processo de reparação tendínea. Dessa forma, estudos na área

da engenharia biomédica estão sendo realizados para o desenvolvimento de

equipamentos e técnicas terapêuticas. O ultra-som, eletroterapia, LASER e

recentemente o LED de baixa potência são os mais estudados para

regeneração tecidual.

1.5 Citocinas no processo inflamatório As ações das citocinas podem ser locais ou sistêmicas. As citocinas

podem agir de três formas, ação autócrina (ação sobre o tipo celular que a

produz), ação parácrina (ação sobre células presentes nas proximidades das

células produtoras da citocina), ação endócrina (agindo sobre células

presentes em outros locais que não os da célula produtora daquela citocina).

(fig.1) As citocinas são proteínas reguladoras de baixo peso molecular ou

glicoproteínas secretadas pelas células sanguíneas brancas e varias outras

células no organismo em resposta a inúmeros estímulos. Os diferentes

estímulos, como agentes infecciosos, tumores, traumas (lesões) ou estresse.

As citocinas atuam na comunicação entre as células, promovendo a indução ou

regulação da resposta imune. Embora diversos tipos celulares possam secretar

citocinas, células T, macrófagos e células dendríticas são as principais fontes

produtoras de citocinas Ansel et al. (2003) e Dong et al (2006).

19

Uma mesma citocina pode ser produzida por mais de um tipo celular,

pode ter diferentes efeitos, dependendo das condições do microambiente

(pleiotropismo), podem exercer a mesma função (redundância), podem

potencializar ou inibir o efeito de outras citocinas (sinergismo ou antagonismo).

A citocinas se liga aos receptores específicos das membranas das

células alvo, degradando as vias de transdução de sinais que, como resultado,

altera a expressão dos genes das células alvo. A suscetibilidade da célula alvo

a uma determinada citocina é determinada pela presença de receptores de

membrana específicos. Em geral, as citocinas e seus receptores exibem alta

afinidade uma para com a outra, com constantes de dissociação variando de

10-10 a 10-12M. por causa desta alta afinidade, as concentrações das citocinas

podem mediar um efeito biológico. Uma determinada citocina pode se ligar aos

receptores na membrana da mesma célula que a secretou, exercendo ação

autócrina; as citocinas podem-se ligar aos receptores em uma célula alvo nas

proximidades da célula produtora, exercendo uma ação parácrina; em poucos

casos, a citocina pode se ligaras células alvo em locais distantes do corpo,

exercendo uma ação endócrina. As citocinas regulam a intensidade e a

duração da resposta imune através da estimulação ou da inibição da ativação,

proliferação e/ou diferenciação de várias células e através da regulação da

secreção dos anticorpos ou de outras citocinas. (Goldsby, 2002).

20

FIGURA 2 – Ação das citocinas pode ser local ou sistêmica. Autócrina (ação sobre a própria célula), parácrina (ação sobre células próximas) e Endócrina (ação sobre células distantes) Goldsby et al. (2002). 1.5.1 Interleucina1-Beta (IL1-β) A IL1-β é secretada por monócitos, macrófagos, células B, células

dendríticas, células endoteliais e outros tipos celulares as células ou tecido alvo

são células TH e células B com sua atividade de ativação coetimuladora e

promover a maturação e a expansão clonal (Goldsby, 2002). A função principal

das IL1-β, é ser mediadora da resposta inflamatória do hospedeiro em traumas,

infecções e outros estímulos inflamatórios. Quando secretada em baixa

concentração, IL1-β atua como um mediador da inflamação local, ela age na

célula endotelial para aumentar a expressão de moléculas de superfície que

medeiam a adesão de leucócitos, tais como ligantes de integrina. Já em altas

concentrações, a IL1-β entra na corrente sanguínea e exerce efeitos

endócrinos causando febre, induzir a síntese de proteínas plasmáticas da fase

aguda pelo fígado e iniciar o desgaste metabólico (caquexia). Na inflamação

articular, as células sinoviais produzem grande quantidade de citocinas,

particularmente citocinas antiinflamatórias como, por exemplo, a IL1-β

Braddock e Quinn (2004). De fato, Xavier et al. (2011) demonstraram que

citocinas como IL1-β é capaz de comprometer a integridade da de tendões em

processos inflamatórios crônicos. Durante o processo inflamatório, o

metabolismo das células que constituem o tecido lesado sofre importantes

alterações. A expressão de enzimas e a síntese de mediadores

antiinflamatórios se apresentam exacerbadas durante o processo inflamatório

Aigner et al. (1994) e Xavier et al. (2011). Os efeitos da IL1-β podem ser inibidos in vitro e in vivo através de

inibidores naturais tais como, antagonistas do receptor de IL1-β e receptores

solúveis. Esse tipo de receptor pertence à família dos receptores de citocinas

que não induzem resposta intracelular Fong et al. (1990). Esses mesmos

autores demonstraram que os inibidores de IL1-β são eficazes no tratamento

dos sintomas da inflamação crônica. Além disso, esses resultados corroboram

com aqueles encontrados em pacientes acometidos por doença reumática.

21

Tomados em conjunto, os resultados descritos sugerem fortemente o

envolvimento da IL1-β no desenvolvimento e manutenção do processo

inflamatório, e por isso, o estudo do mecanismo de ação de terapias anti IL1-β

deve ser explorado. 1.5.2 Fator de transformação do crescimento Beta (TGF–β) Quando instalado a lesão no tendão um quadro de tendinopatia é

iniciado. Nestes casos, a tendinite pode apresentar características de doença

crônica. A presença de células tendíneas junto à reorganização do tecido pode

indicar a presença de fatores de crescimento (TGF-β). Existem 3 isoformas de

TGF-β (b1, b2 e b3), porém seu mecanismo ainda não é bem compreendido.

As 3 isoformas em tendões de coelhos lesionados o TGF-β apresentou uma

aumento durante o processo de reparo e na cirurgia óssea, este aumento foi

percebido 56 dias após a lesão Schnabel et al. (2006).

As três isoformas de TGF-β são caracterizadas da seguinte forma, o b1

são expressos nos vasos sanguíneos e em tecido conjuntivo, na cicatriz,

quelóides e escaras Lee et al. (1999), o b2 é mais expresso em tendões e o b3

em vasos sanguíneos Gold et al. (1997).

O TGF-β é considerado um protagonista na cura de feridas

apresentando outras funções como recrutamento de fibroblastos e macrófagos.

Ele também consegue estimular a mitogenese de tenócitos, a síntese de matriz

extracelular e de colágeno I e III Schnabel et al. (2006).

Para o repara do tendão, atualmente especialistas buscam técnicas que

acelerem o reparo, o processo inflamatório, a dor e também restaurando suas

propriedades mecânicas iniciais Hou et al., (2009). Neste sentido, o TGF-β vem

se destacando pelo seu importante papel na patologia do tendão Rolf et al.,

2001; Neuwirth et al., (2006).

Segundo Chen et al., (2004) o TGF-β também pode ser usado como

terapia para promover o reparo do tendão. Terapias recentes usam injeções de

TGF-β1 no tratamento de tendinites. Foi possível observar o aumento da

expressão de pro colágeno I e III em cultura de células do epitendão e do

endotendão cultivadas separadamente.

22

A formação dos ligamentos transversais de colágeno e a remodelação

da matriz do tendão, o TGF-β é capaz de acelerar, melhorando assim, as

propriedades mecânicas do tendão. Também consegue aumentar a expressão

de colágeno tipo III, nas fases iniciais do reparo tecidual, sendo reduzido após

3 a 4 semanas da lesão, provavelmente pelo aumento da expressão de

colágeno tipo I Hou et al. (2009).

São várias as funções biológicas do fator de crescimento endotelial-

Beta, é secretado por plaquetas, macrófagos, linfócitos e mastócitos, as células

ou tecido alvo são monócitos, macrófagos, macrófagos ativados, células

epiteliais e endoteliais, linfóides e hematopoiéticas, células B em proliferação.

O TGF–β tem com atividade atrai quimiotaticamente, induzir a proliferação e

aumento da IL1-β e induz a mudança de classe para IgA (Goldsby, 2002). A principal ação do TGF-β no sistema imune é inibir a proliferação e a

ativação de linfócitos e outros leucócitos. Alguns linfócitos T reguladores

produzem TGF-β, e as mesmas células podem produzir IL-10, que, assim como

TGF-β, possui atividades imunossupressoras. Inibição da proliferação e

diferenciação de linfócitos T e da ativação de macrófagos. Por meio dessas

ações, o TGF-β inibe respostas imunes e inflamatórias.

23

1.6 Justificativa

Na rotina diária da humanidade a alimentação é fator primordial,

podendo se tornar um problema de saúde pública, uma vez que o seu excesso

ou falta podem causar doenças. Assim, a desnutrição está definida como o

estado nutricional em que ocorre deficiência ou desbalanço de energia,

ausência de proteína e outros nutrientes na dieta causam alterações física,

tecidual, funcional e clínica Lochs et al. (2006). Os efeitos da desnutrição, são

vários estudos que apontam os diversos efeitos da desnutrição na vida adulta,

uma dieta hipoproteíca acarreta em diversos estresses e doenças no

organismo Amaral (2005) e Albuquerque et al. (2007).

A classe baixa, pela falta de nutrição adequada é a mais atingida, sofre

com as diversas doenças que são causadas pela falta dos nutrientes

essenciais. Esta falta de nutrientes provoca o aumento do hormônio do cortisol,

o cortisol é um hormônio catabolico e quando há um aumento deste ocorre

desgaste no organismo e os tendões são muito acometidos, especificamente

nas fibras de colágeno causando a tendinopatia. Indivíduos no quadro de

desnutrição aparentam ter dificuldade de cicatrização e baixa resistência nos

tendões Sawaya (2006).

A tendinopatia conhecida anteriormente como tendinite, uma inflamação

nos tendões, podendo ocorrer de diversas formas, como por exemplo, a má

alimentação ou dieta hipoproteíca, traumas esportivos, acidentes domésticos e

uso crônico de medicamentos Carvalho et al. (2006) e Xavier et al. (2011).

Praticantes de atividade física são os mais prejudicados, se estiverem expostos

no quadro da desnutrição, poderão sofrer, por serem expostos a atividades de

impacto e alto consumo de energia. Quando praticante de atividade física

amador se encontra no quadro de desnutrição é necessário que o mesmo tome

muito cuidado, pois em caso de lesão suas conseqüências podem ser

traumáticas, além do tratamento ser demorado por razão da baixa síntese de

FIGURA 3 – O TGF-beta ao se ligar ao seu receptor provoca uma cascata de reações provocando a síntese de proteínas. FONTE: http://home.ccr.cancer.gov/inthejournals/yuspa.asp (acesso ao site dia 18/11/2012)

24

células (cicatrização) e baixo metabolismo do sistema imunitário o tecido não

será reconstituído a 100%, tendo menos força de tração e resistência

Casalechi et al. (2009) e Monk et al. (2011). Quando uma pessoa parte para o

tratamento para restaurar o tecido lesionado no caso tendão, seja ele por

trauma, desgaste ou rompimento as indicações para o tratamento são através

de fármacos esteriodais, não esteriodais, injeções, antiinflamatórios e

glicocorticóides.

Hoje, existem evidências científicas, conforme podemos constatar na

FIGURA 2, que a fototerapia de baixa potência é uma estratégia terapêutica

para regeneração e fortalecimento nos tendões calcâneos de ratos após uma

lesão induzida. Dessa forma, observa-se que o LED pode vir a ser um

substituto para algumas terapias de baixa intensidade. Entretanto, para tal se

faz necessário ainda muito estudos para determinar dosimetria, efeito e

mecanismo de ação da terapia com LED Casalechi (2009). O desenvolvimento

desta terapia poderia contribuir nos sistemas de atenção a saúde pública,

reduzindo o processo de reabilitação de pacientes por meio de uma terapia de

baixo custo.

1.7 LED (Light Emitting Diode) fototerapia de baixa potência

São vários os métodos de tratamentos que estão sendo introduzidos

para amenizar e curar as tendinopatias (tendinite e tendinose), a literatura vem

demonstrando um aumento exacerbado de estudos referente à utilização de luz

como terapia Carvalho et al. (2006), Albertini et al. (2007) e Xavier et al. (2011).

Há bem menos tempo de estudo referente a fototerapia de baixa

potência, o LED vem demonstrando resultados positivos no processo

inflamatório tão qual comparados aos estudos com outras fototerapias. Um dos

exemplos de outro modelo da fototerapia de baixa intensidade é o LASER. A

diferença entre as terapias é que o LASER que o laser possui coerência na

emissão de luz, enquanto no LED a ausência de coerência, entretanto, a

coerência da luz do LASER não é responsável pelos efeitos da terapia, pois

esta propriedade se perde nas primeiras camadas de tecido biológico Dall et al.

2009).

25

O LED vem sendo recentemente utilizado e investigado na área

biológica e médica. Na prática fisioterapêutica a radiação LED tem sido usada

para acelerar os processos cicatriciais em estudos experimentais. A emissão

de luz é monocromática, não coerente, o que difere da luz LASER Andrade et

al. (2001). Por serem semicondutores, tendo como característica elétrica

conduzir a corrente elétrica em um único sentido apresenta grande eficiência

na conversão de energia elétrica em óptica, dissipando pouca potência

Medeiros (2001), o LED emite apenas uma pequena banda espectral Kurachi

et al. (2001) e Stahl (2000). Diversos autores relatam que a terapia com LED

em baixa intensidade geram os mesmos efeitos comparados com a LASER de

baixa intensidade Andrade et al. (2001) e Faria (2006) e Dall et al. (2009).

Segundo Karu (2000) o aumento da atividade celular, tanto em divisão

como em síntese, têm sido relacionados ao comprimento de onda do fóton e

com a dose, e não especificamente à fonte de luz. O cromóforo é responsável

pela absorção luminosa, quando ocorre a absorção de fótons por um cromóforo

um estado molecular eletronicamente excitado se estabelece, resultando na

atividade celular.

Segundo Andrade (2001) no mercado os aparelhos LED vêm

conquistando espaço, sendo cada vez mais estudados, tendo em vista a

praticidade e baixo consumo de energia e baixo custo. Existem aparelhos

alimentados com pilhas e baterias, eliminando cabos e aumentando a sua

praticidade ou com suas bases alimentadas por fonte elétrica, além disso, a

variação térmica presente nos aparelhos LED é incapaz de causar maiores

danos mesmo quando o aparelho é usado em tempos prolongados.

Vinck et al. (2003), relatam resultados positivos no processo de

regeneração em fibroblastos de aves, diminuição do número de fibroblastos e

melhora na qualidade da remodelação.

Sheiko, Shikhlyarova e Kurkina (2004), concluíram que a fototerapia, que

inclui a exposição ao LED, potencializou o efeito de um anti-tumor, reduziu

seus efeitos colaterais e preveniu metástases.

Faria (2006) comparou o LED com outra terapia de baixa intensidade

(sem variação de parâmetros) e observou maior eficácia do LED. A

26

regeneração tecidual de tecido tendinoso e organização das fibras colágenas

foi maior com os efeitos do LED comparado a outra terapia.

Trelles, Allones e Mayo (2006) utilizaram a terapia com LED (633nm)

para auxiliar a cicatrização de ferida cutânea, e relatam melhora da dor após a

primeira sessão do tratamento e no décimo quinto dia essas feridas já estavam

completamente reparadas e com mínimo tecido cicatricial quando comparados

ou controle.

Bevilacqua et al. (2007) e Tortamano et al. (2009) descrevem que a

fototerapia com LED de baixa potência pode prevenir cáries, efeito bactericida

e alívio da dor na cicatrização.

Casalechi et al. (2009), demonstraram a efetividade do LED no processo

de regeneração do tendão de Aquiles, com diminuição do número de

fibroblastos e melhora na qualidade da remodelação.

Bastos, Lizarelli e Parizzoto (2009), encontraram efeitos semelhantes na

cicatrização do tendão ao comparar o LED (630nm e 880m) com o LASER

(685nm e 830nm), sendo que os comprimentos de onda infravermelhos

obtiveram resultados mais eficientes.

Araújo (2009) verificou que após a utilização do LED em uma inflamação

óssea houve regeneração positiva comparada ao grupo lesão sem tratamento.

