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“Análise da expressão de fatores

envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.”

PPOOLLLLYYAANNNNAA DDEE OOLLIIVVEEIIRRAA RROOCCHHAA

Recife, PE Setembro, 2006

Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...

2


Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Genética da

Universidade Federal de

Pernambuco, como parte dos requisitos

necessários para a obtenção do grau de

Mestre em Genética.

Orientador: Dr Osvaldo Pompílio de

Melo Neto

Recife, PE

Setembro, 2006


3


4

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA

PARECER DA COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE


“Análise da expressão de fatores protéicos envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.”

Área de Concentração: BIOLOGIA MOLECULAR

Recife, Setembro de 2006


5


6

SSUUMMÁÁRRIIOO

Página

Lista de Figuras 7

Lista de abreviações 8

Resumo 9

1. Introdução 10

2. Objetivos 13

2.1 Geral 13

2.2. Específicos 13

3. Revisão Bibliográfica: 14

3.1- Leishmaniose 14 3.1.1- Distribuição 14

3.2.2- Prevenção e controle 15

3.2.3- Sintomas 16

3.1.4- Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-mucosa 17

3.1.4.1- Espectro clínico 17

3.1.4.2- Diagnóstico 17

3.1.5- Leishmaniose Visceral 18

3.1.5.1- Espectro clínico 18

3.1.5.2- Diagnóstico 19

3.1.6- A Leishmamia 19

3.1.6.1- Promastigota – Promastigota 19


7

Metacíclico – Amastigota

3.1.6.2- Cultivo 21

3.1.7- Transmissão 22

3.2- Controle da Expressão Gênica em Leishmania 24

3.3- Iniciação da Síntese Protéica em Eucariotos 27

3.3.1 - Complexo eIF4F 28

3.3.2 - Proteínas Ribossomais 31

3.3.2.1 - A Proteína P0 31

3.3.3 - Iniciação da tradução em tripanossomatídeos

34

3.4- Proteínas de Expressão Estágio-Específica em Leishmania

36

3.4.1 - Proteína META1 37

3.4.2 - A família A2 38

3.5- Diferenciação Celular em Leishmania e

Regulação da Tradução 40

4. Referências Bibliográficas 42

5. Manuscrito de Artigo Científico 51

6. Abstract 88

7. Conclusões 89

8. Anexos 90

8.1 Instruções para Autores 91


8

Lista de Figuras

Figura Página

Revisão Bibliográfica

Figura 1. Mapas ilustrando a distribuição geográfica das Leishmanioses cutânea e visceral.

14

Figura 2. Fotos mostrando as formas amastigota, encontradas parasitando os macrófagos do hospedeiro vertebrado, e promastigota, encontradas no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado.

20

Figura 3. Ciclo evolutivo da Leishmania demonstrando as formas encontradas nos hospedeiros invertebrados (promastigota) e vertebrados (amastigota).

23

Figura 4. Esquema ilustrando o processamento do mRNA através dos mecanismos de “cis-splicing” ou splicing convencional e de “trans-splicing”.

26

Figura 5. Esquema da estrutura dos ribossomos. 33

Manuscrito

Figura 1: Alinhamento múltiplo dos aminoácidos da proteína ribossomal P0 65

Figura 2: Comassie da proteína P0, Western-blot e quantificação da proteína P0 69

Figura 3: Curvas de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis (promastigota, promastigota metacíclica e amastigota) e imagens dos três estágios de desenvolvimento da L. amazonensis.

72

Figura 4: Imagens dos três estágios do desenvolvimento da L. amazonensis. 73

Figura 5: Western-blot mostrando o reconhecimento dos anticorpos contra suas respectivas proteínas recombinantes: Proteína A2 e Proteína META1.

75

Figura 6: Análise da expressão das proteínas META1 (A) e LmP0 (B) em curvas de L. chagasi e L. amazonensis.

78

Figura 7: Análise da expressão dos homóligos LmEIF4G1(A) e LmEIF4G3(B) em curva de crescimento de L. chagasi. 80


9

LISTA DE ABREVIATURAS

bp Pares de Bases cDNA DNA complementar DNA Desoxiribonucleic Acid

Ácido Desoxirribonucléico IPTG isopropil-beta-D-thiogalactopiranosida kb kilo bases (mil pares de bases) KDa Kilo Dalton NCBI Nacional Center for Biotechnology Information

Centro Nacional para Informação em Biotecnologia OMS Organização Mundial de Saúde PCR Polymerase Chain Reaction

Reação em Cadeia da Polimerase RNA Ácido Ribonucléico UFPE Universidade Federal de Pernambuco


10

RESUMO

Em eucariotos, a etapa crítica de iniciação da síntese de proteínas é aquela

mais sujeita a mecanismos de regulação. Esta etapa requer a participação de um

conjunto de fatores de iniciação da tradução (eIFs), além das subunidades

ribossomais. Entre os eIFs se destaca o complexo eIF4F, composto pelas subunidades

eIF4A, eIF4E e eIF4G. Em Leishmania, o controle da síntese de proteínas é essencial

para a regulação da expressão gênica, mas tem sido pouco estudado. Neste

patógeno, múltiplos homólogos para as subunidades do complexo eIF4F foram

identificados e tiveram sua expressão quantificada na forma promastigota (Pm) do

seu ciclo de vida. Neste trabalho, iniciou-se o estudo em Leishmania de um homólogo

da proteína ribosomal P0, componente da subunidade 60S. A partir da clonagem do

seu gene, expressão em Escherichia coli e produção de soro policlonal específico

partiu-se para a quantificação dos seus níveis intracelulares na forma promastigota,

que se mostraram elevados (~6,6x105 moléculas/célula) e superiores aos observados

para os homólogos de eIF4F. Em seguida, visando analisar a sua expressão durante o

ciclo de vida do parasita, otimizou-se as condições de crescimento de espécies

representativas de Leishmania nas suas formas promastigota metacíclica (PmMt) e

amastigota (Am). Buscou-se então a detecção de proteínas de expressão estágio

específico (A2 – Am; META1 - PmMt) para validar as curvas de crescimento, mas

apenas a expressão da META1 foi confirmada, embora a forma Am tenha sido

observada por microscopia. A expressão da proteína P0 se mostrou constante nessas

várias formas celulares. Em comparação, a expressão de um homólogo da proteína

eIF4G, LmEIF4G3, também se mostrou constante, enquanto que um segundo

homólogo, LmEIF4G1 só foi detectado nas formas Pm e Am do parasita. Ensaios com

outros homólogos de eIF4F estão sendo realizados, esperando-se caracterizar melhor

os processos que envolvem a iniciação da tradução em Leishmania e o controle da

sua diferenciação celular.

Palavras-chave: Tripanossomatídeos, Iniciação da Tradução, Ciclo de vida da

Leishmania, Expressão Estágio Específica e Proteína Ribossomal.


11

1- INTRODUÇÃO

A ordem Kinetoplastida contém importantes patógenos de animais,

humanos e plantas. Esses organismos unicelulares representam um nó

primário da árvore evolutiva dos eucariotos e possuem uma variedade de

características bioquímicas, genéticas e morfológicas que são tanto

singulares ao grupo como aquelas observadas em um grande número de

outros organismos. Dentro dos kinetoplastídeos são identificadas três

famílias distintas, entre elas a família Trypanosomatidae. Os parasitas

protozoários pertencentes a esta família incluem um número importante de

patógenos responsáveis por doenças de impacto mundial tais como Doença

do sono (Trypanosoma brucei), Doença de Chagas (T. cruzi) e várias formas

de Leishmanioses (Leishmania sp.).

O gênero Leishmania é responsável pela zoonose endêmica

Leishmaniose em cerca de 88 países. Cerca de 400 mil casos novos são

confirmados anualmente em todo o mundo, onde aproximadamente 350

milhões de pessoas encontram-se em áreas de risco. O quadro preocupante

gerado por essa parasitose vem despertando o interesse de pesquisas mais

aprofundadas sobre estes parasitas, tanto ao nível celular como molecular.

Em eucariotos, a síntese protéica, também chamada de tradução, é

um processo complexo que requer uma diversidade de macromoléculas

incluindo RNAs e proteínas. Sua regulação é essencial para a capacidade dos

organismos de se adaptarem as variações nas condições do seu ciclo de

vida. Embora o ribossomo desempenhe um papel central nesse processo de

tradução, ainda há muito a ser estudado no que se refere ao papel das

proteínas ribossomais na montagem do ribossomo e no processo de

tradução propriamente dito. A complexidade dessa organela, em eucariotos

é uma indicação da sua importância para a sobrevivência dos organismos.

Na tradução, o ponto crítico de iniciação requer, além das subunidades

ribossomais, um número de fatores de iniciação da tradução (eIFs, de


12

“eukariotic initiation factors”) cuja atividade pode ser altamente regulada.

Acima de todos esses fatores está o complexo eIF4F, o qual é necessário

para o recrutamento da subunidade menor ribossomal para a extremidade 5’

do RNA mensageiro. O complexo eIF4F é composto pela RNA helicase eIF4A,

pela proteína de ligação ao cap eIF4E e pela grande proteína central eIF4G,

responsável pela mediação da interação entre o eIF4F e outros fatores da

tradução assim como a subunidade menor ribossomal.

Com o início do seqüenciamento genômico de tripanossomatídeos,

foram identificados pelo nosso grupo de trabalho múltiplos homólogos

potenciais para os três componentes do eIF4F em L. major (4 homólogos ao

eIF4E – LmEIF4E1-4; 2 homólogos ao eIF4A - LmEIF4A1-2; e 5 homólogos

ao eIF4G - LmEIF4G1-5) e também em T.cruzi e T. brucei. Esses homólogos

apresentam uma alta conservação dentro das espécies, mas parecem variar

em diferentes aspectos tais como afinidade de ligação ao cap dos eIF4Es,

níveis de expressão e interação com outros componentes do eIF4F. Os

resultados sugerem um alto grau de complexidade na iniciação da tradução

desses parasitas, o qual pode refletir uma adaptação ao seu complexo ciclo

de vida.

Esse projeto teve origem na identificação das seqüências, clonagem,

expressão e produção de anticorpos específicos contra possíveis homólogos

das subunidades do complexo eIF4F de Leishmania major visando uma

posterior análise, de forma quantitativa, da sua expressão ao longo do ciclo

de vida desta e de outras espécies de Leishmania. Dados preliminares

obtidos foram restritos à fase promastigosta de espécies de Leishmania, mas

mostraram diferenças significativas nos níveis de expressão de diferentes

homólogos de uma mesma subunidade, como no caso dos homólogos de

eIF4E. De forma a verificar o significado funcional dos resultados obtidos,

entretanto, faz-se necessário comparar esses níveis de expressão com o das

unidades básicas de síntese de proteínas, os ribossomos. Assim, em um

primeiro momento, partiu-se para clonar, expressar e produzir anticorpo


13

policlonal contra a proteína ácida ribossomal P0, componente da subunidade

maior ribossomal e cujo padrão de expressão e quantidade de moléculas são

indicativos do total de ribossomos presentes em um dado organismo. Em

seguida partiu-se para analisar como os níveis de homólogos selecionados

de subunidades de eIF4F, e da proteína ribossomal P0, se mantém em

formas representativas do ciclo de vida de espécies distintas de Leishmania.

Sendo assim, tornou-se necessário otimizar as condições de diferenciação

desse parasita em cultura, verificando-se ao mesmo tempo o padrão de

expressão de proteínas estágio específicas destes protozoários, tais como a

proteína A2, específica da forma amastigota, e a proteína META 1, expressa

na fase promastigota metacíclica da Leishmania, tidas como marcadores de

diferenciação do parasita.

Nesse trabalho, pudemos estabelecer condições de diferenciação

celular de espécies representativas de Leishmania, o que nos possibilitou,

como primeiro passo, analisar a expressão da proteína ribossomal P0 e, em

seguida, investigar a expressão de proteínas do complexo eIF4F, através de

ensaios de Western-blot, em curvas de crescimento onde os três principais

estágios da Leishmania foram obtidos. O número de moléculas de proteína

ribossomal por célula também foi estimado, gerando dados que podem ser

comparados com os já descritos na literatura para outros organismos mais

bem estudados. Os resultados obtidos constituem um passo importante na

compreensão do processo de síntese protéica em tripanosomatídeos e de

como este se assemelha ou difere em relação ao que se sabe em outros

eucariotos.


14

2- OBJETIVOS

2.1- Objetivos Gerais

Analisar a expressão de proteína ribosomal, proteínas de expressão estágio

específica e homólogos de subunidades do complexo eIF4F de iniciação da

tradução durante o ciclo de vida de espécies representativas de Leishmania

sp.

2.2- Objetivos Específicos

1. Quantificar a expressão da proteína ribosomal P0 de Leishmania major

em extratos da forma promastigota de espécies representativas de

Leishmania, utilizando soro policlonal específico. Estimar o número de

ribosomas presentes nestas células.

2. Monitorar a diferenciação celular de espécies de Leishmania em cultura,

visando obter extratos das suas três principais formas de vida:

Promastigota, Promastigota Metacíclica e Amastigota.

3. Validar os extratos obtidos das formas de vida de Leishmania, através da

análise de expressão de proteínas sabidamente estágio específicas, no

caso as proteínas Meta1 (expressa na forma Promastigota Metacíclica) e

A2 (expressa em Amastigota).

4. Comparar a expressão da proteína ribosomal P0 de Leishmania, indicativa

dos níveis intracelulares dos ribosomos, com a expressão de homólogos

selecionados de subunidades do complexo eIF4F de iniciação da tradução,

nas três fases de desenvolvimento desse parasita.


15

3- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1- Leishmaniose

3.1.1- Distribuição

A Leishmaniose é encontrada em cerca de 88 países com uma

população total sujeita a infecção estimada em 350 milhões de pessoas. A

maioria dos países afetados estão em áreas tropicais e subtropicais, se

estendendo desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos,

África, Ásia central, Índia e China (figura 1). A leishmaniose é considerada a

segunda principal doença causada por protozoário no mundo, perdendo em

incidência apenas para a Malária (www.vet.uga.edu).

a) b)

Figura 1: Mapas ilustrando a distribuição geográfica das Leishmanioses cutânea (a) e

visceral (b). Podemos observar que o Brasil possui as duas principais formas de

Leishmaniose e em grande parte dos estados. Fonte: www.vet.uga.edu.


16

3.1.2- Prevenção e controle

Noventa por cento (90%) das infecções de leishmaniose cutânea se

desenvolvem no Afeganistão, Paquistão, Síria, Arábia Saudita, Algéria, Irã,

Brasil e Peru; 90% das infecções de leishmaniose visceral ocorrem na Índia,

Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil. Com poucas perspectivas para retorno

financeiro, o desenvolvimento de drogas anti-leishmaniose continua adiado

(Muray HW et al., 2005).

Nos últimos cinco anos, porém, progressos concretos foram

observados no que concerne ao diagnóstico e tratamento da leishmaniose e

ao controle do vetor transmissor. Novos estudos têm aumentado a

compreensão da susceptibilidade à doença e a relação parasito-hospedeiro;

a imunidade anti-leishmaniose tem sido mais precisamente esclarecida e

diferentes opções de vacina estão sendo desenvolvidas. A seqüência do

genoma da Leishmania major foi completada recentemente e a do inseto

vetor Lutzomya longipalpis encontra-se em andamento. Estes avanços irão

claramente gerar oportunidades para um maior entendimento dos aspectos

básicos da biologia do parasita, transmissão e patogênese e poderá levar a

identificação de candidatos ou alvos para ensaios diagnósticos, drogas ou

vacinas (Muray HW et al., 2005).

Evidências clínicas e experimentais abundantes indicam que a

leishmaniose deve ser prevenida por vacinação. Entretanto, o único agente

de vacina provado em seres humanos é a L. major viva, agora em desuso

por causa de lesões inaceitáveis em alguns pacientes. Parasitas mortos

utilizados como vacina geraram resultados encorajadores no Brasil na

década de 70. Experimentos com células de L. major autoclavadas também

foram realizados, porém não demonstraram muita eficiência. Recentemente,

alguns esforços têm sido feitos por laboratórios tendo como foco novos


17

antígenos e adjuvantes, vacinas vivo-atenuadas, proteínas recombinantes

purificadas e subunidades protéicas, “naked DNA” e bactérias expressando

antígenos de Leishmania (Muray HW et al., 2005). A vacina ideal seria uma

vacina “pan- Leishmania” incluindo várias moléculas, preferencialmente

conservadas entre diferentes espécies. A esse respeito, é válido mencionar

estudos recentes mostrando que vacinas de coquetéis e multicomponentes

de DNA induzem uma proteção sólida contra ambas formas de leishmanioses

cutânea e visceral (Iborra S et al., 2003).

