Análise de fatores clínicos, histopatológico e moleculares(p53, Ki67, Bcl2 e PCNA) preditivos de resposta terapêuticaà quimioterapia e radioterapia em pacientes comcarcinoma espinocelular de laringe e orofaringe

1) Titular da Seção de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ. Professor Assistente do Curso de Pós-Graduação Cirugia de Cabeça e Pescoço PUC-RJ. Mestre em Oncologia pelo INCA MS-RJ.2) Chefe do Seção de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ. Professor Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Cirurgia de Cabeça e Pescoço, PUC-RJ. Doutor em Medicina pelo Departamento de Cirurgia da Universidade de São Paulo.3) Titular da Seção de Anatomia Patológica do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ. Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense UFF.4) Titular da Seção de Oncologia Clínica do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ.5) Residente de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ.6) Ex-Residente de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Instituto Nacional de Câncer INCA, MS-RJ.

Instituição: Seção de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Anatomia Patológica do Instituto Nacional do Câncer MS-RJ e Curso de Pós-graduação Cirurgia de Cabeça e Pescoço, PUC-RJ.Correspondência : Terence Farias, Rua Ministro Arthur Ribeiro, 98/503 Rio de Janeiro, RJ. E-mail: terencefarias@yahoo.com.br.Recebido em: 18/06/2007; aceito para publicação em: 10/07/2007; publicado on line em: 18/08/2007.

Artigo Original

Analysis of clinical, histopathological and molecular (P53, Ki-67, Bcl-2 and PCNA) factorspredictive of the therapeutic response to chemotherapy and radiotherapy in patients withlaryngeal and oropharyngeal squamous cell carcinoma

RESUMO ABSTRACT

Introdução: tratamento padrão-ouro para pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) em estádios clínicos (EC) III e IV é o cirúrgico, seguido de radioterapia (RXT). Na preservação de órgãos, vários esquemas com radioterapia e quimioterapia são estudados. No entanto, quais pacientes irão melhor responder a esses protocolos é um questionamento ainda sem resposta. Objetivos: avaliar 21 fatores clínicos e um histopatológico, assim como a expressão p53, Bcl2, Ki67 e PCNA como fatores preditivos de resposta a radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe. Pacientes e Método: no período de janeiro de 2000 a agosto de 2003, 57 pacientes com CEC da laringe e orofaringe (EC III e IV) foram tratados com RXT e quimioterapia no INCA-MS-RJ. Avaliamos, através de análise imunoistoquímica nos blocos de parafina desses pacientes, a expressão da p53, Bcl2, Ki67 e PCNA na mucosa normal, assim como no tumor. Essa expressão foi correlacionada com a resposta ao tratamento, assim como avaliamos a associação de 22 fatores com essa resposta. Resultados: a toxicidade do tratamento foi alta, levando a 100% dos pacientes a interromperem o tratamento de alguma forma. Resposta completa foi observada em 68,4% dos casos, com sobrevida global de 58,24% e sobrevida livre de doença de 56,4%. Dos 22 fatores preditivos, apenas a ausência de hiperalimentação por sonda naso-enteral (SNE) (p=0,0006), tamanho do tumor (T) (p=0,009) e ausência de traqueostomia prévia (p=0,0002) foram preditivos de boa resposta ao tratamento (análise univariada). A expressão negativa do Bcl2 no tumor, na mucosa e em ambos (p=0,017, 0,04 e 0,028, respectivamente) foram preditivos de boa resposta (análise univariada), com probabilidade, respectivamente, de 3,64; 5,29 e 7,68 vezes maior de resposta quando comparado com a população que o expressou. A expressão positiva do Bcl2 foi de 25,5%, do p53 de 55,3%, do Ki67 de 82,6%, do PCNA de 76%. Nenhuma dessas expressões teve impacto na resposta ao tratamento. Entretanto, ao realizarmos a análise multivariada, apenas a ausência da traqueostomia prévia ao tratamento (p=0,0056) e ausência de hiperalimentação por SNE (p=0,002) foram fatores preditores de boa resposta. Conclusões: das 22 variáveis, apenas a ausência de hiperalimentação pela SNE e ausência de traqueostomia prévia foram fatores preditivos de boa resposta ao tratamento. De uma forma isolada (análise univariada), a não expressão imunoistoquímica do Bcl2 no tumor, na mucosa e em ambos (principalmente) estiveram associados a uma melhor resposta terapêutica.

Descritores: câncer; Laringe; Orofaringe; Prognóstico; p53; Ki67; PCNA; Bcl2; Radioterapia; Quimioterapia.

Introduction: the standard treatment for patients with HNSCC stages III and IV is surgical plus radiation therapy (RT). In order to preserve the organs, several schemes using RT and chemotherapy (CT) have been studied. Nevertheless, the patients submitted to this treatment who will better respond to these protocols is not known yet. Objective: to evaluate 22 factors as well as the expressions of proteins p53, Bcl2, Ki67 and PCNA as predictive factors, in response to RT and CT in patients with laryngeal and oropharyngeal SCC. Materials and methods: from January, 2000 to August, 2003, 57 patients with laryngeal and oropharyngeal SCC (Stages III and IV) were treated with RT and CT at INCA-MS-RJ. We analyzed the paraffin blocks of those patients throughout immunohistochemistry study. The positive and negative expressions of p53, Bcl2, Ki67 and PCNA on normal mucosa, as well as in the tumor (and in both of them). The expression was correlated to the response of treatment, as we analyzed the association of 22 clinical factors of patients showing this response. Results: the toxicity of treatment was high, taking 100% of patients to somehow interrupt the treatment. A complete response was observed in 68.4% of the cases, with overall survival rate of 58.24% and disease-free survival rate of 56.4%. Among the 22 predictive factors, only the lack of hypernutrition through nasoenteral tube (p=0.0006), tumor size (T), p=0.009 and the lack of tracheotomy were predictive of a better response to the treatment (univariated analysis). Only the Bcl2 negative expression in the tumor, mucosa and in both (p=0.017, 0.04 and 0.028, respectively) were predictive of a better response (univariated analysis) with support of 3.64; 5.29 and 7.68, respectively, much higher when compared to the population who expressed it. Positive expression of Bcl2 was 25.5%; p53 55.3%; Ki67 82.6%; PCNA 76%. None of those expressions caused any impact to response of treatment. Nevertheless, when a multivariated analysis was made, only the lack of previous tracheotomy to treatment (p=0.0056) and the lack of hypernutrition through NET (p=0.002) were predictive factors for a better result. Conclusions: among 22 predictive factors, only the lack of hypernutrition through SNE and the lack of previous tracheotomy were predictive factors for better results. Throughout an univariated analysis the non-immunohistochemistry expression of Bcl2 in the tumor, on mucosa and in both (mainly), had a good impact in therapeutic response.