Silva et al. (2011) relatam que o LED apresentou maior ação

antiinflamatória, aumento qualitativo e quantitativo dos fibroblastos e fibras

colágenas. Alguns estudos da fototerapia de baixa potência estão

apresentados na figura 4.

Diante do problema da desnutrição na regeneração tecidual, maturação

de tecidos e dos altos índices de estudos sobre a fototerapia de baixa potência

no processo inflamatório, o presente projeto teve como objetivo analisar os

efeitos do LED de baixa potência na regeneração da tendinopatia após um

processo inflamatório induzido em ratos desnutridos e nutridos, se fez por bem

em comparar a terapia abordada com uns dos tratamentos mais convencionais

para o processo inflamatório, sendo os antiinflamatórios não esteróides

(AINEs).

27

Fonte/Terapia

Comp. de

onda

(J/cm2)

Modelo de

estudo

Resultado

Área

estudada

Salate et al.

(2002)

LASER

660

2, 5 e

10

Ratos

Neovascularização

Tendão

calcâneo

Vinck et

al.(2003)

LED

570,660

830,930

1,

0,53 e

0,1

Aves

Diminuição de

fibroblastos

Cultura

celular

Carrinho et al.

(2006)

LASER

685

3 e 10

Ratos

Aceleração na

reparação

tendínea

Tendão

calcâneo

Faria (2006)

LED

640

4

Ratos

Regeneração e

organização nas

fibras colágenas

Tendão

calcâneo

Albertini et al.

(2007)

LASER

660 e

684

4

Ratos

Expressão do

RNAm COX

Tendão

calcâneo

Arruda et al.

(2007)

LASER

670

3

Ratas

Melhor

organização das

fibras colágenas

Tendão

calcâneo

Castro et al.

(2007)

LED

630

10 e

140

Ratos

Na atividade

mitocondrial

Hepatócitos

Bertilini et al.

(2008)

LASER

670

2, 4 e

8

Ratos

dor

e edema

Tendão

calcâneo

Barolet et al.

(2009)

LED

660

4

Humanos

Síntese de

colágeno

Pele

28

Casalechi et al.

(2009)

LED

640

20

Ratos

Fibroblastos e

Remodelação

das fibras

de colágenas

Tendão

calcâneo

Bonatti et al.

(2011)

LED

470

6, 12 e

18

Humanos

Não houve

alteração nos

fibroblastos

Pele

Silva et al.

(2011)

LED

640

4

Ratos

Ação

antiinflamatória

Tendão

calcâneo

Xavier et al

(2011)

LED

780

7,5

Ratos

Redução de

RNAm COX,

TNF, IL4 e IL10

Tendão

calcâneo

FIGURA 4 – Diversos estudos com a fototerapia de baixa intensidade.

29

2. Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo investigar e comparar ação da

fototerapia LED de baixa potência no comprimento de onda de 640 nm (região

do vermelho) com a do fármaco diclofenaco de sódio na tendinopatia (processo

inflamatório) induzida por trauma mecânico em tendão calcâneo de ratos

desnutridos e nutridos.

2.1. Objetivos específicos;

• quantificar Leucócitos em tendões calcâneos;

• diferenciar os subtipos de colágeno I e colágeno III e sua maturação

em tendões calcâneos ;

• verificar a expressão das citocinas IL1-β e TGF-β em tendões calcâneos;

3. Material e Método.

Os aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade

Brasileira de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº.

0033/2011.

3.1 – Protocolo de Desnutrição.

O protocolo de desnutrição foi iniciado após o período de lactação (28

dias), os animais passaram a consumir uma ração especial com baixo teor de

proteína (6%) Latorraca et al. (1998), durante os 32 dias subseqüentes Alves,

Voltarelli e Mello, (2005) (fig.5). Após esse período os animais foram

considerados desnutridos.

30

3.1.1 – Dieta para desnutrição A desnutrição foi induzida com dieta semi purificada contendo 6% de

proteína. A quantidade de nutrientes e porções que determinam a formulação

da ração hipoproteica (6%) Latorraca et al. (1998), estão demostrados na

tabela 1, a formulação proposta pelo American Institute of Nutrition (AIN 1993)

para adequar alimentação de roedores nas fases de crescimento, gestação e

lactação peso normal a ser adquido.

Tabela 1 – Componentes utilizados para formulação da ração hipoproteica,

comparada as normas para adequação da AIN-93G.

1a ETAPA 2a ETAPA 3a ETAPA 4a ETAPA 5a ETAPA 6a ETAPA

GESTAÇÃO LACTAÇÃO DESNUTRIÇÃO LESÃO TRATAMENETO EUTANÁSIA 21 DIAS 28 DIAS 32 DIAS 1 DIA 7, 14 e 21 DIAS 1 DIA

FIGURA 5 - Da gestação até eutanásia dos animais foram seis etapas, na 1ª etapa o período de 21 dias de gestação, a 2ª etapa após o nascimento dos animais os mesmos tiveram um período de 28 dias para amamentação (lactação), a 3ª etapa foi induzido à desnutrição, os animais consumiram ração hipoproteica por um período de no mínimo 32 dias na 4ª etapa foi induzida à lesão traumática nos animais, nesse período os animais continuaram a receber ração hipoproteica até o período da eutanásia, na 5ª etapa foi determinado os períodos experimentais (7, 14 e 21 dias) de tratamento e por último a 6a etapa que representa eutanásia referente a cada período experimental, os animais foram eutanasiados sempre após 24hs da última terapia/tratamento).

31

3.2 Protocolo para induzir a Tendinopatia (tendinite).

Todos os cuidados prévios foram tomados para evitar qualquer

desconforto para os animais. Os animais foram previamente anestesiados com

Cloridrato de Ketamina (80-100mg/kg) e Xilazina (40-75mg/kg) Damy et al.

(2010) em seguida os animais foram posicionados em decúbito ventral no

aparelho para a produção de uma contusão controlada na região medial do

tendão de calcâneo da pata esquerda dos animais conforme o protocolo já

estabelecido na literatura por Salate (2005) e já utilizado por Joensen et al.

(2011) (fig. 6). Para lesão foi determinado uma massa de 220g posicionada a

25 cm do tendão do animal, o impacto da mesma possibilitou uma energia

aplicada no tendão de 0,5J. Após os procedimentos descritos acima, os

animais foram mantidos aquecidos até a finalização do efeito anestésico, com o

objetivo de se evitar a morte acidental por hipotermia decorrente da anestesia.

FIGURA 6 – Aparelho utilizado para induzir a lesão no tendão calcâneo da pata esquerda dos animais, (a) demonstra aparelho em descanso e (b) demonstra o aparelho com sua massa de 220g a 25 cm do ponto de partida. 3.3 - Grupos experimentais “in vivo”.

Foram utilizados 120 ratos, sendo 60 animais desnutridos (160 ± 20g) e

60 animais nutridos (300 ± 20g), distribuídos em 8 grupos (n=15/grupo), os

grupos foram distribuídos da seguinte forma; 4 grupos para animais nutridos e

4 grupos para animais desnutridos, cada grupo conteve três subgrupos com 3

períodos experimentais de 7, 14 e 21 dias (n=5/grupo) (fig. 7) , sendo:

32

FIGURA 7 – Desenho experimental dos grupos, cada grupo com três subgrupos totalizando 15 animais.

Os grupos;

- CONTNUTR (basal nutrido);

- CONTDESN (basal desnutrido);

- TENNUTR (tendinite nutrido);

- TENDESN (tendinite desnutrido);

- LEDNUTR (tendinite e LED 640 nm em nutrido);

- LEDDESN (tendinite e LED 640 nm em desnutrido);

- DROGNUTR (tendinite e diclofenaco 1mg/kg/dia em nutrido);

- DROGDESN (tendinite e diclofenaco 1mg/kg/dia em desnutrido).

3.4 Terapias/Tratamento - LED e Fármaco

A terapia com LED foi aplicada com os seguintes parâmetros: Densidade

de energia 2,04 J/cm2, comprimento de onda 640 nm, potência 96 mW, área

entregue (Spot) 3,30 cm2, tempo de aplicação 70 segundos (Tabela 2).

33

TABELA 2 - Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de

energia (DE) é dada por AEDE = ou

AtPDE .

= , cuja unidade é [J/cm2], onde E é

a energia [Joule], A é a área [cm2], P é a potência [Watt] e t é o tempo [segundo].

Densidade de energia 2,04 J/cm2 Comprimento de onda 640 nm

Potência 96 mW Área entregue (Spot) 3,30 cm2 Tempo de Aplicação 70 segundos

Técnica Contato

O equipamento LED utilizado no estudo foi de modelo artesanal cedido

pela Professora Dra. Stella Regina Zamuner (fig.8). A potência do equipamento

LED foi aferida por meio de um medidor de potência (Model 13 PEM 001/J,

Melles Griot, Netherlands). Para a terapia do LED ser aplicada, os animais

foram posicionados em decúbito ventral e imobilizados manualmente. A pata

traseira esquerda foi imobilizada seguindo-se a aplicação do LED por um

tempo calculado (70s). A aplicação foi pontual e em contato direto com o

tendão calcâneo esquerdo, formando um ângulo de 90º em relação ao tendão.

Para efeito do tratamento os animais foram expostos à radiação LED em dias

alternados, ou seja, com um intervalo de 48 horas entre as aplicações

Casalechi et al. (2009) e Xavier et al (2011).

Os grupos definidos como DROG receberam injeção intraperitoneal (IP)

de diclofenaco de sódio 1mg/Kg/dia no máximo 7 dias conforme posologia do

fármaco. Os animais foram imobilizados em decúbito dorsal e expostos na

região abdominal para aplicação do fármaco, a seringa utilizada para aplicação

foi da marca BD agulha com 8 mm de comprimento e 0,30 de calibre Lopes-

Martins (2006).

34

FIGURA 8 – Aparelho do LED de 640nm utilizado no experimento. 3.5 Eutanásia e coleta das amostras.

Ao termino de cada período experimental (7, 14 e 21 dias), os animais

foram eutanasiados 24hs após a última sessão de terapia (tratamento), isso foi

determinado para padronizar as eutanásias. Os animais foram colocados em

câmara de CO2 por no mínimo 5 minutos para concluir a parada respiratória

Chorilli et al. (2007). Para a retirada dos tendões foram realizadas a tricotomia

e dissecação do tendão calcâneo esquerdo Casalechi et al. (2009) e Damy et

al. (2009). A tenotomia foi realizada na junção miotendinosa e ostiotendinosa

(fig.9), o tendão foi colocado em eppendorf e armazenado em freezer com

temperatura -80° C até a realização das análises.

35

3.6 Processamento das amostras

A preparação do material para as análises histológicas foi realizada no

laboratório de histologia da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) e no

laboratório de investigação medica (LIM 59) da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (FMUSP).

Para o processamento, foram utilizados lâminas de microscopia

lapidadas e para a montagem das lâminas foram feitos cortes congelados em

criostato. Os tendões foram colocados em posição longitudinal e cortados em 7

micra de espessura na temperatura de no mínimo –20° C.

Foram feitos 6 cortes semisseriados de cada tendão e colocados em lâminas

separadas. As lâminas foram separadas da seguinte forma; 2 lâminas coradas

com hematoxilia-eosina (HE), 2 lâminas coradas com picrossírius e 2 lâminas

para imuno-histoquímica, sendo 1 lâmina para IL1-β e 1 lâmina para TGF-β.

FIGURA 9 – Retirada do tendão, tenotomia realizada na junção miotendinosa e ostiotendinosa.

36

3.6.1 Protocolo para coloração com Hematoxilina e Eosina

Para a coloração das lâminas com H.E as amostras foram processados

de acordo com o seguinte o protocolo: (5 minutos no álcool 96%, 2 minutos no

70%, 1 minuto na H2O corrente, 40 minutos no picrossírius, 1 minuto H2O

corrente, 1 minuto na Hematoxilina, 1 minuto na H2O corrente, 2 minutos no

álcool 70%, 2 minutos no álcool 96%, 2 minutos no álcool absoluto, 2 minutos

no xilol e montagem da lâmina). Protocolo utilizado do laboratório de

investigação médica – LIM 59 - Biologia celular – sobe responsabilidade da

Profª. Drª. Élia Tamaso Espin Garcia Caldini que utiliza como referencia montes

e Junqueira (1992). Esse protocolo foi adaptado para o tecido pesquisado

nesse projeto.

3.6.2 Protocolo para coloração com picrossírius red

E para coloração em Picrossirius foi utilizado o protocolo (5 minutos no

álcool 96%, 2 minutos no álcool 70%, 1 minuto na H2O corrente, 1 minuto e 30

segundos na Hematoxilina, 1 minuto na H2O corrente, 2 minutos na eosina, 1

minuto na H2O corrente, 2 minutos no 70%, 2 minutos no álcool 96%, 2 minutos

no álcool absoluto, 2 minutos no xilol e montagem da lâmina. Protocolo

utilizado do Laboratório de Investigação Médica – LIM 59 - Biologia celular –

sobe responsabilidade da Profª. Drª. Élia Tamaso Espin Garcia Caldini que

utiliza como referencia Montes e Junqueira (1992). Esse protocolo foi adaptado

para o tecido pesquisado nesse projeto.

3.6.3 – Imunohistoquímica

Os anticorpos contra TGF-β e IL 1-β utilizados para este estudo estão

descritos na tabela 2:

37

Tabela 3 - Anticorpos utilizados no estudo da imunohistoquimica

ANTICORPO DILUIÇÃO FABRICANTE

IL 1- β 1/200 SANTA CRUZ

TGF-β 1/500 SANTA CRUZ

Cortes de tecido congelado de tendão de espessura 7 µm foram

colocados em lâminas silanizadas (Sigma Chemical Co; St. Louis, Missouri,

EUA). O processo de fixação foi feito ao colocar as lâminas um banho de

álcool 70° por 5 minutos. Em seguida, foram lavadas em água corrente, água

deionizada e deixadas em tampão fosfato pH 7,4. O bloqueio da peroxidase

endógena presente nas hemácias foi feito com água oxigenada 10v (3%), e

depois de lavado em água corrente, água destilada e tampão fosfato salino

(PBS). O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito com imersão das

lâminas em caseína diluída em tampão fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo,

Brasil) por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas

com os anticorpos primários diluídos em 1% de albumina de soro bovino (BSA)

por 1 hora à 37° C e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário

ABC kit VECTASTAIN ( Vector Laboratories – USA) por 1 hora à 37° C. O

cromógeno utilizado foi Diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim, Alemanha). Posteriormente ocorreu a contra-coloração com

Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) para todos os casos.

Após o término do protocolo as lâminas ficaram em repouso por 48hs até

serem encaminhadas para análises. (protocolo lab imunohistoquimica do

departamento de patologia FMUSP sobe a responsabilidade Prof. Dra. Maria

Cláudia Zerbini).

38

3.7 – Coleta das imagens e análise

As lâminas foram fotografadas em 2 campo na área da lesão num

aumento de 1000 vezes para análises celulares (HE), 400 vezes para análise

de colágeno (picrossírius) e 200 vezes para imunohistoquimica. Através de um

microscópio de luz e com filtro polarizador (Nikon) e no software (Image pro-

plus), as imagem foram capturadas com ampliação de 1000x (imersão) e

lâminas coradas com picrossírius com ampliação de 400x (fig. 10).

Para as lâminas de imunohistoquimica foi utilizado o software IC Capture

2.2 (fig. 11). Foi utilizado o software Image J 1.45s (National Institute of Health,

EUA) para contagem de células (na função Cell Counter) em HE e para

quantificação de colágeno em picrossírius (na função Color Histogram) (fig. 12

e fig.13). De acordo com a literatura (Montes & Junqueira, 1992), o colágeno

visto em vermelho sob o microscópio de polarização indica o tipo I, enquanto

visto em verde indica o tipo III. Dessa maneira, foram quantificados os canais

vermelho e verde de cada imagem fotografada sob luz polarizada para inferir

sobre os tipos de colágeno no tecido.