3.1.3- Sintomas

A Leishmaniose tem várias manifestações clínicas: lesões

ulcerativas de pele, inflamações destrutivas da mucosa e infecção

disseminada visceral (Kalazar). A epidemiologia, a imunopatologia e as

conseqüências são igualmente diversas, desde que a infecção ocorre em

múltiplas regiões endêmicas, tanto em crianças quanto em adultos e é

causada por, aproximadamente, duas dúzias de espécies de Leishmania

diferentes.

Mesmo assim, todas as formas dessa protozoose compartilham de

três características patogênicas: macrófagos residentes no tecido são os

alvos e mantém a multiplicação intracelular do parasita; a resposta

imunoinflamatória do hospedeiro regula a expressão e as conseqüências da

doença; e a infecção persistente no tecido é característica (Muray HW et al.,

2005).


18

3.1.4- Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-mucosa

3.1.4.1- Espectro clínico

Múltiplas espécies causam leishmaniose cutânea em crianças e

adultos, primariamente L. major, L. (L) tropica e L. (L) aethiopica

(leishmaniose cutânea do Velho Mundo) e L. (L) mexicana, L. (L)

amazonensis, L. (V) braziliensis, L. (V) panamensis, L. (V) peruviana e L. (V)

guyanensis (leishmaniose cutânea do Novo Mundo). Uma pápula tipicamente

começa com a picada do inseto, aumenta para um nódulo e ulcera entre um

e três meses (Dowlati Y, 1996; Machado P et al., 2002; Magil AJ, 2005). Na

leishmaniose do Velho Mundo, a maioria das lesões são pápulas, nódulos ou

nódulo-úlcera (Dowlati Y, 1996), enquanto lesões ulcerativas são mais

comuns em leishmaniose cutânea do Novo Mundo (Palacios R et al., 2001).

Lesões disseminadas e linfoadenopatia localizada precedendo úlceras na pele

ocorrem no Brasil (Barral A et al., 1995). A associação de leishmaniose

cutânea com HIV (vírus da imunodeficiência humana) tem sido algo não

muito freqüente até o momento (Couppie P et al., 2004; Rabello A et al.,

1990).

3.1.4.2- Diagnóstico

O diagnóstico, na prática, é feito pela identificação de amastigotas

em biópsias, fragmentos e esfregaços. Combinação de microscopia e cultura

aumenta a sensibilidade do diagnóstico para mais de 85% (Blum J et al.,

2004; Ramirez JR et al., 2000) e cultura (ou análise de DNA) permite

identificação da espécie (Vega-Lopez F, 2003; Weina PJ et al., 2004).


19

3.1.5- Leishmaniose Visceral

3.1.5.1- Espectro clínico

A leishmaniose visceral é causada pela L. donovani no

subcontinente indiano, Ásia e África (em adultos e crianças), e pela L.

infantum ou L. chagasi na região do Mediterrâneo, sudeste e centro da Ásia

e América do Sul (primariamente em crianças); outras espécies (por

exemplo, L. tropica no Oriente Médio, L. amazonensis na América do Sul)

são ocasionalmente viscerotrópicas (Desjeux P, 2004; Desjeux P, 2001;

Guerin PJ et al., 2002). A expressão da infecção recentemente adquirida

varia de nenhuma (infecção subclínica), à oligossintomática e à totalmente

estabelecida (Kalazar). Na leishmaniose visceral sintomática, febre,

fraqueza, anorexia e perda de peso são comuns e progridem de semanas a

meses (Collin S et al., 2004; Osman OS et al., 2000; Davidson RN, 1998).

Crianças podem desenvolver diarréia e retardo no crescimento e, no Brasil,

podem mostrar uma infecção oligossintimática incompleta, a qual

geralmente apresenta cura espontânea em um período variável de tempo,

mas pode também progredir para o kalazar (Badaro R et al., 1986; Gama

MEA et al., 2004). Febre, definhamento, hepatomegalia e frequentemente

esplenomegalia são típicos na leishmaniose visceral. Escurecimento da pele

(Kala azar significa febre negra em Hindu) não é freqüente. Anemia,

leucopenia ou trombocitopenia e hipergamaglobulinemia são característicos.

Com o tempo, a doença não tratada em qualquer faixa etária pode produzir

caquexia profunda, doença multi-sistêmica, sangramento pela

trombocitopenia, susceptibilidade a infecções secundárias e morte (Collin S

et al., 2004; Osman OS et al., 2000; Davidson RN, 1998).


20

3.1.5.2- Diagnóstico

Visualização direta de amastigotas em espécimes clínicas é o

diagnóstico padrão ouro em regiões onde aspiração do tecido é viável e

microscopia e perícia técnica são disponíveis. Testes de urina para antígenos

ou anticorpos de leishmania são uma nova abordagem (Sundar S et al.,

2005; Islam MZ et al., 2004). Num laboratório central, amostras clínicas

podem ser cultivadas para isolamento do parasita (Herdwaldt BL, 2004;

Osman OS et al., 2000; Boelaert M et al., 2004) e DNA de leishmania é

prontamente detectável por testes de PCR, incluindo em sangue periférico e

soro (Guerin PJ et al., 2002; Osman OS et al., 2000; Gatti S et al., 2004;

Fissore C et al., 2004).

3.1.6- A Leishmania

3.1.6.1 -Promastigota – Promastigota Metacíclico – Amastigota

Os protozoários do gênero Leishmania apresentam duas formas

morfológicas e três formas fisiológicas. A forma promastigota (figura 2A),

flagelada, infecta o inseto vetor, enquanto que a forma não flagelada

amastigota (figura 2B) reside no interior dos fagolisossomos de macrófagos

de mamíferos. Ambos estados morfológicos são responsáveis pela patologia

em seus respectivos hospedeiros. Uma terceira forma, que aparece como

uma subfase da forma promastigota, é a promastigota metacíclica, cujos

aspectos morfológicos são extremamente parecidos com os da promastigota,

apresentando uma morfologia mais alongada que esta. Esta subfase é tida

como a fase infectante da Leishmania, embora as formas promastigota e

amastigota sejam capazes de infectar o hospedeiro (Teixeira MCA et al.,

2002).


21

A morfologia das formas evolutivas dos parasitas do gênero

guarda, de certa forma, semelhança entre as diferentes espécies. Os limites

micrométricos das formas amastigostas são de aproximadamente 1,5 a 3,0

x 3,0 a 6,5 µm. Já as promastigotas apresentam uma maior variabilidade

nas suas dimensões, de 10,0 a 40,0 x 1,5 a 3,0 µm (Neves DP, 2000). Estes

estágios de desenvolvimento mostram características morfológicas e

metabólicas diferentes consistentes com um alto nível de regulação da

expressão diferencial de proteínas (Campbell DA et al., 2003).

a) b)

Figura 2: Fotos mostrando as formas amastigota (a), encontradas parasitando os

macrófagos do hospedeiro vertebrado, e promastigota (b), encontradas no tubo digestivo

do hospedeiro invertebrado. Fonte: www.med-chem.com.


22

3.1.6.2 -Cultivo

As formas promastigotas podem ser facilmente cultivadas em

diferentes tipos de meio e são freqüentemente usadas em estudos

científicos. Em contraste, a dificuldade de obter grande número de

amastigotas, livres de contaminantes de células do hospedeiro, tem

impedido a investigação das suas propriedades metabólicas, bioquímicas e

biológicas (Chang KP, 1980; Hart DT et al., 1981). A primeira propagação

com sucesso de formas amastigotas de uma espécie de Leishmania,

denominada Leishmania pifanoi, em um meio livre de células foi relatado por

Pan (1984). Desde então, tentativas em cultivar amastigotas em meio livre

de células têm sido realizadas por vários autores (revisado em Bates 1993;

Pan AA et al. 1993). Alguns trabalhos têm focado na transformação in vitro

de promastigotas em formas amastigotas em resposta à elevação da

temperatura (Hendricks LD, 1978; Hunter KW et al. 1982; Leon LL et al.

1995), enquanto que poucos autores têm descrito cultivo axênico serial do

estágio intracelular. O cultivo axênico de amastigotas de Leishmania

mexicana tem sido mais efetivo que de outras espécies de Leishmania

(Bates PA, 1993). Alguns autores têm relatado transformação de

amastigotas de Leishmania donovani em culturas axênicas (Al-Bashir NT et

al. 1992; Saar Y et al. 1998). Apesar desses relatos sobre cultivo axênico de

amastigotas de Leishmania, ainda restam controvérsias sobre a

reprodutibilidade e/ou o tempo certo da transformação do parasita. (Teixeira

MCA et al. 2002). Por isso, uma observação importante ao que se refere ao

cultivo e diferenciação de Leishmania é que, aparentemente, cada espécie

requer condições especiais relacionadas com temperatura, pH e nutrientes

para a transformação de promastigotas para formas amastigotas. Isto

requer uma optimização cuidadosa das condições da cultura de amastigotas

de cada espécie ou cepa de Leishmania (Somanna A et al., 2002).


23

3.1.7- Transmissão

As formas promastigotas, inoculadas pelas fêmeas dos insetos

vetores durante o repasto sanguíneo, utilizam-se de mecanismos que lhes

permitem resistir à ação de elementos dos soros, principalmente do

complemento. Um dos mecanismos sugeridos seria, após a ativação do

complemento, a inserção na membrana do parasito de moléculas do

hospedeiro, como C3, C3b e C3bi, as quais, através de receptores existentes

na membrana do macrófago, facilitariam a sua interiorização. Por outro lado,

moléculas da superfície dos promastigotas, como a GP-63 (glicoproteína de

63 KD) e LPG (um complexo glicofosforoglicano), são também indicadas

como importantes na adesão do parasito e na sua endocitose pelo

macrófago (Neves DP, 2000).

Após a interiorização, o macrófago promove a fusão dos lisossomos

com o fagossomo e o parasito, para sua adaptação às condições do novo

ambiente, sofre a transformação para a forma amastigota, intracelular

obrigatória, capaz de desenvolver-se e multiplicar-se no meio ácido

encontrado no vacúolo digestivo (Neves DP, 2000) (figura 3). O pH

desempenha um papel central na transformação de promastigotas em

amastigotas, e as formas amastigotas apresentam uma maior atividade

metabólica estando em ambiente ácido, embora o citoplasma da amastigota

seja regulado para se manter em um pH próximo do neutro através de

processos ativos que ocorrem na célula do parasita (Burchmore RJS and

Barrett MP, 2001).

A multiplicação, por divisão binária simples, é iniciada pela

duplicação do cinetoplasto, um dos quais mantém o flagelo remanescente,

enquanto o outro promove a reprodução da estrutura flagelar. A seguir, o

núcleo se divide e, em seguida, o corpo do parasito se fende, no sentido


24

antero-posterior. Após sucessivas multiplicações, na ausência do controle

parasitário pela célula hospedeira, esta se rompe e os amastigotas liberados

serão fagocitados por outros macrófagos (Neves DP, 2000).

Figura 3: Ciclo evolutivo da Leishmania demonstrando as formas encontradas nos

hospedeiros invertebrados (promastigota) e vertebrados (amastigota), assim como sua

localização nos mesmos. Fonte: www.dpd.cdc.gov

* Estágios nohospedeiro invertebrado

* Estágios nohospedeiro vertebrado

O inseto realiza o repasto sangüíneoe injeta formas promastigotas na pele As formas promastigotas

são fagocitadas pelos macrófagos

Promastigotas se transformam em amastigotas dentro

dos macrófagos

As amastigotas se multiplicam nas células(incluindo macrófagos)de vários tecidos

O inseto realiza o repasto sangüíneoe ingere macrófagos infectados comamastigotas

Ingestão de célulasparasitadas

Amastigotas se transformam empromastigotas na parte média do tubodigestivo do inseto

Promastigotas se dividem emigram do intestino para a probóscide

Estágio infectivo

Estágio de diagnóstico

* Estágios nohospedeiro invertebrado

* Estágios nohospedeiro vertebrado

O inseto realiza o repasto sangüíneoe injeta formas promastigotas na pele As formas promastigotas

são fagocitadas pelos macrófagos

Promastigotas se transformam em amastigotas dentro

dos macrófagos

As amastigotas se multiplicam nas células(incluindo macrófagos)de vários tecidos

O inseto realiza o repasto sangüíneoe ingere macrófagos infectados comamastigotas

Ingestão de célulasparasitadas

Amastigotas se transformam empromastigotas na parte média do tubodigestivo do inseto

Promastigotas se dividem emigram do intestino para a probóscide

Estágio infectivo

Estágio de diagnóstico


25

3.2- Controle da Expressão Gênica em Leishmania

Os tripanossomatídeos são protozoários eucariotos que divergiram

precocemente da linhagem principal dos eucariotos. A Leishmania, como

outros tripanossomatídeos, exibe uma combinação não usual de mecanismos

de expressão gênica. Os protozoários tripanossomatídeos usam uma

abordagem transcricional policistrônica, na qual pré-RNAs sintetizados ao

longo de centenas de Kilobases produzem RNAs monocistrônicos após

reações acopladas de “Trans-splincing” e a “Poliadenilação”. Assim, a

dependência de mecanismos de regulação da iniciação da transcrição

baseados em um promotor para o controle do nível de mRNA é muito

reduzida; talvez como resultado, grande ênfase pode estar presente nos

mecanismos de regulação pós-trancricional da expressão gênica, tais como

estabilidade e tradução do mRNA e o “turn over” de proteínas (Akopyants

NS et al, 2004).

O processo de “trans-splicing” se dá através de uma trans-

esterificação de dois passos, análogo ao “cis-splicing”, mas formando uma

estrutura em “Y” em lugar do laço intermediário (Liang X et al., 2003). Essa

reação envolve a adição de um “spliced leader” - SL, uma seqüência de RNA

de 39 nucleotídeos, a extremidade 5’ do mRNA (Zick A et al., 2005). A fonte

da seqüência SL é um outro RNA, pequeno, contendo a estrutura cap na sua

extremidade 5’. Assim, a adição da seqüência SL serve para dois propósitos:

funcionar junto com a poliadenilação na dissociação dos transcritos

policistrônicos e prover a estrutura cap aos mRNAs (Liang X et al., 2003)

(figura 4). Diferente da estrutura cap (7-metil guanosina) universalmente

conservada, a qual é ligada ao primeiro nucleotídeo através de uma ligação

5’ – 5’ – trisfosfato, os primeiros quatro nucleotídeos da seqüência SL são

todos modificados por metilação. Este não usual cap modificado, conhecido


26

como estrutura cap-4, é a estrutura cap com maior número de modificações

entre as células eucarióticas (Gao H et al., 2005).

O processamento das extremidades 5’ dos mRNAs da unidade

policistrônica, por “trans-splicing”, gera monocístrons com extremidades 3’

passíveis de degradação por nucleases. Desta forma, a poli-adenilação,

visando à proteção destas extremidades, parece ser um evento dependente

do processo de “trans-splicing” e ambos ocorrem dentro de cada região

intergênica. A ausência da seqüência SL ou da cauda poli-A, pode identificar

transcritos para a degradação (LeBowtiz JH et al., 1993). Nenhuma região

específica clássica, tais como os sinais de poliadenilação (AAUAAA) em

eucariotos superiores, parece estar presente nos RNAs mensageiros dos

tripanossomatídeos (Liang XH et al., 2003), embora já se saiba que uma

seqüência de poli-pirimidinas nos mRNAs precursores possa funcionar como

um sinal para indicar tanto o sítio de “trans-splicing” como o de

poliadenilação em tripanossomatídeos.

A funcionalidade desses mRNAs construídos especialmente em

Tripanossomatídeos e a razão para a ocorrência deles em apenas poucos

organismos são ainda desconhecidas. Contando com o importante papel da

extremidade 5’ do mRNA durante a iniciação da tradução em eucariotos, a

seqüência SL e sua estrutura cap associada são esperadas para

desempenhar um papel significante na iniciação da tradução, e

possivelmente estarem envolvidas num mecanismo de iniciação singular

(Gao H et al., 2005).