Keywords: cancer; larynx; oropharynx; prognostic; p53; Ki67; PCNA; Bcl2; radiotherapy; chemotherapy.complications.

1Terence Farias2Fernando Luiz Dias3Theresinha Carvalho da Fonseca4Daniel Herchenhorn5André Leonardo de Castro Costa6Gabriel Manfro5Leonardo G. Rangel6Leonardo Lopes6Amanda Marques

Rev. Bras. Cir. Cabeça Pescoço, v. 36, nº 3, p. 131 -139, julho / agosto / setembro 2007 131

INTRODUÇÃO

Até os anos 90, o tratamento padrão-ouro com intuito curativo para pacientes com tumores localmente avançados – estádios III e IV tinham por objetivo principal o controle da doença loco-regional e consistia de excisão cirúrgica completa do tumor (se possível) combinada com radioterapia pós-

1operatória; ou, quando irressecável, radioterapia exclusiva .O procedimento cirúrgico implica habitualmente seqüelas físicas, funcionais, sociais e psíquicas que afetam negativamente a qualidade de vida dos pacientes por determinar, em graus variáveis, deformidades na aparência, perda da voz, traqueostomia definitiva, dificuldade de mastigação e deglutição, sensação de engasgo ou sufocamento, distúrbios respiratórios, diminuição da acuidade visual e do olfato; causando tristeza, perda da auto-estima e

2,3problemas de relacionamento .É estabelecido que o tratamento combinado com quimio e radioterapia é a melhor alternativa para a laringectomia total quando se deseja a preservação de órgãos em pacientes com

1carcinoma espinocelular de laringe localmente avançado .Já para as neoplasias malignas de orofaringe estádios III e IV, descobriu-se que o tratamento concomitante com quimio e radioterapia, além de promover um melhor controle local da doença, contribui para aumentar a sobrevida livre de doença e

5,6 a sobrevida global em relação à radioterapia exclusiva .Apesar de não haver estudos bem controlados comparando a combinação de quimio e radioterapia com o tratamento cirúrgico padrão para os tumores de orofaringe, o tratamento concomitante tem sido também considerado uma boa escolha para os pacientes aos quais se deseja a preservação de

7órgãos .Devido à maior toxicidade do tratamento concomitante com quimioterapia e radioterapia para o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, deve-se recomendá-lo apenas para os indivíduos com um bom desempenho clínico e que tenham, além de apoio familiar, condições psicológicas e sociais para lidar com as possíveis complicações. Caso o paciente não preencha esses critérios, mas deseje preservar a voz, deve-se oferecer o tratamento radioterápico exclusivo, visto que este, se comparado ao esquema seqüencial, oferece resultados semelhantes em relação à taxa de preservação de órgãos,

7,8porém, com menores efeitos colaterais .Podemos observar que a radioterapia associada à quimioterapia é uma importante opção terapêutica, contudo, qual o grupo de pacientes que irá ter uma melhor resposta terapêutica aos protocolos de preservação de órgão, ainda é uma questão não respondida.Com os avanços da biologia molecular e imunoistoquímica, houve um aumento no número de fatores que nos fornecem informações a respeito de prognóstico em pacientes com câncer de cabeça e pescoço. Comparativamente com tumores sólidos do pulmão, cólon e mama, há relativamente poucos trabalhos de qualidade avaliando o significado prognóstico das moléculas envolvidas no controle do ciclo celular, diferenciação e ativação. Portanto, diversas proteínas podem servir para Oncologia como fatores preditivos de resposta terapêutica ou como vetores prognósticos em pacientes com câncer.A importância deste estudo está exatamente na tentativa de achar-se um marcador preditivo que irá triar quais os pacientes se beneficiarão com o tratamento com radioterapia e quimioterapia, selecionando, assim, aqueles que teriam melhor resposta, com conseqüente diminuição da duração do tratamento, diminuição do custo, das complicações, do período de internação, aumentando a qualidade de vida e talvez, melhorando a sobrevida destes pacientes.O objetivo foi avaliar 21 fatores clínicos e um histopatológico, assim como a expressão das proteínas p53, Bcl2, Ki67 e PCNA como fatores preditivos de resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com carcinoma espinocelular de

laringe e orofaringe.

