ANA PAULA DE LIMA BARBOSA

MELATONINA IN VITRO NÃO EXERCE AÇÕES DIRETAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE HEPATOMA (HepG2) E DE INSULINOMA (MIN6) QUE EXPLIQUEM SUA CAPACIDADE DE MELHORAR A HOMEOSTASIA

GLICÊMICA

CAMPINAS

2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

ANA PAULA DE LIMA BARBOSA

MELATONINA IN VITRO NÃO EXERCE AÇÕES DIRETAS EM LINHAGENS DE CÉLULAS DE HEPATOMA (HepG2) E DE INSULINOMA (MIN6) QUE EXPLIQUEM SUA CAPACIDADE DE MELHORAR A HOMEOSTASIA

GLICÊMICA

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de doutora em farmacologia.

ORIENTADOR: PROFº. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANA PAULA DE LIMA BARBOSA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ.

CAMPINAS

2014

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RESUMO O Diabetes Mellitus tipo II (DMT2) é uma doença caracterizada pela diminuição da

sensibilidade à insulina e consequente prejuízo na homeostasia glicêmica. Estudos recentes

mostraram que a melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, melhora a

tolerância à glicose e a resistência à insulina, diminui a expressão de proteínas ligadas à

gliconeogênese hepática (G6Pase e PEPCK) e reduz a apoptose de células beta pancreáticas

in vivo. Entretanto, ainda não estava claro se a melatonina conseguia, de fato, reverter in

situ as ações lipotóxicas dos ácidos graxos saturados em células beta pancreáticas e na

musculatura esquelética, e se podia diminuir a expressão dos genes reguladores da

gliconeogênese hepática. Para responder a esse questionamento, utilizamos culturas

celulares de insulinoma (MIN6), de músculo esquelético (miotubos de L6) e de hepatoma

(HepG2). Os resultados mostraram que a melatonina reverte a resistência à insulina gerada

por palmitato em miotubos de L6, mas somente em passagens baixas, não diminui a

apoptose em MIN6 e não altera a expressão do G6pc, o gene que codifica a G6Pase, em

HepG2.

PALAVRAS CHAVES: Melatonina, Técnicas de cultura de células, Resistência à insulina,

Apoptose, Gluconeogênese.

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ABSTRACT Type II Diabetes Mellitus (T2DM) is characterized by decrease of insulin sensitivity,

resulting impairment glucose homeostasis. Recent studies have shown that melatonin, a

hormone produced by the pineal gland, improves glucose tolerance and insulin resistance,

reduce the expression of hepatic gluconeogenesis proteins (G6Pase and PEPCK) and

diminish pancreatic beta cell apoptosis in vivo. However, it was unclear if melatonin could

reverse the lipotoxic actions of saturated fatty acid in pancreatic beta cells and skeletal

muscle, and if melatonin could decrease the expression of regulatory genes of hepatic

gluconeogenesis in situ. To answer this question, we used cell cultures of insulinoma

(MIN6), skeletal muscle (L6 myotubes) and hepatoma (HepG2). The results showed that

melatonin reverses palmitate insulin resistance in L6 myotubes, but only at low passages,

melatonin does not decrease apoptosis in MIN6 and does not alter the expression of G6pc,

the encoding gene of G6Pase, in culture cell of HepG2.

KEYWORDS: Melatonin, Cell culture techniques, Insulin resistance, Apoptosis,

Gluconeogenesis.

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SUMÁRIO DEDICATÓRIA............................................................................................................xiii AGRADECIMENTOS.................................................................................................. xv

LITA DE TABELAS........................................................................................... ........xvii LISTA DE FIGURAS...................................................................................................xix LISTA DE GRÁFICOS............................................................................................... xxi

LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................. xxiii

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................1 1.1. DIABETES E OBESIDADE..........................................................................................1 1.2. INSULINA: PRODUÇÃO E EFEITOS METABÓLICOS......................................................4 1.3. MELATONINA..........................................................................................................8 1.3.1. EFEITOS DA MELATONINA SOBRE O SISTEMA IMUNOLÓGICO...............................12 1.3.2. AÇÃO ANTIOXIDANTE DA MELATONINA ........................................................... 13 1.3.3. MELATONINA E AÇÃO ANTICANCERÍGENA ....................................................... 15 1.3.4. MELATONINA E O ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO........................... 15 1.3.5. MELATONINA E O METABOLISMO ENERGÉTICO ................................................ 19

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 23

3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 24 3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................... 24 3.1.1. CÉLULAS DA LINHAGEM DE MIN6 ................................................................... 24 3.1.2. CÉLULAS DA LINHAGEM DE MIOTUBOS DE L6 .................................................. 24 3.1.3. CÉLULAS DA LINHAGEM DE HEPATOMA HEPG2 ............................................... 24

4. METODOLOGIA ................................................................................................... 25

4.1. CULTIVO E TRATAMENTO DE INSULINOMA MIN6 ................................................ 25 4.2. CULTIVO E TRATAMENTO DE CÉLULAS MUSCULARES MIOTUBOS DE L6 ................ 25 4.3. CULTIVO E TRATAMENTO DE HEPATOMA HEPG2 ................................................ 26 4.4. IMUNOBLOTTING ............................................................................................... 27 4.5. REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA .................................................................. 28 4.6. CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................................... 29 4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 30

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 31

5.1. MIN6 – LINHAGEM DE INSULINOMA .................................................................. 31 5.2 MIOTUBOS DE L6 – LINHAGEM DE MÚSCULO ESQUELÉTICO ................................. 38 5.3 HEPG2 – LINHAGEM DE HEPATOMA .................................................................... 47

6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 54

6.1. MIN6................................................................................................................ 54

xi

6.2. MIOTUBOS DE L6 .............................................................................................. 54 6.3. HEPG2 .............................................................................................................. 54 6.4. CONCLUSÃO GERAL .......................................................................................... 55

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 56

xii

Por muito tempo achei que a ausência é falta. E lastimava, ignorante, a falta.

Hoje não a lastimo. Não há falta na ausência.

A ausência é um estar em mim. E sinto-a, branca, tão pegada, aconchegada nos meus braços,

que rio e danço e invento exclamações alegres, porque a ausência, essa ausência assimilada,

ninguém a rouba mais de mim.

Ausência - Carlos Drummond de Andrade

Saudades dos que se foram ...

xiii

93 million miles from the sun

People get ready, get ready Cause here it comes, it's a light

A beautiful light, over the horizon Into our eyes

Oh, my, my, how beautiful Oh, my beautiful mother

She told me, son, in life you're gonna go far If you do it right, you'll love where you are

Just know, wherever you go You can always come home

240 thousand miles from the moon

We've come a long way to belong here To share this view of the night

A glorious night Over the horizon is another bright sky

Oh, my, my, how beautiful Oh, my irrefutable father

He told me, son, sometimes it may seem dark But the absence of the light is a necessary part

Just know, you're never alone You can always come back home

You can always come back

Every road is a slippery slope But there is always a hand that you can hold on to

Looking deeper through the telescope You can see that your home's inside of you

Just know, that wherever you go

No, you're never alone You will always get back home

93 Million Miles - Jason Mraz

Dedico este trabalho aos meus pais, Daisy e Romeu, minhas irmãs, Helena e Juliana, e meu companheiro Marson, força imensurável e construção de um lar forte dentro de mim.

Gratidão.

xiv

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente a Deus por ter me dado forças e sabedoria para chegar até aqui.

Agradeço também pelos desafios que me foram impostos nessa caminhada, pois sei que me

fizeram mais forte e confiante, além de reafirmar a certeza que tudo é possível quando

Nele se crê!

Sou grata á minha família, pelo imenso suporte e incentivo. Meus pais, Daisy e Romeu, são

para mim a expressão do amor, compreensão e paciência diante das minhas escolhas

tortuosas... Sinceramente, o apoio que me deram foi essencial para que eu pudesse chegar

até aqui. Muito obrigada! As minhas irmãs, Helena e Juliana, pelo carinho e auxílio a todo

instante. E, também, ao Marson, meu primeiro, grande e único amor! Sua companhia fez

essa longa caminhada mais leve e sublime. Como você me ajudou! Às vezes com palavras,

outras somente com gestos de carinho e acolhida. Deus realmente me cercou de pessoas

especiais! Minha família é daquele tipo de que o que eu precisar, seja onde for, na hora

que for, eles estarão lá para me ajudar! Isso realmente não tem preço!

Agradeço às minhas avós, tias e tios, primas e primos, pela grande torcida! Família

grande é assim, tudo vira motivo de festa!

A todos do laboratório, tanto do Prof. Gabriel Anhê quanto do Prof. Lício Velloso, meus

sinceros agradecimentos. Cada um participou da minha história de alguma forma, e isso é

muito importante, pois é o que realmente lembrarei depois de algum tempo, das relações

que construímos. São tantas as pessoas que eu teria que colocar uns três parágrafos

somente de nomes! Obrigada galera!

Contudo, mesmo relutante, pois sei que citar nomes pode ser delicado, não posso deixar de

agradecer àquelas pessoas que estiveram mais próximas dos meus experimentos e que, por

isso, tomaram um lugar importante no meu coração. Primeiramente à Helena, minha

querida irmã e tutora. Muito obrigada pela confiança e pela paciência. Também à Erika

Anne, que me recebeu de braços abertos quando cheguei ao laboratório do Prof. Lício,

profissional impecável e grande amiga. Ao Prof. Lício Velloso, que generosamente abriu

as portas do laboratório e gentilmente nos fez sentir em casa. Obrigada Professor!

xv

E aqueles que participaram mais efetivamente do meu dia-a-dia, Camila Estancial, Camila

Mendes, Carol Mesquita, Carol Solon, Danilo, Dudu, Fabiano, Lineu e Samara, valeu

equipe!!! Com vocês aprendi um pouco mais sobre companheirismo e confiança. Agradeço

do fundo do meu coração!

Gostaria também de agradecer ao Prof. Gabriel pela acolhida e imensa paciência, me

ensinando do mais básico até o que o meu entendimento lhe permitiu ensinar. Muito

obrigada mesmo. Sei que você está fadado ao sucesso, pela sua história de dedicação e

envolvimento nos projetos que acredita. Você faz parte do seleto grupo de pessoas

talentosas que conheci na minha vida! Posso dizer que aprendi muito no seu laboratório!

Você tem a minha gratidão.

Agradeço também à UNICAMP, minha mãe acadêmica! Fiz colégio técnico aqui,

graduação e agora o doutorado. Como sou grata a essa instituição de ensino, e entenda-se

aqui todos os envolvidos, desde professores, secretários, manutenção, enfim, as pessoas

que fazem dela o espaço de excelência que é! Agradeço especialmente à Maísa, Cidinha,

Rosecler, Bruno e Adriana. E a FAPESP e CNPq pelo suporte financeiro.

Não posso deixar de citar a imensa ajuda da banca de qualificação, pela delicadeza e colaboração

para que eu pudesse finalizar este trabalho. Muito obrigada Prof. Edson Antunes, Dra. Emerielle

Cristine Vanzela e Profa. Patrícia Aline Boer.

Também agradeço a todas as cobaias que direta e indiretamente fizeram parte desse trabalho.

Muitas vidas são usadas para que uma descoberta seja feita e precisamos ter noção disso!

E por fim, mais não menos importante, agradeço a todos: amigos, professores (desde a “tia” do

primário até os professores da pós-graduação), alunos, colegas de trabalho, enfim, pessoas que de

alguma forma passaram pela minha vida e contribuíram para a construção de quem sou hoje.