27

a)

b)

Figura 4: Esquema ilustrando o processamento do mRNA através dos mecanismos de “cis-

splicing” ou “splicing” convencional (a) e de “trans-splicing” (b).

Promotor

Exons

Introns

Regiões intergênicas

DNA1 2 3 41 2 3

Transcrição e adição do Cap

RNA

Cap

Poliadenilação

AAAAAAAAA

AAAAAAAAA

Cis -splicing

AAAAAAAAA

Transporte Núcleo/Citoplasma

Tradução

Ribossomos

TRANSCRIÇÃO E CIS-SPLICING EM EUCARIOTOS

RNA 2 RNA 3 RNA 4

DNAGene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 4

Transporte Núcleo/Citoplasma

AAAAAAAAA

Tradução

TRANSCRIÇÃO E TRANS-SPLICING EMTRIPANOSSOMATÍDEOS.

Transcrição

adição do Cap

Trans –splicing

Poliadenilação

RNA 1

Promotor

Regiões intergênicas

Cap

Ribossomos

SL

Cauda poli-A


28

3.3- Iniciação da Síntese Protéica em Eucariotos

Um dos mecanismos usados pelos eucariotos para regular a

expressão gênica é o controle das taxas de tradução. A regulação da

tradução desempenha um papel crítico no crescimento, na proliferação e no

desenvolvimento celular. Vantagens no controle da tradução incluem

resposta rápida e um modo de atingir o nível de um produto gênico na

ausência de transcrição. As taxas de tradução podem ser controladas em

cada um dos seus três estágios: iniciação, elongação e terminação. Contudo,

a regulação ocorre predominantemente na iniciação, onde o ribossomo é

recrutado para um mRNA e posicionado no códon de iniciação (Gingras A-C

et al., 1999).

A tradução do mRNA em proteínas se inicia após a montagem do

ribossomo 80S através da interação entre tRNA iniciador (tRNAi), mRNA e as

subunidades 40S e 60S. O complexo processo de iniciação que leva a

formação do ribossomo 80S consiste em vários estágios relacionados que

são mediados pelos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs) (Pestova TV et

al., 2001). Estes estágios são:

1- Seleção do RNA transportador inicial (tRNAi) a partir do “pool” de

tRNAs pelo fator de iniciação eIF2 e ligação de um complexo ternário

(eIF2 / GTP / tRNAi) e outros eIFs a subunidade 40S para formar o

complexo de pré-iniciação 43S.

2- Ligação do complexo 43S ao mRNA, o que na maioria das vezes

ocorre por um mecanismo que envolve o reconhecimento inicial do

cap na extremidade 5' do mRNA pela subunidade eIF4E (cap-binding-

protein) do complexo eIF4F.

3- Movimento do complexo ribossomal ligado ao mRNA ao longo da

região 5' não traduzida (5' UTR) a partir do sítio inicial de ligação até


29

o códon de iniciação para formar o complexo 48S no qual este códon

tem suas bases pareadas com as bases do anticódon do tRNAi.

4- Desligamento dos fatores de iniciação do complexo 48S e junção da

subunidade 60S para formar o ribossomo 80S, deixando o tRNAi no

sítio P ribossomal.

3.3.1 – Complexo eIF4F

Os fatores de iniciação do complexo eIF4F são responsáveis pelo

recrutamento do mRNA para o ribossomo. O eIF4F é um complexo composto

por 3 polipeptídeos: (a) eIF4A, uma ATPase RNA-dependente e RNA

helicase; (b) eIF4E, a proteína de ligação ao cap, de 24 KDa; e (c) eIF4G,

uma proteína grande contendo sítios de ligação para eIF4E, eIF4A, eIF3 e

PABP (Proteína de ligação à cauda Poli-A). O eIF4F interage tanto com o cap

(através do eIF4E) quanto com o eIF3 associado ao ribossomo (através do

eIF4G). Assim, o eIF4F exerce uma função essencial na ligação entre o

mRNA e o ribossomo (Gingras A-C et al., 1999).

O fator eIF4A é um polipeptídeo de 46KDa que exibe atividades

ATPase dependente de RNA e RNA helicase bidirecional. Essa proteína age

removendo regiões de estrutura secundária dentro da região 5' não

traduzida (5' UTR) do mRNA para facilitar a ligação do ribossomo e sua

migração até o códon de iniciação da tradução (Li W et al., 2001). Há três

isoformas em mamíferos: eIF4AI, eIF4AII e eIF4AIII. O eIF4AII humano

apresenta alta homologia com o eIF4AI (89% de identidade) e é

funcionalmente equivalente. Em contraste, o fator eIF4AIII (com 66% de

identidade ao eIF4AI em humanos) não pode substituir o eIF4AI em ensaios

de ligação a ribossomos. Resultados recentes indicam que a localização do

eIF4AIII é no núcleo (Holzmann K et al., 2000) e que ele pode agir como um


30

fator ancorador para o complexo de junção de exon (“EJC” de Exon Junction

Complex) (Chan CC et al., 2004) e é essencial para o decaimento de mRNAs

com mutações “non-sense” em mamíferos (Palácios IM et al., 2004). A

atividade helicase do eIF4A é fortemente estimulada pelo eIF4B. Embora o

eIF4A e o eIF4B interajam bioquimicamente e geneticamente, não há

nenhuma evidência que essas proteínas interagem fisicamente de uma

maneira estável (Gingras A-C et al., 1999). Recentemente, foi encontrado

um homólogo necessário para reconstituir a tradução em E. coli, fator W2,

que é codificado pelo gene “deaD” o qual apresenta 87% de similaridade na

seqüência de aminoácidos ao fator eucariótico eIF4A. Anticorpos contra o

eIF4A eucariótico apresentam reação cruzada com a proteína em E. coli.

Este fator procariótico se mostrou capaz de promover a tradução em ensaios

onde os mRNAs apresentavam estrutura secundária, mas não naqueles onde

o mRNA não possuía essa característica (Lu J et al., 1999).

O fator eIF4E foi identificado por sua habilidade de se ligar ao cap e

foi subseqüentemente purificado por cromatografia de afinidade numa

matriz contendo cap sintético imobilizado. O eIF4E é responsável pelo

reconhecimento do cap na iniciação e é essencial para a tradução cap-

dependente. A depleção do eIF4E (e proteínas associadas) de extratos

celulares reduz drasticamente a tradução de mRNAs com cap na sua

extremidade 5’; sua atividade total é restaurada pela adição de eIF4E

expressos em bactérias ou eIF4E nativos purificados (Gingras A-C et al.,

1999). Esse fator desempenha uma importante papel no processo de

tradução pela sua ligação ao cap na extremidade 5' do mRNA, recrutamento

dos demais fatores de iniciação e também da subunidade 40S para o mRNA.

O eIF4E é implicado no controle do crescimento e da sobrevivência celulares

(Proud CG, 2002). Altos níveis de expressão desse fator podem desfazer o

controle do crescimento celular e estão relacionados com cânceres humanos

(Scheper GC and Proud CG, 2002). Em experimentos controle onde o eIF4E


31

foi omitido (estava ausente), o complexo ribossomal 48S foi formado na

posição correta, contudo com muito menos eficiência (Morino S et al.,

2000). Estudos recentes utilizando formas mutantes de eIF4E revelaram que

esse fator, assim como o eIF4G, pode recrutar ribossomos independente de

uma ligação física com a extremidade 5' do mRNA ou com o cap (De

Gregorio E et al., 2001). O eIF4E interage com o eIF4G, para a formação do

complexo eIF4F, através de um sítio pelo qual também interage com

proteínas inibitórias chamadas 4E-BPs (“4E-binding-protein”). A associação

do eIF4E com as 4E-BPs o impede de formar um complexo de iniciação

produtivo com o eIF4G; as 4E-BPs, assim, agem como inibidores de

tradução cap-dependente. Esses inibidores, quando sofrem fosforilação, se

desligam do eIF4E. Aminoácidos, insulina e fatores de crescimento estão

entre os numerosos estímulos conhecidos para aumentar a fosforilação das

4E-BPs e assim promovem a formação do complexo eIF4F (Scheper GC and

Proud CG, 2002).

Há duas isoformas de eIF4G em mamíferos, eIF4GI e eIF4GII, que

apresentam 46% de identidade e têm massas moleculares de 171 kDa e 176

kDa, respectivamente. O eIF4G possui sítios de ligação para o eIF4E, eIF4A,

eIF3 e PABP e atua como uma ponte entre o ribossomo e o mRNA (Gingras

A-C et al., 1999). O eIF4GI de mamífero pode ser dividido em três regiões

aproximadamente iguais; uma região amino-terminal que contém sítios de

ligação para a PABP e para o eIF4E; uma região central que liga o eIF4A e o

eIF3; e uma região carboxi-terminal que possui um segundo sítio de ligação

ao eIF4A. Relatos anteriores demonstraram que a região central do eIF4GI é

suficiente para uma tradução cap-independente. Uma seqüência de 540

aminoácidos contendo o sítio de ligação ao eIF4E e a região central do

eIF4GI, é a seqüência mínima requerida para a tradução cap-dependente.

De acordo com isso, um ponto de mutação no eIF4GI que abole a ligação ao

eIF4A na região central inibiu completamente a ligação ao cap. Quando o


32

sítio de ligação na região C-terminal do eIF4GI foi mutado, a ligação ao

ribossomo foi diminuída em 3-4 vezes. Esses dados indicam que a interação

do eIF4A com a região central do eIF4GI é necessária para a tradução,

enquanto que a interação do eIF4A com a região C-terminal desempenha um

papel de modulação (Morino S et al., 2000). Um outro dado encontrado foi

que a região central do eIF4G se liga ao eIF4A com uma afinidade 20 vezes

maior do que a região C-terminal. O eIF4G se associa com o eIF4AI ou

eIF4AII, mas não com ambos simultaneamente, sugerindo uma razão de 1:1

em lugar de 1:2 (Li W et al., 2001).

3.3.2- Proteínas Ribossomais

3.3.2.1- Proteína P0

Ensaios recentes de cristalografia ribossomal revelaram a estrutura

detalhada do ribossomo, a organela celular universal para a tradução do

código genético em proteínas (Gindulyte A et al., 2006). Enquanto a

estrutura primária das proteínas ribossomais de eucariotos é conhecida, um

grande avanço também tem sido feito em relação ao entendimento da

estrutura terciária do ribossomo de várias espécies, entre elas, espécies da

família Tripanosomatidae. Recentemente, a estrutura do ribossomo 80S do

Trypanosoma cruzi foi elucidada. Em comparação com as estruturas

ribossomais de outras espécies, o ribossomo do T. cruzi mostrou a presença

de componentes estruturais não usuais, relacionados a grandes segmentos

na estrutura secundária do rRNA (Figura 5). Acredita-se que esses

componentes ribossomais diferenciados estejam envolvidos no mecanismo

único de iniciação da tradução nos tripanossomatídeos (Gao H et al., 2005).

Apesar disso, ainda falta o conhecimento sobre o papel de proteínas


33

ribossomais na montagem do ribossomo e no processo de tradução

(Tchórzewski M et al., 2003).

Como exemplo, uma família de proteínas cujo comportamento e

função na célula ainda são vagos são as proteínas ácidas ribossomais P.

Estas proteínas formam uma protuberância lateral, chamada de estrutura

em haste (“stalk”) que é localizada na parte ativa do ribossomo, onde

interações entre mRNAs, tRNAs e fatores de tradução acontecem durante o

curso da síntese protéica (Tchórzewski M et al., 2003).

As proteínas P constituem uma família de proteínas ácidas

ribossomais em um ambiente onde a maioria das proteínas é básica e se

localizam dentro da subununidade ribossomal 60S. Em eucariotos, a família

de proteínas P é formada por três membros, P0, P1 e P2, os quais formam

um complexo pentamérico no qual os homodímeros P1/P2 são anexados a

uma única proteína P0 através de suas extremidades NH2-terminal (Skeiky

YAW et al., 1994).

Para entender o mecanismo de biogênese do ribossomo e a função

das proteínas ribossomais, cada proteína ribossomal deve ser estudada

individualmente. Estudos feitos com essas proteínas mostraram a localização

subcelular das proteínas ácidas ribossomais P, as proteínas P1, P2 e P0,

usando abordagens in vivo assim como in vitro. Nesses estudos, foram

mostradas evidências de que essas proteínas não são transportadas

ativamente para dentro do núcleo, mostrando um comportamento único de

proteínas ribossomais o qual não tinha sido descrito até o momento

(Tchórzewski M et al., 2003).


34

Figura 5: Esquema da estrutura dos ribossomos. Figura ilustrativa mostrando as

subunidades em dois pontos de vista do ribossomo de três organismos distintos. Como

observado, o ribossomo 80S do T. cruzi mostra uma maior complexidade entre os demais.

Fonte: Gao H et al., 2005.

Ribossomos de Tripanossomatídeos

Ribossomos de Leveduras

Ribossomos de Bactérias

Ribossomos de Tripanossomatídeos

Ribossomos de Leveduras

Ribossomos de Bactérias


35

3.3.3- Iniciação da tradução em tripanossomatídeos

A iniciação da tradução em tripanossomatídeos é um processo que

vem sendo estudado intensamente por pesquisadores do Departamento de

Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM). A

identificação de homólogos de fatores de iniciação da tradução de L. major

foi possível através de análise do genoma completo deste parasita, cujas

seqüências estão disponíveis no GenBank e em bancos de dados de acesso

livre. Neste projeto genoma foram seqüenciados 36 cromossomos com um

total de 32.8 megabases, onde foram encontrados 911 genes de RNA, 39

pseudogenes e 8272 genes que codificam proteínas, e para apenas 36%

destes genes pode ser atribuída uma função putativa (Ivens et al., 2005).

Os resultados previamente obtidos pelo grupo do CPqAM serviram

de base para análise da expressão dos fatores de iniciação da tradução e

suas interações dentro do parasita L. major. Assim, a análise das funções

dos diferentes homólogos identificados teve início com a amplificação e

clonagem das seqüências codificando para os homólogos aos eIF4E, eIF4A e

eIF4G de L. major (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5,

respectivamente). Essas seqüências foram utilizadas para a expressão das

diferentes proteínas em Escherichia coli e produção de soro policlonal

específico. Os resultados tiveram início com a caracterização preliminar dos

LmEIF4E1-3, LmEIF4A1-2, LmEIF4G3. No começo, foi realizada a

quantificação da expressão dessas proteínas em promastigotas de L. major

por Western-blot usando anticorpos específicos. Os LmEIF4A1 e LmEIF4E3

são muito abundantes (> 5 x 104 moléculas/célula). O LmEIF4G3 é

moderadamente abundante (5x103-104 moléculas/célula) e os LmEIF4E1 /

LmEIF4E2 / LmEIF4A2 são raros ou não detectados (< 5 x 103

moléculas/célula). Depois, foi investigada a atividade de ligação ao cap dos

homólogos ao eIF4E onde foi encontrado que apenas o LmEIF4E1 foi capaz


36

de se ligar a resina 7-metil-GTP-Sefarose com uma afinidade similar àquela

do eIF4E de Xenopus. A modelagem molecular confirmou que o LmEIF4E1

tem todas as características estruturais de uma proteína de ligação ao cap.

Ensaios de “pull-down” foram usados para investigar a interação potencial

entre eIF4A (LmEIF4A1/ LmEIF4A2) e os homólogos do eIF4G (LmEIF4G1-

3). Apenas o LmEIF4G3, através do domínio HEAT, se ligou especificamente

tanto ao homólogo do parasita LmEIF4A1 quanto ao fator humano eIF4A.

Assim, para cada fator, uma das formas encontradas em L. major parece

realizar em parte, pelo menos, as funções esperadas de um fator de

iniciação da tradução. Estes resultados são consistentes com as funções

esperadas para estes fatores na tradução do mRNA do parasita (Dhalia R et

al., 2005).

Paralelamente, alguns estudos têm sido realizados com a proteína

P0 de algumas espécies de tripanossomatídeos, como por exemplo, a LcP0,

a proteína P0 de Leishmania chagasi, a qual é reconhecida durante infecções

humanas com esse parasita. A proteína é homóloga às proteínas ribossomais

de Trypanosoma cruzi e de humano TcP0 e HuP0, respectivamente. O

domínio ácido C-terminal altamente carregado da LcP0 contém um resíduo

de serina tipicamente encontrado na maioria dos eucariotos, mas ausente

em todas as proteínas P de T. cruzi caracterizadas até o momento.