PACIENTES E MÉTODO

Foram selecionados pacientes com mais de 18 anos matriculados no Instituto Nacional de Câncer no período de janeiro de 2000 a agosto de 2003 com diagnóstico de carcinoma espinocelular de laringe ou orofaringe localmente avançados (estádios III ou IV) e sem metástases à distância. Todos os pacientes deveriam ter desempenho clínico entre 0 e 1,

9segundo os critérios do Eastern Cooperative Oncology Group .Excluíram-se os pacientes com diagnóstico de outro tumor maligno sincrônico (segundo primário) ou que haviam recebido tratamento prévio para a doença de base; mulheres grávidas ou que estivesse amamentando; pacientes com diagnóstico de doença infecciosa em atividade, patologia respiratória descompensada, insuficiência cardíaca ou infarto agudo do miocárdio há menos de seis meses.A avaliação pré-tratamento incluiu história clínica e exame físico completos, radiografia simples do tórax e laringoscopia. Tomografia computadorizada do tumor primário ou da região cervical ou qualquer outro exame de rastreamento de metástases à distância foi realizado de acordo com a indicação clínica. Os critérios de elegibilidade envolviam ainda exames laboratoriais recentes (realizados até 14 dias antes do início do tratamento): contagem de leucócitos totais maior que

3 34000/mm , de neutrófilos maior que 1.500/mm e de plaquetas 3maior que 100.000/mm ; hemoglobina acima de 10 g/dL;

transaminases hepáticas (TGO e TGP) menores que 1,5 vezes o valor de referência; bilirrubinas menores que 1,5 g/dL; creatinina sérica inferior a 1,5mg/dL e clearance de creatinina maior que 60 mL/min/24 horas.O acompanhamento dos pacientes foi feito por uma equipe multidisciplinar formada por cirurgiões de cabeça e pescoço, radioterapeutas, oncologistas clínicos, nutricionista, fonoaudióloga e dentista. Todos os pacientes submeteram-se à avaliação odontológica e nutricional com orientação dietética pré-tratamento. O tempo de acompanhamento foi definido como sendo o período compreendido entre o início do tratamento até a data do óbito ou da última consulta médica.O tratamento consistiu de quimioterapia combinada à radioterapia. A dose proposta de radioterapia para tumor primário e as cadeias de drenagem linfática foi de 45Gy em 25 frações seguido por uma dose de reforço com proteção da medula espinhal de 25,2Gy em 14 frações, com 180cGy por fração, durante um período de cinco dias por semana. O tempo estimado de tratamento foi de 49 dias. Utilizou-se a técnica de campos paralelos e opostos látero-laterais para tratamento do tumor primário e dos linfonodos cervicais; as regiões supraclaviculares bilaterais foram tratadas através de campos diretos. A radioterapia só foi iniciada após um mínimo de sete dias do término do tratamento dentário. A quimioterapia com

2 cisplatina, na dose de 100mg/m de superfície corporal, via intravenosa foi aplicada nos dias 1, 22 e 43 da radioterapia. Até oito semanas do término do tratamento, todos os pacientes foram reavaliados pela equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Aqueles que apresentavam resposta clínica patológica completa no sítio primário, porém, que persistiam com linfonodos palpáveis na região cervical, foram recomendados ao esvaziamento cervical; e aqueles com resposta parcial no sítio primário ou que recidivavam posteriormente foram avaliados com vistas à laringectomia de resgate. Considerou-se como resposta completa o total desaparecimento da doença no sítio primário, tanto pela avaliação clínica como por exame histopatológico, quando necessário. Em caso de persistência de doença residual no sítio primário, comprovada por documentação histopatológica, determinava-se o paciente como sendo refratário ao tratamento e considerava-se ausência de resposta. Recidiva de doença foi definida como reaparecimento do tumor, após a resposta

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completa, quer fosse no sítio primário, nas cadeias de drenagem linfática da cabeça e pescoço, como em qualquer região adjacente.Sobrevida global e sobrevida livre de doença foram determinadas pelo período decorrido desde a data do início do tratamento até a data do óbito ou da última consulta no hospital.A toxidade dessa terapia foi graduada de acordo com os critérios do National Cancer Institute Common Terminology

10Criteria for Adverse Events, versão 3.0 .Esse estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer.O estudo histopatológico e imunoistoquímico dos casos analisados (bloco de parafina), foi realizado na Seção de Anatomia Patológica do Instituto Nacional de Câncer, sendo todos os casos revisados por dois membros dessa Seção, sem o conhecimento prévio da resposta ao tratamento desses pacientes.No caso de coloração positiva para o marcador em questão, a intensidade da marcação foi graduada em quatro graus: Grau 1, quando até 25% das células foram coradas; Grau 2, quando 26-50% das células estavam coradas; Grau 3, com 51-75%; e Grau 4, com 76-100% das células coradas positivamente.Portanto, a expressão positiva e negativa das quatro proteínas (p53, Bcl2, Ki67 e PCNA), na mucosa normal e no tumor, assim como o grau de intensidade de coloração (se grau 1, 2, 3 ou 4), foram correlacionados com a resposta ao tratamento. Se o fator for estatisticamente significativo (p< 0,05), analisamos sua expressão combinada tanto na mucosa como no tumor, assim como determinamos o odds ratio dessa variável. De uma forma paralela, tentamos correlacionar a expressão positiva do tumor na mucosa normal e ocorrência de segundo tumor primário. Por fim, após análise univariada dos 22 fatores clínicos e histopatológico, de uma forma multivariada, determinamos quais dentre todas estas variáveis são fatores preditivos de resposta à radioterapia e quimioterapia nos pacientes. Os 22 fatores estudados são: sítio anatômico (orofaringe); presença de segundo tumor primário na evolução; atraso da quimioterapia; pacientes que fizeram menos que três ciclos de quimioterapia com cisplatina (CDDP); individualmente comparamos os pacientes que fizeram um ciclo, dois ciclos ou três ciclos de quimioterapia; comparamos aqueles que foram hipernutridos com dieta por sonda naso-enteral, previamente e durante o tratamento; comparamos individualmente os estágios (III, IVa e IVb); a presença de etilismo; o grau histológico (1, 2 e 3), aqueles que tinham idade maior que 55 anos (idade média) com os mais jovens; presença de metástase cervical; individualmente se o tipo da metástase cervical (N1, N2 ou N3) foi fator preditivo de resposta; a perda ponderal acima de 10%, o performance status do paciente se zero ou um; a dose da radioterapia maior ou menor que 50Gy; o gênero; o tamanho do tumor (T1, T2, T3 ou T4); a presença de tabagismo; presença de toxidade cutânea; gastrintestinal; ou hematológica; e a presença de traqueostomia prévia ao tratamento.A análise estatística foi feita com o uso do programa estatístico Stata versão 9.0. Para as análises de associação entre a expressão das proteínas p53, Ki67, Bcl-2 e PCNA e os 22 fatores clínicos e histopatológico dos pacientes, com a resposta clínica ao tratamento com radioterapia e quimioterapia, usaremos o teste do qui-quadrado para calcular o p da análise univariada. Os fatores estatisticamente significativos como preditores de boa resposta ao tratamento são analisados de forma multivariada, por regressão linear. Também calculamos o odds ratio, ou seja, a probabilidade de um fator isolado ser responsável pela boa resposta quando positivo ou negativo. O p foi considerado significante quando < 0,05 (intervalo de confiança de 95%). A sobrevida global, bem como a sobrevida livre de doença são estimadas com o método de Kaplan-Meier e as curvas de sobrevida serão comparadas pelo teste de Log-Rank.