O software utilizado para Avaliação quantitativa da expressão de IL1-β e

TGF-β nos tendões por análise de imagem foi Image-Pro Plus Versão 4.0

(fig.10). As análises foram realizadas em no mínimo 50% da área total de cada

tendão, sendo em todos os animais de cada grupo. Primeiramente foi realizada

a medida da área total a ser avaliada. Em seguida foi estabelecido o padrão de

imuno reatividade (o que é positivo para cada um dos anticorpos, IL1-β e TGF-

β), padrão esse utilizado para análise de todas as lâminas. Em seguida, foi

avaliada a área positiva em relação à área total, o que nos permitiu avaliar a

porcentagem de área positiva para cada um dos marcadores estudados (IL1-β

39

e TGF-β). Dessa forma, os resultados foram expressos em % de área de IL1- β

e de TGF-β em relação à área total de cada tendão (fig 10).

FIGURA 10 – Software (Image-Pro Plus) utilizado para fotografar as imagens das laminas em HE e quantificar antígeno para citocinas IL 1-Beta e TGF-Beta. O resultado utilizado para imunohistoquimica foi emitido em estatística expresso em somatória (Sum) conforme representado na figura.

FIGURA 11 – Software utilizado para caputurar imagens das lâminas de imunohistoquimica.

40

FIGURA 12 – Software (Image J) na função Cell Counter, foi utilizado para contagem de células inflamatórias e fibroblastos.

FIGURA 13 – Software (Image J) na função Color Histogram foi utilizado para quantificar colágeno.

41

3.8 Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. O

teste de D'Agostino & Pearson foi utilizado para verificar a distribuição

Gaussiana dos dados. Os dados foram analisados por meio do teste t Student

ou Mann Whitney para comparações de duas amostras independentes,

respectivamente. Além disso, análise de variância a duas vias (ANOVA)

seguida por Bonferroni foi empregada quando necessária. O teste de Qui-

quadrado foi empregado em análise de contingência. Nível de significância foi

fixado em p≤0,05.

42

4 – Resultados (artigos)

Artigo 1 Parente M, Vieira RP, Casalechi HL, Kamimura NT, Vasconcellos MS, Aimbire

F, Albertini R. Análise do efeito da fototerapia LED (light emitting diode) em

tendinopatia traumática em ratos. Submetido à Conscientiae Sáude.

43

Análise do efeito da fototerapia LED (light emitting diode) pós tendinopatia traumática em ratos.

Effect of phototherapy LED (light emitting diode) post traumatic tendinopathy in

rats

Título abreviado: Efeito da fototerapia LED para tendinopatia em ratos.

Short Title: Effect of LED Phototherapy for tendinopathy in rats

Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove

de Julho, Rua Vergueiro, 235, CEP 01504-001, São Paulo – SP, Brasil.

Márcio Parente1, Rodolfo de P. Vieira5, Heliodora Leão Casalechi2, Nilce

Tamae Kamimura3, Mariana de Souza Vasconcellos3, Flávio Aimbire4, Regiane

Albertini5

1 - Mestrando do Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação,

Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.

2 - Doutoranda do Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação,

Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.

3 - Aluna na Graduação da Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São

Paulo, Brasil.

4 - Professor Doutor da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São

Paulo, Brasil.

5 - Professor Doutor do Programa de Pós Graduação em Ciências da

Reabilitação, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo, Brasil.

Autor Correspondente Prof. Dra. Regiane Albertini de Carvalho

Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove

de Julho, Rua Vergueiro, 235, CEP 01504-001, São Paulo – SP, Brasil.

Fone: +55 (11) 3665-9325

E-mail: regianealbertini@uninove.br

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Análise do efeito da fototerapia LED (Light Emitting Diode) pós tendinopatia traumática em ratos Effect of phototherapy LED (light emitting diode) post traumatic tendinopathy in

rats

Efeito da fototerapia LED para tendinopatia em ratos Effect of LED Phototherapy for tendinopathy in rats

Resumo: A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença

que afeta os tendões (tendinite e/ou tendinose). Esse estudo teve como

objetivo investigar o efeito da fototerapia (LED 640nm) no processo de

reparação da tendinite no tendão calcâneo em ratos. A tendinite foi induzida no

tendão esquerdo por meio de trauma mecânico. Foram utilizados 40 animais

(300 ± 20g), distribuídos em 4 grupos, (n=5) e com dois sub-grupos com

diferentes períodos experimentais (7 e 21 dias). Os grupos; CONTR

(controle/basal); TEND (lesão sem tratamento); LED (lesão e tratamento com

LED); DROG (lesão e tratamento com fármaco). O grupo definido como DROG

foi tratado com diclofenaco sódico (1mg/Kg/dia). Foram realizadas análises

histopatológicas. A terapia com LED apresentou efeitos antiinflamatórios e de

reparação tecidual.

Descritores: Tendão, tendinite, LED, infamação

Abstract: This study aimed to investigate the effect of phototherapy (LED 640

nm) in the repair process of tendonitis in the Achilles tendon in rats. The

tendinitis was induced in the left paw using a model of mechanical injury. Were

used 40 nourished rats (300± 20g), distributed in 4 groups, (n = 5) and two sub-

groups with different experimental periods (7 and 21 days). The groups,

CONTR (Control); TEND (injury without treatment); LED (injury and LED

treatment); DROG (injury and pharmacological treatment; sodium diclofenac

1mg/kg/dia). Histopathological analysis were performed. In summary, LED

therapy, resulted in improvement of inflammation and remodeling.

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Key Words: Tendon, Tendinitis, LED, inflammation.

Introdução

A tendinopatia refere-se a qualquer processo mórbido e/ou doença que afeta

os tendões. Na literatura encontramos os termos tendinose e tendinite, estes

formam a tendinopatia, sendo que a tendinose se refere aos processos

degenerativos (destrutivos) crônicos progressivos e a tendinite referem-se a

processos inflamatórios (que, por definição, incluem os cinco sinais e sintomas

de inflamação – tumor (inchaço), calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação

dos vasos na zona inflamada), dor e impotência funcional)1.

A tendinopatia pode ocorrer por traumatismo, excesso por repetições de

movimentos infecções e desnutrição, estas ocorrências desencadeiam todo um

processo de degeneração, inflamação e até os rompimentos dos tendões.

Embora a maioria dos tendões tenha a habilidade de reparação espontânea

após um ferimento, o tecido de cicatrização formado pode impedir que o tendão

execute suas funções normais2. Os tendões saldaveis são brancos, brilhantes

e possuem uma textura fibroelástica, são ricos em colágeno do tipo I e

menores presença de colágeno do tipo III, IV, V e VI. O colágeno é a principal

proteína estrutural do corpo e o maior componente da matriz extracelular do

tendão. Os tendões são formados por tecido conjuntivo, fibras de colágeno que

se entrelaçam para permitir as forças geradas pelos músculos.

Atualmente existem evidências científicas de que fototerapia tem ação

terapêutica5,6,7. Entretanto, estudos com LED (Light Emitting Diode) são mais

escassos15,21,22,23.

Em sua maioria, o tratamento convencional para a tendinite é farmacológico.

Dentre os fármacos mais usados pode-se detacar os antiinflamatórios não

esteroidais, os glicocorticóides e drogas imunossupressoras. Estes fármacos

podem apresentar diversos efeitos colaterais9. Até o momento, não existem

evidências de efeitos colaterais da terapia com LED.

O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da terapia com LED

(640 nm) de baixa intensidade em modelo de tendinite traumática em ratos.

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Material e Métodos

Animais

Foram utilizados 40 ratos jovens, machos, da linhagem Wistar (320 ± 20g). Os

aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade Brasileira

de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº. 0033/2011.

.

Os 40 animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos (n=10), e

estão subdividos em 2 tempos de eutanásia 7 e 21 dias, de acordo com a

figura 1. Grupo CONTR (controle)-basal; Grupo TEND (tendinite) - Grupo

submetido à lesão traumática no tendão calcâneo esquerdo, sem nenhum tipo

de tratamento; Grupo LED (terapia com LED) - Grupo submetido à lesão

traumática no tendão calcâneo esquerdo e submetido à terapia com LED;

Grupo DROG (terapia fármaco) - Grupo submetido à lesão traumática no

tendão calcâneo esquerdo, porém submetido ao tratamento com injeção

intraperitoneal do fármaco diclofenaco sódico (1mg/kg/dia), esse tratamento se

iniciou após 12hs após lesão durante 7 dias (conforme posologia do fármaco).

(FIGURA 1)

Indução da Lesão

Os animais submetidos à lesão foram previamente anestesiados com

Cloridrato de Ketamina (80-100mg/kg) e Xilazina (40-75mg/kg)10,11. Em seguida

submetidos à indução da lesão traumática no calcâneo esquerdo, conforme o

protocolo descrito por e Joensen (2011)12 e Salate (2005)13, os animais foram

posicionados em aparelho para produção de uma contusão controlada, foi

determinada massa de 220g posicionada a 25 cm do tendão do animal, o

impacto da mesma possibilitou uma energia aplicada de 0,5J na região medial

do tendão de Aquiles dos animais.

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Terapia LED

Os animais foram expostos à radiação LED em dias alternados, com intervalo

de 48 horas entre as aplicações, iniciando 12 horas após a indução da lesão e

foram interrompidas de acordo com o tempo de eutanásia (7 ou 21 dias).Os

parâmetros da irradiação estão especificados na tabela 1.

Tratamento Medicamentoso.

Após a 12hs da lesão o grupo determinado Droga inicio o tratamento com

diclofenaco, as demais sessões de aplicação foram realizadas em 24X24 horas

até completarem 7 dias de tratamento (posologia) tratados com fármaco

receberam a aplicação do Diclofenaco Sódico na concentração de 1mg/kg, a

cada 24 horas. A administração do medicamento foi por meio de injeção via

intraperitoneal, por um período de 7 dias14.

Eutanásia

Os animais foram sacrificados em câmara de CO210

12 horas após a última

aplicação da terapia LED ou da administração da última dose de diclofenaco.

Após o sacrifício os tendões foram removidos por dissecação, realizou-se a

primeira incisão na junção miotendínea seguido por uma incisão na junção

osteotendínea, na inserção calcanear. Em seguida, os tendões foram

identificados e armazenados a -80°C.

Analise Histológica

Para a confecção das lâminas foram feitos cortes das amostras congeladas no

criostato. Os tendões foram posicionados longitudinalmente e cortados em 7µm

de espessura em temperatura mínima de -20°C. Para cada amostra

determinou-se dois cortes semisseriados. As lâminas foram coradas com

Hematoxilina e Eosina (HE) e Picrosirius Red. Dois campos da área da lesão de

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cada lâmina foram fotografados em um aumento de 400 vezes em microscópio

de luz, para análise das amostras coradas em picrossírius se utilizou o

polarizador e posteriormente as fotos foram analisadas com software Image

Pro-Plus.

Resultados

O grupo Tendinite apresentou maior quantidade de células inflamatórias (fig

2b)) e maior desorganização nas fibras colágenas comparado com os demais

grupos (fig.3b)) com relação ao grupo tratado com LED 7 dias (fig. 2c)), nota-se

que a quantidade de células (fig.2c)) e organização das fibras colágenas

(fig.3c) nesses animais são parecido com o grupo Basal (2 a e 3 a)), já o grupo

Fármaco 7 dias (fig. 2d)) que apresentou quantidade de células parecida com

o grupo Tendinite 7 dias (fig.2b)), mas a fibras colágenas (fig. 3d)) demonstram

estarem bem mais alinhadas comparado ao mesmo grupo (fig.3b)).

(FIGURA 2) e (FIGURA 3)

As imagens representativas dos grupos com tempo experimental de 21 dias

estão apresentadas nas figuras 4 e 5. O grupo Tendinite também apresentou

maior quantidades de células (fig4b)) e maior desorganização nas fibras

colágenas (fig. 5b) comparado com os demais grupos. Quanto ao grupo tratado

com LED 21 dias, percebe-se que a quantidade de células (fig.4c)) e

organização das fibras colágenas (fig.5c)) nesses animais também são

parecido com o grupo Basal, diferente para o grupo Fármaco 21 dias que

apresentou quantidade de células parecida com o grupo Tendinite 21 dias

(fig.4d)), mas a fibras colágenas demonstram estarem bem mais alinhadas

comparado ao mesmo grupo (fig.5d)).

(FIGURA 4) e (FIGURA 5)

49

Discussão

Dentre os efeitos da fototerapia sobre os tecidos biológicos, um dos mais

discutidos é sua influência sobre os fibroblastos, na síntese de colágeno,

remodelamento e melhora funcional dos tendões15. Alguns estudos demostram

que há aumento do número de fibroblastos em tecidos tratados com

Fototerapia16,17..

Estudos também atribuem a Laser terapia tem efeito pró-angenico, aumento da

síntese de VEGF (vascular en-dothelial growth factor) e PDGF (platelet-derived

growth factor), melhora na troca de gases e eliminação de catabólitos por meio

dos vasos sanguíneos, facilitando a migração de macrófagos e fibroblastos nos

casos de reparação tecidual18,19. A utilização do LED terapêutico em estudos

mostra resultados semelhantes aos do Laser terapia para reparo tecidual14,20,21.

A semelhança entre os resultados de estudos utilizando Laser com LED, não

deve ser atribuída à coerência da luz, uma vez que esta se perde nas primeiras

camadas dos tecidos biológicos. Mas sim a comprimentos de onda específicos

que estimulam os componentes da cadeia respiratória mitocondrial

aumentando o metabolismo energético22,23,24.

A utilização da fototerapia de baixa intensidade é relatado em diversos estudos

efeitos benéficos no processo inflamatório, a reparação tecidual, efeito

potencializador, ação antiinflamatória e remodelamento de fibras colágenas23,25.

Por meio de análise histológica o presente estudo demonstrou melhor efeito

antiinflamatório nos grupos tratados com LED, quando comparados aos não

tratados e/ou tratados com fármacos, assim concordando com resultados

apresentados por Casalechi et. al. (2008)21 e Xavier et. al. (2011)23.

Autores mostram com cada vez mais frequência que a terapia com LED tem

efeitos benéficos em processos inflamatórios, concordando com os achados do

presente estudo15,26.A confirmação de resultados positivos atribuídos ao LED

nesse estudo faz com que se tenha a necessidade de mais estudos utilizando

essa fonte de luz.

50

Conclusão

Este estudo nos permite concluir que o LED de baixa intensidade

reduziu o número de células inflamatórias e melhorou o alinhamento das fibras

colágenas.

Agradecimentos

A Fapesp proc. 2011/05890-9, Uninove e LIM 59 (Laboratório de

Investigação Médica), os nossos agradecimentos.

Referências (artigo 1)

1. KHAN, K., COOK, J., MAFFULLI, N. - Where is the pain coming from in

tendinopathy? It may be biochemical, not only structural, in origin. Leader

article. Br J Sports Med nº 34 (2000), pp.81-83.

2. Barker, D.J., Bull, A.R., Osmond, C., Simmonds, S.J. “Fetal and placental

size and risk of hypertension in adult life”. BMJ 1990; 301, 259-262.

3. Carvalho, P.T.C., Silva, I.S., Reis F.A., Belchior, A.C.G., Aydos, R.D., Facco,

G.G., et. al. “Histological study of tendon healing in malnourished Wistar rats

treated with ultrasound therapy”. Acta Cirúrgica Brasileira; -13 – Vol. 21

(Suplemento 4) 2006.

4. Barker, D.J., Gluckman, P.D., Godfrey, K.M., Harding, J.E., Owens, J.A.,

Obinson, J.S. “Fetal nutrition and cardiovascular disease in adult life”. Lancet

1993; 341, 938-941.

5. Stahl, L., Ashworth, S.H., Jandt, K.D., Mills R.W. “Light-emitting diode (led)

polymerization of dental composites: flexural properties and polymerization

potential”. Biomaterials; 2000; v.21,p.1379-1389.

6. Susse, E., David, S., Clair D.S., He, L.I. “Latent Effects Of Prenatal

Malnutrition On Adult Health”. Annals of the new york academy of sciences.

2008; 1136: 185–192.

51

7. Medeiros, I.S. “Dispositivos LED para polimerização de resinas compostas

dentais: comparação com outra fonte de luz”. (Dissertação). Universidade de

São Paulo(2001).

8. Bertolini, G.R.F., Silva, T.S., Ciena, A.P., Trindade D.L. “Efeitos do Laser de

Baixa Potência Sobre a Dor e Edema no Trauma Tendíneo de Ratos”. Rev.