Indivíduos infectados com L.chagasi, assim como aqueles com T.cruzi têm

anticorpos que apresentam reação cruzada com as LcP0 e TcP0

recombinantes e também com a HuP0. Contudo, as propriedades dos

anticorpos anti-P0 em soros de infecções por T.cruzi e L.chagasi são um

tanto diferentes. Através do uso de peptídeos sintéticos, foi mostrado que

enquanto os anti-TcP0 em infecções com T. cruzi são exclusivamente

dirigidos conta a região C-terminal do TcP0, soros de infecção com L.

chagasi contêm anticorpos que reagem com epitopos diferentes da

seqüência C-terminal do TcP0 (Skeiky YAW et al., 1994). Outros resultados

também demonstram que enquanto o domínio de ligação ao RNA da proteína


37

P0 é funcionalmente conservado em eucariotos, as regiões envolvidas nas

interações proteína-proteína com outras proteínas da haste ou fatores de

elongação da tradução têm evoluído notavelmente (Rodriguez-Gabriel MA et

al., 2000). Uma característica também examinada da proteína ribossomal P0

foi sua propriedade imunogênica onde se observou que, em camundongos

imunizados com a construção plasmidial pcDNA3-LiP0 (proteína P0 de L.

infantum), uma proteção notável contra infecção com L. major foi atingida,

como determinada tanto pelo desenvolvimento da lesão quanto pela carga

parasitária (Iborra S et al., 2003).

3.4- Proteínas de Expressão Estágio-Específica em Leishmania

A identificação de genes cujos produtos mostram uma forte

expressão estágio-específica é um ponto muito relevante na patogênese

microbiana para a identificação de importantes caminhos essenciais para a

sobrevivência do parasita. O entendimento de como a Leishmania

desempenha as transições em seu desenvolvimento e dos mecanismos que

ela emprega para sobreviver dentro de cada hospedeiro é crítico para o

desenvolvimento de tratamentos efetivos e cura dessa parasitose

(Akopyants NS et al., 2004). Infelizmente, poucos exemplos de proteínas de

expressão estágio específica bem caracterizadas em Leishmania são

conhecidos. Duas proteínas com resultados relevantes na literatura são as

proteínas META1, específica da fase promastigota metacíclica de Leishmania,

e A2, expressa na fase amastigota de algumas espécies de Leishmania.


38

3.4.1- Proteína META1

Em Leishmania e em outros tripanossomatídeos, genes expressos

de forma específica no estágio infectivo do ciclo de vida do parasita são tidos

como candidatos para o desenvolvimento de novos profiláticos (Uliana SRB

et al., 1999). Entre os genes estágio-específicos identificados em L. major, o

gene meta 1 está presente e conservado em seqüência em todas as espécies

de Leishmania analisadas até o momento (Ramos CS et al., 2004). O gene

meta 1, originalmente identificado em biblioteca de cDNA (Coulson RMR and

Smith DF, 1990), é expresso pela L. major no estágio encontrado no inseto,

predominantemente na fase infectiva e resistente ao complemento,

chamada de promastigota metacíclica, a qual é preparada para

sobrevivência no hospedeiro. A expressão do gene meta 1, em níveis basais

de RNA, é baixa em promastigotas procíclicas e amastigotas comparada com

os altos níveis encontrados em promastigotas metacíclicas. Esse padrão de

expressão pode indicar um papel funcional para a proteína META 1 nesse

estágio infectivo do parasita. Alguns experimentos mostraram que não é

possível gerar um mutante duplamente nulo para o lócus do gene meta1,

sugerindo uma função essencial para este gene. Quando teve sua expressão

aumentada, foi demonstrada uma co-relação entre a expressão do gene

meta1 e virulência in vivo (Uliana SRB et al., 1999). O mRNA meta 1 é

expresso em altos níveis em promastigotas metacíclicas e codifica uma

proteína citoplasmática de aproximadamente 12 kDa que é concentrada em

vacúolos ao redor da bolsa flagelar. A proteína META1 também se comporta

como um forte indutor de resposta imune tipo Th2 em hospedeiros

mamíferos (Ramos CS et al., 2004). Tanto a proteína META1 recombinante

quanto plasmídeos carregando o gene meta1 foram testados quanto a sua

antigenicidade e potencial em induzir imunidade protetora em camundongos.

A vacinação com a proteína recombinante induziu uma resposta

predominante do tipo Th2 e não resultou em proteção ao término do desafio


39

com parasitas vivos. Surpreendentemente, a mudança esperada para uma

resposta do tipo Th1-CD4+ ao término da imunização genética por via

intramuscular não foi observada. Em lugar disso, a vacinação com o gene

meta 1 ou com o gene fusionado a uma proteína induziu uma resposta do

tipo Th2 que se correlacionou com a ausência de proteção contra a infecção

(Serezani CHC et al., 2002).

Em estudos onde a região ao redor do gene meta 1 foi

caracterizada com respeito ao seu conteúdo gênico e padrão de expressão,

em L. amazonensis, visando primariamente uma comparação entre as

regiões homólogas em L. major, Trypanosoma brucei e T. cruzi, foi

encontrado um gene relacionado ao meta 1, chamado de meta 2. Sua região

C-terminal é similar a de proteínas encontradas em Leishmania e

Trypanosoma, cuja função em células animais está relacionada com

processos celulares como remodelagem das junções

citoesqueleto/membrana, vias de transdução de sinais e apoptose. Essa

putativa proteína META 2 contém três cópias do domínio META, sugerindo

uma relação funcional desta com a proteína META 1. Uma futura

determinação do papel da proteína META 2 em Leishmania, assim como

possíveis interações entre as diferentes proteínas META, podem gerar

subsídios para uma elucidação dos mecanismos de virulência em Leishmania

(Ramos CS et al., 2004).

3.4.2- A família A2

Uma família de proteínas de expressão estágio específica de

amastigotas de Leishmania já bem caracterizada é a que compreende as

proteínas A2. Há, pelo menos, sete membros da família de genes A2 que

codificam proteínas entre 45 e 100 Kda que são constituídas principalmente

de uma seqüência repetitiva de aminoácidos e se localizam principalmente

no citoplasma (Zhang WW et al., 1996). Os genes que codificam para as


40

proteínas A2 em L. donovani foram previamente descritos como expressos

no estágio de desenvolvimento amastigota, mas também podem ser

induzidos experimentalmente em promastigotas pela combinação de

mudanças de pH e temperatura, condições que mimetizam o compartimento

fagolisossomal do macrófago. Os genes A2, contudo, não estão presentes

em todas as espécies de Leishmania e estão ausentes em L. major (Ghedin

et al., 1997).

Considerando a importância das formas amastigotas na infecção

humana, tentou-se entender os mecanismos associados a expressão

diferencial das proteínas A2 em amastigotas. Os resultados mostraram

evidências de que a expressão da proteína A2 durante a citodiferenciação de

promastigota para amastigota é mediada através do controle da estabilidade

do seu mRNA e envolve a sua região 3’ não traduzida (Charest H et al.,

1996).

Em trabalhos que tinham o objetivo de definir a base molecular da

sobrevivência da amastigota de Leishmania donovani no hospedeiro

mamífero, a família de proteínas A2 foi utilizada. Sua expressão, assim como

os mRNAs codificando para as proteínas A2, foi inibida em amastigotas

utilizando RNA anti-senso. O resultado mostrou que as amastigotas

deficientes das proteínas A2 foram severamente comprometidas com

respeito à virulência em camundongos. As amastigotas que chegaram a

sobreviver nos camundongos tinham recuperado a expressão das proteínas

A2. Esses dados demonstraram que as proteínas A2 são requeridas para a

sobrevivência da L. donovani no hospedeiro mamífero e isto representa o

primeiro fator de virulência específico de amastigotas identificado em

Leishmania. Já em experimentos realizados em culturas de amastigotas ou

promastigotas in vitro não houve nenhuma alteração significante na taxa de

crescimento ou morfologia do parasita, sugerindo que as proteínas A2 não

são requeridas para a proliferação do parasita in vitro (Zhang WW and

Matlashewski G, 1997).


41

Outros estudos demonstraram que a proteína A2 pode ser um

antígeno utilizado para diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral

(Ghedin E et al., 1997) e uma das outras funções sugeridas para a proteína

A2 é seu envolvimento na visceralização da Leishmaniose associada a L.

donovani (Zhang WW and Matlashewski G, 2001).

3.5- Diferenciação Celular em Leishmania e Regulação da Tradução

Como visto, em tripanossomatídeos, assim como em todos os

eucariotos, a síntese de proteínas depende das atividades dos fatores de

iniciação da tradução, tanto facilitando como controlando o acesso dos

ribossomos aos mRNAs. A quase total ausência de mecanismos de controle

da síntese de mRNAs nos tripanosomatídeos torna de grande importância

um estudo detalhado sobre como é regulada a sua tradução, principalmente

quando se leva em conta os vários estágios de diferenciação celular pelos

quais estes organismos passam ao longo do seu ciclo de vida. Em eucariotos

de uma forma geral, o conhecimento que se tem até o momento sobre os

princípios cinéticos que estão envolvidos no controle da tradução é muito

limitado, assim como detalhes sobre concentrações relevantes dos fatores

são escassos (Von der Haar T and McCarthy JEG, 2002). Gerar informações

sobre os níveis intracelulares dos eIFs nos organismos de estudo, para

investigar de que forma as concentrações de fatores específicos se

relacionam com o alcance de ótimas taxas de tradução, é um objetivo muito

importante a ser atingido.

Os dados de expressão dos homólogos de eIF4F já analisados de

Leishmania se restringem apenas ao estágio promastigota do seu ciclo de

vida (Dhalia R et al., 2005). Tendo em vista as diferenças significativas

observadas nos níveis de eIF4E, como exemplo, é importante verificar se

essas diferenças são mantidas ao longo de todas as formas de vida do


42

parasita. Dados da literatura sugerem que o homólogo LmEIF4E1 pode ter

uma expressão preferencial no estágio amastigota (Boucher N et al., 2002).

Desta forma, este trabalho se iniciou com o objetivo de comparar os níveis

desses fatores com o de proteínas comprovadamente envolvidas na

atividade de síntese da cadeia polipeptídica, em tripanossomatídeos. Como

exemplo, temos as próprias proteínas componentes das subunidades

ribossomais. Um exemplo é a proteína ácida ribossomal P0, já descrita. Esse

estudo comparativo visa encontrar, por exemplo, a razão fator/ribossomo, o

que pode nos mostrar se os nossos fatores são limitantes para a síntese

protéica ou se apresentam outro papel na regulação deste processo. Por

outro lado, buscou-se otimizar as condições de crescimento das três

principais formas do ciclo de vida de espécies selecionadas de Leishmania e

analisar a expressão nestas formas da proteína P0 em comparação com

homólogos selecionados das subunidades do complexo eIF4F de Leishmania.

Sendo assim, tornou-se necessário confirmar a obtenção das formas

celulares diferenciadas pela visualização da síntese de proteínas estágio

específicas destes protozoários, tais como a proteína A2 (fase amastigota) e

a proteína META 1 (fase promastigota metacíclica), tidas como indicadoras

de diferenciação do parasita. Com este estudo espera-se poder contribuir no

entendimento dos processos de diferenciação celular em Leishmania, assim

como da importância de mecanismos de regulação pós-transcricional, agindo

ao nível de tradução, no controle desta diferenciação. Estas informações

poderão servir de base para novas estratégias de combate à infecção, como

por exemplo, a confecção de quimioterápicos eficazes utilizados na inibição

específica da síntese de proteínas desses parasitas.


43

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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52

5. MMAANNUUSSCCRRIITTOO DDEE AARRTTIIGGOO CCIIEENNTTÍÍFFIICCOO


53

Análise da expressão de fatores protéicos envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.

Pollyanna O. Rochaa,b, Mariana L. Palmab, Osvaldo P. de Melo Netoa,b

aDepartamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Professor Moraes Rego s/n,

Cidade Universitária, Recife 50732-970, PE, Brasil bCentro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Avenida Professor Moraes Rego s/n,

Cidade Universitária, Recife 50670-420, PE, Brasil

Manuscrito a ser encaminhado à revista

MMoolleeccuullaarr aanndd BBiioocchheemmiiccaall PPaarraassiittoollooggyy


54

RESUMO

Em eucariotos, a síntese de proteínas é um processo complexo cuja etapa

crítica, a iniciação, requer um número de fatores de iniciação da tradução (eIFs),

entre eles o complexo eIF4F, composto por três subunidades: eIF4A, eIF4E e eIF4G.

Em Leishmania major e outros tripanossomatídeos patogênicos pouco se conhece

sobre a iniciação de sua tradução, entretanto múltiplos homólogos foram identificados

para cada uma das subunidades de eIF4F (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5).

Em estudos prévios, essas proteínas tiveram sua expressão quantificada na fase

promastigota do ciclo de vida de L. major, revelando uma grande variação nos seus

níveis intracelulares. Neste trabalho partiu-se para comparar a expressão de algumas

destas proteínas com a de uma proteína ribossomal (P0), cujos níveis intracelulares

são indicativos do número de ribossomos presentes no organismo. Foram analisadas

os três principais estágios do ciclo de vida de L. chagasi e L. amazonensis,

promastigota (Pm), promastigota metacíclico (PmMt) e amastigota (Am). Estas

espécies foram selecionadas por ser possível sua diferenciação em cultura. Anticorpos

contra proteínas de expressão estágio-específica, as proteínas A2 (expressa em Am)

e META1 (PmMt), foram produzidos e utilizados para monitorar esta diferenciação,

embora só a proteína META1 tenha se mostrado útil nesta análise. Formas

semelhantes à amastigota foram observadas por microscopia. Foram detectados altos

níveis da proteína ribossomal P0 (~6,6x105 moléculas/célula na forma Pm) com

pouca variação entre os três estágios analisados. Em comparação, a expressão do

homólogo de eIF4G, LmEIF4G3, também se mostrou constante, enquanto que o

homólogo LmEIF4G1 só foi detectado nas formas Pm e Am do parasita. Ensaios com

outros homólogos de eIF4F estão sendo realizados, esperando-se caracterizar melhor

os processos que envolvem a iniciação da tradução em Leishmania e o controle da

sua diferenciação celular.

Palavras-chave: Trypanossomatídeos, Iniciação da Tradução, Ciclo de vida da

Leishmania, Expressão estágio específico e Proteína ribossomal.


55

1.Introdução

O gênero Leishmania (Ross, 1903) agrupa espécies de

protozoários unicelulares, heteroxenos, parasitos pertencentes à ordem

Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae, encontrados na forma

flagelada promastigota, no trato digestivo dos hospedeiros invertebrados,

e amastigota, sem flagelo livre, parasita intracelular obrigatório das

células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados

[1]. Este gênero é responsável pela zoonose endêmica Leishmaniose em

cerca de 88 países. Cerca de 400 mil casos novos são confirmados

anualmente em todo o mundo, onde aproximadamente 350 milhões de

pessoas encontram-se em áreas de risco [2].

Os tripanossomatídeos são protozoários eucariotos que

divergiram precocemente da linhagem principal dos eucariotos. A

Leishmania, como outros tripanossomatídeos, exibe uma combinação não

usual de mecanismos de expressão gênica. Os protozoários

tripanossomatídeos usam uma abordagem transcricional policistrônica, na

qual pré-RNAs sintetizados ao longo de centenas de Kilobases produzem

RNAs monocistrônicos após reações acopladas de “Trans-splincing” e

“Poliadenilação”. Assim, a dependência de mecanismos de iniciação da

transcrição baseados em um promotor para o controle do nível de mRNA

é muito reduzida; talvez como resultado, grande ênfase pode estar

presente nos mecanismos de regulação pós-trancricional, tais como

estabilidade e tradução do mRNA e o “turn over” de proteínas [3].

Em eucariotos, a tradução é um processo complexo que requer

uma diversidade de macromoléculas incluindo RNAs e proteínas. Neste

processo, o ponto crítico de iniciação requer um número de fatores de

iniciação da tradução (eIFs, de “eukariotic initiation factors”) cuja

atividade pode ser altamente regulada. Acima de todos esses fatores está

o complexo eIF4F, o qual é necessário para o recrutamento da


56

subunidade menor ribossomal para a extremidade 5’ do RNA mensageiro.