RESULTADOS

Foram incluídos 57 pacientes tratados com quimioterapia e radioterapia combinadas entre janeiro de 2000 e agosto de 2003. As características dos pacientes estão detalhadas na tabela 1.

Tabela 1 – Características dos pacientes com CEC laringe/orofaringe submetidos ao protocolo de preservação de órgão.

A distribuição por estádios, de acordo com a classificação de 7 TNM é apresentada na tabela 2.

Tabela 2 – Estadiamento do tumor pela classificação TNM.

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A dose terapêutica de radioterapia (65Gy, no mínimo) foi aplicada em 50 pacientes (87,7%). Destes, 27 (47,4%) fizeram o tratamento radioterápico proposto com 70,2Gy; os outros 23 pacientes (40,3%) receberam entre 65 e 70,1Gy. O tempo médio de tratamento foi de 68,5 dias (52 a 84 dias). Nenhum dos doentes recebeu a radioterapia dentro dos 49 dias preconizados, pois em todos eles houve necessidade de interrupção no tratamento devido à toxidade. Sete pacientes (12,3%) receberam doses inferiores a 65Gy e, entre estes, 5 (8,8%) menos de 45Gy. Os motivos relacionados a esses tratamentos inadequados foram: piora clínica – três pacientes; hemorragia digestiva alta por úlcera gástrica – um; sangramento tumoral – um;e abandono de tratamento – um.Em relação ao tratamento quimioterápico, 43 pacientes (75,4%) receberam os três ciclos de cisplatina planejados; nove (15,8%) receberam dois ciclos e cinco (8,8%) apenas um ciclo. Os três ciclos não foram administrados a esses 14 pacientes (24,6%) por: pioram clínica – seis; nefrotoxicidade três; pneumonia – um; ototoxicidade – um; nefro e ototoxicidade – um; sangramento tumoral – um; e hemorragia digestiva alta – um. Dentre os pacientes que fizeram os três ciclos de cisplatina, 12 (21,1%) sofreram atrasos entre os ciclos, justificados por: toxicidade cutânea – três; neutropenia – dois; piora clínica – dois; ototoxicidade – um; náuseas e vômitos grau 4 – um; fasceíte cervical – um; problema social – um; e perda ponderal – um. Em cinco pacientes (8,8%) foi necessária à redução da dose da quimioterapia: três receberam 80% e 2,75% da dose total devido a nefrotoxicidade – dois; náuseas e vômitos grau 4 – um; neutropenia – um; e perda ponderal - um. Trinta e um pacientes (54,4%) fizeram o tratamento quimioterápico conforme planejado.Com respeito às reações adversas, consideraram-se apenas as toxicidades graus 3 e 4. Dezesseis pacientes (28,1%) apresentaram complicações dermatológicas na área irradiada: 13 (22,8%) grau 3 e três pacientes (5,3%) grau 4. Náuseas e vômitos grau 3 foram percebidos em 12 pacientes (21,1%) e grau 4 em um (1,8%). Somente três pacientes sofreram toxicidade hematológica: neutropenia grau 3 em dois (3,5%) e anemia grau 3 em um doente (1,8%). Entre os 51 pacientes dos quais se recuperaram os dados sobre o peso pré-tratamento, notou-se uma perda ponderal média de 10,1%; em 16 deles (31,4%) a perda foi considerado grau 3 (entre 10 e 19,9%) e, em sete (13,7%), grau 4 (acima de 20%). Apenas treze doentes (23,63%) receberam alimentação enteral durante o tratamento: nove por sonda naso-enteral e quatro por gastrostomia.Antes do início da terapia, 15 pacientes (26,3%) haviam sido submetidos à traqueostomia por desconforto respiratório associado ao tumor. Após um seguimento mediano de 21 meses, sete pacientes (12,3%) ainda necessitavam de traqueostomia: três por laringectomia de resgate, dois por persistência de doença, um por edema actínico e um devido ao tratamento cirúrgico para um segundo tumor primário de cavidade oral.Após o término do tratamento, 39 pacientes (68,4%) apresentaram resposta completa. Dezesseis (28,1%) foram considerados refratários, porém, em três, realizou-se laringectomia de resgate. Cinco pacientes (8,8%) foram encaminhados a esvaziamento cervical por persistência de linfonodos palpáveis nas cadeias de drenagem; no entanto, em quatro deles o laudo histológico da peça não mostrou evidências de neoplasia residual. Não se conseguiu avaliar a resposta em dois doentes (3,5%), pois foram a óbito por complicações clínicas (pneumonia e hemorragia digestiva alta por úlcera gástrica) na vigência do tratamento e perdeu-se o seguimento de outros dois doentes (3,5%).Metástases à distância foram observadas em dois pacientes (3,5%): óssea – um e pulmão – um; outros três pacientes desenvolveram segundos tumores primários: cavidade oral – um; estômago – um; e pulmão – um. Vinte e três pacientes

(40,3%) morreram, 19 (33,3%) por progressão de doença e quatro (7,0%) por causas não relacionadas ao tumor primário (pneumonia – um; hemorragia digestiva alta por úlcera gástrica – um; e segundo tumor primário – dois – tabela 3.