Bras. Med. Esporte; – 2008; Vol. 14, No 4 – Jul/Ago,

9. Lopes-Martins RA, Marcos RL, Leonardo PS, Prianti AC Jr, Muscará MN,

Aimbire F, Frigo L, Iversen VV, Bjordal JM. Effect of low-level laser (Ga-Al-As

655 nm) on skeletal muscle fatigue induced by electrical stimulation in rats. J

Appl Physiol. 2006;101(1): 283- 288.

10. Damy, S.B., Camargo, R.S., Chammas, R., Figueiredo, L.F.P. (2010),

“Aspectos fundamentais da experimentação animal - aplicações em cirurgia

experimental”. Rev Assoc Med Bras; 56(1): 103-11.

11. Massone, F. (1994), “Anestesiologia Veterinária: Farmacologia e Técnicas”.

2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,. 107p.

12. Joensen J, Gjerdet NR, Hummelsund S, Iversen V, Lopes-Mar tins RA,

Bjordal JM. An experimental study of low-level laser therapy in rat Achilles

tendon injury. Lasers Med Sci. 2011.

13. Salate A.C.B., Barbosa G., Gaspar P., Koeke P.U., Parizotto N.A., Benze

B.G., Foschiani, D. (2005), “Effect of In-Ga-Al-P Diode Laser Irradiation on

Angiogenesis in Partial Ruptures of Achilles Tendon in Rats. Photomedicine

and Laser Surgery Mary Ann Liebert, Inc V 23, N 5, Pp. 470–475.

14. Chorilli, M., Michelin, D.C., Salgado, H.R.N. (2007), ”Animais de laboratório:

o camundongo”. Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl., v. 28, n.1, p.11-23.

15. Silva, J.M.N., de Carvalho, J.P., Júnior, M.J.M (2011), “Estudo morfométrico

da terapia LED de baixa potência em tendinite de ratos”. Fisioterapia e

Pesquisa, São Paulo, v.18, n.4, p. 365-70.

16.Taciro, C., Serikawa, M.A., Parizotto N.A. (2007), “Aspectos Nanoestruturais

Do Colágeno No Processo De Regeneração Tendínea Estimulada Por Laser

De Baixa Intensidade – Estudo Piloto” Fisioterapia Especialidades – V. 1 – N. 1,

p. 21-24.

52

17. Enwemeka, C. S. (1989), “Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in

regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Physical T.erapy”.

v. 69, n. 10, p. 816-825.

18. Chow, R.T., Barnsley, L. (2005) “Systematic Review of the Literature of

Low-Level Laser Therapy (LLLT) in the Manage -ment of Neck Pain”. Lasers

Sur. Med. 37, 46–52.

19. Klebanov, G.I., Poltanov, E.A., Chichuk, T.V., Osipov, A.N. and

Vladimirov, Y.A. (2005) ''Changes in Superoxide Dismutase Activity and

Peroxynitrite Content in Rat Peritoneal Macrophag -es. Exposed to He_Ne

Laser Radiation Biochemistry (Moscow)''. 70 (12), 1335-1340.

20. D`Amore, P.A. and Thompson, R.W. (1987) ''Mechanism of

angiogenesis''. Ann. Rev. Physiol 49, 453 – 64.

21. Casalechi, H.L, Nicolau, R.A.; Casalechi, V.L.; Silveira-Júnior, L., Paula,

A.M.B., Pacheco, M.T.T. (2009) ''The effects of low level light emitting diode on

the repair process of Achilles tendon therapy in rats''. Lasers Med. Sci., v.24,

p.659-665.

22. Lim, W. Lee, S. Kim, I. Chung, M. Kim, M. Lim, H. Park, J. Kim, O. Choi, H.

(2007) ''The Anti-Inflammatory Mechanism of 635 nm Light-Emitting-Diode

Irradiation Compared With Existing COX Inhibitors''. Lasers Surg. Méd., v.39,

p.614-621.

23. Xavier, M., David, D.R., Souza, R.A., Arrieiro, A.N., Miranda, H., Santana,

E.T., Silva, J.A. Jr., Albertini. R. (2011) “Anti-inflammatory effects of low-level

light emitting diode therapy on Achilles tendinitis in rats”. Lasers Surg Med,

(Epub ahead of print).

24. Karu, T.I., Pyatibrat, L.V. and Afanasyeva, N.I. (2005) “Cel -lular effects of

low power laser therapy can be mediated by nitric oxide. Lasers Surg. Med. 36,

307–314.

25. Albertini R, Aimbire F, Villaverde AB, Silva JA Jr, Costa MS. COX-2 mRNA

expression decreases in the subplantar muscle of rat paw subjected to

carrageenan-induced inflammation after low level laser therapy. Inflamm Res. 2007; 56(6):228.

53

26. Vinck E.M, Cagnie B.J, Cornelissen M.J, Declercq H.A, Cambier D.C.

(2003) “ Increased fibroblast proliferation induced by light emitting diode and

low power laser irradiation”. Lasers Med Sci.;18(2):95-9.

Tabela 1 - Informações LED

Parâmetros Variáveis

Densidade de Energia 2.04 J/cm2

Comprimento de onda 640 nm

Potência 96 mW

Área determinada (spot) 3,30 cm2

Tempo de aplicação 70 s

Técnica Contato

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B asa l

F igu ra 2 – F oto s d o s tend õ es 4 0 0 x co rad o s H E . A n im aisd o p erío d o ex p erim en ta l d e 7 d ias: a ) B asa l, b ) Ten d in it e(au m en to d e cé lu las), c ) L E D (red u ção d e cé lu la s) e d )F árm aco (au m en to d e célu l as). A s se tas in d icam o sn ú cleo s d as cé lu las.

T E N D – 7 D IA S

L E D – 7 D IA S F Á R M – 7 D IA S

B A S A L – 7 D IA S

a ) b )

c ) d )

55

56

Artigo 2 Parente M, Vieira RP, Casalechi HL, Rodrigues NRD, Caldini EG, Santos ABG, Araruna AC, Rodrigues D, Silva DFT, Serra AJ, Aimbire F, Albertini RC. Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos desnutridos. Submetido a revista Brasileira de Fisioterapia

57

Análise do efeito do LED (Light Emitting Diode) de 640 nm no

modelo experimental de tendinopatia traumática em ratos desnutridos.

Márcio Parente1, Rodolfo P. Vieira2, Heliodora Leão Casalechi3, Nilsa Regina Damaceno-Rodrigues8, Elia Garcia Caldini7, Ângela Batista Gomes Santos6, Ana Carolina Araruna1, Douglas Rodrigues4, Daniela Fátima Teixeira Silva2,

Andrey Jorge Serra2, Flavio Aimbire5, Regiane Albertini de Carvalho2

1 - Mestrandos do programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil. parente10@yahoo.com.br carolararuna@gmail.com 2 - Professores Doutores do programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil. rodolfo.vieira@uninove.br dfteixeira@uninove.br andreyserra@gmail.com regianealbertini@uninove.br 3 - Doutorando do programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brazil. doraleao@gmail.com 4 - Graduando no curso de Biomedicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, Brasil. punk.douglas@gmail.com 5 - Professor Doutor da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brazil. flavioaimbire@yahoo.com.br 6 - Mestre do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. angelitabasan@yahoo.com.br 7 - Chefe do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. elia@usp.br 8 - Doutora do Laboratório de Biologia Celular (LIM 59) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brazil. nilsa@usp.br Author for correspondence: Regiane Albertini de Carvalho, Prof. Ph.D.

Post Graduate Program in Rehabilitation Sciences

Nove de Julho University (UNINOVE)

58

Rua Vergueiro, 235

Postal Code: 01504-001

São Paulo – SP, Brazil

Fone: +55 11 33859222

E-mail: regianealbertini@uninove.br

Resumo O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da fototerapia LED (640nm±20) no processo inflamatório tendíneo, a tendinopatia (tendinite) foi induzida por trauma mecânico em tendão de Aquiles de ratos desnutridos e nutridos. Para tal foram utilizados 120 ratos, machos sendo 60 animais desnutridos (160±20g) e 60 nutridos (300±20g). A desnutrição foi induzida nos animais por uma ração com baixo teor de proteína (6% proteína) sendo que os animais nutridos consumiram ração normal (22% de proteína). Os animais foram divididos em oito grupos (n=15/grupo): CONTNUTRI e CONTDESN (controle); TENNUTR e TENDESN (lesão sem tratamento); LEDNUTR e LEDDESN (lesão e tratamento com LED); DROGNUTR e DROGDESN (lesão e tratamento com diclofenaco de sódio), cada grupo foi subdivididos em três subgrupos (n=5/grupo) de acordo com os períodos experimentais para a eutanásia 7, 14 e 21 dias após a lesão. A tendinite foi induzida no tendão calcâneo da pata esquerda por meio de trauma mecânico. Os tratamentos com LED e Fármaco iniciaram-se 12 horas após a lesão e o tratamento se repetiu a cada 48hs para LED e 12 hs para Fármaco. Os tendões foram dissecados, extraídos e encaminhados para realização das técnicas de histologia para análise de células inflamatórias, teor de colágenoo e imunohistoquimica para antigenos IL1-β e TGF-β beta. Após o processamento das amostras, os resultados obtidos demostram que os animais desnutridos apresentaram maior numero de células inflamatórias e teor de colágeno III comparado aos grupos nutridos, (p≤0.05). O LED de baixo potencia teve ações positivas sobre maturação das fibras colágenas e no processo inflamatório em animais nutridos e desnutridos. Dessa maneira com os resultados obtidos se concluiu que o LED de baixa potência teve ações positivas sobre processo inflamatório, diminuição na expressão de IL1-β e aumento na expressão TGF-β em animais nutridos e desnutridos. A terapia com fármaco também teve resultados positivos nos animais desnutridos e nutridos, porém como já descritos na literatura os efeitos indesejáveis que o mesmo pode causar. Palavra-Chave: Inflamação, Desnutrição, Tendinite, Colágeno, Citocínas.

59

Introdução

A desnutrição é um tema de grande interesse em todo o mundo, seus

efeitos sobre os diferentes órgãos e sistemas tem sido objeto de inúmeros

estudos, pois está fortemente associada a doenças crônicas, degenerativas,

hipertensão, deficiências na manutenção e reparação tecidual, processos

inflamatórios, funções imunológicas, doenças coronarianas, diabetes tipo I,

doenças renais, doenças cardiovasculares e capacidade metabólica muscular

[1,2,4,5,6,7].

A desnutrição pode acometer a tendinopatia que se refere a qualquer

processo mórbido e/ou doença que afete os tendões. Na literatura encontramos

os termos tendinose e tendinite, estes formam a tendinopatia, sendo que a

tendinose se refere aos processos degenerativos (destrutivos) crônicos

progressivos e a tendinite refere-se a processos inflamatórios (que, por

definição, incluem os cinco sinais e sintomas de inflamação – tumor (inchaço),

calor (quente), rubor (vermelho pela dilatação dos vasos na zona inflamada),

dor e impotência funcional) [2,8] A tendinite, caracterizada pela instalação do

processo inflamatório no tendão, causa diversas reações, pois as células

nucleadas produzem citocinas sinalizando área lesionada e também ajudam na

reparação tecidual. Algumas citocinas têm como função ajudar na síntese de

colágeno, o linfócito T sintetiza o fator de transformação do crescimento beta

(TGF-β) que tem como função a transformação de procolágeno em fibra de

colágeno, o TGF-β também tem com função inibir os macrófagos ativarem

citocinas inflamatórias[3]. Outra citocina presente no processo inflamatório é a

interleucina1-beta (IL1-β), produzida por macrófagos ativados e sua função é

estimular o processo inflamatório [3].

60

O tratamento convencional para a tendinite na sua maioria são os

farmacológicos. Dentre eles se destacam: os antiinflamatórios não esteroidais

(AINEs), os glicocorticóides e as drogas imunossupressoras, esses fármacos

convencionais apresentam diversos efeitos colaterais[14]. Existem evidencias

científicas que o terapia de baixa intensidade é uma estratégia terapêutica

eficaz para a regeneração após uma lesão induzida [6,9,10,11,12,13,22,34].

Entretanto, estudos com LED são mais escassos e ainda necessários para

determinar a dosimetria, efeito e mecanismo de ação da terapia.

Por estes diversos motivos presente trabalho tiveram como objetivo

investigar e comparar do efeito da fototerapia LED de baixa potência no

comprimento de onda de 640 nm (região do vermelho) com fármaco

diclofenaco de sódio em tendinopatia (processo inflamatório) induzida por

trauma mecânico em tendão calcâneo de ratos desnutridos e nutridos. A fim de

especificar o projeto se quantificou células inflamatórias (Leucócitos), analisar a

maturação dos subtipos de colágeno I e colágeno III e verificar a expressão das

citocinas IL-1β e TGF-β;

Materiais e Métodos

Animais - Foram utilizados 120 ratos jovens, machos, da linhagem Wistar,

sendo 60 animais desnutridos (180 ± 20g) e 60 animais nutridos (320 ± 20g).

Os aspectos éticos deste estudo seguiram as premissas da Sociedade

Brasileira de Ciências Animais (SBCAL) de laboratório e foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Nove de Julho (UNINOVE) nº.

0033/2011.

61

Modelo de desnutrição - A desnutrição dos animais foi iniciada após o

período de amamentação (28 dias). A partir desse período, os animais

passaram a consumir uma ração especial com baixo teor de proteína (6%) [15]

até o dia de eutanásia. Após o período de 32 dias os animais foram

considerados desnutridos [16] e a partir deste período iniciou-se o protocolo

experimental.

Protocolo experimental “in vivo” - Os animais foram aleatoriamente

distribuídos em 8 grupos com 15 animais em cada grupo (fig.1), cada grupo foi

composto por três subgrupos (n=5) (7, 14 e 21 dias). Três períodos diferentes

de tratamento e eutanásia foram determinados para cada grupo, sendo 7, 14 e

21 dias, estes tempos foram determinados após a lesão no tendão calcâneo

dos animais. Os grupos foram determinados da seguinte forma;

- grupo CONTNUTR (controle nutrido);

- grupo CONTDESN (controle desnutrido);

Não houve nenhum protocolo de experimento nestes animais.

- grupo TENNUTR (tendinite nutrido);

- grupo TENDESN (tendinite desnutrido);

Estes grupos foram submetidos à lesão traumática no tendão calcâneo da pata

esquerda e os animais destes grupos não receberam nenhum tipo de

tratamento;

- grupo LEDNUTR (terapia com LED em animais nutrido);

62

- grupo LEDDESN (terapia com LED em animais desnutrido);

Estes grupos também foram submetidos a lesão traumática no calcâneo,

porém foram submetidos a terapia com LED;

- grupo DROGNUTR (terapia fármaco nutrido);

- grupo DROGDESN (terapia fármaco desnutrido);

Estes grupos tiveram o mesmo protocolo de lesão dos demais grupos, porém a

terapia aplicada nestes grupos foi injeção intraperitoneal do fármaco

diclofenaco sódico (1mg/kg/dia) esse tratamento se iniciou após 12hs da lesão

e durante 7 dias conforme posologia do Fármaco.

(FIGURA 1)

Modelo de lesão - Os animais foram previamente anestesiados com Cloridrato

de Ketamina (80- 100mg/kg) e Xilazina (10-15 mg/kg)[17,18] em seguida foram

submetidos à lesão traumática que foi induzida no calcâneo esquerdo dos

animais conforme o protocolo já estabelecido na literatura[19,20]. Para lesão foi

determinado uma massa de 220g posicionada a 25 cm do tendão do animal, o

impacto da mesma possibilitou uma energia aplicada no tendão de 0,5J para

todos os animais que receberam a lesão.

Tratamentos LED e Fármaco – O comprimento de onda utilizado foi no

vermelho (luz), os parâmetros do LED estão apresentados na tabela 1. As

aplicações do LED foram iniciadas após 12hs da lesão e as demais sessões

foram com intervalos de 48 horas. As sessões de aplicação foram

63

interrompidas conforme o tempo de experimento de 7, 14 ou 21 dias após a

lesão. Os grupos definidos como DROG receberam injeção intraperitoneal (IP)

de diclofenaco de sódio no máximo 7 dias conforme posologia do fármaco. Os

animais foram imobilizados em decúbito dorsal e expostos na região abdominal

para aplicação do fármaco, a seringa utilizada para aplicação foi da marca BD

agulha com 8 mm de comprimento e 0,30 de calibre1mg/Kg/dia Lopes-Martins

(2006).