O complexo eIF4F é composto pela RNA helicase eIF4A, pela proteína de

ligação ao cap eIF4E e pela grande proteína central eIF4G, responsável

pela mediação da interação entre o eIF4F e outros fatores da tradução

assim como a subunidade menor ribossomal [4].

Alguns fatores de iniciação da tradução de tripanossomatídeos

já caracterizados incluem subunidades de fatores de elongação tais como

eEF2 e eEF3 [5] e a proteína de ligação à cauda Poli-A, PABP, de T. cruzi,

T. brucei and Leishmania major [6, 7, 8]. Múltiplos homólogos potenciais

para os três componentes do eIF4F foram identificados recentemente e

caracterizados em L. major (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5).

Os homólogos que tiveram suas características analisadas até o momento

parecem variar em diferentes aspectos tais como afinidade de ligação ao

cap dos eIF4Es, níveis de expressão e interação com outros componentes

do eIF4F. Os resultados sugerem um alto grau de complexidade na

iniciação da tradução desses parasitas, o qual pode refletir uma

adaptação ao seu complexo ciclo de vida. Até o momento, contudo, os

dados de expressão dos homólogos analisados se restringem apenas ao

estágio promastigota do ciclo de vida da Leishmania. Os LmEIF4A1 e

LmEIF4E3 se mostraram muito abundantes, o LmEIF4G3 moderadamente

abundante e os LmEIF4E1 / LmEIF4E2 / LmEIF4A2 raros ou não

detectáveis [9]. Um ponto importante para se entender melhor a função

desses vários homólogos então é verificar a sua expressão ao longo do

ciclo de vida de espécies de Leishmania.

Morfologicamente, a Leishmania apresenta duas formas

distintas, enquanto que fisiologicamente são observadas três formas: A

forma promastigota, encontrada no inseto vetor, a forma promastigota

metacíclica, a forma infectante do parasita, e a forma amastigota, forma

parasita do sistema fagocítico monocuclear do hospedeiro vertebrado

[10]. As formas promastigotas podem ser facilmente cultivadas em


57

diferentes tipos de meio. Em contraste, a dificuldade de obter grande

número de amastigotas, livres de contaminantes de células do

hospedeiro, tem impedido a investigação das propriedades metabólicas,

bioquímicas e biológicas [11]. Além dos empecilhos encontrados na

manutenção das amastigotas, um ponto muito importante, e também

difícil, é a confirmação de cada estágio em que a célula se encontra. Para

isso pode-se fazer uso de proteínas sabidamente de expressão estágio-

específico. Exemplos de proteínas de Leishmania já caracterizadas que se

enquadram nessa situação são a proteína META1, cuja expressão é vista

na fase promastigota metacíclica, e a proteína A2, específica da fase

amastigota de algumas espécies de Leishmania.

O gene meta 1, originalmente identificado em biblioteca de

cDNA), é expresso pela L. major no estágio encontrado no inseto,

predominantemente na fase infectiva e resistente ao complemento,

chamada de promastigota metacíclica. A expressão do gene meta 1, em

níveis basais de RNA, é baixa em promastigotas procíclicas e amastigotas

comparada com os altos níveis encontrados em promastigotas

metacíclicas [12]. Em estudos onde as regiões que flanqueiam o gene

meta 1 foram caracterizadas com respeito ao seu conteúdo gênico e

padrão de expressão, em L. amazonensis, visando primariamente uma

comparação entre as regiões homólogas em L. major, Trypanosoma

brucei e T. cruzi, foi encontrado um gene relacionado ao meta 1,

chamado de meta 2, cuja expressão também parece ser estágio

específica [13]. A família de proteínas A2 compreende um grupo de

proteínas das mais estudadas cuja expressão se restringe ao estágio de

amastigota de Leishmania [14]. Há, pelo menos, sete membros da família

de genes A2 que codificam proteínas entre 45 e 100 KDa que são

constituídas principalmente de uma seqüência repetitiva de aminoácidos

e se localizam principalmente no citoplasma [15]. Em trabalhos que

tinham o objetivo de definir a base molecular da sobrevivência da


58

amastigota de Leishmania donovani no hospedeiro mamífero observou-se

que as amastigotas deficientes das proteínas A2 foram severamente

comprometidas com respeito à virulência em camundongos [16].

O conhecimento sobre o balanço de atividades dos fatores de

iniciação da tradução de eucariotos (eIFs) é crucial para o entendimento

dos mecanismos envolvidos no controle da tradução. Com base nisso,

trabalhos recentes estimaram os níveis intracelulares dos eIFs de células

da levedura Saccharomyces cerevisiae na fase logarítmica de

crescimento, o que gerou dados importantes para a base do

desenvolvimento de um modelo quantitativo da maquinaria envolvida na

tradução dos eucariotos [17]. Como visto, os níveis de expressão dos

eIF4Fs de tripanosomatideos variam significativamente em termos

quantitativos. Entretanto o significado real dessa variação não pode ser

totalmente compreendido, em especial quando se leva em conta o pouco

se conhece sobre a síntese protéica nestes organismos. Até mesmo os

níveis intracelulares dos ribossomos destes organismos não foram

devidamente estimados. Recentemente a estrutura do ribossomo de T.

cruzi foi elucidada, embora não se conheça os detalhes do

posicionamento de suas várias subunidades protéica [18] e pouco tenha

se estudado sobre essa organela nos tripanosomatideos. Um grupo de

proteínas ribossomais, cujo comportamento e função na célula eucariótica

ainda são vagos, mas que já foram estudadas em um certo nível nos

tripanosomatideos, são as proteínas ácidas ribossomais P. Estas proteínas

formam uma protuberância lateral, chamada de estrutura em haste

(“stalk”) que é localizada na parte ativa do ribossomo, onde interações

entre mRNAs, tRNAs e fatores de tradução acontecem durante o curso da

síntese protéica. A estrutura em haste é formada por dois heterodímeros

(P1/P2)2, com P1 como uma âncora para o núcleo da proteína ribossomal

P0, a qual é subsequentemente presa ao RNA 28S [19]. Alguns estudos

foram realizados com a proteína P0 de algumas espécies de


59

tripanossomatídeos, como por exemplo, a LcP0, a proteína P0 de

Leishmania chagasi, a qual é reconhecida durante infecções humanas

com esse parasita. [20].

Nesse trabalho, pudemos observar e monitorar a diferenciação

celular de duas espécies representativas do gênero Leishmania, através

da análise da expressão de proteínas estágio específicas e/ou da

microscopia confocal. Em seguida, analisamos a expressão da proteína

ribossomal P0 durante todo o ciclo de vida da Leishmania, assim como

também obtivemos sua quantificação (n° de moléculas por célula). Uma

análise preliminar da expressão de homólogos do fator de iniciação da

tradução eIF4G também foi realizada. Com base nesses resultados,

pretende-se seguir adiante na análise da expressão dos fatores de

iniciação da tradução em espécies do gênero Leishmania, fazendo uso da

metodologia já estabelecida para a diferenciação celular, o que servirá de

base para estudos posteriores sobre esses homólogos e análises

comparativas de padrões de expressão com outros organismos mais bem

estudados.


60

2.Materiais e Métodos

2.1- Crescimento e manutenção em cultura das formas

promastigotas, promastigotas metacíclicas e amastigotas de

Leishmania amazonensis e L. chagasi.

Culturas da forma promastigota de Leishmania amazonensis

LTB0016 (cedida pela Dra. L. Cysne-Finkelstein) e L. chagasi (cepa

Merivaldo – cedida pelo Dr. G. Oliveira) foram estabelecidas a partir de

alíquotas previamente congeladas. A manutenção das culturas foi

realizada em meio LIT (Liver Infusion Triptose) modificado, composto por

Infusão de fígado, Triptose e Sacarose, suplementado com 20% de soro

fetal bovino (SFB), antibióticos (Estreptomicina/Penicilina 0,1%) e

Hemina, 0,1%, em volumes de aproximadamente 3 ml, a 26°C, e

repassados para novo meio a cada 3-4 dias. As culturas de promastigotas

também foram cultivadas em meio M-199 com SFB 10% e

complementado com Glutamina 200 mM, Ácido Fólico 10 mg/ml e

mantidas a 26°C com repiques a intervalos de 3 a 4 dias. A expansão das

culturas foi realizada repassando alíquotas de manutenção para volumes

de cultura de 50 ml do respectivo meio de cultura. Para a indução da

diferenciação de promastigotas em amastigotas foi utilizada a

metodologia descrita em Doyle PS, 1991, com algumas adaptações, onde

os parasitas de ambas as espécies, mantidos em M-199, eram

transferidos para o meio RPMI com SFB a 20% e pH 5,5 a 37°C por até 5

dias.

Alternativamente, para manutenção das culturas de

promastigotas de L. amazonensis e diferenciação em amastigotas, foi

utilizado o protocolo descrito por Cysne-Finkelstein, 1998. Amastigotas

isoladas de lesão de pata de camundongos eram inicialmente cultivadas


61

em meio Schneider com pH 7,2 e temperatura de 26°C, suplementado

com SFB 10%, antibióticos (Estreptomicina/Penicilina 0,1%) e L-

glutamina 1mM até sua diferenciação em promastigotas (3 dias). Para

diferenciação em formas promatigotas metacíclicas, estas culturas eram

mantidas no mesmo meio por, no mínimo, outros 5 dias. Para

diferenciação em amastigotas as células metacíclicas foram reincubadas

no mesmo meio, agora com pH 5,5, a 32°C, resultando após cerca de

duas semanas em amastigotas axênicas viáveis para manutenção e para

re-infecção. Das diferentes culturas, seja promastigota, promastigota

metacíclica ou amastigotas, as células foram coletadas por centrifugação

(1000 g/5 minutos/4°C) e o sedimento ressuspendido em tampão de

proteína SDS-desnaturante (Laemmli 2X). Os extratos protéicos foram

fracionados em gel SDS-PAGE 15% para análise de concentração e

integridade das amostras, assim como para a padronização de

concentração de extratos protéicos de diferentes parasitas.

2.2- Isolamento de Amastigotas de lesão

O procedimento utilizado está de acordo com o descrito por

Bates (1992) com algumas adaptações. A lesão foi retirada

assepticamente e colocada em placa de Petri contendo malha de aço

estéril e meio de cultura (meio Schneider pH 7,2). O tecido foi macerado

com êmbolo de seringa estéril e o homogeneizado foi centrifugado (1000

g/ 3’/ 4°C) para obtenção do sobrenadante contendo amastigotas e

outras células. O sobrenadante foi centrifugado (2000 g/ 3’/ 4°C) para

obtenção de um sedimento contendo apenas as amastigotas e livre de

contaminação das células do hospedeiro. Estas foram ressuspendidas

numa concentração final de 5x105 células/ml do meio Schneider pH 7,2,

SFB 10%. A cultura foi mantida a 26°C por 3 dias e novamente contada

para a mesma concentração final, apenas mudando o pH do meio para


62

5,5 e sua concentração de SFB para 20%. Seis dias depois, a cultura foi

novamente contada e repassada para o mesmo meio ácido com SFB

20%, e mantida a uma temperatura de 32°C. Após 7 dias, a cultura foi

repassada para o meio ácido com a mesma concentração de SFB e a

mesma temperatura. A partir desse 16° dia desde o isolamento da lesão,

as amastigotas foram repicadas rotineiramente a cada 10-14 dias

utilizando o mesmo meio Schneider pH 5,5, SFB 20%.

2.3- Amplificação e clonagem do gene que codifica a

proteína ribosomal P0 de Leishmania major.

A seqüência que codifica para a proteína ribossomal P0 foi

utilizada para desenhar oligonucleotídeos que permitiram amplificar por

PCR, a partir de DNA total de L. major (cepa Friedlin), a seqüência

codificadora para essa proteína. Inicialmente, foram utilizados 2 primers

(3’ - GCG CAC CAC AAG GAG GCT AAG AGA - e 5’ - TGC GCC CAA CAC

CTA CAA CAT ACG) externos à seqüência do gene P0 para a amplificação

do fragmento. Em seguida, utilizou-se um par de primers internos

contendo os sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI (3’ - TG

CTC GAG GAA GAG ACC GCC CAT GCC GAA G - e 5’ - CTA GGA TCC ATG

CCG TCT ATC ACC ACT GCC, respectivamente). O produto de PCR foi

então clonado em vetor plasmidial de expressão pET21a (série pET da

Novagen) visando a produção da respectiva proteína em E. coli fusionada

a uma seqüência de poli-histidinas.


63

2.4- Expressão em Escherichia coli das proteínas A2,

META1 e P0 de Leishmania major e purificação das respectivas

proteínas recombinantes.

Os plasmídeos contendo os genes codificando para as proteínas

de expressão estágio- específico A2 (Matlashewski G, 1996 [15]), e

META1 (Uliana e cols., 1999 [12]), respectivamente nos vetores pET16b e

pQE-30, foram cedidos para utilização em nosso trabalho. As construções

plasmidias contendo as seqüências codificantes para as proteínas A2,

META1 e P0, foram inseridas em E. coli, cepa Bl21, por choque térmico

(A2 e META1), ou por eletroporação (P0). Após a produção dessas

proteínas (A2 e META1, ambas contendo suas respectivas caudas de

Histidina na região N-terminal, e P0, com a cauda de histidinas na

extremidade C-terminal), utilizando o IPTG, por 4 horas a 30°C, estas

foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de Ni-NTA

Agarose (Qiagen) segundo o protocolo do fabricante. As proteínas foram

eluídas na presença de concentrações variadas de Imidazol (de 50 a 200

mM) e então utilizadas para imunização de coelhos para produção de soro

policlonal. A proteína P0 ainda apresentou uma etapa posterior de

solubilização, a qual foi realizada com tampão de Uréia.

2.5– Produção de soros policlonais específicos e análise

da expressão dos homólogos aos fatores de iniciação da tradução

de tripanossomatídeos por “Western-Blot”.

A obtenção de soro foi realizada pela imunização de coelhos

adultos com as proteínas recombinantes embebidas em gel (200 µg de

cada proteína, 4 pulsos de imunização, a cada 15 dias), no Laboratório de

Microbiologia do CPqAm. Os soros produzidos contra as proteínas A2,

META1 e P0 foram utilizados em ensaios de “Western-Blot” com os


64

extratos celulares das formas promastigota, promastigota metacíclica e

amastigota de L. chagasi e L. amazonensis. Para tal, alíquotas das

diferentes culturas de parasitas foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e

então transferidas para membrana PVDF (“Polyvinylidene Difluoride

Membrane”-Immobilon-P – Millipore®) para a realização de ensaios de

detecção por anticorpo (“Western-Blot”). A primeira incubação foi

realizada em solução de TBS 1x, leite 1% e Tween-20 a 0,05% com seus

respectivos soros policlonais específicos dos diferentes homólogos, na

diluição necessária. A segunda incubação foi realizada com o anticorpo

(anti-IgG de coelho) conjugado a peroxidase na diluição de 1:3000. O

“Western-blot” foi revelado por quimioluminescência (técnica ECL –

“Enhanced Chemioluminecency”).

2.5- Purificação dos anticorpos específicos contra os

homólogos por Imunoadsorcão

A proteína recombinante P0, utilizada na produção do soro

policlonal específico, foi fracionada por eletroforese em gel SDS-PAGE

15% para posterior transferência para membrana PVDF. Em seguida, a

membrana foi corada com 0,2% Rouge Ponceau /1% TCA para

visualização da banda referente à proteína em questão. A saturação da

membrana foi realizada com leite 1% em PBS 1x e Tween-20 a 0,05%

durante 30 minutos a 4°C. A membrana foi incubada com o soro

policlonal produzido contra a proteína P0 (1:1 soro/PBS 1x) a 4°C, sob

agitação, durante a noite. A eluição apenas dos anticorpos específicos foi

realizada por tratamento da membrana com solução de Glicina ácida

0,1M (pH 2,5), temperatura ambiente, seguida de neutralização da

solução resultante com 1/10 de volume de Tris-HCl 1M pH 8,0 e igual

volume (soma dos volumes da Glicina e do Tris-HCl) de PBS 2x.