“O Ser Humano é a medida de todas as coisas. Pelo tamanho do Ser Humano se mede a vastidão do Universo, assim como pelo palmo e a braça se começou a medir a Terra. Todo o conhecimento do mundo se faz de uma perspectiva humana, todo o julgamento das coisas do mundo se faz por um parâmetro humano. Assim, enaltecer o senso moral do Ser Humano não é um floreio de linguagem que a única espécie que fala se faz, é valorizar este frágil instrumento de medição pelo qual a vida revela seu sentido. O Ser Humano ou é moral, e julga tudo por um prisma moral, ou é apenas um mecanismo inútil.” Luís Fernando Veríssimo

xvi

LISTA DE TABELA

TABELA 01: VALORES PARA O DIAGNÓSTICO DE DIABETES.............................................................2

xvii

xviii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 01. PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA TRANSLOCAÇÃO DE VESÍCULAS COM GLUT4 E

CAPTAÇÃO DE GLICOSE................................................................................................................................6

FIGURA 02. BIOSSÍNTESE DA MELATONINA............................................................................................9

FIGURA 03. MOLÉCULA DA MELATONINA.............................................................................................13

FIGURA 04. ATIVAÇÃO DAS VIAS DO ESTRESSE DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO.................18

FIGURA 05. SINALIZAÇÃO DA MELATONINA........................................................................................22

FIGURA 06. BLOT MOSTRANDO A PRESENÇA DE RECEPTORES MT1 E MT2 NAS CÉLULAS

MIOTUBOS DE L6............................................................................................................................................44

xix

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LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 01. DOSE RESPOSTA COM PALMITATO EM MIN6...............................................................32

GRÁFICO 02. DOSE RESPOSTA COM MELATONINA 24h EM MIN6....................................................33

GRÁFICO 03. TRATAMENTO INTERMITENTE E CONTÍNUO COM MELATONINA (12h E 24h) E

PALMITATO 24h EM MIN6............................................................................................................................35

GRÁFICO 04. DOSE RESPOSTA COM PALMITATO 24h EM MIOTUBOS DE L6.................................39

GRÁFICO 05. DOSE RESPOSTA DE MELATONINA POR 72h COM PALMITATO 500µM POR 24h

EM MIOTUBOS DE L6....................................................................................................................................41

GRÁFICO 06. TRATAMENTO COM MELATONINA 500nM E COM PALMITATO 500µM AMBOS

POR 24h EM MIOTUBOS DE L6.....................................................................................................................43

GRÁFICO 07. TRATAMENTO COM LUZINDOL 10µM, ANTAGONISTA DOS RECEPTORES MT1 E

MT2 EM MIOTUBOS DE L6............................................................................................................................45

GRÁFICO 08. DOSE RESPOSTA COM MELATONINA 24h EM HepG2...................................................47

GRÁFICO 09. TEMPO RESPOSTA COM MELATONINA 100nM NOS TEMPOS 3, 6, 12 E 24h EM

HepG2.................................................................................................................................................................48

GRÁFICO 10. WESTERN BLOT TEMPO RESPOSTA DO TRATAMENTO COM MELATONINA A

100nM COM ALGUMAS PROTEÍNAS DA VIA DO ESTRESSE DE RETÍCULO ENDOPLASMÁTI-CO

EM HepG2..........................................................................................................................................................49

GRÁFICO 11. REAL TIME RT-PCR PARA A EXPRESSÃO RELATIVA DE mRNA DE Pck (GENE

QUE CODIFICA PEPCK) E G6pc (G6Pase) EM HepG2.................................................................................51

GRÁFICO 12. REAL TIME RT-PCR PARA mRNA DE G6pc (GENE QUE CODIFICA G6Pase) EM

HepG2.................................................................................................................................................................52

xxi

xxii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA-NAT – Arilalquilamina-N-acetiltransferase AC – Adenilato ciclase ADA – American Diabetes Association AGL – Ácidos graxos livres AKT/PKB – Proteína cinase B AMPc – Adenosina monofosfato cíclica AS160 – Proteína ativadora da Rab-GTPase no substrato de 160 kDa da AKT ASK1 – Apoptosis signal-regulating kinase 1 ATF4 – Activated transcription factor 4 ATF6 – Activated transcription factor 6 ATP – Adenosina trifosfato Bcl-2 – B-cell lymphoma 2 BR – Brasil BSA – Albumina de soro bovino (do inglês Bovine Serum Albumin) CHOP – C/EBP(enhancer-binding protein) homologous protein DE – Alemanha DM – Diabetes Mellitus DMEM – Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMT1 – Diabetes Mellitus tipo I DMT2 – Diabetes Mellitus tipo II DNA – Ácido desoxirribonucleico eIF2-α – Eukaryotic translation-initiation factor 2 alpha ERAD – Sistema de degradação associado ao RE EROs – Espécies reativas de oxigênio FITC – Fluorescein isothiocyanate G6Pase – Glicose-6-fosfatase G6pc – Gene que codifica a G6Pase GADD153 – Growth arrest–DNA damage gene GAPDH - Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GCS – Gânglio cervical superior GLUT-4 – Transportador de glicose-4 (Glucose Transporter-4) Grp78 – Glucose-regulated protein-78 Grp94 – Glucose-regulated protein-94 GS – Glicogênio sintase GSK3 β – Glycogen synthase kinase 3 beta HIOMT – Hidroxi-indol-O-metiltransferase IBMX – 3-isobutil-1-metilxantina IDF – International Diabetes Federation IL – Interleucina IL1β – Interleucina 1 beta IL6 – Interleucina 6 IMC – Índice de massa corpórea IR – Insulin receptor

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IRE1 – Inositol-requiring protein 1 IRS – Insulin receptor substrate ITT – Teste de tolerância à glicose JAK2 – Janus Kinase 2 JNK – c-Jun-N-terminal kinase LPS – lipopolissacarídeos mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro MT1 – Receptor de melatonina do tipo 1 MT2 – Receptor de melatonina do tipo 2 MTNR1B – Receptor de melatonina do tipo 1B NA – Noradrenalina NK – linfócitos Natural Killer NPV – Núcleo paraventricular NSQ – Núcleos supraquiasmáticos Pck – Gene que codifica a PEPCK PCR – Reação de polimerase em cadeia PDK1 – Proteína cinase dependente de PIP3 PEPCK – Fosfoenol-piruvato-carboxiquinase PERK – PKR-like ER kinase PI3K – Fosfatidilinositol-3-cinase PIP2 – Fosfatidilinositol-3,4-bifosfato PIP3 – Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato PKA – Proteína cinase A PLC – Fosfolipase C PTP1B – Proteína tirosina fosfatase 1B RE – Retículo endoplasmático RNA – Ácido ribonucleico RPMI – Roswell Park Memorial Institute RT-PCR – Reação da polimerase em cadeia com transcriptase reversa S1P – site-1-proteases S2P – site-2-proteases SFB – Soro fetal bovino SH2 – Domínios de homologia Src-2 SOD – Superóxido dismutase STAT3 – Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 TAg SV40 – Antígeno T associado ao Simian Vacuolating Virus 40 TLR – Toll-like receptor TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa TPH – Triptofano hidroxilase TRAF2 – Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 UK – Reino Unido UPR – Unfolded Protein Response USA – Estados Unidos da América XBP-1 – X-box-binding

xxiv

1. Introdução

1.1. Diabetes e Obesidade

Segundo a Federação Internacional de Diabetes (do inglês International Diabetes

Federation – IDF), há mais de 380 milhões de pessoas com Diabetes no mundo. Desses

casos, cerca de 90% são de Diabetes Mellitus tipo 2 (DMT2) e estão relacionadas,

principalmente, ao estilo de vida sedentário e aos hábitos alimentares [1].

Um evento chave na fisiopatologia do DMT2 é a resistência à insulina,

caracterizada por uma resposta subnormal a esse hormônio, sendo essa a primeira causa da

intolerância à glicose. Nas fases iniciais da doença, a resistência à insulina pode levar à

hiperinsulinemia mas, à medida que o quadro se agrava, a história natural da doença evolui

para uma fase de perda da massa de células beta pancreáticas e, consequentemente, da

capacidade endógena de produção de insulina [2].

Segunda a Associação Americana de Diabetes (do inglês American Diabetes

Association – ADA), o Diabetes é geralmente diagnosticado com base nos níveis de glicose

plasmática em mg/dl. Os testes são de glicemia após 8h de jejum ou pós-sobrecarga de

glicose, que é a glicemia após de 2h da ingestão dextrosol na dose máxima de 75g

(1,75g/Kg até os 43kg de massa corporal). Também pode ser diagnosticado pelo teste de

hemoglobina glicada, fornecido em porcentagem, e com um teste aleatório de glicose

plasmática, sendo que, nesse último, o diagnóstico deve estar associado aos sinais clínicos

de hiperglicemia ou de crise hiperglicêmica (Tabela 1).

1

Tabela 01: Valores para o diagnóstico de Diabetes

Tipo de Teste Glicemia

Teste de Hemoglobina Glicada > 6,5%

Glicemia de jejum >126 mg/dL (7.0 mmol/L)

2h pós-sobrecarga de glicose >200 mg/dL (11.1 mmol/L)

Nível plasmático de glicose aleatória >200 mg/dL (11.1 mmol/L)

Fonte: ADA, 20141.

Uma potente desencadeadora de resistência à insulina, intolerância à glicose e

DMT2 é a obesidade. Segundo Sattar e Gill (2014), o risco relativo de desenvolver DMT2,

conforme aumenta a obesidade, está entre os mais altos de todos os fatores de risco para

qualquer doença. Estudos mostraram que o risco de DMT2 aumenta em torno de 50 a 80

vezes para um índice de massa corpórea (IMC) maior de 35 kg/m2, quando comparado com

um IMC inferior a 23 kg/m2, em determinadas populações [4, 5].

Assim, o aumento do grau de obesidade é um fator importante para os níveis

crescentes DMT2 em todo o mundo. Nesse contexto, muitos estudos têm concentrado

esforços para desvendar os mecanismos pelos quais o sinal intracelular da insulina é

alterado, levando à resistência à insulina na obesidade.

Em situações de normalidade, os adipócitos possuem não só a função de armazenar

energia, na forma de gordura, mas também exercem extenso controle hormonal e neural,

principalmente ligados à ingestão de alimentos e à homeostasia energética. Isso decorre da

associação de diversas substâncias que são secretadas pelos adipócitos, como a leptina,

adipsina, adiponectina, resistina, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), osteonectina, entre

outras, que atuam de forma complexa nesse ajuste [6].

Contudo, na obesidade, observa-se um estresse metabólico geral, devido ao excesso

de consumo de nutrientes. Assim, células metabólicas especializadas, como os adipócitos,

são as que primeiramente sustentam esse insulto. Dessa forma, seja pelo aumento do

número, ou pela hipertrofia celular, as alterações morfofuncionais dos adipócitos

desencadeiam uma resposta inflamatória subclínica programada, alterando o perfil

1 Fonte ADA [116] http://media.mycme.com/documents/90/ada_2014_standards_of_medical__22444.pdf

2

secretório. Nesse contexto, os adipócitos passam a secretar maiores concentrações de TNF-

α e interleucinas (IL), como a IL6 e a IL1β, que antagonizam a ação da insulina e, portanto,

interferem na sua sinalização [7]. Esse é um dos mecanismos propostos para explicar como

a obesidade gera resistência à insulina.

Ainda, no que concerne a resposta inflamatória e aos danos à homeostasia

glicêmica, um mecanismo emergente que também associa obesidade e resistência à

insulina, está relacionado a uma classe de sensores imune, conhecida como o Toll-like

receptor (TLR). Esses receptores, quando ativados como, por exemplo, lipopolissacarídeos

(LPS) ou por ácidos graxos livres (AGL) circulantes, podem desencadear uma cascata de

sinalização que regulam negativamente a sinalização da insulina. Dessa forma, diminuem a

captação de glicose em determinados tecidos, como já foi demonstrado em tecido adiposo

de animais obesos e tecido muscular esquelético, além da resistência à insulina em

hepatócitos e deficiência na capacidade secretora de células beta pancreáticas [8, 9, 10, 11,

12].

Portanto, além dos fatores inflamatórios secretados pelos adipócitos, concentrações

elevadas de AGL são um importante fator de risco para gerar a resistência à insulina. O

excesso de AGL circulantes pode servir como nutriente para alguns tecidos, até mais

eficazmente que a glicose. Esse mecanismo foi inicialmente sugerido em 1963, por Philip

Randle e colaboradores, e recebeu o nome de Ciclo de ácido graxo-glicose de Randle, no

qual, basicamente, os AGL sofrem beta oxidação para o fornecimento de energia em

detrimento à glicose. Dessa forma, diminui-se a captação de glicose, mesmo em quadro

hiperinsulinêmico, principalmente em músculo esquelético e cardíaco, configurando um

quadro de resistência à insulina [13].

Alguns trabalhos também demonstraram que os AGL podem reduzir a sinalização

de insulina devido ao aumento de diacilglicídeos e ceramidas, que regulam negativamente a

atividade da cascata de sinalização da insulina em músculo esquelético [14, 15].

Além disso, alguns estudos ainda indicam que os AGL em excesso podem

desencadear a resistência à insulina devido ao estresse de retículo endoplasmático (RE) e o

aumento dos níveis de diversas espécies reativas de oxigênio (EROs) e radicas livres

gerados pela sua metabolização [16].

3

Apesar das diversas hipóteses, o fato é que um número consistente de achados

sugere que a resistência à insulina resulta dos elevados níveis plasmático de AGL

saturados, seja pela ação direta desses nos tecidos, seja pela inflamação subclínica

decorrente das alterações metabólicas geradas. Essas alterações são encontradas na maioria

dos casos de obesidade e estão associadas tanto in vitro quanto in vivo a uma regulação

negativa da ação da insulina [4, 16, 17, 18, 19].

Em experimentos, para simular o excesso de AGL circulantes, pode-se usar o ácido

palmítico (C16H32O2, C16:0). Em soluções com pH fisiológico, esse ácido é dissociado,

gerando o palmitato. O ácido hexadecanóico, como também é chamado, é um dos ácidos

graxos saturados mais abundantes, tanto em gordura de origem animal quanto vegetal.