Tabela 3 – Característica dos pacientes no último seguimento.

Em um tempo mediano de acompanhamento de 21 meses, a taxa de preservação de laringe foi de 45,5%, a sobrevida global de 58,2% e a sobrevida livre de doença de 56,4%; (tabela 4).

Tabela 4 – Resultado do tratamento conforme o estádio clínico.

p = 0,0731

Oito pacientes (14%) em resposta completa recidivavam em um tempo médio de 12,5 meses (6-19 meses): sete no sítio primário (laringe – seis; e orofaringe – um) e um em linfonodos supraclaviculares. No momento desta análise, dois encontravam-se em cuidados paliativos e os outros seis já haviam falecidos em virtude da doença.Não houve diferença estatística em relação à sobrevida-global quando se agruparam os pacientes por estágios clínicos (figura 1).

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Figura 1 – Sobrevida global, de acordo com o estágio clínico, pelo método Kaplan-Meier, em 30 meses de acompanhamento.

Sobrevida média: III — 25,52 meses IVA — 23,57 meses IVB — 17,43 meses

p = 0,0731 (Log Rank Test)

Em 25 dos 39 pacientes que apresentaram resposta completa, observou-se que 96% deles eram capazes de alimentar-se por via oral e, em 88%, a dieta era constituída, principalmente por comidas sólidas. O apetite estava preservado em 88% dos entrevistados e o paladar em 80%. A qualidade da voz foi considerada boa ou satisfatória em 64% e todos desempenhavam atividades sociais normais. Odinofagia foi relatada em 16% dos pacientes; 20% apresentaram alguma dificuldade de deglutição; e xerostomia foi descrita como leve em 44% deles, moderada em 8% e intensa em 16%. Déficit de audição foi referido em 20% e depressão, leve ou moderada, foi à queixa de 16% dos doentes.Analisamos individualmente a expressão imunoistoquímica positiva e negativa de cada marcador (Bcl2, Ki67, p53, PCNA) no tumor, na mucosa normal, sua graduação de coloração (ou seja, o percentual de células coradas, Grau 1 se 1-25% foram coradas; Grau 2, 26-50%; Grau 3, 51-75%; Grau 4, 76-100%), com a resposta clínica dos pacientes. Se a expressão (negativa ou positiva), for estatisticamente significativa (p < 0,05), analisamos a expressão no tumor e na mucosa normal associadamente. Da mesma forma, também analisamos a expressão do marcador na mucosa normal e ocorrência de segundo tumor primário. As tabelas abaixo (5 a 8) mostram esses resultados.

Tabela 5 – Expressão imunoistoquímica do marcador Bcl2 no tumor, e a resposta clínica ao tratamento com radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC orofaringe e laringe.

p: 0,017 — OR: 3,64; Expressão positiva Bcl2 no tumor: 25,5%; expressão negativa Bcl2 no tumor: 74,5%; p = qui-quadrado; OR = odds ratio

Tabela 6 - Expressão imunoistoquímica do marcador Bcl2 na mucosa normal e a resposta clínica ao tratamento com radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC orofaringe e laringe.

p: 0,04 - OR: 5,29; Expressão positiva de Bcl2 na mucosa normal: 18,6%; expressão negativa de Bcl2 na mucosa normal: 81,4%; p = qui-quadrado; OR = odds ratio

Tabela 7 – Expressão imunoistoquímica do marcador Bcl2 negativo no tumor e na mucosa e a resposta clínica ao tratamento com radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC orofaringe e laringe.

p =0,028; OR=7,68; expressão positiva Bcl2 no tumor e na mucosa: 29,5%; expressão negativa Bcl2 no tumor e na mucosa: 70,5%; p = qui-quadrado; OR = odds ratio

Tabela 8 – Graduação da coloração imunoistoquímica do marcador Bcl2 e a resposta clínica ao tratamento com radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC orofaringe e laringe.

p: 0,02; 0 = sem coloração; 1 = 1—25% das células coradas; 2 = 26—50% das células coradas; 3 = 51—75% das células coradas; 4 = 76—100% das células coradas; p = qui-quadrado.

Apenas com o Bcl2 tivemos resultados estatiscamente significativos. Analisamos nas tabelas 9 e 10 os fatores clínicos e histopatológico preditivos de boa resposta nesses pacientes.

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Tabela 9 – Fatores clínicos e histopatológico preditivos de resposta à radioterapia e quimioterapia em 57 pacientes com carcinoma epidermóide de laringe e orofaringe.

Análise univariada = qui-quadrado - Análise multivariada = regressão - linear. p estatisticamente significante quando 0,05. Obs: Dos 57 pacientes tratados, 55 tiveram a resposta clínica aferida por nós. *4 pacientes não tiveram os pesos pré e pós-tratamento aferidos. ** O grau de diferenciação histológica não é disponível em 2 pacientes.

Portanto, podemos observar que expressão positiva do Ki67 no tumor foi 82,6%, um índice de proliferação celular alto, todavia, não havendo influência na resposta ao tratamento (idem para sua expressão negativa) e na mucosa normal foi de 65,1%, também sem impacto na terapêutica, da mesma forma que sua intensidade de expressão (Grau 1, 2, 3 ou 4) também foi insignificante. Sua expressão na mucosa normal não foi correlacionada com aparecimento de segundo tumor primário.Quanto ao PCNA, sua expressão positiva no tumor foi de 76%, índice de PC alto, na mucosa normal de 61,3%, porém, ambos sem impacto na resposta terapêutica, assim como o grau de intensidade de coloração (Grau 1, 2, 3 e 4) e a correlação de expressão na mucosa e ocorrência de segundo tumor primário.O p53 teve sua expressão positiva no tumor em 55,3% dos casos, na mucosa normal em 47,7%, o grau de expressão (Grau 1, 2, 3 e 4) e a correlação de sua expressão na mucosa e ocorrência de segundo tumor primário não tiveram impacto na resposta terapêutica.Por outro lado, a expressão negativa do Bcl2 no tumor, observada em 74,5% dos casos de uma forma isolada (análise univariada) (p=0,017) teve um percentual estatisticamente significativo com relação à resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe e esses pacientes com expressão negativa têm uma chance de 3,64 (odds ratio) vezes maior de ter uma boa resposta, quando comparados com os outros. Entretanto, essa resposta aconteceu independente do grau de coloração, não importando se Grau 1, 2, 3 ou 4 (p=0,02). Na verdade, aqueles que não coraram foram os mais responsivos.Mais importante ainda foi a expressão negativa do Bcl2 na