65

3.Resultados

3.1 Alinhamento múltiplo das seqüências de

aminoácidos da proteína ribossomal P0.

Enquanto a estrutura primária das proteínas ribossomais de

eucariotos é conhecida, e um grande avanço tem sido feito em relação

ao entendimento da estrutura terciária do ribossomo de várias espécies,

pouco se sabe sobre o papel de proteínas ribossomais na montagem do

ribossomo e no processo de tradução. Como exemplo, uma família de

proteínas cujo comportamento e função na célula ainda são vagos são

as proteínas ácidas ribossomais P (P0, P1 e P2). Estas proteínas

participam em várias interações com mRNAs, tRNAs e fatores de

tradução durante o curso da síntese protéica e são representativas de

proteínas constituintes da subunidade maior ribosomal.

Buscando analisar a conservação de seqüência de proteínas

ribosomais em tripanosomatídeo e utilizando-se a proteína P0 como

modelo, iniciou-se este trabalho, comparando a seqüência de

aminoácidos da proteína ácida ribossomal P0 de L. major, identificada

em banco de dados do NCBI, com as seqüências desta proteína de

outros tripanossomatídeos e eucariotos (Trypanosoma cruzi,

Trypanosoma brucei, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisae e

Homo sapiens). O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o

algorítimo Clustal. A figura foi feita no programa Bioedit e o limiar para

o sombreamento utilizado foi de 60% de similaridade. Através desse

alinhamento observamos uma alta conservação dessa proteína

ribossomal entre essas variadas espécies (figura 1).


66

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

L.major 1 --MPSITTAK REYEERLVDC LTKYSCVLFV GMDNVRSQQV HDVRRALRGK AEFMMGKKTL QAKIVEKRAQ AKDASAEAKH FNDQCEEYNL

T.cruzi 1 --MPSVSEAK REYEERFNGC LTKYGRVLFC LMDNVRSQQV HDVRRDLRGL GELVMGKKTL QKKIVERRAE DKKASAYDKL LYNTCIEKKL

T.brucei 1 --MPSVSQEK RDYEDRLNGC LTKYSRVLFC LMDNVRSQQV HGVRRDLRGK GELVMGKKTL QKKIVEKRAE GNKATDADKL FHQVCTDKQL

A.thaliana 1 MVKATKAEKK IAYDTKLCQL IDEYTQILVV AADNVGSTQL QNIRKGLRGD SVVLMGKNTM MKRSVRIHSE NTGNTAILNL LP-------L

S.cerevisae 1 --MGGIREKK AEYFAKLREY LEEYKSLFVV GVDNVSSQQM HEVRKELRGR AVVLMGKNTM VRRAIRGFLS D--LPDFEKL LP-------F

H.sapiens 1 MPREDRATWK SNYFLKIIQL LDDYPKCFIV GADNVGSKQM QQIRMSLRGK AVVLMGRNTM MRKAIRGHLE N--NPALEKL LP-------H

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

L.major 89 LSGNTGLIFT NNAVQEITSV LDAHRVKAPA RVGAISPCDV IVPAGSTGME PTQTSFFQAL NIATKIAKGM VEIVTEKKVL SVGDKVDNST

T.cruzi 89 LCGNTALIFT NEEIPVITAV LDKHRVQAPA RVGAIAPCDV IVPAGNTGME PKATSFFQAL NIATKIAKGT VEIVSDKKVL SVGDRVDNST

T.brucei 89 LCGNTSMIFT NSEVSDITSV LDSHRVQAPA RVGAIAPCDV IVPAGNTGME PKATAFFQAL NIATKISKGT VEIVSDKKVL STGDKVDNST

A.thaliana 84 LQGNVGLIFT KGDLKEVSEE VAKYKVGAPA RVGLVAPIDV VVQPGNTGLD PSQTSFFQVL NIPTKINKGT VEIITPVELI KQGDKVGSSE

S.cerevisae 80 VKGNVGFVFT NEPLTEIKNV IVSNRVAAPA RAGAVAPEDI WVRAVNTGME PGKTSFFQAL GVPTKIARGT IEIVSDVKVV DAGNKVGQSE

H.sapiens 82 IRGNVGFVFT KEDLTEIRDM LLANKVPAAA RAGAIAPCEV TVPAQNTGLG PEKTSFFQAL GITTKISRGT IEILSDVQLI KTGDKVGASE

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

L.major 179 ATLLQKLNIS PFYYQVNVLS VWDRGVLFTR EDLMMTEDMV EKMLMDGLSN VAAMALGAGI PTPSTIGPML VDAFKNLLAV SVATSYEFEE

T.cruzi 179 ATLLQKLDIS PFYYQVEVQS VWDRGMLFLR EDLSITDDVV EKYLLEGISN VAALSLGAGI PTAATLPHMI MDAFKTLLGA SVATEYEFDE

T.brucei 179 ATLLQKLDIS PFYYQVEVQS VWDRGVLFTR EDLSVTDAVV EKYLLEGISN ISAMSLGAGI PTAATLPHMI VDAFKTLLGA SVATNYEFEE

A.thaliana 174 AALLAKLGIR PFSYGLVVQS VYDNGSVFSP EVLDLTEDQL VEKFASGISM VTSLALAVSY PTLAAAPHMF INAYKNALAI AVATEYTFPQ

S.cerevisae 170 ASLLNLLNIS PFTFGLTVVQ VYDNGQVFPS SILDITDEEL VSHFVSAVST IASISLAIGY PTLPSVGHTL INNYKDLLAV AIAASYHYPE

H.sapiens 172 ATLLNMLNIS PFSFGLVIQQ VFDNGSIYNP EVLDITEETL HSRFLEGVRN VASVCLQIGY PTVASVPHSI INGYKRVLAL SVETDYTFPL

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

L.major 269 HNGKELREAA INGLLAGS-- CSAAAEPAAA APAAPSAAAK EEPEESDEDD FGMGGLF--- 323

T.cruzi 269 FDGKNLRKAA LEGNLGGG-V ADAAAAADTG AAAAPAAAAE PE-EEDDDDD FGMGALF--- 323

T.brucei 269 YDGKNLRTAA LEGKLGGGEA AAPAAAAAAA APAAAPAAAA AE-EEEDDDD FGMGALF--- 324

A.thaliana 264 AEKVKEYLKD PSKFAVAS-V AAVSADAGGG APAAAKVEEK EE-SDEEDYG GDFG-LFDEE 320

S.cerevisae 260 IEDLVDRIEN PEKYAAAA-- -PAATSAASG DAAPAEEAAA EE-EEESDDD MGFG-LFD-- 312

H.sapiens 262 AEKVKAFLAD PSAFVAAAPV AAATTAAPAA AAAPAKVEAK EE-SEESDED MGFG-LFD-- 317

Figura 1: Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos da proteína ribossomal P0. As seqüências de aminoácidos da proteína P0 de L. major foi alinhada com as de outros tripanossomatídeos e eucaritos, onde foi observada uma alta conservação de seqüência.


67

3.2 Quantificação da proteína ácida ribossomal P0 em extratos

protéicos de L. chagasi e L. amazonensis.

Assim que a seqüência codificante para a proteína ribossomal P0

foi encontrada, foram desenhados oligonucleotídeos específicos visando

amplificação e posterior clonagem desse fragmento em vetor que

possibilitasse a expressão da proteína recombinante. Após a clonagem do

fragmento, flanqueado pelos sítios de restrição das enzimas BamHI e XhoI,

no vetor pET21a, foi realizado a etapa de seqüenciamento para a

certificação sobre o fragmento clonado. Uma vez confirmada a clonagem, o

próximo passo se deu com a expressão da proteína e posterior purificação

(Figura 2A), segundo descrito na metodologia.

Uma vez purificada a proteína recombinante, esta foi utilizada

para a produção de soro policlonal específico, o qual seria utilizado em

ensaios de Western-blot. Após a obtenção do soro, este foi purificado por

imunoadsorção e testado quanto a sua especificidade. O soro foi testado

contra extrato total protéico de E. coli, contra a proteína P0 e contra outra

proteína ribossomal recombinante, a proteína L19, e se mostrou específico

contra a proteína P0 (figura 2B).

Visando uma análise comparativa entre o número de moléculas de

proteínas importantes na síntese protéica e dos fatores de iniciação da

tradução quantificados até o momento em algumas espécies de

Leishmania, foi realizada a quantificação da proteína ácida ribossomal P0

(número de moléculas/célula) em extrato total do parasita, através de

ensaios de Western-blot. Primeiramente, a proteína recombinante, corada

com Comassie Blue, foi quantificada através da comparação com uma

curva previamente quantificada de BSA (Albumina Sérica Bovina). O valor

obtido em µg de proteína foi então convertido para número de moles. Em

seguida, essas proteínas foram utilizadas em ensaios de Western-blot,

juntamente com as proteínas do extrato total do parasita. A quantificação


68

da proteína P0 se deu pela comparação da intensidade das bandas da

proteína recombinante, diluída seqüencialmente com um fator de diluição

½ (25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng e 3,125 ng), e a intensidade da banda

equivalente ao extrato das curvas de crescimento de L. chagasi e L.

amazonensis (106 células). A partir dessa comparação obteve-se o número

de moles de proteínas presentes em 106 células. Utilizando-se o número de

Avogrado pôde-se então chegar a um número aproximado de moléculas de

proteína P0 por 106 células do parasita e então calcular o número de

moléculas por célula individual. Estima-se que o número aproximado de

moléculas da proteína P0 por Leishmania seja de 6,6x105 (figura 2D), o que

se mostrou condizente com o número de ribossomos observado na

levedura Saccharomyces cerevisiae (2x105 por célula).


69

A) B)

SDS-PAGE Western-blott

Ext

rato tot

al de E. coli

P0 (em

ext

rato

tot

al de E. coli)

P0 (so

lubi

liza

da em

tam

pão de

uré

ia)

L19

(em

ext

rato

total de E. coli)

L19

(pu

rifica

da)

Ext

rato tot

al de E. coli

P0 (em

ext

rato

tot

al de E. coli)

P0 (so

lubi

liza

da em

tam

pão de

uré

ia)

L19

(em

ext

rato

total de E. coli)

L19

(pu

rifica

da)

Ext

rato

total d

e E. coli

P0 (em

ext

rato

total

de E. coli)

P0 (solub

ilizad

a

em ta

mpã

o de

uré

ia)

Ext

rato

total d

e E. coli

P0 (em

ext

rato

total

de E. coli)

P0 (solub

ilizad

a

em ta

mpã

o de

uré

ia)


70

C)

SDS-PAGE D)

Western-blott

Figura 2: Comassie da proteína P0, Western-blot e quantificação da proteína P0. Extrato total de E. coli e alíquotas das proteínas recombinantes P0 (não purificadas) foram fracionados em gel SDS-PAGE 15% (A) e transferidos para membrana de nitrocelulose para reação de “Western-blot” (B), visando testar a especificidade do anticorpo purificado. Tendo em mãos a proteína P0 recombinante purificada e quantificada (C), foi realizada uma estimativa da quantidade de proteína P0 por Leishmania, onde uma curva de diluição da proteína recombinante e alíquotas das curvas de crescimento das espécies L. chagasi e L. amazonensis foram comparadas, em ensaios de Western-blot (D).

LM

W

2 µg 1

µg

0,5

µg

0,25

µg

0,12

5 µg

Curva de BSACurva de diluição da proteína P0

(fator de d ilu ição ½)

45 KDa

66 KDa

LM

W

2 µg 1

µg

0,5

µg

0,25

µg

0,12

5 µg

Curva de BSA

LM

W

2 µg 1

µg

0,5

µg

0,25

µg

0,12

5 µg

Curva de BSACurva de diluição da proteína P0


Curva de diluição da proteína P0


45 KDa

66 KDa

45 KDa

66 KDa

50 ng

25 ng

12,5 ng

6,25

ng

3,12

5 ng


Amos

tra da

cur

va de L.chagasi,

106cé

lulas

Amos

tra da

cur

va de L.amazonensis

106cé

lulas

50 ng

25 ng

12,5 ng

6,25

ng

3,12

5 ng


50 ng

25 ng

12,5 ng

6,25

ng

3,12

5 ng

50 ng

25 ng

12,5 ng

6,25

ng

3,12

5 ng


Amos

tra da

cur

va de L.chagasi,

106cé

lulas

Amos

tra da

cur

va de L.amazonensis

106cé

lulas


71

3.3 Curvas de crescimento das espécies L. chagasi e L.

amazonensis

Com o intuito de analisar a expressão de fatores de tradução

selecionados nas diferentes formas de vida de L. chagasi e L.

amazonensis, foi necessário padronizar condições de crescimento destes

parasitas de forma a otimizar sua diferenciação in vitro. Duas diferentes

metodologias de crescimento celular foram estabelecidas. Na primeira

delas, buscou-se monitorar a diferenciação de formas promastigotas em

promastigotas metacíclicos. Já na segunda o objetivo foi induzir a

diferenciação de promastigota em formas amastigotas, em condições de

cultura axênicas, um procedimento que não funciona com todas as

espécies de Leishmania e pode ser de difícil padronização.

Visando monitorar a diferenciação de formas promastigotas em

promastigotas metacíclicos, culturas de promastigotas de L. chagasi e L.

amazonensis, mantidas em meio M-199 (a 26ºC e pH 7.2), foram

repicadas para uma concentração final de 106 células/ml e tiveram seu

crescimento e morfologia monitorados a cada 24 horas. Nos mesmos

intervalos alíquotas eram retiradas, sedimentadas por centrifugação e

ressuspendidas em tampão de amostra para SDS-PAGE. Nos primeiros

três dias desta curva (figura 3A), as células se encontravam na fase

logarítmica de crescimento (crescimento exponencial) e a morfologia

observada foi de uma típica promastigota nessa fase (figura 4A). A

partir do terceiro dia, as células começaram a entrar na fase

estacionária. Embora a cultura ainda apresentasse algum crescimento,

as células mostravam-se mais alongadas e entrando na fase

estacionária da curva. No quinto dia, as células mostravam uma

morfologia tipicamente de fase estacionária (promastigotas metacíclicas)

(figura 4B). A partir do nono dia, as células entraram em fase de

declínio, caracterizando o final da curva. Apesar das culturas de cada


72

espécie, nas fases promastigota e promastigota metacíclica, terem se

comportado, em geral, de forma equivalente, a cultura de L.

amazonensis apresentou um crescimento mais acentuado a partir do 3º

e 4º dias, o qual teve continuidade até o fim da curva (figura 3A).

Embora esse crescimento diferenciado da L. amazonensis tenha sido

notório ao longo da curva, ele não interferiu na morfologia, nem nas

análises posteriores onde amostras das curvas foram utilizadas.

A curva das amastigotas axênicas iniciou-se com a

transferência de células mantidas em meio M-199, em estágio

promastigota, para o meio RPMI-1640, a uma temperatura de 37ºC e

um pH de 5,5. Assim como a curva de promastigotas, a de amastigota

começou a uma concentração final de 106 células/ml e teve uma

amostra retirada a cada 24 horas. Em especial, nesse caso, foi colhida

uma amostra após 6 horas de transferência de meio e temperatura,

visando uma alíquota que representasse as células em choque térmico,

porém sem morfologia característica de uma amastigota (figura 3B). A

cultura apresentou crescimento até a 48ª hora, a partir da qual as

células começaram a entrar em fase estacionária. A morfologia

característica de amastigota só foi observada a partir do terceiro dia da

curva (48 horas) (figura 4C). Diferentemente das curvas de

promastigota e promastigota metacíclica, as curvas de amastigota das

duas espécies mostraram um crescimento homogêneo ao longo do

experimento (figura 3B).


73

A B Figura 3: Curvas de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis. A) Curva de crescimento das células nos estágios promastigota e promastigota metacíclica. B) Curva de crescimento das células no estágio amastigota.

Curva de crescimento - Promastigota e

Promastigota Metacíclica

0

5

10

1520

25

30

35

40

dia

1

dia

2

dia

3

dia

4

dia

5

dia

6

dia

7

dia

8

dia

9

dia

10

dias da cultura

quantidade de células x

106 células

L. amazonensis

L. chagasi

Curva de crescimento - Amastigota Axênica

0

5

10

15

20

25

6 horas 24 horas 48 horas 72 horas

horas de coleta das amostras

Quantidade de células x

106 células

L. amazonensis

L. chagasi


74

Figura 4: Imagens dos três estágios de desenvolvimento da L. amazonensis. A) Fase promastigota (correspondente ao dia 1 da curva de promastigota). B) Fase promastigota metacíclica (correspondente ao dia 5 da curva de promastigota). C) Fase amastigota (correspondente a 48 horas da curva de amastigota). Amostras das culturas foram colhidas nas três fases do ciclo de vida da Leishmania e observadas com o auxílio de um microscópio confocal.