Principalmente porque, quando há excesso de consumo de carboidratos, o ácido palmítico é

o primeiro ácido graxo produzido e passa a ser o precursor de outros ácidos graxos. Dessa

forma, é também o ácido graxo mais abundante no plasma de humanos e roedores [20].

Há uma vasta literatura mostrando que tratamentos com palmitato não só diminuem

a sensibilidade à insulina, como também podem levar diversos tipos celulares à apoptose.

Muito provavelmente devido ao estresse de RE, as diversas EROs e os radicais livres

gerados durante a metabolização desse ácido graxo, o palmitato desencadeia o processo

apoptótico em tecidos como células beta pancreáticas [21, 22], hepatócitos [23], células

musculares [16, 24] e adipócitos [25].

1.2. Insulina: produção e efeitos metabólicos

A insulina é um hormônio produzido e liberado pelas células beta do pâncreas. A

sua produção e secreção são controladas por uma série de fatores neurais, metabólicos e

hormonais que se ajustam às demandas do organismo, a um dado momento do dia, de

acordo com o estado nutricional. Contudo, apesar dessa comunicação complexa, o principal

regulador da sua secreção é, de fato, a glicose.

Dentre os vários efeitos catabólicos da insulina, aqueles que estão prejudicados em

um quadro de resistência a esse hormônio são os que se relacionam ao metabolismo

4

glicídico. Em situações normais, a insulina é um forte hipoglicemiante, de maneira que esse

efeito resulta de sua ação combinada no fígado, na musculatura esquelética e no tecido

adiposo. Assim, a insulina diminui o débito hepático de glicose, inibindo a gliconeogênese

e a glicogenólise, ao mesmo tempo em que aumenta a captação de glicose pela musculatura

esquelética e pelo tecido adiposo. O aumento da depuração de glicose é, em última análise,

uma consequência da mobilização de vesículas intracelulares que contém GLUT4 para a

membrana celular. Esse evento, que resulta no aumento da difusão de glicose para o meio

intracelular, está claramente prejudicado no paciente com DMT2.

A transmissão do sinal intracelular da insulina que culmina nesse evento é

complexa, mas algumas etapas já estão bem esclarecidas. Primeiramente, o receptor de

insulina (insulin receptor – IR) é uma proteína tetramérica, composta por duas subunidades

α extracelulares que se ligam alostericamente à insulina, resultando na ativação das duas

subunidades β transmembrânicas. As subunidades β, quando ativas, catalisam

autofosforilação em resíduos de tirosina, gerando conseguinte transfosforilação, mudança

conformacional e aumento da sua atividade tirosina cinase [26].

A seguir, os substratos do receptor de insulina (insulin receptor substrate – IRS 1 a

4), conhecidas como proteínas ancoradouras, pois permitem a associação de diversas

proteínas com domínios de homologia Src-2 (SH2), são fosforiladas em tirosinas pelo

próprio IR. Dessa maneira, os IRS habilitam as interações com proteínas com domínios

SH2, como a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K).

A PI3K, constituída por uma subunidade reguladora e uma subunidade catalítica,

tem papel central na ação metabólica da insulina. Em uma situação basal, a primeira inibe a

atividade catalítica da segunda. Contudo, quando a PI3K se liga, por meio da subunidade

reguladora, em domínios fosfotirosínicos dos IRS, ocorre a ativação da subunidade

catalítica, que inicia a catálise de diversas reações, dentre estas, a transformação do

fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) em fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3).

O PIP3 recruta para a membrana citoplasmática a proteína cinase dependente de

PIP3 (PDK1), ativando-a. Essa última fosforila em treonina a proteína cinase B

(AKT/PKB), uma proteína com atividade serina/treonina cinase. Sendo também recrutada

para a membrana plasmática, essa proteína é completamente ativada pela fosforilação em

resíduos de serina por outras proteínas. Assim como a PI3K, a AKT é uma etapa chave na

5

sinalização da insulina, de modo que camundongos que apresentam deleção funcional para

a AKT2 são intolerantes à glicose e resistentes à ação da insulina, com uma menor captação

de glicose pelo músculo esquelético [27].

Diante das múltiplas reações que são desencadeadas após a completa ativação da

AKT/PKB, essa proteína passou a ser considerada um nó crítico na cascata de sinalização

da insulina. A partir desse momento, ocorre a fosforilação da proteína ativadora da Rab-

GTPase no substrato de 160 kDa da AKT, ou AS160, de extrema importância no processo

de captação de glicose pela célula. A AS160, quando não fosforilada, inibe a ação da

proteína Rab-GTPase. No entanto, ao sofrer fosforilação, essa proteína perde sua ação

inibitória. Dessa forma, a Rab-GTPase continua ativa, promovendo a reorganização do

citoesqueleto e a translocação de vesículas que contém GLUT-4 (transportador de glicose-

4) em direção à membrana celular, permitindo assim o transporte de glicose [26].

Figura 01: Proteínas envolvidas na translocação de vesículas com GLUT4 e captação de

glicose. O receptor de insulina (IR) se liga alostericamente à insulina, resultando na ativação das duas subunidades β. Essas, quando ativas, catalisam sua autofosforilação em resíduos de tirosina. A seguir, as subunidades β, fosforilam os substratos do receptor de insulina (IRS 1 a 4), habilitando as interações com proteínas com domínios SH2, como a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K). Dessa forma, a PI3K tem sua atividade catalítica, e inicia a catálise de diversas reações, dentre estas, a transformação do fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) em fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3). O PIP3 recruta para a membrana citoplasmática a proteína cinase dependente de PIP3 (PDK1), ativando-a. Essa última fosforila em treonina a proteína cinase B (AKT/PKB). A partir desse momento, ocorre a fosforilação da proteína ativadora da Rab-GTPase no substrato de 160 kDa da AKT, ou AS160. A AS160, ao sofrer fosforilação, ativa a Rab-GTPase, promovendo a reorganização do citoesqueleto e a translocação de vesículas que contém GLUT-4 (transportador de glicose-4) em direção à membrana celular, permitindo assim o transporte de glicose [figura do autor].

6

Além dessa fina regulação no tecido adiposo e na musculatura esquelética, via

GLUT4, no fígado, vale ressaltar que a difusão de glicose para dentro dos hepatócitos

ocorre via GLUT2, um subtipo de GLUT que já se encontra disposto na membrana celular.

Dessa forma, a entrada da glicose em território hepático não é dependente da translocação

dessas vesículas.

Os mecanismos pelos quais a insulina marcandamente inibe a gliconeogênese e

aumenta da formação de glicogênio, envolvem sinalizações que interferem na expressão de

diversas proteínas. Para inibir a gliconeogênese, a insulina basicamente diminui a expressão

de genes que codificam as enzimas limitantes da gliconeogênese, tais como glicose-6-

fosfatase (G6Pase) e fosfoenol-piruvato-carboxicinase (PEPCK). Dessa forma, a insulina

suprime drasticamente a produção de novo da glicose [28].

Em um quadro de resistência à insulina, não há a supressão desses genes, o que

pode gerar a hiperglicemia matutina, comuns em DMT2. Concordante a esse dado, Sun e

colaboradores demonstraram que a superexpressão de G6Pase e PEPCK pode contribuir

para o desenvolvimento de DMT2, devido ao aumento da produção e liberação de glicose

de fontes não glicídicas para a circulação [29].

Já para a conversão de glicose em glicogênio, a insulina pode aumentar a atividade

da glicogênio sintase (GS), uma enzima limitante para a produção dessa reserva energética

[30]. Como a síntese de glicogênio aumenta muito a captação de glicose no estado pós

prandial, essa via é considerada a principal forma de contribuição do fígado para a

depuração da glicose plasmática [31].

Consequentemente, o quadro de resistência à insulina, característico do DMT2,

acarreta a elevação da glicemia. Contudo, observa-se uma certa característica circadiana,

geralmente nas primeiras horas da manhã. Segundo Radziuk e Pye (2006), essa alteração

apresenta uma característica temporal bem definida e ocorre principalmente devido a uma

maior produção endógena de glicose por mecanismos relacionados à estimulação da

gliconeogênese [32].

7

1.3. Melatonina

A melatonina, ou N-acetil-5-metoxi-triptamina (Figura 03), é uma indolamina

produzida por diversos tecidos, como a retina, o intestino e a glândula pineal, sendo que,

nessa última, ocorre a liberação sistêmica modulada pela luz. Dessa forma, a melatonina

está associada à regulação circadiana de diversos parâmetros fisiológicos em vertebrados.

Especialmente nos mamíferos, os ritmos diários dos processos fisiológicos e

comportamentais são controlados, principalmente, por um conjunto de neurônios do

hipotálamo, o núcleo supraquiasmático (NSQ). Essa região também é chamada de relógio

central, pois é ela quem determina os diversos eventos que caracterizam o ritmo circadiano

e sazonal. E o mecanismo utilizado pelo NSQ para manter esse ritmo é através do controle

rígido da síntese e da secreção da melatonina pela glândula pineal [33].

A produção de melatonina (Figura 02) depende basicamente da informação

luminosa, que é transmitida da retina para o NSQ, por meio do trato retino-hipotalâmico.

As células sensíveis à luz, responsáveis pelo encaminhamento da informação claro/escuro,

são, na verdade, um pequeno subconjunto de células da retina que contêm o fotopigmento

melanopsina. Por meio de uma comunicação mediada por diversos neurotransmissores,

ocorre a tradução do sinal luminoso para o NSQ. Nesse caminho, chega o estímulo à

glândula pineal, que produz e secreta a melatonina para a corrente sanguínea somente na

ausência de luz [34].

8

RETINA NSQ NPVCérebro posterior

Medula Espinhal

GCS

ATPAMPcSíntese

Proteica

Triptofano

5-hidroxitriptofano

5-hidroxitriptamina

N-acetilserotonina

Melatonina

NA

Pinealócito

Hipotálamo

NA

C-quinase

Ausência de Luz

α

β

TPH

Descarboxilase

AA-NAT

HIOMT

Figura 02: Biossíntese da melatonina. A retina, na ausência de luz, ativa os núcleos supraquiasmáticos (NSQ) do hipotálamo, que por uma via polissináptica, passa pelo núcleo paraventricular (NPV), cérebro posterior e medula espinhal, atinge o gânglio cervical superior (GCS). Fibras simpáticas projetam para a pineal e ativam adrenoreceptores (α e β) nos pinealócitos, por meio do neutransmissor noradrenalina (NA). Esse é o sinal neuroendócrino para a indução da transcrição gênica da enzima arilalquilamina-N-acetiltransferase (AA-NAT), uma enzima chave para a produção de melatonina. Dessa forma, ocorre a síntese da 5-hidroxitriptamina, ou serotonina, a partir do triptofano, ocorre sob estímulo luminoso. Para chegar à serotonina, são necessárias duas enzimas, a triptofano hidroxilase (TPH) e L-aminoácidos aromáticos descarboxilase. Contudo, para a formação da N-acetilaserotonina pela AA-NAT é necessário a ausência de luz. Por fim, a formação da melatonina, ou N-acetil-5-metoxi-triptamina, ocorre pela ação enzimática da hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT) [34].

Para a produção de melatonina, o primeiro passo consiste na captação do

aminoácido triptofano pelo pinealócito. Esse aminoácido é transformado em 5-

hidroxitriptofano pela ação da enzima 5-TPH, um passo limitante para formação da

serotonina. Em seguida, ocorre a descarboxilação enzimática, originando a 5-

hidroxitriptamina, ou serotonina. Depois desse passo, a serotonina, sob a ação da AA-NAT,

recebe um grupo n-acetil, sendo transformada em N-acetil-serotonina. A AA-NAT é

regulada pela estimulação simpática e sua produção ocorre somente na ausência de luz . Por

fim, a N-acetil-serotonina é transformada em melatonina pela ação da hidroxi-indol-O-

metiltransferase (HIOMT) e liberada para a corrente sanguínea [34].

9

Dessa forma, como a melatonina só é produzida na ausência de luz, esse hormônio

age como um marcador temporal para diversos tecidos, principalmente nos que apresentam

receptores de melatonina do tipo 1 e 2 (MT1/MT2), conferindo aos mesmos ritmicidade.

Esses receptores são do tipo acoplados à proteína Gi, que inibem a ação da proteína

adenilato ciclase e, com isso, diminuem a concentração de AMPc [35]. Por meio dessa

sinalização, a melatonina controla a expressão e a atividade de uma imensidão de proteínas,

dentre elas alguns genes relógio (clock genes) [33, 34].