(Tabela 1)

Eutanásia e Coleta das amostras - Os animais foram eutanasiados em

câmara de CO2[21]. Para a retirada dos tendões foi realizado tricotomia e

dissecção do tendão calcâneo esquerdo. A tenotomia foi realizada na junção

miotendinosa e ostiotendinosa, o tendão foi colocado em eppendorf e

armazenado em freezer com temperatura -80° C até a realização das técnicas.

Para padronizar as eutanásias, as mesmas foram realizada sempre após 24hs

da última sessão de tratamento.

Técnicas Histológicas e análise dos dados –. Para a montagem das lâminas

foram feitos cortes congelados em criostato, os tendões foram colocados em

posição longitudinal e cortados em 7 micra de espessura na temperatura de no

mínimo –20° Celsius. Cada amostra (tendão) teve 6 cortes semisseriados e

colocados em lâminas separadas. As lâminas foram separadas da seguinte

forma; 2 lâminas coradas em Hematoxilia-Eosina (HE), 2 lâminas coradas em

Picrossírius e 2 lâminas para Imuno-histoquímica, sendo 1 lâmina (IL1-β) e 1

64

lâmina (TGF-β). Para a coloração da (HE) em corte congelado o tendão passou

pelo seguinte o protocolo; (5’ no álcool 96%, 2’ no 70%, 1’ na H2O corrente, 40’

no pricrossirius, 1’ H2O corrente, 1’ na Hematoxilina, 1’ na H2O corrente, 2’ no

álcool 70%, 2’ no álcool 96%, 2’ no álcool absoluto, 2’ no xilol e montagem da

lâmina). Para coloração em Picrossirius Red foi utilizado o protocolo (5’ no

álcool 96%, 2’ no álcool 70%, 1’ na H2O corrente, 1’,5” na Hematoxilina, 1’ na

H2O corrente, 2’ na eosina, 1’ na H2O corrente, 2’ no 70%, 2’ no álcool 96%, 2’

no álcool absoluto, 2’ no xilol e montagem da lâmina. As lâminas depois de

coradas foram fotografadas em 2 campos na área da lesão num aumento de

1000 vezes para análises celulares (HE), 400 vezes para análise de colágeno

(Picro) e 200 vezes para imunohistoquimica. Através de um microscópio de luz

e com filtro polarizador (Nikon) e no software pro Capture as imagem foram

capturadas. Para análise das fotos foi utilizado o software Imaje J para

contagem de células (na função Cell Counter) e para quantificação de colágeno

(na função Color Histogram).

Imunohistoquímica

Os anticorpos contra IL1-β e TGF-β que foram utilizados para este estudo

estão descritos na tabela 2:

(tabela 2)

65

Cortes de tecido congelado de tendão de espessura 7 µm foram colocados em

lâminas silanizadas (Sigma Chemical Co; St. Louis, Missouri, EUA). O

processo de fixação foi feito ao colocar as lâminas um banho de álcool 70° por

5 min. Em seguida, foram lavadas em água corrente, água deionizada e

deixadas em tampão fosfato pH 7,4. O bloqueio da peroxidase endógena

presente nas hemácias foi feito com água oxigenada 10v (3%), e depois de

lavado muito bem em água corrente, água destilada e tampão fosfato salino

(PBS). O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito com imersão das

lâminas em caseína diluída em tampão fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo,

Brasil) por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas

com os anticorpos primários diluídos em 1% de albumina de soro bovino (BSA)

por 1 hora à 37° C e posteriormente incubados com o anticorpo secundário

ABC kit VECTASTAIN ( Vector Laboratories – USA) por 1 hora à 37° C. O

cromógeno utilizado foi Diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim, Alemanha). Posteriormente ocorreu a contra-coloração com

Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha) para todos os casos.

Após o termino do protocolo as laminas ficaram em repouso por 48hs até

serem encaminhadas para análises. (protocolo lab imunohistoquimica do

departamento de patologia FMUSP sobe a responsabilidade Prof. Dra. Maria

Cláudia Zerbini). 4 – Coleta das imagens e analise das mesmas. As

lâminas depois de prontas foram fotografadas em 2 campos na área da

lesão num aumento de 1000 vezes para análises celulares (HE), 400

vezes para análise de colágeno (Picrossírius) e 200 vezes para

imunohistoquimica. Através de um microscópio de luz e com filtro

polarizador (Nikon) e no software (Image pro-plus) as imagem foram

capturadas para lâminas coradas em HE com ampliação de 1000x

(imersão) e lâminas coradas com picrossírius com ampliação de 400x.

Para as lâminas de imunohistoquimica foi utilizado o software IC Capture

2.2. Foi utilizado o software Image J 1.45s (National Institute of Health,

EUA) para contagem de células (na função Cell Counter) em HE e para

quantificação de colágeno em picrossírius (na função Color Histogram).

De acordo com a literatura (Montes & Junqueira, 1992), o colágeno visto

66

em vermelho sob o microscópio de polarização indica o tipo I, enquanto

visto em verde indica o tipo III. Dessa maneira, foram quantificados os

canais vermelho e verde de cada imagem fotografada sob luz polarizada

para inferir sobre os tipos de colágeno no tecido. O software utilizado

para Avaliação quantitativa da expressão de IL1- β e TGF-β nos tendões

por análise de imagem foi o Image-Pro Plus Versão 4.0 (fig.9). As

análises foram realizadas em no mínimo 50% da área total de cada

tendão, sendo em dois animais de cada grupo. Primeiramente foi

realizada a medida da área total a ser avaliada. Em seguida foi

estabelecido o padrão de imunoreatividade (o que é positivo para cada

um dos anticorpos, IL1-β e TGF-β), padrão esse utilizado para análise de

todas as lâminas. Em seguida, foi avaliada a área positiva em relação à

área total, o que nos permitiu avaliar a porcentagem de área positiva

para cada um dos marcadores estudados (IL1-β e TGF-β). Dessa forma,

os resultados foram expressos em % de área de IL1- β beta e de TGF-β

em relação à área total de cada tendão.

Descrição da estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. O

teste de D'Agostino & Pearson foi utilizado para verificar a distribuição

Gaussiana dos dados. Os dados foram analisados por meio do teste t Student

ou Mann Whitney para comparações de duas amostras independentes,

respectivamente. Além disso, análise de variancia a dois fatores (ANOVA)

seguida por Bonferroni foi empregada quando necessária. O teste de Qui-

quadrado foi empregado em análise de contingência. Nível de significância foi

fixado em p≤0,05.

67

Resultados

As imagens obtidas foram selecionadas aleatoriamente. A figura 2

representa os resultados das imagens capturadas, a imagem (A) possibilitou a

contagem de leucócitos (células positivas), já imagem (B) demonstra

maturação das fibras colágenas, a imagem (C) se observa expressão de

antígeno IL1-β e (D) expressão de antígeno TGF-β.

(Figura 2)

Tanto os animais nutridos e desnutridos apresentaram células positivas

para inflamação ao longo de 7, 14 e 21 dias de acompanhamento. Os

resultados das células positivas nos animais nutridos são apresentados nas

figuras 3 por fotomicrografia e na figura 4 nos gráficos A, B e C apresentam os

resultados dos três períodos experimentais. Para ambos os períodos se

percebeu que os grupos Tendinites apresentaram maior números de células

positivas comparadas aos demais grupos, exceto para o período experimental

de 14 dias que apresentou menor numero de células. Os grupos LED no

período experimental de 7 e 21 dias apresentaram menor número de células

comparado ao grupo Tendinite e maior numero de células comparado ao grupo

Fármaco, já para o período experimenta de 14 dias o grupo LED apresentou

maior numero de células comparado aos demais grupos (fig. 4).

(FIGURA 3)

Os resultados das células positivas nos animais desnutridos também são

apresentados nas figuras 3 por fotomicrografia e na figura 4 nos gráficos D, E e

F que apresentam os resultados dos três períodos experimentais. Os animais

desnutridos do grupo Tendinite dos três períodos experimentais (7, 14 e 21

dias) demonstram maior proporção de células positivas comparadas aos

demais grupos. Somente o grupo LED do período experimental de 7 dias

apresentou menor numero de células comparado ao grupo Fármaco, (figura 3 e

4 gráfico (D)).

68

Os animais do quadro de desnutrição de ambos os períodos

experimentais responderam aos tratamentos aplicados, se nota que os grupos

LED e Fármaco foram efetivos em reduzir a frequência de células positivas

presente na tendinite (fig. 4 (D, E, F)).

(FIGURA 4)

Os animais dos diferentes quadros nutricionais foram comparados nas

condições Controles, Tendinite, tratamento com LED e Fármaco, estão

apresentados na figura 5 (A, B e C) que apresentam resultados dos períodos

experimentais de 7,14 e 21 dias, nota-se que no período experimental de 7 dias

(A) somente os grupos Tendinite, LED e Fármaco apresentaram diferença

estatisticamente significante.

No período experimental de 14 dias (B) os grupos que apresentaram

diferença estatisticamente significante foram; grupo Tendinite desnutrido e

grupo Fármaco desnutrido que apresentaram maior números de células

positivas comparado aos seus respectivos grupos nutrido. No gráfico C que

representa o tempo experimental de 21 dias, somente os grupos Tendinite,

LED e Fármaco apresentaram diferença estatisticamente significante (p≤0,05)

(fig. 5).

(FIGURA 5)

Comparações dos resultados de Picrossírius para colágeno I de todos os

grupos nutridos x grupos desnutrido foram; O colágeno do tipo I nos grupos Basais do período experimental de 7

dias e independentemente do estado nutricional apresentaram em alta

quantidade comparado aos demais grupos, não houve diferença entre os

mesmos. O grupo Tendinite e o grupo LED nutrido a proporção de colágeno do

tipo I foi maior comparado ao respectivo grupo Tendinite e LED desnutrido,

essas comparações teve diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Os

grupos Fármaco nutrido e grupo Fármaco desnutrido não tiveram diferença.

Houve diferença estatisticamente significante (p≤0,05) quando foram

69

comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional (fig. 6 e 7

gráfico (A)).;

- grupo tendinite desnutrido apresentou redução de colágeno I

comparado ao grupo basal desnutrido;

- grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com

grupo basal e tendinite nutrido;

- grupo LED desnutrido com redução de colágeno I comparado com

grupo basal e tendinite desnutrido;

- grupo Fármaco nutrido com redução de colágeno I comparado com

grupo basal e tendinite nutrido e grupo Fármaco desnutrido com redução

de colágeno I comparado com grupo basal e tendinite desnutrido.

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7

gráfico (A)).

Para o período experimental de 14 dias o colágeno do tipo I apresentou-

se em menor quantidade no grupo Basal nutrido comparado ao grupo Basal

desnutrido e com diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Já para o

grupo Tendinite e LED nutrido tiveram um aumento exacerbado comparado ao

respectivo grupo Tendinite e LED desnutrido, essa diferença foi

estatisticamente significante (p≤0,05). O grupo Fármaco nutrido apresentou

menor quantidade de colágeno I comparado com o grupo desnutrido, essa

diferença também foi significante (p≤0,05). Também houve diferença

estatisticamente significante (p≤0,05) quando foram comparados os seguintes

grupos do mesmo quadro nutricional. Estes resultados estão apresentados nas

seguintes figuras (fig. 6 e 7 gráfico (B));

- no grupo Tendinite nutrido apresentou maior teor de colágeno I

comprado com o grupo controle nutrido e o grupo Tendinite desnutrido

(já descrito), o grupo Tendinite desnutrido apresento menor porção de

colágeno I comparado ao grupo ao grupo basal desnutrido;

- o grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com

o grupo Tendinite e com maior porção comparado ao grupo Fármaco

70

nutrido; o grupo LED desnutrido com menor porção de colágeno I

comparado com os demais grupos;

- o grupo Fármaco nutrido comparado com os grupos Controle e

Tendinite;

- o grupo Fármaco desnutrido com redução de colágeno I comparado

com os grupos Controle, Tendinite e com maior porção de colágeno

comparado ao grupo LED desnutrido.

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7

gráfico (B)).

Nos grupos experimentais do período de 21 dias, o grupo Basal e

Tendinite nutrido apresentaram maior porção de colágeno tipo I que os grupos

Basal e Tendinite desnutrido, essa diferença é significante (p≤0,05). Diferente

dos grupos Basal e Tendinite, o grupo LED apresentou menor porção de

colágeno I, mas quando comparado com o grupo LED desnutrido. O grupo

Fármaco nutrido apresentou menor teor de colágeno I comparado ao grupo

Fármaco desnutrido e não houve diferença estatisticamente significante (fig. 6

e 7 gráfico (C)).

Os grupos dos diferentes quadros nutricionais foram comparados e

apresentaram diferença estatisticamente significante (p≤0,05), sendo;

- o grupo Tendinite nutrido apresentou maior porção de colágeno I

comprado com o grupo controle e o grupo Tendinite desnutrido também

apresentou maior porção de colágeno I quando comparado ao grupo

basal desnutrido.

- o grupo LED nutrido apresentou redução de colágeno I comparado com

o grupo Basal e Tendinite nutrido e com maior porção comparado ao

grupo Fármaco nutrido; o grupo LED desnutrido apresentou menor

porção de colágeno I comparado com os grupo Basal e Tendinite

demais grupos.

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 7

gráfico (C)).

(FIGURA 6)

71

(FIGURA 7)

Comparações dos resultados de Picrossírius para colágeno III de todos os

grupos nutridos x grupos desnutrido foram;

O colágeno do tipo III no período experimental de 7 dias foram mais

abundantes no grupos desnutridos. O grupo Basal nutrido apresentou menor

quantidade comparada ao grupo Basal desnutrido, os mesmo não apresentaram diferença estatística significante. O grupo Tendinite nutrido

apresentou menor quantidade de colágeno III comparado ao grupo Tendinite

desnutrido, para esses grupos houve diferença significante (p≤0,05). O

tratamento com LED apresentou nos animais nutridos menor quantidade de

colágeno III comparado nos animais desnutridos, mas essa diferença também

não foi estatisticamente significante. Para os animais nutridos tratados com

Fármaco os mesmo apresentaram menor quantidade de colágenos III

comparado com grupo desnutrido o resultado dessa comparação teve

diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Além dos resultados já

apresentados, também houve diferença estatisticamente significante (p≤0,05)

quando foram comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional

(fig.6 e 8 gráfico (D));

- grupo Tendinite nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III

comparado ao grupo Basal nutrido;

- O grupo LED nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III

comparado ao grupo Basal e ao grupo Tendinite desnutrido;

- O grupo LED desnutrido também apresentou menor quantidade de

colágeno III comparado ao grupo Basal, grupo Tendinite a o grupo

Fármaco desnutrido;

- o grupo Fármaco nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III

comparado ao grupo Basal e grupo Tendinite nutrido Estes resultados

estão apresentados nas seguintes figuras;

72

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8

gráfico (D)).

No período experimental de 14 dias o colágeno do tipo III apresentou em

menor quantidade nos grupos Basal e Tendinite nutrido quando comparado

com o grupo Basal e Tendinite desnutrido, essa diferença foi estatisticamente

significante (p≤0,05). Os grupos que sofreram tratamento LED e Fármaco

nutrido apresentaram maior quantidade de colágeno III comparado aos grupos

LED e Fármaco desnutrido, não houve diferença significante entre os grupos.

Houve diferença estatisticamente significante (p≤0,05) quando foram

comparados os seguintes grupos do mesmo quadro nutricional (fig. 6 e 8

gráfico (E));

- o grupo Tendinite nutrido apresentou maior porção de colágeno III

comprado com o grupo basal e o grupo Tendinite desnutrido também

apresentou maior porção de colágeno III quando comparado ao grupo

basal desnutrido.

- no grupo LED nutrido apresentou menor quantidade de colágeno III

quando comparado ao grupo Basal e Tendinite nutrido e da mesma

forma foi para o grupo LED desnutrido que apresentou menor

quantidade de colágeno III quando comparado com o grupo Basal e

Tendinite desnutrido;

- A quantidade de colágeno III no grupo Fármaco nutrido foi menor

quando comparado ao grupo Basal e Tendinite nutrido e da mesma

forma foi para o grupo Fármaco desnutrido que apresentou menor

quantidade de colágeno III quando comparado com o grupo Basal e

Tendinite desnutrido;

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8

gráfico (E)).