A B CA B C


75

3.4 Reconhecimento das proteínas de expressão estágio

específica pelos seus respectivos anticorpos em ensaios de

Western-blot.

Proteínas cuja expressão é sabidamente estágio específica são

de grande importância quando se trabalha com análise de expressão de

outras proteínas ao longo do ciclo de vida de um organismo, uma vez

que se torna necessária a confirmação do estágio da célula que está

sendo utilizado para tal análise. Em nosso trabalho, as proteínas

escolhidas para essa observação da diferenciação dos estágios do ciclo

de vida de espécies de Leishmania foram as proteínas A2 (Matlashewski

G, 1996), para a fase amastigota, e META1 (Uliana SR, 1999), para a

fase promastigota metacíclica. Assim, com os plasmídeos contendo os

fragmentos codificantes para as respectivas proteínas (pET16b-A2 e

pQE-30-META1), foi realizada a expressão em E. coli das mesmas e

posterior purificação. Essas proteínas foram utilizadas para a imunização

de coelhos convencionais e posterior obtenção de soro policlonal

específico, como descrito na metodologia. Os anticorpos foram obtidos

para serem utilizados em ensaios de Western-blot e, uma vez

reconhecendo suas respectivas proteínas, visando validar os protocolos

de diferenciação das células de Leishmania nas curvas de crescimento

estabelecidas.

Esses anticorpos foram inicialmente testados contra as proteínas

recombinantes (A2 e META1 fusionadas a uma cauda de Histidinas)

(figura 5A e 5B) utilizadas para sua produção. Nos ensaios de Western-

blot, os anticorpos reconheceram especificamente suas proteínas,

servindo para a utilização em etapas posteriores do trabalho (figura 5C

e 5D).


76

A B SDS-PAGE SDS-PAGE C D Western-blott Western-blott Figura 5: Proteínas de expressão estágio específica. Curva de diluição das proteínas recombinantes marcadoras celulares A2 (A) e META1 (B) e Western-blot mostrando o reconhecimento dos anticorpos contra suas respectivas proteínas recombinantes (C e D). Alíquotas das proteínas recombinantes A2 e META1 foram fracionadas em gel SDS-PAGE 15% e 20%, respectivamente. Uma vez quantificadas, as proteínas foram utilizadas em ensaios de Western-blott, como descrito na metodologia.

100 ng 50 ng200 ng 100 ng 50 ng200 ng 200 ng 100ng 50 ng200 ng 100ng 50 ng200 ng 100ng 50 ng

20 µg 10 µg 5 µg20 µg 10 µg 5 µg 20 µg 10 µg20 µg 10 µg


77

3.5 Análise da expressão das proteínas META1 e P0 nas curvas

de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis através de

ensaios de Western-blot.

Após os ensaios onde o reconhecimento das proteínas A2 e

META1 pelos seus respectivos anticorpos foi observado, partiu-se para a

análise da expressão das mesmas ao longo das curvas de crescimento

de L. chagasi e L. amazonensis, com o intuito de validar essas curvas.

Alíquotas representativas de ambas as curvas foram utilizadas para a

realização dos ensaios de Western-blot. No caso da curva de L.

amazonensis, foi adicionado um ponto correspondente a um extrato

obtido a partir de uma cultura mais recente e cultivada em meio

Schneider (utilizando a metodologia de Cysne, 1998), buscando uma

comparação preliminar entre as duas metodologias. Uma comparação

mais detalhada entre as metodologias de cultivo de células abordadas

em nosso laboratório vem sendo realizada na obtenção de novas curvas.

No caso da análise da expressão da proteína META1, esta se

mostrou expressa na fase promastigota metacíclica nas duas espécies

de Leishmania analisadas (Figura 6A). Outras duas proteínas distintas

foram reconhecidas nessa análise. Uma delas se mostrou constante

durante toda a curva, tanto em L. chagasi quanto em L. amazonensis

(Figura 6B). A outra proteína, embora tenha se mostrado presente

durante ambas as curvas, apresentou uma maior intensidade que pôde

ser observada do dia 5 da curva de promastigota ao último dia da curva

de amastigota (72 horas), em L. chagasi, e, no caso da L. amazonensis,

mostrou maior intensidade a partir do 9º dia da curva de promastigota,

que se estendeu a 72ª hora da curva de amastigota (Figura 6B). Em

paralelo, ensaios visando a análise da expressão da proteína A2 ao

longo das curvas de crescimento também foram realizados. Embora a

proteína não tenha sido detectada nas alíquotas das curvas equivalentes


78

à fase amastigota, a diferenciação celular foi observada através de

microscopia confocal como mostrado na figura 5C.

Sendo o conhecimento do padrão de expressão de proteínas

essenciais para a tradução um ponto importante para o entendimento

do processo de síntese protéica como um todo, uma vez confirmadas as

diferenciações celulares nas curvas de ambas as espécies trabalhadas,

partiu-se para a análise da expressão da proteína ácida ribossomal P0.

Utilizando-se os mesmos pontos representativos das curvas que foram

utilizados para as proteínas de expressão estágio específico, pudemos

observar uma expressão constante ao longo de ambas as curvas

(L.chagasi e L. amazonensis - figura 6B).


79

A

B

Figura 6: Análise da expressão das proteínas META1 (A) e LmP0 (B) em curvas de L. chagasi e L. amazonensis. Extratos totais do parasita, previamente quantificados, foram fracionados em gel SDS-PAGE 20%, para a proteína META1, e 15%, para a proteína LmP0, e analisados por ensaios de Western-blot com seus respectivos soros. As setas sem peso molecular, mostradas na figura 6B, indicam mais dois padrões de expressão na análise da proteína META1 (A).

META1

(12 Kda)

dia 1

dia 3

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

Curva de crescimento L. chagasi

106 células por poço

Curva de crescimento L. amazonensis


dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 3

dia 1

recém-is

olad

a

META1

(12 Kda)

dia 1

dia 3

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas



dia 1

dia 3

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas



dia 1

dia 3

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 1

dia 3

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas







dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 3

dia 1

recém-is

olad

a



dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 3

dia 1

recém-is

olad

a





dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 3

dia 1

recém-is

olad

a

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

72 horas

dia 3

dia 1

recém-is

olad

a

P0

(45 Kda)

P0

(45 Kda)


80

3.6 Análise da expressão de homólogos de fatores de iniciação

da tradução em diferentes formas de vida de L. chagasi .

Uma vez que a análise da expressão de alguns homólogos aos

fatores de iniciação da tradução, na fase logarítmica da curva de

crescimento de espécies de Leishmania, já tinha sido realizada por

trabalhos anteriores do nosso grupo [11], partiu-se para a análise da

expressão destes ao longo de toda a curva de crescimento, incluindo as

fases promastigotas metacíclicas e amastigotas, de L. chagasi e L.

amazonensis. Embora os resultados mostrados aqui se restrinjam à

espécie L. chagasi, alíquotas da curva de L. amazonensis vêm sendo

utilizadas para ensaios onde a expressão de proteínas diretamente

envolvidas na iniciação da tradução pode ser observada.

Os homólogos aos fatores de iniciação da tradução, cuja

expressão foi analisada ao logo da curva de L. chagasi, relatados aqui

neste trabalho, foram os LmEIF4G1 e LmEIF4G3. O LmEIF4G1 teve sua

expressão observada no início da curva, correspondente a fase

promastigota, uma ausência na fase promastigota metacíclica e

novamente sua expressão na fase amastigota (figura 7A). Já o

homólogo LmEIF4G3 (figura 7B) se mostrou constante durante toda a

curva, sugerindo ser uma proteína essencial para a síntese, embora uma

discreta diminuição da expressão possa ser observada no último dia da

fase promastigota metacíclica (dia 9 – figura 7B).


81

A

B

Figura 7: Análise da expressão dos homóligos LmEIF4G1(A) e LmEIF4G3(B) em curva de crescimento de L. chagasi. Extratos totais do parasita, previamente quantificados, foram fracionados em SDS-PAGE 15% e analisados por ensaios de Western-blot com seus respectivos soros. O reconhecimento dos homólogos nos extratos totais do parasita geraram padrões que puderam ser analisados e comparados com os obtidos, ateriormente, na fase promastigota de Leishmania e em outros organismos.

72 horas

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

dia 3

dia 1

114 KDa

72 horas

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

dia 3

dia 1

72 horas

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

dia 3

dia 1

72 horas

dia 5

dia 7

dia 9

24 horas

48 horas

dia 3

dia 1

114 KDa114 KDa

71,2 KDa71,2 KDa71,2 KDa


82

4. Discussão

O conhecimento do balanço de atividades dos fatores de

iniciação da tradução de eucariotos (eIFs) é um ponto crítico para o

entendimento dos mecanismos envolvidos no controle da tradução [17].

As subunidades do complexo de iniciação da tradução eIF4F são

bastante estudadas em eucariotos (unicelulares e pluricelulares) e se

mostram bastante peculiares ao que se refere à espécie em observação.

No caso dos tripanossomatídeos, organismos protozoários unicelulares,

as múltiplas isoformas do eIF4F podem ser associadas com os diferentes

estágios de vida desse parasita ou serem requeridos para a tradução de

diferentes classes de mRNAs [9]. Uma prévia quantificação dessas

isoformas em L. major, na fase promastigota de crescimento, mostrou

que os níveis dos homólogos aos fatores pertencentes ao eIF4F são

bastante variáveis. Como exemplo, temos o LmEIF4E1, com suas

estimadas 3,2 x 103 moléculas por célula. Enquanto uma outra isoforma,

o LmEIF4E3, mostra-se bem mais abundante, com 7,1 x 104 moléculas

por Leishmania. As outras isoformas quantificadas, incluindo os

LmEIF4A1 e LmEIF4G1-3, também mostraram suas variações, sendo o

homólogo ao eIF4A detectado em altos níveis (3,6 x 105 moléculas por

célula) e o LmEIF4G3 estimado em 6,4 x 103 moléculas por célula [9].

Comparando-se os níveis desses homólogos encontrados em Leishmania

com os níveis encontrados em outro eucarioto unicelular, como exemplo

em Levedura, percebe-se uma correlação do número de moléculas. O

homólogo ao eIF4A da Levedura Sccharomyces cerevisiae foi estimado

em 7-9 x 105 moléculas por célula (o mais abundante entre os fatores

de iniciação da tradução nesse organismo), enquanto que o homólogo

ao eIF4E encontra-se entre 3,2-3,6 x 105 moléculas por célula. Nessa

espécie de levedura, o menos abundante fator de iniciação da tradução

foi o homólogo de eIF4G, com suas 1,5-2,0 x 104 moléculas por célula


83

[17]. Em Leishmania, uma análise da expressão desses homólogos

durante todo o ciclo de vida do parasita se torna importante para um

maior entendimento desse ponto crítico da síntese protéica que é a

iniciação da tradução. O que pudemos observar em nossos resultados

foi uma expressão constitutiva, no caso do homólogo LmEIF4G3 e uma

expressão diferenciada de acordo com o estágio da célula para o

LmEIF4G1, o qual foi encontrado nas fases promastigota e amastigota,

mas não na fase promastigota metacíclica. Uma análise da expressão

dos outros componentes do complexo eIF4F, seguida de uma estimativa

do número de moléculas, em espécies de Leishmania é foco de trabalhos

posteriores do nosso grupo. Uma análise da expressão de isoformas de

outra proteína relacionada à iniciação da tradução em espécies de

Leishmania, a proteína de ligação à cauda Poli-A, PABP, vem também

sendo realizada pelo nosso grupo. Essa proteína se mostrou bastante

variável nos ensaios realizados até o momento, nas curvas de

crescimento de L. chagasi e L. amazonensis (dado não mostrado).

A quantificação de uma proteína diretamente relacionada à

síntese protéica durante curva de crescimento de espécies de

Leishmania e uma posterior quantificação de seus níveis se torna um

dado importante no entendimento desse processo. A proteína escolhida

por nosso grupo de trabalho foi a proteína ácida ribossomal P0. Sua

expressão constitutiva e seus altos níveis celulares, mostrados aqui,

indicam sua importância no processo de tradução. Seus estimados 6,6 x

105 moléculas por célula, acima dos níveis encontrados para os fatores

do complexo eIF4F em Leishmania, sugerem que essa proteína

desempenha um papel essencial na biossíntese protéica. Em levedura,

por exemplo, os níveis de moléculas de ribossomo por célula gira em

torno de 2 x 105 [17]. Dados na literatura sugerem que a proteína

ribossomal P0 se liga numa relação 1:1 com o ribossomo [21]. Sendo

assim, estima-se uma concentração de 6,6 x 105 ribossomos por


84

Leishmania. A relação entre fator de iniciação da tradução/ribossomo

também pode ser calculada e comparada usando-se os dados dos

trabalhos anteriores tanto de Leishmania quanto de Levedura, o que

pode acrescentar bastante ao pouco que se sabe sobre o complexo

processo de síntese protéica em tripanossomatídeos.

O cultivo das espécies de L. chagasi e L. amazonensis se

mostrou de acordo com outros trabalhos realizados até o momento [22,

23]. As formas obtidas nesse trabalho condizem com as observadas e

utilizadas em outro trabalho onde a diferenciação foi a base para os

resultados [14]. À curva de L. amazonensis foi adicionada uma alíquota

de amastigotas recém isoladas de lesão, a qual seria uma representante

mais fidedigna das condições encontradas no parasita in vivo. Embora

não tenha havido diferença morfológica significativa entre as

amastigotas obtidas pela metodologia sugerida em Doyle PS et al

(1991) e as recém isoladas de lesão (de acordo com Cysne-Finkelstein L

et al., 1998), estudos mais detalhados visando a análise do padrão de

expressão das proteínas analisadas nesse trabalho ainda será alvo de

nossos estudos. A utilização de proteínas de expressão estágio

específico para a diferenciação das três fases estudadas, visando uma

correlação com a morfologia observada, atendeu às expectativas apenas

ao que se refere à proteína META1. Embora outras duas proteínas

tenham sido reconhecidas pelo anti-META1, uma delas podendo ser a

proteína relacionada META2 recentemente encontrada [13], a expressão

da proteína META1 durante os dias onde a morfologia se apresentava

mais alongada, o que caracteriza a metaciclogênese, foi de acordo com

o esperado. Já a proteína marcadora celular A2 não apresentou dados

suficientes para uma correlação com a morfologia do parasita. Sua

expressão durante curva de crescimento das espécies utilizadas nesse

trabalho (dado não mostrado) não foi satisfatória para ser utilizada

como marcadora de diferenciação celular. Outra proteína expressa


85

exclusivamente na fase amastigota deve ser escolhida como marcadora

de diferenciação para nossos próximos estudos.

Dado o exposto, podemos perceber a quantidade de variáveis

que devem ser abordadas para um estudo de expressão protéica

relacionada a diferenciação celular desses protozoários de biologia

molecular tão peculiar. Pretende-se dar mais ênfase a alguns pontos

desse trabalho, tanto ao que se refere à quantificação de alguns fatores

quanto à diferenciação dos parasitas. Assim, espera-se contribuir para a

elucidação dos mecanismos envolvidos nessa que parece ser a fase

crítica do controle da expressão gênica dos tripanossomatídeos.


86

5. Referências Bibliográficas

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89

6. Abstract

In eukaryotes, the critical initiation stage of protein synthesis is mostly

associated with regulatory mechanisms. Besides the ribosomal subunits, this

stage requires the action of a number of translation initiation factors (eIFs).

Paramount within those is the eIF4F complex, which is composed by the

subunits eIF4A, eIF4E and eIF4G. In Leishmania, translation control is essential

to achieve regulation of gene expression, but so far it has been little studied. In

this pathogen, multiple homologues to the subunits of the eIF4F complex have

been identified and had their expression quantified in the promastigote (Pm)

stage of its life cycle. Here we have begun the study of a Leishmania

homologue of the ribosomal protein P0, a component of the 60S subunit.