São esses marcadores internos que permitem aos mamíferos responderem às

mudanças anuais do fotoperíodo, gerando as alterações adaptativas do seu estado

fisiológico, como a reprodução, hibernação e todo o processo de controle energético

conforme as estações do ano. Por isso, o padrão de secreção da melatonina, determinado

pela fase, duração, amplitude e quantidade, confere sincronização circadiana às diversas

estruturas internas, e isto nada mais é do que o ajustamento das oscilações existentes no

organismo durante os períodos de claro e escuro, ou dia e noite [33].

A variação da quantidade de melatonina produzida é de 0,43 a 0,86 pmol durante o

dia, para 4,3 a 8,6 pmol à noite, por glândula pineal de rato. Esse aumento de 10 vezes à

noite é o que caracteriza o pico de melatonina. Em concentrações plasmáticas, varia de 43 a

86 pmol/L durante o dia para 344 a 430 pmol/L, à noite. Por se tratar de uma molécula

lipofílica, a melatonina produzida é prontamente liberada por difusão, pela glândula pineal

[34].

Quando chega à corrente sanguínea, a melatonina tem meia vida de

aproximadamente 20 minutos, uma vez que é rapidamente metabolizada pelo fígado por

meio do citocromo P450. O principal metabólito gerado é a 6-sulfatoxi-melatonina, que é

eliminada pela urina. Por isso, uma das formas indiretas para dosar a melatonina é através

da 6-sulfatoxi-metatonina na urina [36]. Esse metabólito pode ser encontrado na urina de

ratos, humanos e camundongos. Embora, na urina dos camundongos, a 6-glucoronil-

melatonina seja o metabólito predominante [37].

A quantificação direta da melatonina, na glândula pineal ou no plasma, reflete

rigorosamente o momento da sua síntese, uma vez que não pode ser armazenada. Essas

características de produção, liberação e metabolização conferem à melatonina uma

10

resolução altamente dinâmica, que é essencial para as suas propriedades como marcador

temporal interno [34].

Obviamente, a melatonina não é o único hormônio circadiano que está presente nos

mamíferos. Outro bom exemplo é o cortisol, que é secretado em antifase à melatonina, ou

seja, quando há o pico de melatonina (chamado de acrofase em cronobiologia) observa-se a

menor concentração plasmática de cortisol (ou nadir do cortisol). Sabe-se que o NSQ inerva

o núcleo autônomo paraventricular, que por sua vez regula tanto a glândula pineal quanto o

córtex da adrenal. Assim, a inervação simpática regula a secreção de melatonina, como

também as oscilações diárias dos níveis de glicocorticoides, tudo mediado pelo NSQ [38].

No caso dos glicocorticoides, o pico circadiano na sua liberação ocorre

imediatamente antes ou perto do início da atividade em mamíferos. Dessa forma, tanto a

melatonina quanto o cortisol são importantes marcadores da fase circadiana, pois além de

sincronizarem os ritmos diários dos tecidos periféricos, provavelmente, fornecem um

feedback para o NSQ [38].

Por sua característica rítmica, a melatonina passou a ser foco de estudos para as

diversas causas de perturbações no ritmo circadiano. Seja pelas condições de vida, como

mudanças de turnos no trabalho e problemas com fuso horário; ou até mesmo por

circunstâncias naturais, como o envelhecimento, essas perturbações envolvem mudanças

fisiológicas que quase sempre podem ser associadas aos níveis de melatonina. No caso do

envelhecimento, por exemplo, é comum o desenvolvimento de patologias específicas, como

distúrbios do sono e perturbações metabólicas como obesidade, diabetes,

hipercolesterolemia, câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, e essas

coincidem com a diminuição da secreção de melatonina [39, 40, 41, 42].

Consequentemente, o tratamento farmacológico com melatonina exógena pode

sincronizar não só NSQ, ao melhorar a temporização circadiana ou agir indiretamente em

algum nível a jusante da rede circadiana, como também restaurar diversos outros

parâmetros metabólicos [33, 39]. Por isso, além do seu uso em distúrbios do sono, a

administração de melatonina tem surgido como uma alternativa ou uma importante

associação farmacológica para doenças senis e metabólicas.

Principalmente devido a sua ação antioxidante, há estudos que sugerem seu uso em

casos de Alzheimer, Parkinson, acidente vascular cerebral e doenças cardíacas, entre outras

11

relacionadas ao excesso de radicais livres e morte celular. Bem como há estudos que

indicam que a reposição de melatonina pode melhorar o sistema imunológico, e os

distúrbios gerados pela síndrome metabólica e a homeostasia glicêmica, nesse último,

devido a sua ação junto à insulina e a diminuição de adiposidade.

1.3.1. Efeitos da melatonina sobre o sistema imunológico

Estudos mostraram que ratos pinealectomizados exibem o timo estruturalmente

modificado. E que em ratos muito velhos, após a reposição de melatonina ou o enxerto de

pineal de rato jovem, impediu-se a involução do timo, comum no envelhecimento [43, 44,

45, 46]. Dessa forma, esses trabalhos introduziram a ideia de que a melatonina pode afetar

o sistema imunológico.

Corroborando com esses dados, em tratamentos com doses elevadas de melatonina

exógena, in vivo, observa-se uma estimulação generalizada das células imunitárias. Dentre

as alterações, pode-se citar o aumento da atividade de células T e aumento no número de

linfócitos. Já in vitro, a melatonina também aumenta a atividade de células T Helper e

Natural Killer (NK), a produção de IL2 e interferon gama e a expressão de RNA

mensageiros para a síntese de IL1 em monócitos de humanos [34].

Esses efeitos podem ocorrer pela ação direta da melatonina, por difusão para o meio

intracelular, ou pela sua ação via receptores de melatonina, presentes em vários tecidos do

sistema imune, como o timo, o baço, os linfócitos e as células T Helper. Além disso, a

melatonina, como hormônio cronobiológico, pode estar envolvida na regulação circadiana

do sistema imunológico, interferindo na ritmicidade diária do número e da atividade de

linfócitos T, B e NK. Dessa forma, a melatonina também pode mediar as mudanças

sazonais características do sistema imunológico, que é reforçada em dias curtos, com uma

duração mais longa do pico melatonina [47].

Em geral, os trabalhos mostram que a melatonina apresenta ação estimuladora do

sistema imunológico, seja em roedores, humanos e in vitro [34].

12

1.3.2. Ação antioxidante da Melatonina

A publicação, em 1994, de um possível efeito revitalizador da melatonina,

observado em ratos velhos transplantados com pineais de ratos jovens, suscitou o interesse

geral para melatonina como uma importante substância de ação antioxidante e

antienvelhecimento [48].

Desde 1993 já se sabe que a melatonina é um potente captador de radicais livres. A

proposta é de que a melatonina, de característica anfifílica com pronunciada lipofílicidade,

difunde-se para o citosol da célula e do núcleo, protegendo as macromoléculas da

citotoxicidade dos radicais livres [49, 50, 51, 52]. Essa característica advém do grupo indol,

presente na sua estrutura, que atua como centro reativo de interação com agentes oxidantes,

devido à sua elevada estabilidade de ressonância e muito baixa barreira de energia de

ativação para as reações com espécies altamente reativas, como os radicais livres [53, 54].

Figura 03: Melatonina, grupo indol em destaque (círculo vermelho), com grande estabilidade devido à ressonância eletrônica.

Além disso, as cadeias laterais amida e metoxi também contribuem de forma

significativa para a capacidade antioxidante da melatonina. Se o grupo metoxi for

substituído por um grupo hidroxila (–OH), sob algumas condições in vitro, melhora-se a

Grupo Indol

Grupo metoxi

Grupo amida

13

capacidade antioxidante dessa molécula. Contudo, apesar do aumento do potencial anti-

oxidativo, essa mudança gera como custo a redução da sua lipofilicidade.

Consequentemente, esse evento diminui a permeabilidade da melatonina através da

membrana plasmática, o que, de certa forma, reduz o campo de atuação da melatonina

como antioxidante in vivo [54].

Devido a sua estrutura, a melatonina pode eliminar uma variedade de espécies

reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio, incluindo radicais livres como hidroxila

(OH•), superóxido (O2–•), óxido nítrico (NO•), além de moléculas e ânions muito reativos

como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o oxigênio singleto (1O2, forma excitada de

oxigênio molecular), e o ânion peroxinitrito (ONOO –) [52, 53, 54, 55, 56, 57].

Outra característica que beneficia a ação da melatonina contra os radicais livres é

que, ao contrário dos antioxidantes clássicos, todos os produtos intermediários gerados pela

interação da melatonina com espécies reativas também são depuradores de radicais livres.

Devido a essa cascata de reações, uma molécula de melatonina tem o potencial para

eliminar até quatro ou mais espécies reativas. Isso torna a melatonina muito eficaz na sua

ação antioxidante. Sob condições in vivo, esse hormônio é, geralmente, várias vezes mais

potente do que a vitamina C e E em proteger os tecidos de danos oxidativos, quando

comparada a uma dose equivalente, em mmol/kg [54].

De forma geral, existem diversas proposições de mecanismos de interação da

melatonina com as espécies reativas, contudo o que fica evidente é que independentemente

do mecanismo e da sua degradação, a melatonina apresenta elevada capacidade de reparar

biomoléculas danificadas [54]. Somado a isso, além da sua ação direta sobre as espécies

reativas e radicais livres, a melatonina pode agir indiretamente como antioxidante,

alterando a transdução de sinal, a expressão e a atividade de enzimas antioxidantes, como

superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase, entre outras, aumentando

assim a atividade antioxidante das células [24, 52, 57, 58].

Os benefícios do uso da melatonina como antioxidante ainda são vastamente

pesquisados e, principalmente, em casos de doenças relacionadas ao estresse do RE, câncer

e doenças neurodegenerativas, tem amplo espectro para possíveis usos no futuro. Contudo,

ainda não há evidências das consequências sobre o uso prolongado da melatonina exógena

e de superdosagens.

14

1.3.3. Melatonina e ação anticancerígena

Há diversas hipóteses que associam o avanço da idade, o efeito dos radicais livres e

a ocorrência de câncer. Além disso, com o envelhecimento, observa-se a diminuição dos

níveis séricos de melatonina. Considerando que a melatonina tem poderosa ação

antioxidante, diversos trabalhos sugerem que a manutenção de um nível elevado desse

hormônio poderia retardar as alterações relacionadas com a idade e a incidência de câncer

[51, 52, 59].

O efeito anticancerígeno da melatonina é mais pronunciado, tanto in vivo quanto in

vitro, sobre os tumores mamários responsivos ao estrogênio [60]. In vivo, existe uma

correlação inversa entre o nível noturno de melatonina plasmática e o número de receptores

de estrogênio em pacientes com um câncer do tipo dependente de estrogênio.

Concordantemente, in vitro, doses de 1 a 100 nmol/L de melatonina induzem a apoptose de

40 a 60% de linhagem de células tumorais da mama humana, a MCF-7 [60, 61].

Além da MCF-7, diversas outras linhagens, inclusive em HepG2, evidenciam que a

melatonina gera a morte de células cancerígenas [62, 63]. Contudo, os efeitos da

melatonina contra o câncer, ocorrem em doses na faixa de micromolar (10-6 mol/L),

enquanto que, fisiologicamente, as concentrações plasmáticas estão na ordem de picomolar

(10-12 mol/L), ou seja, um milhão de vezes menor. Mesmo assim, é notável o efeito

benéfico da melatonina contra células cancerígenas.

1.3.4. Melatonina e o estresse do retículo endoplasmático

Alguns estudos fornecem evidências que o estresse do RE desempenha um papel

fundamental na progressão da obesidade e resistência à insulina em tecidos como fígado,

adiposo e músculo esquelético [64, 65]. Considerando as ações antioxidantes da melatonina

e a possível diminuição de adiposidade, muitos estudos estão associando tratamentos com

esse hormônio em casos clássicos de estresse de RE.

15

Primeiramente, vamos discutir brevemente as vias que são ativadas no estresse do

RE.

É no lúmen do retículo endoplasmático (RE) que ocorrem a síntese, o dobramento e

a secreção de proteínas. Essa organela, formada por uma rede intercomunicante de túbulos,

é a região na qual ocorrem as modificações pós traducionais, como a glicosilação e a

oxidação de tióis provindos de resíduos de cisteínas, garantindo, dessa maneira, a

manutenção conformacional de proteínas recém-formadas.

Para garantir a eficiência do processo de dobramento correto, há elevada

concentração de uma família de proteínas conhecidas como chaperonas no lúmen do RE,

que incluem Grp78 (glucose-regulated protein-78, também conhecida como Bip), Grp94

(glucose-regulated protein-94), calnexina, calreticulina, entre outras. Essas são liberadas

quando há excesso de proteínas, numa tentativa de melhorar o dobramento das mesmas.

Mas, ao serem liberadas, as chaperonas passam a ser também sensores de estresse. Por isso,

as chaperonas assumem um papel importante no controle de qualidade das proteínas [66].