No período experimental de 21 dias o colágeno do tipo III apresentou-se

em menor quantidade no grupo Basal e grupo Tendinite nutrido quando

comparado ao grupo Basal e grupo Tendinite desnutrido, essa diferença foi

73

estatisticamente significante (p≤0,05). Os grupos que receberam tratamento

LED e Fármaco nutrido apresentaram maior quantidade de colágeno III

comparado com o grupo LED e grupo Fármaco desnutrido, somente para a

comparação entre os grupos LED houve diferença estatisticamente significante

(p≤0,05) (fig. 6 e 7 gráfico (F)). Os grupos dos diferentes quadros nutricionais

foram comparados e apresentaram diferença estatisticamente significante

(p≤0,05), sendo;

- os animais do grupo nutrido que recebeu lesão e não foi submetido a

nenhum tipo de tratamento teve menor quantidade de colágeno III

comparado com o grupo Basal nutrido;

- os animais do grupo Tendinite desnutrido apresentaram menor

quantidade de colágeno III comparado com o grupo Basal desnutrido;

- o grupo LED nutrido apresentaram menor quantidade de colágeno do

tipo III quando comparado com o grupo Tendinite e o grupo Fármaco

nutrido;

- o grupo LED desnutrido apresentaram menor quantidade de colágeno

do tipo III quando comparado com o grupo Basal e o grupo Tendinite

desnutrido;

- os animais do grupo Fármaco nutrido apresentaram menor quantidade

de colágeno III comparado com o grupo Basal nutrido;

- o grupo Fármaco desnutrido apresentou menor quantidade de

colágeno do tipo III quando comparado com o grupo Basal e o grupo

Tendinite desnutrido;

Estes resultados estão apresentados nas seguintes figuras (fig. 6 e 8 gráfico

(F)).

(FIGURA 8)

Os resultados obtidos para expressão IL1-β do período experimental de

7 dias estão apresentados na figura 9 (A) e figura/gráfico 10. Os grupos

tendinite e fármaco apresentaram maior quantidade na expressão de IL1-β nos

tendões comparados aos grupos Basal e LED, essas diferenças foram

estatisticamente significante (p≤0,05).

74

Os resultados obtidos para IL1-β do período experimental de 14 dias

estão apresentados na figura 9 (B) e figura/gráfico 11. Os grupos tendinite de

ambos os quadro nutricional e o grupo nutrido fármaco apresentaram maior

quantidade na expressão de IL1-β nos tendões comparados aos demais

grupos, essas diferenças foram estatisticamente significante (p≤0,05).

(FIGURA 9) (FIGURA 10) (FIGURA 11)

Os resultados obtidos para TGF-β do período experimental de 7 dias

estão apresentados na figura 12 (C) e figura/gráfico 13. Os grupos tendinite e

fármaco apresentaram maior expressão de TGF-β nos tendões comparados

aos grupos Basal e LED, essas diferenças foram estatisticamente significante

(p≤0,05).

Os resultados obtidos para TGF-β do período experimental de 14 dias

estão apresentados na figura 12 (D) e figura/gráfico 14. Os grupos tendinite de

ambos quadro nutricional apresentaram maior quantidade na expressão de

TGF-β nos tendões comparados aos demais grupos, essas diferenças foram

estatisticamente significante (p≤0,05).

(FIGURA 12) (FIGURA 13) (FIGURA 14)

Discussão

O baixo consumo de proteína na dieta traz diversos problemas à saúde

[1,2,7], a desnutrição está bem elucidada na literatura, os estudos apontam os

efeitos da desnutrição no processo inflamatório [2,16]. Também esta bem

elucidada as diversas formas para induzir a desnutrição na literatura, dentre

elas foi inspirada para o presente projeto o teor de proteína de 6% [15,16].

75

A desnutrição leva o organismo ao processo degenerativo, conforme

relatado por Susse et al. [7], os tendões são alvo dessa degeneração, isso

implica o processo inflamatório levando aos 5 cinco sintomas da inflamação [2].

O processo inflamatório induzido em tendões é bem apresentado na

literatura. Ao contrario do protocolo utilizado no presente projeto também nos

deparamos com protocolos que utilizam a colagenase, criolesão e a tenotomia

para induzir a lesão em tendões[19,20,34,37].

Um dos efeitos mais discutidos na fototerapia sobre os tecidos biológicos

é a sua influência sobre o fibroblasto, síntese de colágeno, remodelamento de

tendões, melhora funcional e efeito analgésico[22]. Uma vasta literatura

demonstra o aumento da população de fibroblastos com a utilização do LASER

de baixa intensidade[23,24,25,26]. Alguns estudos demonstraram o efeito pró-

angenico da LASER terapia[27,28] também aumento da síntese de VEGF

(vascular en-dothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor),

diminuição da expressão da IL1–β e aumento TGF-β, óxido nitrico e superóxido

dismutase, os vasos sanguíneo melhora a permuta de gases, os catábolitos

são melhor eliminados e os fibroblastos mais os macrófagos migram com maior

facilidade para o reparo tecidual[29,30,31,32]. Os estudos com LED estão

demonstrando resultados semelhantes ao do LASER e outros tipo de terapias

[2,21,33,34,35,36]. A explicação para os resultados semelhantes entre LASER

e LED é que apesar da teoria da fotoquímica, os componentes da cadeia

respiratória são estimulados a comprimentos de onda eletromagnética

específicos, isso faz com que a cadeia respiratória mitocondrial aumente seu

metabolismo energético[36,37,38,39,40].

A pesquisa demonstrou por meio de análise histológica um melhor efeito

antiinflamatório no grupo tratado com LED em relação ao não tratado (grupo

tendinite) tanto nutrido como desnutrido. A questão dos grupos desnutridos já

se era esperado os resultados aqui apresentados, pois pela deficiência da

proteína é fato que o organismo não consegue sintetizar as moléculas

necessárias para regeneração tecidual[2]. Trabalhos na literatura também

relatam que o LED teve maior ação no processo inflamatório quando

comparado a grupos sem tratamento [22,23,34,41].

76

Os resultados apresentados para antígenos IL1-β e TGF-β corroboram

com os resultados apresentados na literatura [37,42]. Em ambos os grupos que

sofreram lesão dos diferentes períodos experimentais demonstraram que a

expressão de IL1- β e TGF-β foram positivos comparados aos demais grupos,

independente do quadro nutricional, então por se tratar de um período agudo

os estudos relatam um alto índice de expressão de IL1-β e TGF-β [3,37,42]. O

aumento dessas citocinas é estudado por alguns autores no processo

inflamatório, pois o aumento da IL1-β é para desencadear o processo

inflamatório enquanto o aumento do TGF-β é para inibir as células que

sintetizam a IL1-β, dessa maneira não agravando o processo inflamatório[3].

Alguns estudos que abordam o processo inflamatório e as terapias de

baixa potencia relatam que a expressão de citocinas ficam presente no tecido

por meses, porem alguns estudos abordam somente período experimental de 7

e 14 dias para verificar o efeito da terapia no processo inflamatório agudo e

semiagudo[36,37,42], isso justifica os períodos experimentais de 7 e 14 dias

abordado nesse estudo.

Os grupos LED demonstraram em ambos os períodos experimentais (7

e 14 dias) resultados satisfatório e semelhantes quando comparados com

estudos relacionados a fototerapia na literatura, ou seja menor expressão da

IL1- β e TGF- β [14,16,19,37,42]. Os grupos nutridos e desnutridos Tendinite do

período experimental de 14 dias apresentaram aumento da expressão de IL1-β,

os grupos nutrido LED, desnutrido LED e somente o grupo desnutrido Fármaco

apresentaram menor expressão e essa diferença foi estatisticamente

significante, exceto o grupo nutrido Fármaco que demonstrou expressão de

IL1-β significativa aumentada. Este resultado merece mais estudos, pois o que

se observa na literatura é a diminuição da expressão do IL1-β quando é

utilizado o diclofenaco no período experimental de 14 dias [37,38].

O tratamento com LED apresentou resultados positivos no processo

inflamatório, dessa forma o estudo corrobora com autores que já relataram a

diminuição das citocinas inflamatórias e expressão de citocinas

antiinflamatórias [22,34,35,36,37,41,43]. Dessa maneira a investigação do LED

no processo inflamatório vem sendo relatados com efeitos positivos.

77

Conclusão

A terapia LED mesmo em condições de desnutrição teve efeitos

antiinflamatórios e de reparação tecidual. Nesse caminho podemos concluir

que o LED de baixo potencia teve ações positivas sobre maturação das fibras

colágenas e o processo inflamatório em animais nutridos e desnutridos. A

terapia com fármaco também teve resultados positivos nos animais nutridos e

desnutridos, porém como já descritos na literatura os efeitos indesejáveis que o

mesmo pode causar.

Agradecimentos

Fapesp proc. 2011/05890-9, UNINOVE.L e Laboratório de Investigação

Médica (LIM 59), FMUSP.

Referências do Artigo 2 [1] Barker, D.J., Bull, A.R., Osmond, C., Simmonds, S.J. (1990) “Fetal and placental size and risk of hypertension in adult life”. BMJ 301, 259-262. [2] Carvalho, P.T.C., Silva, I.S., Reis F.A. et. al. (2006) “Histological study of tendon healing in malnourished Wistar rats treated with ultrasound therapy”. Acta Cirúrgica Brasileira; -13 – Vol. 21 (Suplemento 4). [3] Choi, M.S., Yoo, M.S., Son, D.J., Jung, H.Y., LEE, S.H., Jung, J.K., Lee, B.C., Yun, Y.P., Pyo, H.B., Hong, J.T. Increase of collagen synthesis by obovatol through stimulation of the TGF-b signaling and inhibition of matrix metalloproteinase in UVB-irradiated human fibroblast. Journal of Dermatological Science, v. 46, 127-137, 2007. [4] Barker, D.J., Gluckman, P.D., Godfrey, K.M., Harding, J.E., Owens, J.A., Obinson, J.S. (1993) “Fetal nutrition and cardiovascular disease in adult life”. Lancet 341, 938-941. [5] Perez, A.C., Matos, D., Monteiro, E.F.S., Souza, H.S., Barbosa, F.C.P., Saad, F., Dip, N. (2005) “Effects of sodium hyaluronate and carboxymethcellulose membrane on collagen and fibroblast formation in bowel suture healing: experimental study in rats”. Acta Cir. Bras., v.20, n.1, p.15-21. [6] Stahl, L., Ashworth, S.H., Jandt, K.D., Mills R.W. (2000), “Light-emitting diode (led) polymerization of dental composites: flexural properties and polymerization potential”. Biomaterials; v.21,p.1379-1389. [7] Susse, E., David, S., Clair D.S., He, L.I. (2008), “Latent Effects Of Prenatal Malnutrition On Adult Health”. Annals of the new york academy of sciences. 1136: 185–192. [8] Medeiros, I.S. (2001), “Dispositivos LED para polimerização de resinas compostas dentais: comparação com outra fonte de luz”. (Dissertação). Universidade de São Paulo.

78

[9] Arruda, E.R.B, Rodrigues, N.C., Taciro, C., Parizzotto, N.A. (2007), “Influência de diferentes comprimentos de onda da laserterapia de baixa intensidade na regeneração tendínea do rato após tenotomia”. Rev. Bras. Fisioter; São Carlos, v. 11, n. 4, p. 283-288, jul./ago. [10] Bertolini, G.R.F., Silva, T.S., Ciena, A.P., Trindade D.L. (2008), “Efeitos do Laser de Baixa Potência Sobre a Dor e Edema no Trauma Tendíneo de Ratos”. Rev. Bras. Med. Esporte; – Vol. 14, No 4 – Jul/Ago, [11] Buso, N.C., Villaverde, A.G.J., Salgado, M.A.C., Barbosa, A.M. (2006), “Avaliação do laser Arseneto de Gálio (904nm) no processo de cicatrização do tendão de Aquiles em ratos”. Encontro latino americano de pós-graduação univap, 6, 2006, São José dos Campos. Anais, Univap, p. 232-235. [12] Carrinho, P.M., Renno A.C.M., Koeke, P., Salate, A.C.B., Parizotto, N.A., VIDAL, B.C. (2006), Comparative study using 685-nm and 830-nm Lasers in the tissue repair of tenotomized tendons in mouse. Photomed. Laser Surg. v.24, n.6, p.754-758. [13] Salate, A.C.B. (2002), “Síndromes, por overuse em tendão de calcâneo”. Fisioter. brás; V.3, N.6, P.351-355,. [14] Lopes-Martins RA, Marcos RL, Leonardo PS, Prianti AC Jr, Muscará MN, Aimbire F, Frigo L, Iversen VV, Bjordal JM. Effect of low-level laser (Ga-Al-As 655 nm) on skeletal muscle fatigue induced by electrical stimulation in rats. J Appl Physiol. 2006;101(1): 283- 288. [15] Latorraca, M.Q., Gobatto, C.A., Carneiro, E.M, Galdino, R..S., Sibuya, C.Y, Mello, M.A.R. (1998), “Descrição de dieta purificada para indução de quadro de desnutrição protéica em ratos”. Rev. Bras. Med. Esporte. 4: 9-12. [16] Alves CR, Voltarelli FA, Mello MAR. Spirulina como fonte protéica na recuperação de ratos desnutridos: efeitos sobre o músculo esquelético. Revista Digital - Buenos Aires. Ano10, n°86. 2005. [17] Damy, S.B., Camargo, R.S., Chammas, R., Figueiredo, L.F.P. (2010), “Aspectos fundamentais da experimentação animal - aplicações em cirurgia experimental”. Rev Assoc Med Bras; 56(1): 103-11. [18] Massone, F. (1994), “Anestesiologia Veterinária: Farmacologia e Técnicas”. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,. 107p. [19] Joensen J, Gjerdet NR, Hummelsund S, Iversen V, Lopes-Mar RA, Bjordal JM. An experimental study of low-level laser therapy in rat Achilles tendon injury. Lasers Med Sci. 2011. [20] Salate, A.C.B., Barbosa G., Gaspar P., Koeke P.U., Parizotto N.A., Benze B.G., Foschiani, D. (2005), “Effect of In-Ga-Al-P Diode Laser Irradiation on Angiogenesis in Partial Ruptures of Achilles Tendon in Rats. Photomedicine and Laser Surgery Mary Ann Liebert, Inc V 23, N 5, Pp. 470–475. [21] Chorilli, M., Michelin, D.C., Salgado, H.R.N. (2007), ”Animais de laboratório: o camundongo”. Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl., v. 28, n.1, p.11-23. [22] Silva, J.M.N., de Carvalho, J.P., Júnior, M.J.M (2011), “Estudo morfométrico da terapia LED de baixa potência em tendinite de ratos”. Fisioterapia e Pesquisa, São Paulo, v.18, n.4, p. 365-70. [23] Taciro, C., Serikawa, M.A., Parizotto N.A. (2007), “Aspectos Nanoestruturais Do Colágeno No Processo De Regeneração Tendínea Estimulada Por Laser De Baixa Intensidade – Estudo Piloto” Fisioterapia Especialidades – V. 1 – N. 1, p. 21-24.