Through the cloning of its gene, expression in Escherichia coli and production of

specific polyclonal serum, its intracellular levels have been quantified (~6,6x105

molecules/cell) and found to be superior to those observed for the eIF4F

homologues. To analyze its expression during the parasite life cycle, the

conditions for the growth of representative species of Leishmania and their

differentiation into the metacyclic promastigote (MtPm) and amastigote (Am)

life stages were first optimized. The detection of proteins whose expression are

stage specific (A2- Am; META1 – MtPm) was attempted to validate these

growth curves, but only the META1 protein was found, although amastigote

cells were observed through the microscope. The expression of P0 was found to

be constant within these various life forms. In comparison, the expression of a

homologue of the eIF4G protein, LmEIF4G3, also was found to be constant,

whilst the LmEIF4G1 homologue was only detected at the Pm and Am stages.

Assays with other eIF4F homologues are currently being performed so as to

better characterize the processes involved in translation initiation in Leishmania

and the control of its cellular differentiation.

Keywords: Trypanosomatids, Translation initiation, Leishmania life cycle,

Stage specific expression and Ribossomal protein.


90

7. CONCLUSÕES

• A diferenciação de espécies de Leishmania nos três estágios

fisiológicos encontrados nos hospedeiros é reprodutível e tem

correlação direta com a morfologia esperada.

• A proteína marcadora celular da fase promastigota metacíclica

META1 serve como parâmetro de padrão de expressão de

proteínas estágio específicas.

• A proteína ácida ribossomal P0 é essencial para a síntese protéica

e é encontrada em altos níveis nas espécies L. chagasi e L.

amazonensis.

• Os níveis de ribossomo encontrada uma Leishmania é em torno de

6,6 x 105 moléculas.


91

8. AANNEEXXOOSS


92

8.1. Anexo 1 IINNSSTTRRUUÇÇÕÕEESS PPAARRAA AAUUTTOORREESS

Revista MMOOLLEECCUULLAARR AANNDD BBIIOOCCHHEEMMIICCAALL PPAARRAASSIITTOOLLOOGGYY


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Guide for Authors

Submission of a paper to Molecular and Biochemical Parasitology, including a revised version, implies the transfer of copyright from the author(s) to the publisher and therefore that the corresponding author has obtained the approval of all other authors to the text and that it does not contain information previously published (except as a meeting abstract or by submission of sequence data to an electronic database) and is not under consideration for publication elsewhere. Publication in Molecular and Biochemical Parasitology is taken to imply the authors' willingness to comply with reasonable requests to supply reagents such as recombinant clones and monoclonal antibodies, and sequence data in electronic form to persons lacking access to computer databases.

Manuscripts returned for revision should be returned to the editor within 3 months. Papers accepted for publication should be as concise as possible and should be no longer than 14 printed pages. In exceptional cases the editors will consider longer papers (never exceeding 20 printed pages) if the authors of such complex papers show to the satisfaction of the editors that the limitation in length would result in subdivision of the material into several papers and hence in an increase in the total number of pages necessary for the presentation of the work.

Online Submission Submission to this journal is now totally online. Please use the following guidelines to prepare your article. Via the online submission page of this journal (http://ees.elsevier.com/molbio/) you will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article, which is used in the peer review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and request for revision, takes place by email and via the author's homepage, removing the need for a hard-copy paper trail.

The above represents a brief outline of this form of submission. It can be advantageous to print this "guide for authors" from the site (http://authors.elsevier.com/) for reference in the subsequent stages of article preparation.


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Authors' rights

As an author you (or your employer) may do the following:

- make copies (print or electronic of the article for your own personal use, including for your own classroom teaching use

- make copies and distribute such copies (including through email) of the article to research colleagues, for the personal use by such colleagues(but not commercially or systematiccally, e.g., via an email list or list servier)

- post a pre-print version of the article on Internet websites including electronic pre-print servers, and to retain indefinitely such versions on such servers or sites

- post a revised version of the final text of the article (to reflect changes made in the peer review and editing process) on your personal or institutional website or server, with a link to the journal homepage on www.elsevier.com

- present the article at a meeting or conference and to distribute copies of the article to delegates attending such a meeting

- for your employer, if the article is a 'work for hire', made within the scope of your employment, your employer may use all or part of the information in the article for other intra-company use (e.g., training)

- retain patent and trademark rights and rights to any processes or procedure described in the article

- include the article in full or in part in a thesis or dissertation (provided that this is not to be published commercially)

- use the article or any part thereof in a printed compilation of your works, such as collected writings or lecture notes (subsequent to publication of your article in the journal)

- prepare other derivative works, to extend the article into book-length form, or to otherwise re-use portions or excerpts in other works, with full acknowledgement of its original publication in the journal.

Protein and Nucleic Acid Sequences. Novel nucleotide or protein sequence data must be deposited in the GenBank™, EMBL or DDBJ databases and an accession number obtained before the paper can be accepted for publication. Submission to any one of the collaborating databanks is sufficient to ensure entry in all. The accession number should be included as a footnote on the title page of the manuscript: 'Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in the GenBank™, EMBL and DDBJ databases under the accession number(s)----'. If


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requested the database will withhold release of data until publication. The usual method for submitting sequence data is by World Wide Web to either GenBank™ (via Banklt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/), EMBL (via Webln: http://www.ebi.ac.uk/subs/allsubs.html) or to DDBJ (via SAKURA: http://sakura.ddbj.nig.ac.jp/). Special types of submissions such, as genomes, bulk submissions, segmented sets, and population/phylogenetic/mutation studies, can be more easily prepared with the Sequin programme (available from the above Web sites). Files generated by the Sequin programme may be sent via e-mail to GenBank™ (submissions: e-mail:[email protected]; enquiries: e-mail: [email protected], EMBL (submissions: e-mail: [email protected]; enquiries: e-mail: [email protected]) or DDBJ (submissions: e-mail: [email protected]; enquiries: e-mail: [email protected]). Submitters without Web or e-mail access should write to one of the following addresses to obtain a hard copy submission form (GenBank Submissions, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Building 38A, Room 8N-805, Bethesda, MD 20894, USA. EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK. DNA Data Bank of Japan, Center for Information Biology, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka 411-8540, Japan). Authors are encouraged by the databases to update their entries as the need arises.

DNA sequences and GenBank Accession numbers

Many Elsevier journals cite "gene accession numbers" in their running text and footnotes. Gene accession numbers refer to genes or DNA sequences about which further information can be found in the databases at the National Center for Biotechnical Information (NCBI) at the National Library of Medicine. Elsevier authors wishing to enable other scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these sources, should type this information in the following manner:

For each and every accession number cited in an article, authors should type the accession number in bold, underlined text. Letters in the accession number should always be capitalised. (See Example 1 below). This combination of letters and format will enable Elsevier's typesetters to recognize the relevant texts as accession numbers and add the required link to GenBank's sequences.

Example 1: "Note:GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no.AA361117)".

Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully. An error in a letter or number can result in a dead link.

In the final version of the printed article, the accession number text will not appear bold or underlined (see Example 2 below).


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Example 2: "Note:GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)".

In the final version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the appropriate source in the NCBI databases enabling readers to go directly to that source from the article (see Example 3 below).

Example 3: "GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)".

Manuscripts Manuscripts should be in English on numbered pages with double-spaced typing throughout (including tables, legends and reference lists) on one side of the paper only with margins of a least 3cm all round. They should be divided into: (1)title page - include a succinct title (which should not normally exceed 100 characters and should not contain any subtitles or abbreviations), the names of all authors, including a given name for each, the institutions with city, state and country where the work was performed, the name and complete address (including telephone, telefax and e-mail) of the corresponding author, a list of abbreviations and a list of addresses of authors who have moved from the institutions where the work was performed. (2) abstract - maximum 250 words, (3) keywords (3-6 indexing terms), (4) introduction, (5) materials and methods, (6) results, (7) discussion, (8)acknowledgements (grant support and technical support to be listed here), (9) references, (10) tables and (11) figure legends. A recent issue of the journal should be consulted for details. In the interests of clarity and brevity, it may sometimes be advantageous to combine the results and discussion into a single section. Everyone makes minor modifications to standard methods. Do not describe standard materials and methods or modifications unless they have significant and demonstrable utility. Do not duplicate descriptions of methodology in the figure legends. Generic and species names should be typed out in full the first time mentioned - in the title, the summary and the text - and thereafter the generic name should be abbreviated. Words or letters to be printed in italics should either be in italics or underlined. The metric system should be used throughout.

Short communications These are intended for the publication of brief definitive reports, primarily to complete DNA sequence data, methods, biochemical or immunochemical data, that do not merit a full-length publication. Short communications are no more than four pages long including everything, with maximally two figures, one table and a maximum of 20 references . A single page contains about 900 words. Only the salient points of a long DNA sequence should be published, as the whole sequence will be available for a computer database. The title, authorship and affiliations will be in the standard format of the journal. The text should not be sectioned, except


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for references. Essential experimental details may be incorporated into a figure legend. To facilitate rapid publication, authors will be expected to supply high-quality copy and expedite any necessary revisions, although decisions will normally be yes or no, based on the quality and appropriateness of the initial submission.

Minireviews. Minireviews are by invitation only. Potential topics of general current interest should be submitted to the senior editor for consideration. Reviews should be short, current, specific and potentially provocative. They should provide a balanced synthesis from the available data rather than a comprehensive regurgitation of the literature. If possible, they should provide new concepts and ideas extending across different parasite systems. Reviews are restricted to about 4000 words, at most three display items including figures and tables and a list of references of not more than 50. The text can be divided into simple subsections with a succinct abstract. Minireviews will undergo the established review process at MBP, and will be published by an accelerated schedule if accepted.

References In the text, references should be numbered singly in square brackets in order of their citation, e.g. [2,3,5-7]. In the list, references should be numbered in the order of citation in the text, not in alphabetical order. Unpublished data, personal communications and papers in preparation or 'submitted' should not be listed in the references (but may be incorporated at the appropriate place in the text); work 'in press' may be listed only if it has been accepted for publication. Personal communications must be accompanied by a letter from the named person(s) giving permission to quote such information. Abstracts (whether published or not), theses and similar material are not to be quoted in the list. If necessary, they can be referred to in the text in parentheses. Periodicals [1], books [2] and edited books [3] should accord with the following examples:

[1] Furuya T, Zhong L, Meyer-Fernandes JR, Lu H, Moreno SNJ, Docampo R. Ecto-protein tyrosine phosphatase activity in Trypanosoma cruzi infective stages. Mol Biochem Parasitol 1988;92:339-48.

[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989.

[3] Borst P, Bitter W, Blundell PA, et al. The expression sites for variant surface glycoproteins of Trypanosoma brucei. In: Hide G, Mottram JC, Coombs GH, Holmes PH, editors. Trypanosomiasis and Leishmaniasis: Biology and Control. Oxford: CAB International, 1997;7:109-31.

Abbreviations of journal titles should conform to those adopted by the List of Serial Title Word abbreviations, ISDS International Centre, 20, rue Bachaumont, 75002 Paris, France (ISBN 2-904938-02-8).


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Tables Each table should be typed double-spaced on a separate sheet and have a short descriptive title. A legend may be placed under table. Footnotes should be identified in the table by a,b, c, etc.

Figures Figures must be in a form and condition suitable for high quality reproduction. Lettering should be clear and of adequate size to be legible after reduction. Consider the printed page and column proportions when preparing figures. If figures are not to be reduced their format should not exceed 16 x 20 cm. Multiple panels of a single figure must be mounted together. Each DNA sequence figure must fit on a single sheet of paper. Place numbering at one end of each line, not on separate lines, and avoid excessive line spacing. Consider placing nucleotide and protein data in separate panels, using single-letter amino acid abbreviations for the protein sequence and grouping nucleotides either continuously or in blocks of ten separated by one space (90 to 120 nt per line). Over 10 000 bp can legibly fit on each journal page in this format (see, e.g., Mol. Biochem. Parasitol. 95:141-146). Preferably use a sans-serif font. Upper case is standard, except that introns or other features can be usefully distinguished by lower case. Provide sharp laser-printer or imagesetter copy. Nucleotide sequences of long coding regions, where the amino acid sequence is the primary feature, and long DNA sequences, may, at the editor's discretion, be omitted from the printed paper. They can be obtained from electronic databases or from the authors. Half-tone illustrations may be included. They should be submitted as black-and-white prints on glossy paper and have as much contrast as possible. A scale should appear on photomicrographs. Colour plates will be published free of charge if colour contributes to the understanding of the information. In all other cases, the author should be prepared to pay the extra costs of 635 EUR for the first page and 318 EUR for following pages of colour. Figures legends should be typed double spaced at the end of the text, not on the figures. Figures should be checked extremely carefully, particularly after revisions. No changes to figures will be possible after acceptance of the manuscript.

Detailed instructions Abbreviations, symbols, chemical and biochemical nomenclature, etc., should follow the recommendations given in the Journal of Biological Chemistry (Vol. 272, pp. 28165-28170; http://www.jbc.org). Avoid abbreviations which are not in common use across the field of molecular and biochemical parasitology. Those used should be defined in the text on first usage and listed as a footnote on the title page. Do not introduce abbreviations unless they are used at least 4 times.

Genetic nomenclature for Trypanosoma and Leishmania should follow the guidelines proposed by Clayton et al (1998), Mol Biochem Parasitol 1998;97:221-224 (http://www.elsevier.nl/cas/tree/store/molbio/free/1998/97/1-2/3178.pdf).

Author enquiries For enquiries relating to the submission of articles please visit Elsevier's Author Gateway at http://authors.elsevier.com The Author Gateway also provides the facility to track accepted articles and set up email


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alerts to inform you of when an article's status has changed, as well as detailed artwork guidelines, copyright information, frequently asked questions and more.

Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those related to proofs, are provided after registration of an article for publication.

ProofreadingOne set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to the corresponding Author. (If we do not have an e-mail address then paper proofs will be sent by post). Elsevier now sends PDF proofs which can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 available free from http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs. If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return to Elsevier in an e-mail. Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or send by post. Proofs should be read carefully and returned within 2 days of receipt. Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything possible to get your article published quickly and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received.

Language Polishing For authors who require information about language editing and copyediting services pre- and post-submission, please visit http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/languagepolishing or contact [email protected] for more information. Please note that Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any products, gooods or services offered by outside vendors through our services or in any advertising. For more information, please refer to our terms and conditions http://www.elsevier.com/wps/find/termsconditions.cws_home/termsconditions.

US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting/ "Public Access Policy"

Elsevier facilitates author posting in connection with the voluntary posting request of the NIH (referred to as the NIH "Public Access Policy"; see http://publicaccess.nih.gov/) by submitting the peer-reviewed author's manuscript directly to PubMed Central on request from the author,


100

immediately after formal publication. Please e-mail us at [email protected]) that your work has received NIH funding (with the NIH grant/project number(s), as well as the name and e-mail address of the Principal Investigator(s)) and that you intend to respond to the NIH request. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed Central on your behalf a version of your manuscript that will include peer-review comments, for public access posting 12 months after the final publication date. This will ensure that you will have responded fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript directly to PubMed Central, and any such posting is prohibited (although Elsevier will not request that manuscripts authored and posted by US government employees should be taken down from PubMed Central). Individual modifications to this general policy may apply to some Elsevier journals and its society publishing partners.

Editors

C.E. Clayton Zentum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg, Im Neuerheimer Feld 282, D-69120 Heidelberg, Germany Tel: +49 6221 546876 Fax: +49 6221 545894 E-mail:[email protected]

A.P. Waters Department of Parasitology, L4-Q, Leiden University Medical Center, Albinusdreef 2, 2333 ZA Leiden, The Netherlands. Tel.: +31 71 5265069; Fax +31 71 52668907; e-mail: [email protected]

P.T. LoVerde, Southwest Foundation for Biomedical Research, PO BOX 760549, USA; e-mail: [email protected]

B. Ullman Department of Biochemistry, Oregon Health Science University, 3181 SW Sam Jackson Park Road, Portland OR 97201, USA Tel: +1 503 494 8437 Fax: +1 503 494 8393 E-mail:[email protected]

Reviews Editor

Alister Craig, Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool L3 5QA, UK. Tel: +44 151 705 3161; Fax: +44 151 705 3371; email:[email protected]

análise da expressão de fatores envolvidos na síntese de ... · mais sujeita a mecanismos de...

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