Diante desta função complexa, inevitavelmente algumas proteínas saem

desdobradas (unfolded protein) ou mal dobradas (misfolded protein), mas são rapidamente

degradadas por sistemas de destoxificação [67]. Entretanto, em situações em que ocorre a

formação de grandes quantidades de proteínas imaturas, seja por excesso de nutrientes,

espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio, ácidos graxos saturados, entre outros

insultos estressantes ao sistema, estimula-se uma resposta adaptativa chamada de Unfolded

Protein Response, a UPR [68]. Desta forma, a UPR pode ser entendida como uma tentativa

do RE de processar o excesso de proteínas mal dobradas, sendo basicamente caracterizada

pela diminuição da taxa de tradução, o aumento da expressão de chaperonas do RE, em

detrimento à síntese proteica em geral, e a ativação do sistema de degradação associado ao

RE (ERAD), que, em conjunto podem reduzir os erros no dobramento das proteínas [69].

A UPR consiste basicamente na associação de três vias distintas, mas

orquestradamente integradas, que incluem PERK (PKR-like ER kinase), ATF6 (activated

transcription factor 6) e IRE1 (inositol-requiring protein 1) [70]. Estas são proteínas

ancouradouras das chaperonas e, como são transmembrânicas, possuem domínios tanto no

lúmen do RE como no citosol. Desta forma, funcionam como sinalizadoras da função

reticular para toda a célula [71].

16

Uma das primeiras respostas ao estresse do RE envolve a ativação da via da PERK

[70]. Quando ativa, a PERK se dimeriza, sofrendo autofosforilação e conseguinte ativação

de seu domínio cinase. Torna-se possível, desta maneira, a fosforilação da subunidade α do

eIF2-α (eukaryotic translation-initiation factor 2 alpha), conduzindo, assim, a atenuação da

tradução geral de proteínas [72].

Esse primeiro passo impede o aumento na taxa de tradução de proteínas durante as

fases iniciais de estresse do RE. Entretanto, é importante ressaltar que, embora a

fosforilação do eIF2-α atenue a tradução de uma maneira global, certos mRNAs, como o

ATF4 (activated transcription factor 4), ganham uma vantagem seletiva para a tradução

nessas condições. A tradução desse fator de transcrição garante a transcrição e tradução de

chaperonas do RE, como Grp78 e GADD153 (growth arrest–DNA damage gene, também

conhecida como CHOP – C/EBP homologous protein). Contudo, não há aumento do

conteúdo proteico, pois a taxa de transcrição celular está inibida [72, 73].

Semelhantemente à PERK, o ATF6 é um fator de transcrição transmembrânico do

RE, com seu domínio luminal ligado à Grp78 sob condições de equilíbrio [74]. Contudo,

sob estresse, ocorre a dissociação da Grp78 e liberação do ATF6 da membrana do RE,

permitindo seu o deslocamento para o aparelho de Golgi, onde é clivado por proteses S1P e

S2P (site-1 e site-2-proteases) [75]. A clivagem do domínio transcricionalmente ativo do

ATF6, a p50, na membrana do aparelho de Golgi, permite que ocorra a migração desse

fator de transcrição para o núcleo, onde se liga aos genes promotores induzíveis da UPR,

especificamente as chaperonas e a XBP-1 (X-box-binding) [76].

A via final ativada é a da IRE1. Similar à PERK e ao ATF6, a IRE1 também

permanece ligado à Grp78 em condições de homeostase na produção de proteínas [72].

Após a dissociação da Grp78, a IRE1 se oligomeriza passando a apresentar atividade

endoribonucleasica, o que resulta no splicing não convencional e posterior tradução do

mRNA que codifica a proteína XBP1, previamente transcrito pela ação do ATF4 e do

ATF6. A remoção de um íntron de 26 nucleotídeos do mRNA imaturo da XBP1 pela IRE1

produz um factor de transcrição de XBP1 ativo, que coordena a expressão de várias

chaperonas no RE, incluindo a Grp78 [66].

Embora a UPR seja uma tentativa de atenuar a condição de estresse, a persistência

prolongada do insulto, ou a sua gravidade, pode levar a célula à morte por apoptose. Isto

17

decorre da ativação persistente da IRE1, já que essa, além da sua atividade

endoribonucleásica, também recruta a TRAF2 (tumor necrosis factor receptor-associated

factor 2) e ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1) para a membrana do RE. Esta

associação, ao seu turno, ativa as caspases pela via mitocondrial, além da JNK [77]. O

recrutamento de TRAF2 para a membrana do RE pela IRE1 libera também TRAF2 para o

citosol, permitindo não só a ativação da caspase 12 como consequentemente a ativação

outras caspases executoras [78].

Somado a isso, no decorrer da ERAD, ocorre a liberação de íons Ca2+ do RE

ativando a calpaina. Esta, ao ativar a procaspase 12 e outras caspases, dispara o processo

apoptotótico [79]. Em paralelo, o estresse do RE também pode induzir a morte através da

PERK e IRE1 por meio da ativação de proteínas pró-apoptóticas, especificamente a

GADD153 (ou CHOP), uma vez que essas, entre outras ações, podem diminuir a expressão

de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), uma proiteína antiapoptótica [68].

Figura 04: Ativação das vias do estresse do retículo endoplasmático [figura do autor].

Nogueira e colaboradores (2011) mostraram que ratos pinealectomizados

apresentam aumento da expressão de ATF4 e ATF6, o que coincidiu com a resistência

18

hepática à insulina e aumento do débito hepático de glicose [80]. Somado a isso, há

evidentes associações entre obesidade, stress do RE e aumento da gliconeogênese. Mais

especificamente, um estudo recente demonstrou que o estresse do RE aumenta a expressão

das enzimas hepáticas ligadas à gliconeogênese de maneira dependente à diminuição da

fosforilação do STAT3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3). Esse processo

desempenha um papel muito importante no aumento da produção hepática de glicose tanto

na obesidade quanto no diabetes [81].

1.3.5. Melatonina e o metabolismo energético

Além da ação da melatonina como antioxidante, esse hormônio também apresenta

estreita relação com a obesidade e o diabetes. Segundo Wolden-Hanson e colaboradores

(2000), o tratamento oral com 0,4 µg/mL de melatonina na água de beber, por 12 semanas,

em ratos idosos, aumentou não somente a sensibilidade à insulina e à leptina, como também

a temperatura corporal e a atividade física desses animais, o que diminuiu a massa do rato

envelhecido. Ao passo que extinguida a reposição, esses animais voltavam a apresentar a

mesma massa que os ratos velhos não tratados [39].

Somado a isso, Frese e colaboradores (2009), demonstraram que as glândulas

pineais de ratos com DMT2, do tipo Goto-Kakizaki, secretavam menos melatonina que as

pineais de Wistar saudáveis. Segundo os autores, essa diferença se deve à menor expressão

de RNA mensageiros responsáveis pela tradução de proteínas ligadas à síntese da

melatonina e menor produção desse hormônio nos ratos diabéticos [82].

A administração por longo período de tempo de melatonina também se mostrou

eficiente na melhora do metabolismo lipídico e na sensibilidade à insulina em ratos com

DMT2 [83]. E, em ratos que receberam dieta hiperlipídica por 12 semanas, a administração

intraperitoneal de melatonina, nas doses de 5 e 10 mg/kg, foi eficaz na redução da esteatose

hepática e na inflamação, diminuindo os níveis de aminotransferases (alanina e aspartato),

colesterol total e triglicerídeos no fígado desses animais [84]. Concordantemente a esse

dado, Nishida e colaboradores reportaram que a pinealectomia pode levar ao acúmulo de

triglicerídeos no fígado [85].

19

Em humanos, foi demonstrado que pessoas com resistência à insulina também

apresentam menor secreção de melatonina, durante a noite [32]. E em um grande estudo

realizado com mais de 18 mil enfermeiras, entre 2000 e 2012, evidenciou uma associação

entre a diminuição da secreção de melatonina e um risco aumentado para o

desenvolvimento de DMT2, independente de outros fatores como estilo de vida, IMC,

qualidade do sono, disfunção endotelial, entre outros [86].

Nos estudos genômicos, o polimorfismo de um único nucleotídeo no receptor de

melatonina (MTNR1B) foi associado com níveis mais elevados da glicemia de jejum, da

hemoglobina glicada e com o aumento da incidência de DMT2 durante a gestação [87, 88,

89]. Os dados obtidos em animais e os estudos genéticos em humanos sugerem que a baixa

secreção e/ou a redução da sinalização da melatonina consequentes de polimorfismos

podem prejudicar a sensibilidade à insulina e levar ao DMT2 [86].

Em culturas primárias de adipócitos, isolados de tecido adiposo branco de ratos,

observou-se o aumento da captação de glicose estimulada pela insulina, quando tratadas

com melatonina [90]. E, em animais pinealectomizados, a capacidade dos adipócitos

captarem glicose, após o estímulo de insulina, foi diminuída, provavelmente em

decorrência de uma menor expressão e translocação do transportador de glicose GLUT4 no

tecido adiposo [91].

Ainda em animais pinealectomizados, observou-se que esses apresentavam

resistência à insulina frente a um teste de tolerância à insulina (ITT) e que tanto a

resistência à insulina quanto a diminuição da expressão do GLUT4 no tecido adiposo

desses animais foram recuperadas após reposição de melatonina [92]. Alem disso, esses

animais podem apresentar resistência hepática à insulina no período noturno, aumento da

expressão da PEPCK, além do aumento da conversão de piruvato em glicose no final da

noite, evidenciando a forte relação entre a ausência de melatonina e os mecanismos ligados

à produção hepática de glicose e a elevação da glicemia [80].

Incubações em adipócitos primários mostraram, também, que a melatonina

potencializa a ação da insulina de maneira mais eficiente quando intermitente (12h na

presença e 12h de ausência de melatonina), se comparada com a exposição continua à

melatonina por 72h [93]. Esse tipo de incubação intermitente tem a intenção de mimetizar o

ciclo claro/escuro. Além disso, no caso de células beta pancreáticas, as diferenças entre

20

exposição contínua e intermitente à melatonina parecem gerar efeitos opostos. A exposição

aguda e contínua de ilhotas isoladas de ratos à melatonina diminui a secreção de insulina

[94], quando analisado imediatamente após à exposição a esse hormônio. No entanto, a

exposição por duas 2 horas, em perfusão com variação da concentração, simulando o pico

de melatonina, resulta em um aumento da secreção somente 9 horas após a retirada da

melatonina [95]. Assim, a ação da melatonina pode se repercutir também depois de um

tempo da sua ausência, de forma refratária.

Ainda em relação às células beta pancreáticas, a melatonina tem se mostrado muito

eficiente na proteção contra EROs e radicais livres, consequentemente colaborando com a

homeostasia glicêmica. Em tratamentos com melatonina, in vivo, ratos com DMT1

induzida por estreptozotocina – um suposto mecanismo de ação dessa droga é de que pode

gerar apoptose das células beta pancreáticas devido à metilação e conseguinte fragmentação

do DNA –, apresentaram regeneração parcial e proliferação de células pancreáticas,

aumentando a depuração da glicose plasmática nesses animais [96, 97].

Quanto ao mecanismo de ação da melatonina, em casos de resistência à insulina,

diversos trabalhos mostraram que essa indolamina por si só tem a capacidade de ativar a

sinalização da insulina em células primárias. Essa ação sinérgica foi observada tanto em

células neuronais quanto em células musculares e adiposas [24, 93, 98, 99].

Esses estudos demonstraram que a ativação da sinalização da insulina em tecidos ou

células sadias é dependente da interação da melatonina com seus receptores de membrana

MT1/MT2 e que, no caso das células musculares, isso leva a uma maior captação de

glicose. Muito brevemente, isso ocorre porque a adenilato ciclase converte ATP em AMPc,

que, por sua vez ativa a proteína cinase A (PKA). Essa, ao seu turno, ativa a proteína

tirosina fosfatase 1B (PTP1B). Como o próprio nome diz, a PTP1B, desfosforila outras

proteínas em tirosina, dentre elas, a IRS 1/2. Dessa forma, inibe-se a cascata de sinalização

da insulina (Figura 05 A).

21

A) B)

Figura 05: Sinalização da melatonina

Contudo, quando a melatonina se liga aos receptores metabotrópicos MT1/MT2

(Figura 05 B), libera-se a subunidade alfa da proteína Gi. Essa subunidade inibe a ação da

adenilato ciclase, não havendo mais o acúmulo de AMPc e a sinalização a jusante. Dessa

forma, a proteína IRS1/2 continua fosforilada, permitindo o prosseguimento da cascata de

sinalização da insulina [98, 99].

De maneira geral, todos esses achados sugerem que a ritmicidade da melatonina

favorece a sensibilidade à insulina e pode estar associada ao DMT2.