79

[24] Enwemeka, C. S. (1989), “Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Physical Therapy”. v. 69, n. 10, p. 816-825. [25] Enwemeka, C.S., Rodriguez, O.O., Gall, N.G., Walsh, N.E. (1998) “Morphometrics of collagen fibril populations in HeNe la -ser photostimulated tendons”. J. Clin. Laser Med. Surg.. 47-62. [26] Enwemeka, C.S. (1991) “Connect tissue plasticity: ultra-struc -tural, biomechanical, and morphometric effects of physical fac -tors on intact and regenerating tendons”. J. Orth. Sports phys. Ther. 14 (5) 198-212. [27] Roubenoff, R., Harris, T.B., Abad, L.W. (1998) “Monocyte cytokine production in an elderly population: effect of age and inflammation”. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 53, 20-26. [28] Chakravarti, B., Abraham, G.N. (1999) “Aging and T-cell-mediated immunity”. Mech Ageing Dev 108, 183-206. [24] 28. Mirsky, N., Krispel, Shoshany, Maltz, and Oron, U. (2002) Promotion of Angiogenesis by Low Energy Laser Irradiation. An -tioxidants & Redox Signaling. 4 (5), 785-790. [29] Chow, R.T., Barnsley, L. (2005) “Systematic Review of the Literature of Low-Level Laser Therapy (LLLT) in the Manage -ment of Neck Pain”. Lasers Sur. Med. 37, 46–52. [30] Klebanov, G.I., Poltanov, E.A., Chichuk, T.V., Osipov, A.N. and Vladimirov, Y.A. (2005) ''Changes in Superoxide Dismutase Activity and Peroxynitrite Content in Rat Peritoneal Macrophag -es. Exposed to He_Ne Laser Radiation Biochemistry (Moscow)''. 70 (12), 1335-1340. [31] Fujimaki, Y., Shimoyama, T., Liu, Q., Umeda, T., Nakaji, S., Sugawara, K. (2003) ''Low-Level Laser Irradiation Attenuates Production of Reactive Oxygen Species by Human Neutrophils''. Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery. [32] Tuby, H., Maltz, L., Oron, U. (2006) “Modulations of VEGF and iNOS in the rat heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and enhanced angiogenesis”. Lasers Surg. Med., article In press. [33] D`Amore, P.A. and Thompson, R.W. (1987) ''Mechanism of angiogenesis''. Ann. Rev. Physiol 49, 453 – 64. [34] Casalechi, H.L, Nicolau, R.A.; Casalechi, V.L.; Silveira-Júnior, L., Paula, A.M.B., Pacheco, M.T.T. (2009) ''The effects of low level light emitting diode on the repair process of Achilles tendon therapy in rats''. Lasers Med. Sci., v.24, p.659-665. [35] Dall Agnol, M.A., Nicolau, R.A., Lima, C.J., Munin, E. (2009) “Comparative analysis of coherent light action (laser) versus non-coherent light (light-emitting diode) for tissue repair in diabetic rats''. Lasers Med. Sci., v.24, p.909-916. [36] Lim, W. Lee, S. Kim, I. Chung, M. Kim, M. Lim, H. Park, J. Kim, O. Choi, H. (2007) ''The Anti-Inflammatory Mechanism of 635 nm Light-Emitting-Diode Irradiation Compared With Existing COX Inhibitors''. Lasers Surg. Méd., v.39, p.614-621. [37] Xavier, M., David, D.R., Souza, R.A., Arrieiro, A.N., Miranda, H., Santana, E.T., Silva, J.A. Jr., Albertini. R. (2011) “Anti-inflammatory effects of low-level light emitting diode therapy on Achilles tendinitis in rats”. Lasers Surg Med, (Epub ahead of print).

80

[38] Karu, T.I., Pyatibrat, L.V. and Afanasyeva, N.I. (2005) “Cel -lular effects of low power laser therapy can be mediated by nitric oxide. Lasers Surg. Med. 36, 307–314. [39] Mohammed Ihsan, F.R. (2005) “Low-level laser therapy ac -celerates collateral circulation and enhances microcirculation. Photomedicine and Laser Surgery”. 23, (3), 289–294. [40] Yu, W., Naim, J.O., Lanzafame, R.J. (1994) “The effect of laser irradiation on the release of bFGF from 3T3 fibroblasts”. Photo -chem Photobiol;59, 167–170. [41] Vinck E.M, Cagnie B.J, Cornelissen M.J, Declercq H.A, Cambier D.C. (2003) “ Increased fibroblast proliferation induced by light emitting diode and low power laser irradiation”. Lasers Med Sci.;18(2):95-9. [42] Fewinck, S. A.; CURRY, V.; HARRALL, R. L.; HAZLEMAN, B. L.;HACHENY, R.; RILEY, G. P. (2001); Expression of transforming growth factor-beta isoforms and their receptors in chronic tendinosis. J. Anat., v.199, p 231-240. [43] ALBERTINI, R.; AIMBIRE, F.; VILLAVERDE, A.B.; SILVA, J.A. JR.; COSTA, M.S.; COX-2 mRNA expression decreases in the subplantar muscle of rat paw subjected to carrageenan-induced inflammation after low level laser therapy. Inflamm Res. 2007; 56(6):228. [43] MONTES, G.S. & JUNQUEIRA L.C.U.; The use of the Picrosirius - polarization method for the study of the biopathology of collagen. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 1992.

FIGURA 1 – Desenho experimental dos animais nutridos e desnutridos, o grupo basal não recebeu nenhum tipo de experimento, o grupo Tendinite não recebeu nenhum tratamento, já os grupos LED e Fármaco também foram expostos à lesão e inicio do tratamento foi 12hs após a lesão, para o grupo LED as sessões de tratamento foram entre 48hs até eutanásia, para o grupo Fármaco as sessões de aplicação do fármaco foram entre 12hs até 7 dias, conforme a

81

posologia da droga. Os animais de ambos os grupos foram eutanasiados conforme os períodos experimentais de 7, 14 e 21 dias.

Tabela 1. Parâmetros do LED (Light Emitting Diode). A densidade de energia

(DE) é dada por AEDE = ou

AtPDE .

= , cuja unidade é [J/cm2], onde E é a

energia [Joule], A é a área [cm2], P é a potência [Watt] e t é o tempo [segundo].

Informações LED

Parâmetros Variáveis

Densidade de Energia 2.04 J/cm2

Comprimento de onda 640 nm

Potência 96 mW

Área determinada (spot) 3,30 cm2

Tempo de aplicação 70 s

Técnica Contato

Figura 2. Fotomicrografia de tendões de ratos desnutridos. A imagem (A) possibilitou a contagem de células (1000x), já imagem (B) demonstrou o alinhamento das fibras colágenas (400x) e a imagem (C) a visualização de antígeno IL1- β (200x) e (D) a visualização de antígeno TGF- β (200x).

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Tabela 2 - Anticorpos utilizados no estudo da imunohistoquimica

ANTICORPO DILUIÇÃO ORIGEM

TGF BETA 1/500 SANTA CRUZ

IL 1 BETA 1/200 SANTA CRUZ

Figura 3 – Fotomicrografia do tendão de ratos nutridos e desnutridos. As imagens foram capturadas no aumento de 1000x, as mesmas estão com barra de escala de 100 micra. As abreviações CI são referentes a Células leucocitárias e FB são referentes a fibroblasos. As imagens apresentadas ilustram os três periodos experimentais.

83

Figura 4. Proporção de leucócitos (células positivas) para inflamação nos grupos nutridos e desnutridos ao longo de 7, 14 e 21 dias de acompanhamento. O teste de qui-quadrado (4x2) foi aplicado para as comparações dentro de cada condição nutricional para os respectivos períodos. Em animais nutridos, a proporção de células positivas para inflamação foi significativamente elevada somente para o período de 7 dias (p=0,0005). Entretanto, animais desnutridos apresentaram proporções significativamente elevadas em relação aos demais grupos para todos os períodos (p<0,0001). Notável foi à observação que os diferentes tratamentos foram eficazes em diminuir a presença de células positivas para inflamação.

Figura 5. Proporção de Leucócitos (células positivas) para inflamação do grupo nutrido comparado ao grupo desnutrido em animais controle, tendinite, LED e Fármaco, respectivamente. As Figuras A, B e C ilustram resultados de 7, 14 e 21 dias de segmento, respectivamente. O teste de qui-quadrado (tabela 2x2) foi aplicado para as comparações entre nutridos e desnutridos.

84

FIGURA 6 – Fotomicrografia em 400x do tendão de ratos com coloração em pricrossírius para quantificação de colágeno I (vermelho) e colágeno III (verde). Foi determinado barra de escala de 100 µm. As imagens apresentadas de cada grupo representam todos os períodos experimentais, pois os resultados são semelhantes. As distribuições dos grupos estão apresentadas conforme respectivas letras. As imagens A, C, E e G são referentes aos grupos nutridos e as imagens B, D, F e H são referentes aos grupos desnutridos.

Figura 7. Os gráficos apresentam os resultados da quantificação das fibras

colágenas do tipo I. Os gráficos A, B e C representam os três períodos

experimentais (7, 14 e 21 dias), para comparação entre os grupos foi

determinado # para os grupos Controle, S para os grupos Tendinite, * para

os grupos droga e quando apresentados o resultado foi estatisticamente

significante (p≤0.05) e NS para não significante. ANOVA duas vias

complementada por Bonferroni foi utilizado para comparações.

Figura 8. Os gráficos apresentam os resultados da quantificação das fibras colágenas do tipo III. Os gráficos D, E e F também representam os três períodos experimentais (7, 14 e 21 dias), para comparação entre os grupos foi determinado também foi determinado # para os grupos Controle, S para os grupos Tendinite, * para os grupos droga e quando apresentados o resultado foi estatisticamente significante (p≤0.05) e NS para não significante. ANOVA duas vias complementada por Bonferroni foi utilizado para comparações.

85

FIGURA 9 - Fotomicrografia de imunohistoquimica da expressão de IL1-β dos tendões de ratos. As imagens foram capturadas no aumento 200x, a barra de escala determinada foi de 100 micra. Na prancha (A) estão apresentados as imagens dos animais do período experimental de 7 dias e na prancha (B) estão apresentados as imagens dos animais do período 14 dias.

FIGURA 10 - Expressão de IL1-β nos grupos desnutridos e nutridos do período experimental de 7 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante (p≤0,05) nos grupos Tendinite e Fármaco quando comparados aos demais grupos.

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FIGURA 11 - Expressão de IL1-β nos grupos desnutridos e nutridos do período experimental de 14 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante (p≤0,05) nos grupos Tendinite e no grupo nutrido Fármaco quando comparados aos demais grupos.

Figura 12 - Fotomicrografia de imunohistoquimica da expressão de TGF-β dos tendões de ratos. As imagens foram capturadas no aumento 200x, a barra de escala determinada foi de 100 micra. Na prancha (C) estão apresentados os animais do período experimental de 7 dias e na prancha (D) estão apresentados os animais de 14 dias.

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FIGURA 13 - Expressão de TGF-β nos grupos desnutridos e nutridos do período experimental de 7 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante (p≤0,05) somente nos grupos desnutrido e nutrido Tendinite.

FIGURA 14 13 - Expressão de TGF-β nos grupos desnutridos e nutridos do período experimental de 14 dias. Observa-se diferença estatisticamente significante (p≤0,05) nos grupos desnutridos e nutridos Tendinite quando comparados aos demais grupos.

88

5. Considerações Finais

Quando há um processo inflamatório no organismo o mesmo passa por

diversas cascatas de reação, o envolvimento de células e migração das

mesmas aumentam exacerbamente. No quadro de desnutrição, os resultados

deste trabalho mostraram que essa mobilização de célula inflamatória é ainda

maior. Entretanto, nossos resultados mostraram que apesar do quadro de

desnutrição os LED apresentou resultados anti-inflamatorios, sendo um recurso

importante para o processo de reabilitação.

89

6. Referências

AIGNER, T.; SOEDER, S.; HAAG, J.; IL-1beta and BMPs- interactive players of

cartilage matrix degradation and regeneration. Eur Cell Mater, 2006; 26(12):49-

56.

ALBERTINI, R.; AIMBIRE, F.; VILLAVERDE, A.B.; SILVA, J.A. JR.; COSTA,

M.S.; COX-2 mRNA expression decreases in the subplantar muscle of rat paw

subjected to carrageenan-induced inflammation after low level laser therapy.

Inflamm Res. 2007; 56(6):228.

ALBUQUERQUE, J.V.R.S.; Avaliação dos efeitos do estresse nutricional

promovido pelo déficit protéico pós-desmame sobre o sistema cardiovascular

de ratos (dissertação). 2009.Universidade Federal de Ouro Preto.

ALVES, A. P.; DÂMASO, A. R.; DAL, P. V.; Efeito da desnutrição protéica pré e

pós-natal sobre a morfologia, a diferenciação e o metabolismo do tecido

muscular estriado esquelético em ratos

ALVES, C.R.; VOLTARELLI, F.A.; MELLO, M.A.R.; Spirulina como fonte

protéica na recuperação de ratos desnutridos: efeitos sobre o músculo

esquelético. Revista Digital - Buenos Aires. 2005 Ano10, n°86.

AMARAL, D.A.; Avaliação Bioquímica, Nutricional e Cardiopulmonar de Ratos

Recuperados de uma Desnutrição Protéica (dissertação) 2005. Universidade

Federal de Ouro Preto.

AMERICAN INSTITUTE OF NUTRITION (AIN), AIN-93.; Purified diets for

laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc

writing committee on the reformulation of the AIN-76-A rodent diet. J Nutr 1993;123:1939-51.

90

ANDRADE, M.F.; RASTELLI, A.S.; SAAD, R.S., SAAD, J.R.C.; Avaliação de

capacidade de polimerização de um novo dispositivo a base de LED á bateria.

J. Am. Dent. Assoc. 2001, v.4, p.372-376.

ANSEL, K.M.; LEE, D.U.; RAO, A.; An epigenetic view of helper T cell

differentiation. Nat Immunol. 2003; 4:616-23.

ARAÚJO, K.S.; Efeito da Terapia com LED operando em baixa potência sobre

a reparação óssea de ratos – análise por espectroscopia Raman. 2009.

Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) 2009. São José dos Campos:

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba,

São Paulo;

ARRUDA, E.R.B.; RODRIGUES, N.C.; TACIRO, C.; PIRIZZOTTO, N.A.;

Influência de diferentes comprimentos de onda da laserterapia de baixa

intensidade na regeneração tendínea do rato após tenotomia. Rev. Bras. Fisioter 2007; São Carlos, v. 11, n. 4, p. 283-288, jul./ago..

ATREYA, R.; MUDTER, J.; FINOTTO, S.; MULLBERG, J.; JOSTOCK, T.;

WIRTZ, S.; SCHUTZ, M.; BARTSCH, B.; HOLTMANN, M, BECKER C.

Blockade of interleukin-6 trans-signaling suppresses T-cell resistance against

apoptosis in chronic intestinal inflammation: evidence in Crohn's disease and

experimental colitis in vivo. Nat Med. 2000; 6:583-588.

BARKER, D.J.; BULL, A.R.; OSMOND, C.; SIMMONDS, S.J.; Fetal and

placental size and risk of hypertension in adult life. BMJ(1990) 301, 259-262.

BARKER, D.J.; GLUCKMAN, P.D.; GODFREY, K.M.; HARDING, J.E.; OWENS,

J.A.; OBINSON, J.S.; Fetal nutrition and cardiovascular disease in adult life.

Lancet 341(1993). 938-941.

91

BASTOS, J.L.N.; LIZARRELLI, R.F.Z.; PARIZZOTTO, N.A.; Comparative study

of laser and LED Systems of Low Intensity Applied to Tendon Healing. Laser Phys, 2009, v.19, n.9, p.1925-1931.

BAXTER, D.G.; Therapeutic. Lasers: Theory e and Practice. New York,

Churchill Livingstone. 1994.

BERTOLINI, G.R.F.; SILVA, T.S.; CIENA, A.P.; TRINDADE, D.L.; Efeitos do

Laser de Baixa Potência Sobre a Dor e Edema no Trauma Tendíneo de Ratos.

Rev. Bras. Med. Esporte, 2008; – Vol. 14, No 4 – Jul/Ago,

BEVILACQUA, I.M.; NICOLAU, R.A.; KHOURI, S.; BRUGNERA, A.J.R.;

TEODORO, G.R.; ZÂNGARO, R.A.; The impact of photodynamic therapy on

the viability of Streptococcus mutans in a planktonic culture. Photomed Laser Surg. 2007;25(6):513-8.

BOYLE, D.L.; JONES, T.L.; HAMMAKER, D.; SVENSSON, C.L.;

ROSENGREN, S.; ALBANI, S.; SORKIN, L.; FIRESTEIN, G.S.; Regulation of

peripheral inflammation by spinal p38 MAP kinase in rats. PloS Med, 2006;

3(9):e338.

BRADDOCK, M.; QUINN, A.; Target IL-1 in inflammatory disease: new

opportunities for therapeutic intervention. Nat Rev Drug Discov. 2004;

3(4):330-339.