mucosa normal (81,4%), influenciando bastante de forma positiva a resposta terapêutica nestes pacientes (p=0,04), sendo a chance de boa resposta de 5,29 vezes maior (odds ratio), quando comparado com o grupo com expressão positiva.Ainda mais, se houver expressão negativa do Bcl2 na mucosa e no tumor (70,5% dos casos), a probabilidade de boa resposta é de 7,68 vezes maior (odds ratio) quando comparado com o grupo que expressou o Bcl2 (p=0,028), sendo estatisticamente bem significante tal diferença.A expressão positiva ou negativa do Bcl2 na mucosa normal não influenciou a ocorrência de segundo tumor primário (p=0,88).Portanto, analisamos de uma forma individual (univariada) 21 parâmetros clínicos e um histopatológico inerentes ao paciente e quatro proteínas. Foram significantes: o tamanho do tumor (se T1, T2, T3 ou T4) (p=0,009), a ausência de hiperalimentação por sonda naso-enteral (p=0,0006), a ausência de traqueostomia prévia (p=0,0002), a não expressão do Bcl2 no tumor (p=0,017), a não expressão do Bcl2 na mucosa normal (p=0,04) e a não expressão do Bcl2 na mucosa normal e no tumor (p=0,028)Realizamos análise multivariada com essas seis variáveis através de uma regressão linear e observamos que os únicos fatores com real impacto benéfico na resposta terapêutica à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe foram a ausência de sonda naso-enteral (p=0,002) e a ausência de traqueostomia prévia no tratamento (p=0,00456). A não expressão de Bcl2, quer seja na mucosa (p=0,54), no tumor (p=052) ou em ambos (p=0,63) (tabela 11), à análise multivariada, não apresentaram significância estatística.

Tabela 10 – Fatores clínicos e histopatológico preditivos de resposta à radioterapia e quimioterapia em 57 pacientes com carcinoma epidermóide de laringe e orofaringe.

Análise univariada = qui-quadrado; análise multivariada = regressão – linear; p estatisticamente significante quando 0,05. Obs: Dos 57 pacientes tratados, 55 tiveram a resposta clínica aferida por nós. *4 pacientes não tiveram os pesos pré e pós-tratamento aferidos. ** O grau de diferenciação histológica não é disponível em 2 pacientes.

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Tabela 11 – Fatores clínicos e moleculares preditivos de resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe.

T = tamanho do tumor (TNM); TQT = traqueostomia; SNE = sonda naso-enteral.

A seqüência a seguir (fotomicrografias 1 a 4) são as fotos em diversos aumentos das reações imunoistoquímicas realizadas no tumor e na mucosa, com a proteína Bcl2, p53, Ki67 e PCNA, nos pacientes deste estudo.

DISCUSSÃO

Observaram-se 58,2% de sobrevida global, 56,4% de sobrevida livre de doença e 49,1% de sobrevida livre de

11 traqueostomia. No estudo do Head and Neck Intergroupestima-se que a sobrevida global em um ano tenha sido cerca

12,13de 65%; e no RTOG 91-11 , superior a 75%, com a taxa de preservação de laringe de 90%.Percebe-se, então, grande semelhança entre os resultados

11 aqui apresentados e os do Head na Neck Intergroup em relação à sobrevida global. Convém ressaltar que, neste estudo brasileiro, foram incluídos todos os pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço estágios III e IV, não importando se os tumores eram ressecáveis ou não.

12,13 Considerando-se o estudo do RTOG 91-11 que inclui apenas pacientes com tumores passíveis de ressecção cirúrgica, a taxa de sobrevida foi bastante superior àquela aqui descrita. É possível que neste trabalho tenham sido selecionados mais indivíduos com neoplasias irressecáveis, o que poderia justificar, em parte, os resultados inferiores.Apesar do número reduzido de pacientes, que não permitiu que

se identificassem diferenças estatísticas de acordo com o estadiamento clínico, nota-se um menor percentual de respostas completas entre os doentes com maior volume tumoral, ou seja, aqueles com estágio IVB (57,1%), se comparados com os dos estágios III (69,3%) e IVA (70,8%).

1Confirmando os achados da literatura , a associação de quimioterapia e radioterapia também se mostrou bastante tóxica. Estudos já publicados com pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, tratados com radioterapia do tipo split course, demonstraram que as interrupções no tratamento radioterápico afetam negativamente tanto o controle local como a sobrevida em longo prazo por favorecerem a re-

14,15população neoplásicaDados referentes à radiobiologia tumoral mostram que, após a exposição a agentes citotóxicos, tais como a radiação, além da morte de algumas células neoplásicas, observa-se ainda a re-oxigenação do tecido tumoral. Graças a isso, há um aumento subseqüente da taxa de proliferação de células remanescentes, que se encontravam em estado de inércia pelo suprimento inadequado de oxigênio e pela privação nutricional, fenômeno conhecido por repopulação, que varia conforme a histologia e a origem da célula maligna. Nos tumores de cabeça e pescoço, a taxa de proliferação é considerada relativamente alta, 15% em

14,15média .Há fortes evidências clínicas e radiobiológicas que indicam que o tempo global de tratamento radioterápico é determinante de cura nas neoplasias de cabeça e pescoço e, portanto, uma vez que inicie a radioterapia, esta deve ser completada sem atrasos