22

2. Justificativa

Estudos que usaram uma abordagem in vivo demonstraram que a administração de

melatonina em roedores obesos está associada a uma redução na resistência sistêmica à

insulina [30, 100]. Além disso, observou-se que a síntese de melatonina está diminuída em

roedores obesos e pacientes humanos com resistência à insulina [32, 82, 86].

Quanto ao metabolismo hepático, Shieh e colaboradores mostraram que a

administração de melatonina por duas semanas, via intraperitonial, em camundongos

alimentados com dieta hiperlipídica, diminuiu a esteatose hepática e aumentou a síntese de

glicogênio em 40%. Inclusive em linhagens de HepG2, verificou aumento da fosforilação

da AKT e da GSK3 beta (Glycogen synthase kinase 3 beta), ativando a via de síntese de

glicogênio [30]. Concordantemente à esses dados, alguns trabalhos demonstraram que a

injeção de melatonina no cérebro de camundongos e ratos diminuiu a glicemia plasmática

e da gliconeogênese hepática, via receptor de melatonina MT1/MT2 [101, 102]. Esses

trabalhos demonstram a estreita associação entre a melatonina e sua ação central no

metabolismo glicídico.

De meneira geral, já se sabe que a melatonina ativa a via de sinalização da insulina e

melhora a sua sensibilidade sistêmica. Contudo, apesar desses achados in vivo, ainda não

havia investigações, até o presente momento, sobre a exposição direta à melatonina em

linhagens de células beta pancreáticas, músculo esquelético e fígado, tecidos tão

importantes para a homeostasia da glicose. Por isso, este trabalho se voltará para a análise

de como essas células de tecidos chaves para a evolução do DMT2, in vitro, se comportam,

de maneira independente, diante da melatonina.

23

3. Objetivos

O objetivo geral deste projeto foi verificar se a melatonina age diretamente em

linhagens de células beta pancreáticas, células musculares e hepatócitos.

3.1. Objetivos específicos 3.1.1. Células da linhagem de MIN6

Verificar se a melatonina reverte a apoptose gerada por palmitato em linhagens de

células beta pancreáticas.

3.1.2. Células da linhagem de miotubos de L6

Investigar se a melatonina reverte a resistência à insulina gerada por palmitato em

células musculares miotubos de L6, por meio da fosforilação da AKT/PKB. Também

demonstrar se isso ocorre via receptores de melatonina (MT1/MT2).

3.1.3. Células da linhagem de hepatoma HepG2

Verificar se a melatonina altera a expressão dos genes que codificam as proteínas

reguladoras da gliconeogênese, PEPCK e G6Pase.

24

4. Metodologia

4.1. Cultivo e tratamento de insulinoma MIN6

Células MIN6, oriundas de camindongos, foram mantidas em garrafas de plástico de

75 cm2 (Sarsted, DE) em meio de cultura RPMI 1640 11 mmol/l de glicose, acrescido de

100 U/ml de penicilina e 0,1 mg/ml de estreptomicina (Invitrogen, USA) e 10% de soro

fetal bovino (SFB) (Invitrogen, USA). Para a proliferação e o tratamento, ficaram em estufa

com atmosfera de 5% CO2 a 37°C. Quando atingiam confluência de aproximadamente

90%, eram repicadas para o tratamento, em placas de 6 poços (Sarsted, DE). Somente

quando atingia cerca de 90 a 100% de confluência, eram submetidas ao tratamento com

ácido palmítico (Sigma, USA) e melatonina (Sigma, USA) em meio RPMI livre se SFB e

com 1% de albumina de soro bovino (BSA) (Sigma, USA).

Tanto o palmitato quanto a melatonina foram dissolvidas em álcool etílico absoluto

(Synth, BR), e o controle recebeu igual quantidade desse solvente. Os tratamentos foram

realizados entre as passagens 45 a 55 e os experimentos realizados com essa linhagem

foram de citometria de fluxo, para verificar se a melatonina revertia a apoptose gerada pelo

palmitato.

4.2. Cultivo e tratamento de células musculares miotubos de L6

Mioblastos de células L6, oriundas de músculo glicolítico de ratos, foram

compradas do Banco de Células do Rio de Janeiro. Foram mantidos em garrafas de plástico

de 25 cm2 (Sarsted, DE) em meio de cultura DMEM, acrescido de 25 mM de glicose e 100

U/ml de penicilina e 0,1 mg/ml de estreptomicina (Invitrogen, USA) e 10% de SFB

(Invitrogen, USA), em atmosfera com 5% CO2 a 37°C. Quando as garrafas atingiam cerca

25

de 50 a 60% de confluência, eram submetidas ao tratamento para diferenciação em

miotubos, com a privação de soro. Para isso, foi usado DMEM com 2% de SFB.

A diferenciação era acompanhada diariamente, com a ajuda de microscópio óptico,

e levava de 4 a 7 dias após a restrição de soro. Após a diferenciação de mais de 40% da

garrafa, iniciavam-se os protocolos de tratamento, com ácido palmítico (Sigma, USA),

melatonina (Sigma, USA) e Luzindole (Tocris, UK), para determinação de doses, tempos,

intermitência ou continuidade para cada substância em questão.

Os tratamentos foram feitos em meio DMEM 4,5g de glicose, livre se SFB e com

1% de BSA (Sigma,USA). Tanto o palmitato quanto a melatonina foram dissolvidas em

álcool etílico absoluto (Synth, BR), e o controle recebeu igual quantidade desse solvente.

Os tratamentos foram realizados entre as passagens 10 a 12, e com essa linhagem, foi

verificada se a melatonina revertia a resistência à insulina, gerada pelo palmitato, via

fosforilação da AKT/PKB, pela técnica de Western Blot.

Nos tratamentos de 72h, iniciavam-se os experimentos adicionando a melatonina em

meio com 1% de BSA. Depois de 48h de incubação com melatonina, colocava-se o

palmitato, acrescentando esse ácido graxo na garrafinha, sem trocar o meio. Depois de 24h

realizava-se a extração. Dessa forma, a exposição à melatonina completava 72h e o

palmitato 24h. Para os tratamentos de 24h, seguiu-se sempre a seguinte ordem: exposição à

melatonina, e após a incubação de 30 min na estufa, acrescentava-se o palmitato, ou igual

quantidade de veículo da dissolução do palmitato. Para os tratamentos com luzindol, eram

feitas as incubações com luzindol por 30 min na estufa, depois acrescentava-se a

melatonina, incubação novamente por mais 30 min na estufa, e, somente depois das duas

incubações de 30 min acrescentava-se o palmitato. A contagem do tempo de tratamento

iniciava-se somente após a adição de palmitato.

4.3. Cultivo e tratamento de hepatoma HepG2

As células da linhagem HepG2, compradas do Banco de Células do Rio de Janeiro,

na passagem 90, são derivadas de hepatoma humano, do sexo masculino (15 anos de

26

idade). Estas foram mantidas em meio de cultura DMEM 5,6 mM de glicose acrescido de

100 U/ml de penicilina e 0,1 mg/ml de estreptomicina (Invitrogen, USA) e 10% de SFB

(Invitrogen, USA), sob atmosfera de 5% CO2 a 37oC. As células HepG2 foram usadas entre

as passagens 91 até 104, mantidas em garrafas de plástico de 25 cm2 (Sarsted, DE) até

atingirem confluência de aproximadamente 90%-100% para serem então tratadas. As

células HepG2 foram expostas somente à melatonina (Sigma, USA). Nessa linhagem foram

realizados experimentos de citometria de fluxo, Western Blot, para verificar a dose e o

tempo que não geravam apoptose e nem ativavam as vias de sinalização do estresse de

retículo. Depois foram submetidas a RT-PCR em tempo real, para verificar a ação da

melatonina sobre os genes que codificam a G6Pase e PEPCK.

4.4. Imunoblotting

Garrafas de 25 cm2 confluentes de células foram lavadas e as células foram

removidas com uso de rodo apropriado em solução isotônica. Em seguida, as amostras com

as células em suspensão foram transferidas para um tubo de 1,5mL e precipitadas com uma

breve centrifugação de 1000xg por 10 min. O pellet de células foi acrescido de tampão de

extração (SDS 1%, Tris pH 7,4 a 100mM, pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio

100mM, EDTA 10mM, ortovanadato de sódio 100mM), submetido à homogeneização

ultrasônica para romper as membranas celulares e, em seguida, incubadas à 96ºC por 10

min. Depois desse tempo, as amostras foram centrifugadas para a remoção do material

insolúvel. Após centrifugação, parte do sobrenadante das amostras foi utilizada para

determinação do conteúdo proteico por espectrofotometria com reagente Bradford (Biorad,

USA), com leitura em comprimento de onda de 595nm, e o restante foi acrescido de

tampão Laemmli 5X e incubado à 96ºC por 10 min. A mesma quantidade de proteínas

totais de cada amostra tratada com Laemmli foi fracionado em SDS-PAGE (2,6%C e 8-

12%T) em aparelho para minigel (Mini-Protean, Bio-Rad). Após separação eletroforética,

as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, USA).

27

As membranas foram então bloqueadas com uma solução contendo BSA 5%, Tris-

Base, NaCl e Tween-20 por 2 horas a temperatura ambiente. Após o bloqueio, as

membranas foram incubadas com anticorpos específicos para p-AKT, GAPDH, p-PERK,

Eif-2α, XBP-1, ATF-4, ATF-6 e IL6, todos da Santa Cruz Biotechnology (USA) por 4

horas a temperatura ambiente, ou overnight. Após marcação com anticorpo primário, as

membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase por 1 hora à

temperatura ambiente (GE Healthcare, USA). Antes da detecção, as membranas foram

incubadas por 2 minutos com uma solução contendo luminol, ácido p-cumárico e H2O2 e,

então, expostas durante tempos variados a filmes de raio-X. Depois de revelados, esses

filmes foram submetidos à análise de densitometria óptica pelo software Scion Image

(Scioncorp, USA).

4.5. Reação de polimerase em cadeia

Para a extração do RNA total, as células foram homogeneizadas com 1mL do

reagente Quiazol (Quiagen, USA) direto na placa de 6 poços. Em seguida, foi adicionado às

amostras 0,2 mL de clorofórmio para cada 1 mL de Quiazol, agitando-se vigorosamente por

15 segundos, com posterior incubação em temperatura ambiente, por 15 minutos. A

centrifugação foi em 14.000 g por 15 minutos a 4 °C, e as amostras apresentaram três fases:

uma inferior de coloração rosada, denominada orgânica (na qual está solubilizado o

material proteico), a fase do meio, branca, constituída de DNA e uma superior aquosa,

incolor e transparente (na qual está solubilizado o RNA). A fase aquosa foi coletada

cuidadosamente e transferida para um novo tubo, onde o RNA foi precipitado com 0,8 ml

de isopropanol por 15 minutos à temperatura ambiente, seguido de centrifugação a 14.000g

por 10 minutos a 4 °C. Esse precipitado foi ressuspendido em 1 mL de etanol 75% e a

amostra mais uma vez centrifugada a 14.000g, por 5 minutos a 4°C. O RNA foi diluído em

20µL de água RNAse-free e quantificado em espectrofotômetro a 260nm. A integridade do

RNA obtido foi verificada submetendo as amostras à eletroforese em gel de agarose 1,5%.

A fita-molde de cDNA foi obtida através de uma reação de transcrição reversa com

28

kit da Applied Biosystem (Life Technologies, USA). Para tanto, as amostras de RNA foram

submetidas a uma seleção do RNA mensageiro, utilizando-se um oligonucleotídeo poli-dT,

e posteriormente à transcrição com a enzima transcriptase reversa. O cDNA obtido foi

utilizado na reação da PCR em tempo real.

Para as PCRs em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM

(Applied Biosystems, Life Technologies, USA), que é constituído por um par de primers e

uma sonda marcada com um fluoróforo (normalmente FITC). O cDNA foi utilizado na RT-

PCR em tempo real, com o sistema TaqManTM. O kit utilizado foi o TaqMan Gene G6pc

(G6Pase): Hs00609178_m1 e Pck2 (PEPCK): Hs00388934_m1. O gene Gapd (TaqManTM

- Applied Biosystems, Life Technologies, USA) foi o controle endógeno da reação, utilizada

para normalizar a expressão do gene de interesse. A sonda Gapd é marcada com o

fluoróforo VIC e os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos

resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Life Technologies,

USA).