BUSO, NC.; VILLAVERDE, A.G.J.; SALGADO, M.A.C.; BARBOSA, A.M.;

Avaliação do laser Arseneto de Gálio (904nm) no processo de cicatrização do

tendão de Aquiles em ratos. ENCONTRO LATINO AMERICANO DE PÓS-GRADUAÇÃO UNIVAP, 6, 2006, São José dos Campos. Anais, Univap, 2006.

p. 232-235.

BURKE, R.E.; TSARIS, P.; The correlation on physiological properties with

histochemical characteristics in single muscle units. Ann N Y Acad S'ci 228:145,

92

1974.

CARRINHO, P.M.; RENNO, A.C.M.; KOEKE, P.; SALATE, A.C.B.;

PARIZOTTO, N.A.; VIDAL, B.C.; Comparative study using 685-nm and 830-nm

Lasers in the tissue repair of tenotomized tendons in mouse. Photomed. Laser Surg. 2006, v.24, n.6, p.754-758.

CARVALHO, P.T.C.; SILVA, I.S.; REIS, F.A.; Histological study of tendon

healing in malnourished Wistar rats treated with ultrasound therapy. Acta Cirúrgica Brasileira 2006; -13 – Vol. 21 (Suplemento 4).

CASALECHI, H.L.; NICOLAU, R.A.; CASLECHI, V.L.; SILVEIRA, J.R.L.;

PAULA, A.M.B.; PACHECO, M.T.T.; The effects of low level light emitting diode

on the repair process of Achilles tendon therapy in rats. Lasers Med. Sci. 2009;

v.24, p.659-665.

CHAN, B.P.; CHAN, K.M.; MAFFULLI, N.; WEBB, S.; LEE, K.K.H.; Effect of

basic fibroblast growth factor: an in vitro study of tendon healing. Clin. Orthop. Relat. Res. 1997, v.342, p.239-247.

CHAVES, M.G.; MELLO, M.A.R.; Metabolismo glicídico em músculo estriado

esquelético de ratos em repouso submetidos à restrição protéica alimentar.

Alim. Nutr. 2003, Araraquara, v. 14, n. 1, p. 97-101,

CHAKRAVARTI, B.; ABRAHAM, G.N.; “Aging and T-cell-mediated immunity”.

Mech Ageing Dev 108, 183-206. [24] 28. Mirsky, N., Krispel, Shoshany,

Maltz, and Oron, U. (2002) Promotion of Angiogenesis by Low Energy Laser

Irradiation. An-tioxidants & Redox Signaling. 4 (5), 785-790.

CHORILLI, M.; MICHELIN, D.C.; SALGADO, H.R.N.;”Animais de laboratório: o

camundongo”. Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl. (2007),, v. 28, n.1, p.11-23.

93

CONTRAN, R.S.; KUMAR, V.; COLLINS, T.; Patologia Estrutural e Funcional.

6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000;1485 p.

CHOW, R.T.; BARNSLEY, L.; “Systematic Review of the Literature of Low-

Level Laser Therapy (LLLT) in the Manage -ment of Neck Pain”. Lasers Sur. Med. (2005) 37, 46–52.

DALL, A.M.A.; NICOLAU, R.A.; LIMA, C.J.; MUNIN, E.; “Comparative analysis

of coherent light action (laser) versus non-coherent light (light-emitting diode)

for tissue repair in diabetic rats''. Lasers Med. Sci. (2009), v.24, p.909-916.

DAMY, S.B.; CAMARGO, R.S.; CHAMMAS, R.; FIGUEIREDO, L.F.P.;

“Aspectos fundamentais da experimentação animal - aplicações em cirurgia

experimental”. Rev Assoc Med Bras; (2010), 56(1): 103-11

DOBBING, J.; Malnutrition et développement du cerveau. La Recherche 1976;

7: 139-46.

DONG, C.; Diversification of T-helper-cell lineages: finding the family root of IL-

17-producing cells. Nat Rev Immunol. 2006; 6:329-33.

D`AMORE, P.A.; THOMPSON, R.W.; ''Mechanism of angiogenesis''. Ann. Rev. Physiol(1987) 49, 453 – 64.

ENWEMEKA, C.S.; Inflamation, cellurarity and fibrillogenesis in regeneration

tendon: Implications for tendon rehabilitation. Phys. Ther. 1989, v.69, n.10,

p.816-825.

ENWEMEKA, C.S.; “Connect tissue plasticity: ultra-struc -tural, biomechanical,

and morphometric effects of physical fac -tors on intact and regenerating

tendons”. J. Orth. Sports phys. (1991) Ther. 14 (5) 198-212.

94

ENWEMEKA, C.S.; RODRIGUEZ, O.O.; GALL, N.G.; WALSH, N.E.;

“Morphometrics of collagen fibril populations in HeNe la -ser photostimulated

tendons”. J. Clin. Laser Med. (1998) Surg.. 47-62.

FARIA, E.T.B.; Estudo dos efeitos da terapia com luz coerente e não coerente

sobre a reparação tendínea através da espectroscopia Raman e análise

histopatológica. 2006. Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) 2006. São

José dos Campos: Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade

do Vale do Paraíba, São Paulo;.

FERREIRA, M.M.; SCIALOM, J.M.; CAMPOS, A.D.; RAMALHO, L.L.Z.;

MARCHINI, J.S.; FÉRES, O.; ROCHA, J.J.R.; Efeito da Desnutrição na

Cicatrização de Anastomoses Colônicas: Estudo Experimental em Ratos. Rev

bras Coloproct, 2006;26(3): 239-243.

FONG, Y.; LOWRY, S.F.; Tumor necrosis factor in the pathobiology of infection

and sepsis. Clin Immunol Immunopathol. 1990; 55(2): 157-170.

FUJIMAKI, Y.; SHIMOYAMA, T.; LIU, Q.; UMEDA, T.; NAKAJI, S.; SUGAWARA,

K.; ''Low-Level Laser Irradiation Attenuates Production of Reactive Oxygen

Species by Human Neutrophils''. Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery. (2003)

FROTA, M.A.; SOUSA, R.M.V.; FILHO, O.A.S.; BARROSO, M.G.T.;

Diagnóstico das necessidades humanas básicas no contexto sócio familiar de

crianças desnutridas. Cogitare Enfermagem 2007 12(2):198-203.

FROTA, M.A.; ALBUQUERQUE, C.M; LINARA, A.G.; Educação popular em

saúde no cuidado à criança desnutrida. Texto Contexto Enfermagem 2007

16(2):246-53.

HEGSTED, D.M.; YET-OY, C.;. Protein utilization in growing rats at different

levels of intake. Journal of Nutrition, v. 87, n. 1, p. 19-25, 1967.

95

JAQUES C, GOSSET M, BERENBAUM F, GABAY C. The role of IL-1 and IL-

1Ra in joint inflammation and cartilage degradation. Vitam Horm. 2006; 74:371-

403.

JOENSEN J, GJERDET NR, HUMMELSUND S, IVERSEN V, LOPES-MAR

TINS RA, BJORDAL JM. “An experimental study of low-level laser therapy in rat

Achilles tendon injury. Lasers Med Sci”. (2011).

JUNQUEIRA LC & CARNEIRO J. Histologia básica. 10. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2004; p. 92-124.

KARU TI. Cellular mechanism of low power laser therapy. In: SIMUNOVIC, Z.

(org.). Karu Tiina. Lasers in medicine and dentistry: basic science and up-to-

date clinical application of Low Energy-Level Laser Therapy - LLLT . Croatia: Vitagraf, 2000; p.79-100.

KARU TI, Pyatibrat LV, Afanasyeva NI “Cel -lular effects of low power laser

therapy can be mediated by nitric oxide. Lasers Surg. Med. (2005) 36, 307–

314.

KAPLANSKI G, MARIN V, MONTERO-JULIAN F, MANTOVANI A.,

FARNARIER C. IL-6: a regulator of the transition from neutrophil to monocyte

recruitment during inflammation. Trends Immunol. 2003; 24:25-29.

KHAN, K., COOK, J., MAFFULLI, N. - Where is the pain coming from in

tendinopathy? It may be biochemical, not only structural, in origin. Leader

article. Br J Sports Med nº 34 (2000), pp.81-83.

KLEBANOV, GI, POLTANOV EA, CHICHUK TV, OSIPOV AN, VLADIMIROV

YA. ''Changes in Superoxide Dismutase Activity and Peroxynitrite Content in

Rat Peritoneal Macrophag -es. Exposed to He_Ne Laser Radiation

Biochemistry (Moscow)'' (2005). 70 (12), 1335-1340.

96

KURACHI C, TUBOY AM, MAGALHÃES DV, BAGNATO VS. Hardness

evaluation of a dental composite polymerized with experimental led-based

devices. Dental Materials, 2001; v.17, p.309-315.

LATORRACA MQ, GOBATTO CA, CARNEIRO EM, GALDINO RS, SIBUYA

CY, MELLO MAR. (1998), “Descrição de dieta purificada para indução de

quadro de desnutrição protéica em ratos”. Rev. Bras. Med. Esporte. 4: 9-12.

LIM W. LEE S, KIM I, CHUNG M, KIM M, LIM H, PARK J, KIM O, CHOI H. ''The

Anti-Inflammatory Mechanism of 635 nm Light-Emitting-Diode Irradiation

Compared With Existing COX Inhibitors''. Lasers Surg. Méd (2007)., v.39,

p.614-621.

LOCHS H, ALLISON SP, MEIER R, PIRLICH M, KONDRUP J, SCHNEIDER S.

Introductory to the ESPEN Guidelines on Enteral Nutrition: Terminology,

definitions and general topics. Clin.Nutr. 2006., v. 25, n. 2, p. 180-186.

LOPES-MARTINS RA, MARCOS RL, LEONARDO PS, PRIANTI AC JR,

MUSCARÁ MN, AIMBIRE F, FRIGO L, IVERSEN VV, BJORDAL JM. Effect of

low-level laser (Ga-Al-As 655 nm) on skeletal muscle fatigue induced by

electrical stimulation in rats. J Appl Physiol. 2006;101(1): 283- 288.

LOPEZ-ARMADA MJ, CARAMES B, LIRES-DEAN M, CILLERO-PASTOR B,

RUIZ-ROMERO C, GALDO F, BLANCO FJ. Cytokines, tumor necrosis factor-

alpha and interleukin-1beta, diferentially regulate apoptosis in osteoarthritis

cultured human chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 2006; 14(7):660-669.

MACHADO MVM, VULCANO LC, HUSSNI CA, ALVES LG. Efeito da

laserterapia em tendinite experimental no tendão flexor digital superficial em

eqüinos: Estudo histológico e ultrasonográfico, Arch. Vet. Sci. 2000; v.5,

p.111-115.

97

MONK JM, STEEVELS TAM., HILLYER LM, WOODWARD B. Constitutive, but

Not Challenge-Induced, Interleukin-10 Production Is Robust in Acute Pre-

Pubescent Protein and Energy Deficits: New Support for the Tolerance

Hypothesis of Malnutrition-Associated Immune Depression Based on Cytokine

Production in vivo. Int. J. Environ. Res. Public Health 2011, 8, 117-135;

doi:10.3390/ijerph8010117.

MOHAMMED, IFR. “Low-level laser therapy ac -celerates collateral

circulation and enhances microcirculation”. Photomedicine and Laser Surgery (2005). 23, (3), 289–294.

MONTES, G.S. & JUNQUEIRA L.C.U. The use of the Picrosirius - polarization

method for the study of the biopathology of collagen. Mem. Inst. Oswaldo Cruz,

1992.

NAKAMURA H., MASUKO Y.K., KATO T., NISHIOKA K. Effects of celecoxib on

human chondrocytes- enhanced production of chemokines. Clin Exp Rheumatol, 2007; 25(1):11-16.

ROUBENOFF R., HARRIS T.B., ABAD L.W. “Monocyte cytokine production in

an elderly population: effect of age and inflammation”. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. (1998) 53, 20-26.

SALATE A.C.B. Sindromes por overuse em tendão de calcâneo. Fisioter. brás,

2002; V.3, N.6, P.351-355,.

SALATE A.C.B., BARBOSA G., GASPAR P., KOEKE P.U., PARIZOTTO N.A.,

BENZE B.G., FOSCHIANI D. “Effect of In-Ga-Al-P Diode Laser Irradiation on

Angiogenesis in Partial Ruptures of Achilles Tendon in Rats. Photomedicine and Laser Surgery Mary Ann Liebert, (2005), Inc V 23, N 5, Pp. 470–475.

SAWAYA, A.L. Desnutrição: consequência em logo prazo e efeitos da

recuperação nutricional. Estudos avançados (58), (2006); 147-158.

98

SHEIKO, E.A., SHIKHLYAROVA, A.I., KURKINA, T.A.. Low-Energy Red Light

Radiation Improves Antitumor Activity of Cyclophosphamide. Bul. Exp. Bio. Méd. 2004; v.138, n.6, p.590-592.

SILVA J.M.N., CARVALHO J.P., JÚNIOR, M.J.M. “Estudo morfométrico da

terapia LED de baixa potência em tendinite de ratos”. Fisioterapia e Pesquisa (2011),, São Paulo, v.18, n.4, p. 365-70.

SIMÕES, M.L., MARQUES, L.O., ADUR, R.C., CAVAZZANA, W., LIMA, E.B.

Sutura x não sutura do peritônio e a formação de aderência: estudo

experimental em ratos. Rev. Bras. Cir. 1996., v.86, n.6, p.303-305.

Stahl L, Ashworth SH, Jandt KD, Mills RW, Light-emitting diode (led)

polymerization of dental composites: flexural properties and polymerization

potential. Biomaterials, 2000; v.21,p.1379-1389.

SUSSE, E., DAVID, S., CLAIR, D.S., HE, L.I. Latent effects of prenatal

malnutrition on adult health. Annals of the new york academy of sciences. (2008), 1136: 185–192.

TACIRO, C., SERIKAWA, M.A., PARIZOTTO, N.A. “Aspectos Nano estruturais

Do Colágeno No Processo De Regeneração Tendínea Estimulada Por Laser

De Baixa Intensidade – Estudo Piloto” Fisioterapia Especialidades (2007), –

V. 1 – N. 1, p. 21-24.

TORTAMANO, A., LENZI, D.C., HADDAD, A.C., BOTTINO, M.C.,

DOMINGUEZ, G.C., VIGORITO, J.W. Low-level Laser for pain caused by

placement of the first orthodontic archwire: a randomized clinical trial. am j orthod dentofacial orthop. 2009;136(5):662-7.

99

TOSCANO, A.E.; FERRAZ, K.M.; CASTRO, R.M.; CANON F; Passive stiffness

of rat skeletal muscle undernourished during fetal development. CLINICS, 2010; 65(12):1363-1369.

TRELLES, M.; ALLONES, I.; MAYO, E; Er.yag laser ablation of plantar verrucae

with red led therapy-assisted healing. Photomed. Laser Surg. 2006; v.24, n.4,

p.494-498.

TUBY, H.; MALTZ, L.; ORON, U; “Modulations of VEGF and iNOS in the rat

heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and

enhanced angiogenesis”. Lasers Surg. Med. (2006), article In press.

VANE, J.R.; MITCHELL, J.A; APPLETON, I.; TOMLINSON, A.; BISHOP-BAILY

D, CROXTALL J, WILLOUGHBY D. Inducible isoform of cyclooxygenase and

nitric oxide synthase in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; v.91,

p.2046-2050.

VINCK, E.M; CAGNIE, B.J.; CORNELISSEN M.J.; DECLERCQ, H.A.;

CAMBIER, D.C.; “ Increased fibroblast proliferation induced by light emitting

diode and low power laser irradiation”. Lasers Med Sci. (2003);18(2):95-9.

YU, W.; NAIM, J.O.; LANZAFAME, R.J.; “The effect of laser irradiation on the

release of bFGF from 3T3 fibroblasts”. Photo -chem Photobiol; (1994) 59,

167–170.

XAVIER, M.; DAVID, D.R.; SOUZA, R.A.; ARRIEIRO, A.N.; MIRANDA, H.;

SANTANA, E.T.; SILVA, J.A.; ALBERTINI, R.; Anti-inflammatory effects of low-

level light emitting diode therapy on Achilles tendinitis in rats. Lasers Surg Med, 2011; (Epub ahead of print).