14,15desnecessários .Portanto, considerando-se o tempo total de tratamento dos pacientes de acordo com o estadiamento clínico, percebe-se que as interrupções na radioterapia foram maiores entre os pacientes do estágio III (7,3 dias em média) do que entre os IVA (3,8 dias em média), o que pode justificar uma melhor resposta para o estagio IVA (70,8%) quando comparado ao III (69,3%) — tabela 7, porém, sem diferença estatística.O benefício da quimioterapia em suprimir a disseminação metastática foi também notado neste estudo, em que se observou uma redução da incidência de metástases à distância em 96,5% dos pacientes (tabela 3).De acordo com os achados deste estudo, podemos inferir que pacientes com tumores menores, ou seja, aqueles onde ainda não houve comprometimento do estado geral do paciente, não sendo necessária sonda naso-enteral para hiperalimentação e não haja processo obstrutivo, por ser um tumor não tão grande, não necessitando de traqueostomia, são os que apresentarão melhor resposta ao tratamento de radioterapia e quimioterapia. Por outro lado, esse é o perfil de paciente ideal para um tratamento cirúrgico de ressecção parcial do órgão, como uma laringectomia supracricóidea. Para determinar qual dos dois tratamentos oferecerá o melhor resultado oncológico e com melhor qualidade de vida, necessita-se de um estudo prospectivo e randomizado.Pacientes já traqueostomizados têm sua laringe não funcional. Protocolos de preservação de órgão com radioterapia e quimioterapia não estariam bem indicados, visto o órgão já estar não funcionante. Da mesma forma, são tumores grandes, estando o tratamento cirúrgico radical a melhor forma de tratamento.Com relação aos fatores moleculares, a detecção do TP53 mutante pode ser feita pela análise molecular (detecção de seqüência de DNA) ou por estudos imunoistoquímicos, técnicas que permitem avaliar a expressão do gene TP53 através da proteína p53, presente na célula. A detecção imunoistoquímica da proteína p53 está baseado na premissa de que a p53 tipo selvagem está presente no núcleo da célula em pequena quantidade e que, devido à sua vida média reduzida, que varia de 5 a 30 minutos, não é normalmente detectada. Quando, porém, ocorre mutação do TP53, vários fatores que regulam sua expressão são acionados, as proteínas mutantes ficam

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mais estáveis, apresentando sua meia vida de até três horas, o que resul ta em meios detectáveis por método

16imunoistoquímicos .A expressão suprabasal do p53 tem valor preditivo para o desenvolvimento subseqüente de carcinoma, fato não encontrado em nossos casos, não só com a análise da p53 na mucosa normal como também com o Ki67 e PCNA. O único que foi preditivo foi o Bcl2 e quando não expresso na mucosa normal.

17Teman demonstrou que o status do gen p53 foi preditor de resposta à quimioterapia de indução com cisplatina e 5-fluoruracil nos CEC de cabeça e pescoço avançados, assim como a presença de mutações de contato do p53 em outro

18estudo conferiu um risco alto de fracasso de tratamento. Dois estudos cuidadosos demonstraram que mutações de contato no p53 são fortemente associadas com falência de tratamento

19,20loco-regional seguido de radioterapia . A análise da expressão do bcl2 pode prover informação prognóstica adicional e pode ser associado, quando se apresenta com mutação de p53, com um maior risco de fracasso de tratamento loco-regional em CEC de cabeça e pescoço seguindo à

21radioterapia . Semelhantemente, mutações em p53 estavam presentes em uma proporção alta de recorrência de tumores

22 que eram refratários à radioterapia .A descoberta de mutações de p53 também pode ser útil como valor preditivo na resposta de pacientes tratados com quimioterapia. Em um estudo prospectivo detalhado de pacientes tratados com quimioterapia neoadjuvante baseada em cisplatina, pacientes cujos tumores contiveram mutações de p53 obtiveram uma taxa de resposta significativamente mais baixa que aqueles

23com ausência de mutação .De uma forma mais ou menos de acordo com o que foi visto na literatura (40% de discrepância nos artigos pesquisados), a expressão positiva ou negativa do p53 no nosso estudo não foi fator preditivo de resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe.As proteínas da família Bcl2, assim como o p53, também são envolvidas na regulação da morte celular, como visto anteriormente. A Bcl2, a mais estudada, inibe a apoptose, em tese, favorecendo crescimento tumoral. A expressão da Bcl2 já foi relatada em neoplasias epiteliais malignas como carcinomas de pulmão, tireóide, mama, ovários e estômago, assim como no adenocarcinoma colo-retal. Alguns trabalhos mostram resultados contraditórios no que diz respeito à correlação entre a expressão da Bcl2 e prognóstico nessas neoplasias. Nos cânceres de mama e esôfago, a expressão da Bcl2 está associada a um bom prognóstico, relação inversa

24ocorrendo nos carcinomas de próstata, testicular e colorretal . Assim como aconteceu no nosso estudo, onde apenas a não expressão do Bcl2 quer seja no tumor, na mucosa normal ou em ambos, é que foram fatores prognósticos de resposta terapêutica.Em uma série de 107 casos de CEC de cavidade oral houve expressão da Bcl2 nas células tumorais, em 31,8%, (nosso estudo foi de 25,5%) com reatividade maior em tumores com

24 25moderada ou pouca diferenciação . Outro estudo , em 85 amostras de CEC de língua, variando de T1 a T4, submetidos a método imunoistoquímico, foi avaliado o índice apoptótico medido pela porcentagem de células apoptóticas, expressão da Bax, da Bcl2 e da p53 nas células tumorais. Imunorreatividade para Bax e Bcl2 foram encontradas em 83 tumores (97%), enquanto que, para p53, em 52 (61%) (nosso estudo foi de 55,3%). Altos índices de apoptose estavam relacionados à alta expressão da Bax e a tumores altamente diferenciados. A expressão aumentada da Bax parece favorecer a susceptibilidade às drogas antineoplásicas e à

25radioterapia, efeito oposto empregado pela Bcl2 (com relação ao Bcl2, o resultado é semelhante ao nosso).