4.6. Citometria de Fluxo

Com a citometria de fluxo foi avaliada a fragmentação de DNA por meio da medida

de incorporação de iodeto de propídeo ao DNA. A solução utilizada foi de 10 µ de iodeto

de propídeo (Sigma, USA), em tampão fosfato com citrato de sódio e Triton-X. O

citômetro de fluxo utilizado foi o modelo FACSCalibur TM (BD Biosciences, USA)

equipado com laser de argônio (comprimento de onda fixado em 488 nm) e software versão

CellQuest 3.3 (BD Biosciences, USA). Para todas as amostras foram adquiridos 10.000

eventos. A dispersão de luz foi detectada em escala linear, sendo registrada em um gráfico

de pontos com dois parâmetros (granulosidade e tamanho), enquanto a fluorescência (FL2)

foi detectada em escala logarítmica e registrada em dois parâmetros (eventos e

fluorescência). As células foram semeadas 2x105 por poço, em placas de 6 poços (Sarsted,

DE) e cultivadas em meio propício para crescimento. Depois dos tratamentos as células

foram lavadas com tampão isotônico gelado e removidas com uso de rodo apropriado. Em

29

seguida, as amostras foram transferidas para um tubo plástico de 1,5mL e precipitadas com

uma breve centrifugação de 2000xg por 10 min. O pellet de células foi acrescido de tampão

de fragmentação de DNA contendo iodeto de propídeo, homogeneizadas e incubadas por

24h, a 4ºC, para posterior análise no citômetro de fluxo (canal FL2).

4.7. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) e

analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA de uma via com pós-teste de

Tukey, ou duas vias com pós-teste de Student, quando apropriado). Também foi realizado,

quando adequado, o teste de Student. Em todos os resultados foram adotados 5% como

limite de significância estatística (p < 0,05).

30

5. Resultados e Discussão

5.1. MIN6 – Linhagem de Insulinoma

A linhagem celular de insulinoma MIN6, é derivada de um camundongo

transgênico, que expressa o TAg SV40 (antígeno T associado ao Simian Vacuolating Virus

40) em células beta do pâncreas [103].

O TAg SV40 apresenta potente ação oncogênica, devido a sua ligação promíscua à

diversas proteínas que suprimem células tumorais, como a p53 por exemplo [104, 105].

Esse antígeno é transcrito durante uma infecção viral por SV40, um vírus de DNA circular

de cadeia dupla, pertencente à família Polyomavirida, primeiramente isolado de tumores

renais de macacos. Esses vírus podem infectar uma ampla variedade de vertebrados e

causar tumores sólidos em múltiplos locais [105].

No caso da MIN6, o fato da TAg SV40 estar presente em células beta pancreáticas

dos camundongos, permitiu que essas assumissem a característica de linhagem. Nessas

células, a secreção de insulina estimulada por glicose, o transporte de glicose e sua

conseguinte fosforilação são muito parecidas com as de ilhotas isoladas, indicando que essa

linhagem celular pode ser usada como modelo de células beta do pâncreas [103].

Como já é sabido, o palmitato exerce ação lipotóxica e pode ser usado para simular

um quadro de dislipidemia. Para tanto, foi realizado primeiramente um dose resposta com

palmitato, para determinar qual a melhor dose para gerar apoptose em 24h (Gráfico 01).

31

Gráfico 01. Dose resposta com Palmitato em MIN6. Porcentagem de apoptose por

citometria de fluxo, com iodeto de propídeo. Experimento com diferentes concentrações de

palmitato, 0,5; 0,75 e 1mmol/L por 24h. n=6-12. Os valores são expressos Média+Erro com

pós-teste de Tukey. C= Controle, P= Palmitato em mmol/L. *p<0,05 Palmitato 0,5 vs.

Palmitato 1,0, ***p<0,001 Controle vs. todos os tratamentos com Palmitato.

Esse experimento permitiu concluir que a concentração que gera maior apoptose é

de 1mmol/L de palmitato por 24h, com um aumento de quase 6 vezes da apoptose, quando

comparada ao controle. Esse dado é concordante com a literatura, que mostra que para

gerar apoptose em MIN6 são necessárias concentrações maiores de palmitato, do que as

comparadas com ilhotas isoladas e outras linhagens de insulinoma, como a INS [106]. Mais

importante ainda, esse experimento mostrou que a linhagem de MIN6, assim como nas

ilhotas isoladas, sofre apoptose na presença de palmitato. Isso nos permite afirmar que essa

linhagem apresenta resposta fisiológica semelhate às células beta pancreáticas.

Diante desse primeiro resultado, o passo seguinte foi verificar a ação da melatonina

sobre a apoptose gerada pelo palmitato. Para testar o efeito da melatonina, foram feitos

experimentos de dose resposta de melatonina, sob incubação de palmitato nas

concentrações de 0,5 e 1 mM, por 24h (Gráficos 02 A e B, respectivamente).

C P0,5 P0,75 P1,0

Apo

ptos

e (%

)

30

20

10

0

***

32

A)

B)

Gráfico 02. Dose resposta com Melatonina em duas concentrações de Palmitato por 24h em MIN6. Porcentagem de apoptose por citometria de fluxo, com iodeto de propídeo. Experimento com diferentes concentrações de melatonina, 0,5, 0,75, 1 e 10 nmol/L por 24h. n=6-12. Os valores são expressos Média+Erro com pós-teste de Tukey. A) Dose resposta de Melatonina com Palmitato 0,5mM, por 24h e B) Dose resposta de Melatonina com Palmitato 1mM, por 24h. C = controle, P= Palmitato 0,5 mmol/L por 24h, P1= Palmitato 1 mmol/L por 24h, P+M = Palmitato 0,5 mmol/L por 24h + Melatonina em nmol/L por 24h e P1+M = Palmitato 1 mmol/L por 24h + Melatonina em nmol/L por 24h. ### p<0,005 C vs. todos os outros tratamentos com Palmitato 0,5mM, *p<0,05 P1mM vs. P1+M10,0 e ***p<0,005 C vs. todos os outros tratamentos com Palmitato 1mM.

C P0,5mM P+M P+M P+M P+M 0,5 0,75 1,0 10,0

###

Apo

ptos

e (%

)

25

20

15

10

5

0

C P1mM P1+M P1+M P1+M P1+M 0,5 0,75 1,0 10,0

*** *

Apo

ptos

e (%

)

40

30

20

10

0

33

A melatonina, nas concentrações de 0,5; 0,75 e 1,0nmol/L, não alterou a apoptose

gerada pelo palmitato a 1mmol/L por 24h. Contudo, a exposição contínua à melatonina

10nmol/L, por 24h, corroborou com o processo de morte programada gerada pelo

palmitato, evidenciando um aumento de 20% na apoptose quando comparada ao grupo

palmitato 1mmol/L. Dessa forma, foram escolhidas as concentrações intermediárias de 0,75

e 1nmol/L, para o prosseguimento dos experimentos (Gráfico 03).

É comum em experimentos com melatonina, mimetizar o ciclo claro/escuro

mediante exposições intermitentes de 12h na presença e 12h na ausência desse hormônio

[93, 107]. De certa forma, a exposição contínua a melatonina não expressa o que acontece

in vivo, uma vez que ocorrem variações circadianas nas concentrações plasmáticas. Por

isso, a exposição intermitente pode aproximar um pouco mais o modelo experimental das

condições de um organismo, obviamente respeitadas todas as limitações experimentais e o

fato de ser uma cultura de células.

34

Gráfico 03. Tratamento intermitente e contínuo com Melatonina (12h e 24h) e Palmitato

24h em MIN6. Porcentagem de apoptose por citometria de fluxo, com iodeto de propídeo a

15µmol/L. Experimento com 0,75 e 1 nmol/L de melatonina, por 12h “dia” ou 12h “noite”

e 24h com Palmitato 1mM por 24h. n = 6-12. Os valores são expressos Média+Erro com

pós-teste de Tukey. C= controle, P1mM= Palmitato 1mmol/L por 24h, M0,75 = Melatonina

0,75nM , M1,0 = Melatonina 1,0nM, = tratamento com melatonina 12h dia subjetivo,

= tratamento com melatonina 12h noite subjetiva e = tratamento com melatonina

24h. ***p<0,005 C vs. Palmitato 1mM, ###p<0,005 C vs. todos os tratamentos com

Melatonina + Palmitato 1mM.

Os resultados não mostraram diferença estatística entre as células tratadas com

palmitato e células tratadas com palmitato e melatonina. Portanto, com base nos resultados

obtidos, pode-se afirmar que a melatonina, nas concentrações de 0,5 e 1nmol/L, não reverte

a apoptose gerada por 24h de exposição ao palmitato 1mmol/L em células da linhagem

MIN6.

###

C

P 1mM+ M 0,75 nM

P 1mM+ M 1,0 nM

***

Apo

ptos

e (%

) 40

30

0

20

10

35

Ainda não há trabalhos publicados que revelem uma ação direta da melatonina, na

diminuição de apoptose gerada por palmitato em células beta pancreáticas. PARK e

colaboradores mostraram em INS-1E, que a melatonina a 100nmol/L, por 72h, pode

diminuir a apoptose gerada pela glicose. Nesse trabalho, os tratamentos mimetizaram as

condições euglicêmicas e hiperglicêmicas, respectivamente 11,1 e 33,3mol/L de glicose,

por 12h cada, completando 72h. A ideia central era de gerar um meio glicotóxico, que

causa a morte das células beta pancreáticas devido a contínua estimulação da via do

estresse de RE, gerando disfunção e consequente apoptose. O tratamento com a melatonina

sozinha não melhorou a secreção de insulina. Somente na associação com o ácido 4-

fenilbutírico, uma substância que diminui o estresse do RE, foi observada a diminuição da

apoptose e a melhora a secreção de insulina estimulada por glicose. Dessa forma, concluiu-

se que o estresse do RE prejudica a secreção de insulina e enquanto que as EROs levam

essas células à apoptose. Por isso, nesse trabalho evidencia-se a ação antioxidante da

melatonina [107]. Isso é muito importante, tendo em vista que as células beta pancreáticas

são vulneráveis ao estresse oxidativo devido à baixa expressão das principais enzimas

antioxidantes [108].

Estudos in vitro, mostraram que a exposição prolongada de melatonina em ilhotas

de humanos, melhora a sensibilidade à glicose [109]. E que, na apoptose gerada por

estreptozotocina, o tratamento in vivo com melatonina (10mg/Kg intraperitonial) mostrou

regeneração parcial e a proliferação de novas células pancreáticas, aumentando a depuração

da glicose plasmática em ratos [96, 97].

Em 2008, Ramracheya e colaboradores mostraram diferenças na distribuição dos

receptores MT1 e MT2 nas ilhotas, o que, segundo os autores pode influenciar diretamente

na ação da melatonina em diferentes espécies. Foi demonstrado em ilhotas de humanos uma

maior quantidade de receptores MT1, em detrimento ao MT2, concentrado, essencialmente

em células alfa. Isso assume importância porque os receptores MT1 também podem estar

associados às proteínas Gq, que mediadas pela fosfolipase C (PLC), aumentam o nível de

cálcio intracelular. Dessa forma, em ilhotas perfundidas, foi mostrado que a melatonina

estimula a liberação de glucagon pelas células pancreáticas alfa, por meio do aumento da

concentração de cálcio intracelular e também há aumento da secreção de insulina. Contudo,

nesse último caso, os autores sugerem ser um efeito parácrino do glucagon, ao invés da

36

ação local da melatonina, devido a ausência de receptores MT1 nas células beta

pancreáticas. Nesse mesmo trabalho, foi verificado que a melatonina não altera a

concentração de AMPc em ilhotas de humanos, mas diminui a concentração desse segundo

mensageiro em cultura de pseudoilhotas de MIN6, que apresentam tanto MT1 quanto MT2,

além de inibir, também, a secreção de insulina [110].

Assim, a ação da melatonina pode depender da espécie e das condições fisiológicas

dos indivíduos (se diabéticos ou não, por exemplo). Uma vez que as flutuações nas

densidades de receptores no pâncreas endócrino podem gerar diferentes efeitos da

melatonina in vivo. Talvez por conta desse viés, ainda não há um consenso na literatura

sobre a ação da melatonina na secreção da insulina.

Dessa forma, já foi demonstrado que a melatonina apresenta ação antioxidante e

restauradora das células do pâncreas, além de melhorar a sensibilidade à glicose. E pode até

reverter a apoptose, quando essa é gerada por excesso de glicose. Além disso, densidades

diferentes dos receptores de melatonina nas ilhotas podem determinar diferentes respostas

do pâncreas frente à melatonina. Contudo, nas linhagens de MIN6, a melatonina, nas

condições utilizadas nos nossos experimentos, não reverteu a apoptose gerada por

palmitato.

37

5.2 Miotubos de L6 – Linhagem de músculo esquelético

A linhagem de mioblastos L6 foi obtida a partir das células musculares glicolíticas

de ratos e são capazes de sofrer diferenciação para miotubos multinucleados, semelhantes

às células musculares maduras. Também expressam GLUT4, uma característica importante

para a captação de glicose [111].