26Muzio et al. mostraram expressividade da Bcl2 em 54,5% de 66 casos de CEC de cavidade oral. Não foi encontrada relação significativa com a variável idade, gênero, grau histológico, TNM, recidiva ou sobrevida global. Em relação à sobrevida

específica por doença, o grupo Bcl2 positivo apresentou taxa de 60% em 72 meses, enquanto que, no grupo Bcl2 negativo, a taxa foi zero, demonstrando que nestes houve um comportamento mais agressivo do tumor, sendo a variável

27independente , resultado contrário ao nosso. Portanto, podemos observar dados extremamente conflitantes com relação ao Bcl2.Com relação ao Ki-67, a laringe é o sítio anatômico mais estudado, visto seu valor prognóstico, valor preditivo positivo

28em relação à resposta a radioterapia. No estudo de Kropveld , houve resposta significativamente maior ao tratamento radioterápico nos pacientes com altos índices de proliferação celular determinados pela Ki67.Entretanto, alguns estudos falharam em demonstrar um valor prognóstico positivo para essa proteína, da mesma forma na qual sua expressão, quer seja positiva ou negativa na nossa pesquisa, não teve valor prognóstico. Poucos estudos foram realizados no intuito de demonstrar a proliferação celular, através da quantificação da proteína Ki67 como fator prognóstico. Existe uma discreta tendência a acreditar que a alta expressão da Ki67 determine uma pior evolução e prognóstico nos casos de câncer de oro, naso e

29hipofaringe .Um ponto importante na maioria dos estudos é que a expressão da proteína Ki67, seja ela forte, intermediária ou fraca, não afetou estatisticamente os casos de cura (sobrevida livre de doença por cinco anos após o tratamento), independente do tipo de tratamento oferecido (cirurgia, cirurgia + radioterapia, radioterapia exclusiva, quimioterapia + radioterapia) e do tipo de tumor. Também classificamos a intensidade de coloração em Grau 1, 2, 3 ou 4, na expectativa de encontrarem-se valores significativos naqueles com alto índice de coloração (>76% das células coradas – Grau 4), porém, não houve diferença em nenhum dos quatro marcadores estudados. Os tumores com alto grau proliferação celular (PC) apresentaram uma tendência maior à recidiva precoce, contudo, uma melhor resposta aos tratamentos que afetem o ciclo celular (radioterapia e

30quimioterapia) .Na nossa casuística, 82,6% dos tumores tiveram alto índice de PC (expressão positiva do Ki67), assim como 76% de expressão positiva do PCNA (que também avalia proliferação celular), porém, 87,7% eram moderadamente diferenciados e 5,3% pouco diferenciados, talvez o que expressasse a insignificância da expressão dessas proteínas com a resposta terapêutica.O valor clínico dos marcadores de proliferação para o prognóstico dos tumores da região de cabeça e pescoço é ainda

31 sujeito a debate. Enquanto alguns autores têm demonstrado que tumores com altos índices de proliferação apresentam menores índices de sobrevida, outros não conseguiram

32estabelecer essa correlação .Assim, pode-se concluir, como é discordante na literatura, o real valor da expressão se positiva ou negativa de diversos marcadores moleculares, não só o Bcl2, p53, Ki67 ou PCNA, como vários outros, no intuito de funcionar como fator preditivo de resposta a tratamentos oncológicos ou como fator

33,34prognóstico .Na nossa casuística, a única proteína capaz de predizer qual grupo de pacientes teria uma boa resposta ao tratamento com radioterapia e quimioterapia foi o Bcl2, quando não expresso, quer seja na mucosa normal, no tumor e, principalmente, em ambos, todavia, apenas de uma forma isolada, não tendo força estatística na análise multivariada. Contudo, os dados de literatura são bastante conflitantes, sendo difícil inferir de uma forma contundente que esse marcador é um bom fator preditivo de resposta terapêutica.Em tese, como a p53 é uma proteína apoptótica, induz a morte celular. A superexpressão da p53 mutante não induziria a apoptose, sendo fator de pior prognóstico, fato não encontrado por nós.O Bcl2 é antiapoptótico. A sua superexpressão também iria bloquear a apoptose, sendo fator de mau prognóstico,

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exatamente o contrário do que achamos, assim como vários autores na literatura.O Ki67 e o PCNA, sendo correlacionados com proliferação celular, quanto maior sua expressão, maior a probabilidade de resposta ao tratamento, porém, pior a sobrevida devido à agressividade do tumor, com recidiva loco-regional e metástases. Nos nossos casos, a super-expressão dessas proteínas não apresentou relevância estatística.São vários fatores envolvidos em cascata, sendo ainda difícil de encontrar-se, de uma forma prática, um único marcador ou grupo de marcadores que objetivamente pudesse dar uma resposta a qual grupo de pacientes se beneficiaria melhor com um certo tratamento específico. Entretanto, abre-se um terreno vasto de pesquisa, principalmente no nível de biologia molecular.

CONCLUSÕES

Das 21 variáveis clínicas e uma histopatológica analisadas, assim como a expressão das proteínas p53, Bcl2, PCNA e Ki67, através de análise imunoistoquímica, apenas a ausência de hiperalimentação nasoenteral (p=0,002) e a ausência de traqueostomia prévia ao tratamento (p=0,056) foram fatores preditivos de boa resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe (análise multivariada).De uma forma isolada (análise univariada), a não expressão imunoistoquímica do Bcl2 no tumor na mucosa normal ou em ambos foram fatores preditivos de boa resposta à radioterapia e quimioterapia em pacientes com CEC de laringe e orofaringe, com probabilidade de resposta de 3,64, 5,29 e 7,68 vezes (respectivamente) maior quando comparado com os pacientes que expressaram positivamente o Bcl2.

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