Nesse conjunto de experimentos, primeiramente foi determinada a dose de palmitato

necessária para diminuir a fosforilação da AKT/PKB 1/2/3 em Ser 473 (para representar

essa proteína utilizaremos somente o termo AKT). Também foi feito estímulo com insulina,

para verificar a sensibilidade das células a esse hormônio (Gráfico 04).

38

A)

B)

Gráfico 04. Dose resposta com Palmitato 24h em miotubos de L6. A) Figura de um blot

representativo do experimento e respectivo Ponceau da membrana. C = Controle, P250 =

Palmitato a 250 µmol/L por 24h e P500 = Palmitato a 500 µmol/L por 24h. B) Western

Blot para verificar o efeito de diferentes concentrações de Palmitato sobre a fosforilação em

serina 473 da AKT nas células musculares miotubos de L6 após estímulo com insulina.

Dados normalizados com Ponceau, n=4. (+) = estímulo com insulina 10µM por 10 min. Os

valores são expressos Média+Erro, ANOVA uma via com pós-teste de Tukey. *p<0,05

Controle (+) vs. P500µmol/L(+).

A AKT foi utilizada como um indicador de resistência à insulina, gerada pelo

palmitato, já que é uma proteína chave na sinalização da insulina e, em quadros de

*

p-A

KT(

Ser)

/Pon

ceau

(UA

)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0 (-) (+)

Controle (-) (+) P250µM

(-) (+) P500µM

Controle P250 P500

(–) (+) (–) (+) (–) (+)

p-AKT(Ser)

Ponceau 75 kDa 63 kDa 48 KDa

39

resistência, observa-se a diminuição na sua fosforilação. Alem disso, participa ativamente

do processo de captação de glicose em músculo esquelético.

Diante dos resultados, foi possível concluir que a melhor concentração é de

500µmol/L de palmitato, por 24h, na qual foi observada uma redução de mais de 40% na

fosforilação da AKT quando comparado ao controle estimulado pela insulina.

Assim, o próximo passo foi a determinação da dose e do tempo de melatonina. A

escolha inicial foi pelo tratamento com melatonina por 72h, para verificar se o uso contínuo

da melatonina poderia apresentar alguma alteração na fosforilação da AKT . Este protocolo

foi escolhido por assemelhar-se a outros já descritos na literatura [93, 107] (Gráfico 05).

40

A)

B)

Gráfico 05. Dose resposta de Melatonina por 72h com Palmitato 500 µM por 24h em miotubos de L6. A) Figuras de blots representativos dos experimentos e os respectivos Ponceau. C= Controle, P= Palmitato a 500 µmol/L, P+M = Palmitato a 500 µmol/L 24h + Melatonina nas diversas doses em nM 72h. B) Western Blot da fosforilação em serina 473 da AKT nas células musculares miotubos de L6 tratadas com Melatonina nas concentrações de 0,5 a 500 nM por 72h juntamente com Palmitato 500 µM nas últimas 24h, após estímulo com insulina. (+) = estímulo com insulina por 10min. Dados normalizados com Ponceau, n=2-6. Os valores são expressos Média+Erro, ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey. **p<0,01 Controle (+) vs. P500µM(+) e ##p<0,01 P500µM(+) vs. P+M500(+).

##

**

p-A

KT(

Ser)

/Pon

ceau

(UA

) 3.0

2.0

1.0

0 (-) (+) Controle

(-) (+) P500µM

(-) (+) P+M 0,5

(-) (+) P+M 1,0

(-) (+) P+M 10

(-) (+) P+M 100

(-) (+) P+M 200

(-) (+) P+M 500

Melatonina 72h + Palmitato 500 µM 24h

Controle P500 P+M0,5 P+M1 P+M10

(–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+)

p-AKT(Ser)

Ponceau 78 kDa

53 kDa

(–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+)

p-AKT(Ser)

Ponceau 78 kDa

53 kDa

Controle P500 P+M100 P+M200 P+M500

41

Nessa etapa dos experimentos, foi possível observar que tais resultados eram muito

dependentes da passagem, sendo que, tanto a resistência gerada pelo palmitato quanto para

a melhora da sensibilidade gerada pela melatonina, diminuíam drasticamente depois de

duas passagens após o descongelamento.

Mesmo assim, os resultados obtidos permitiram afirmar que a melatonina, a

500nmol/L por 72h, reverte a resistência à insulina gerada pelo palmitato, em células

miotubos de L6, em aproximadamente 75%, quando tratadas com palmitato 500μmol/L por

24h e estimuladas com insulina; agindo sinergicamente com a insulina pela via da AKT.

Depois desse resultado, o tempo de tratamento com a melatonina foi diminuído para

24h, pois foi o tempo mínimo de exposição ao palmitato. Nesse conjunto de experimentos,

a intenção foi observar como seria a ação da melatonina em um tempo contínuo, contudo,

mais breve (Gráfico 06).

42

A)

B)

Gráfico 06. Tratamento com Melatonina 500 nM e com Palmitato 500 µM ambos por 24h

em miotubos de L6. A) Figura representativa de blot e seu respectivo Ponceau. C = Cotrole,

P500 = Palmitato a 500 µmol/L 24h, M500 = Melatonina 500 nM 24h, M+P = Melatonina

500 nM + Palmitato a 500 µmol/L por 24h. B) Western Blot da fosforilação em serina 473

da AKT nas células musculares miotubos de L6, após estímulo com insulina. (+) = estímulo

com insulina por 10min. Dados normalizados com Ponceau, n=3-6. Os valores são

expressos Média+Erro, com Teste T de Student. *p<0,05 Controle (+) vs. P500µM(+) e

#p<0,05 P500(+) vs. P+M500nM(+).

Foi observada a recuperação de 91% da fosforilação da AKT quando exposta por

24h à melatonina. Diante desse sucesso, mesmo somente em duas passagens após o

Controle P500 M500 P+M500

(–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+)

p-AKT(Ser)

Ponceau 75 kDa 63 kDa 48 KDa

2.0

1.5

1.0

0.5

(-) (+) Controle

(-) (+) P500µM

(-) (+) M500nM

(-) (+) P+M500nM

p-A

KT(

Ser)

/Pon

ceau

(UA

)

0

*

#

43

descongelamento, o próximo passo incluiu determinar se essa ação da melatonina ocorria

via receptores MT1 e MT2.

Para tanto, foi feito um blot para verificar a presença de receptores de melatonina

nas células musculares miotubos de L6 (Figura 06). Como o resultado foi positivo, foi

utilizado o Luzindol 10μmol/L por 24h, um antagonista MT1/MT2 na presença e na

ausência de melatonina (Gráfico 07).

Figura 06. Blot mostrando a presença de receptores MT1 e MT2 nas células miotubos de

L6. Hip= hipotálamo de rato (controle positivo), L6 = miotubos de L6 e Mus= músculo

sóleo de rato.

MT1 MT2

Hip L6 Mus

44

A)

B)

Gráfico 07. Tratamento com Luzindol 10 µM, antagonista dos receptores MT1 e MT2 em

miotubos de L6. A) Figura de um blot representativo desse experimento e seu respectivo

Ponceau. C = controle, P500 = Palmitato 500 µmol/L, Luz 10 = Luzindol 10 µmol/L por

24h, P+M = Palmitato 500 µmol/L + Melatonina 500 nmol/L 24h e P+M+L = Palmitato

500 µmol/L + Melatonina 500 nmol/L + Luzindol 10 µmol/L. B) Western Blot da

fosforilação em serina da AKT nas células musculares miotubos de L6 após estímulo com

insulina. (+) = estímulo com insulina por 10min, n=3-4. Os valores são expressos

Média+Erro com Teste T Student.* p<0,05 P500μM(+) vs. P+M500.

Diante desses resultados, pode-se afirmar que a linhagem de miotubos de L6

apresenta resistência à insulina quando tratadas com palmitato 500µmol/L por 24h. Essa

ação é revertida pelo tratamento com melatonina 500nmol/L, tanto por 24h quanto por 72h,

Controle P500 Luz10 P+M500 P+M+L

(–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+) (–) (+)

p-AKT(Ser)

Ponceau 78 kDa 53 KDa

(-) (+) Controle

(-) (+) P500µM

(-) (+) Luz10µM

(-) (+) P+M500

*

p-A

KT[

Ser]

/Pon

ceau

(UA

)

2.5

2.0

1.0

0.5

0 (-) (+) P+M+L

45

agindo sinergicamente com a insulina pela via da AKT (apenas nas passagens 10 e 11).

Tais resultados não se reproduzem em passagens mais altas (acima de 12).

Dessa forma, baseando-se na análise estatística, observamos que, à medida que se

aumenta a passagem da célula L6 de 10 para 12, a linhagem já não responde da mesma

forma ao palmitato, não reproduzindo o quadro de resistência à insulina. Além disso, o

efeito “antirresistência” à insulina, promovido pela melatonina, diminui gradualmente

conforme aumentamos a passagem. Em face desses acontecimentos, o uso deste modelo

impossibilita afirmar a participação dos receptores de melatonina em tal processo.

Ha e colaboradores mostraram que a melatonina, 1nmol/L em cultura de músculo

esquelético do tipo C2C12, aumentou a fosforilação do IRS1 em 80% e da PI3K em 50%,

além de aumentar a captação de glicose. Contudo, essas células superexpressavam os

receptores de melatonina MT1/MT2 [99].

Mostrando que estávamos muito perto, Teodoro e colaborados publicaram

recentemente, em cultura primária de músculo esquelético, que o tratamento com

melatonina 10nmol/L, por 24h, reverteu a resistência à insulina, gerada por palmitato

(750µmol/L por 24h) e aumentou a captação de glicose estimulada por glicose [24].

46

5.3 HepG2 – Linhagem de Hepatoma

Nesse conjunto de experimentos, as células não foram tratadas com palmitato, pois

a intenção era verificar se a melatonina altera a expressão de proteínas ligadas à

gliconeogênese. Dessa forma, foi realizado um experimento de dose resposta de

melatonina, a fim de verificar doses que não geram apoptose (Gráfico 08).

Gráfico 08. Dose resposta com Melatonina 24h em HepG2. Porcentagem de apoptose por

citometria de fluxo, com iodeto de propídeo. Experimento com diferentes concentrações de

melatonina, 10, 100, 1.000 e 10.000 nmol/L por 24h. n=5. Os valores são expressos

Média+Erro com Pós-teste de Tukey. C = controle e M = Melatonina por em nmol/L24h.

Como não houve diferença estatística na apoptose, nas diferentes concentrações de

melatonina, foi escolhida a dose intermediária de 100nmol/L para prosseguir os

experimentos.

Foi verificado se diferentes tempos, na concentração de 100 nM, poderia interferir

na apoptose na linhagem de HepG2 (Gráfico 09).

C M10 M100 M1.000 M10.000

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Apo

ptos

e (%

)

47

Gráfico 09. Tempo resposta com Melatonina 100 nM nos tempos 3, 6, 12 e 24h em

HepG2. Porcentagem de apoptose por citometria de fluxo, com iodeto de propídeo.

Experimento com diferentes tempos de exposição à Melatonina 100 nmol/L por 24h. n=6-

10. Os valores são expressos Média+Erro com Pós-teste de Tukey. C= controle, M=

Melatonina 100 nM.

Como também não houve diferença estatística, escolhemos o tempo de 12h para os

próximos experimentos.

Sabendo que o estresse do RE pode alterar a expressão das proteínas ligadas à

gliconeogênese, fizemos um conjunto de experimentos para verificar se a dose de 100nM

de melatonina poderia ativar as proteínas da via do estresse de RE (Gráfico 10).

C M3h M6h M12h M24h

25

Apo

ptos

e (%

)

5 0

20

15

10

48

C M3h M6h M12h M24h

2.5

2.0

2.5

1.0

1.5

0

0.5

p-PE

RK

/Pon

ceau

(UA

)

p-PERK

Ponceau C 3h 6h 12h 24h

C M3h M6h M12h M24h

p-eI

F2α/

Ponc

eau

(UA

)

p-eIF2α

Ponceau C 3h 6h 12h 24h

2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5

C M3h M6h M12h M24h

2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5 ATF

-4/P

once

au (U

A)

ATF-4

Ponceau C 3h 6h 12h 24h

C M3h M6h M12h M24h

CH

OP/

Ponc

eau

(UA

) CHOP

Ponceau

2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5

C 3h 6h 12h 24h 2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5

49

Gráfico 10. Western Blot tempo resposta do tratamento com Melatonina a 100 nM com

algumas proteínas da via do estresse de retículo endoplasmático em HepG2. Figuras

representativas dos blots (filme e Ponceau) e os respectivos gráficos de p-PERK, p-eIF2α,

ATF4, CHOP (GADD153), ATF6 e XBP-1, n = 4-7. Dados normalizados com Ponceau. Os

valores são expressos Média+Erro com pós-teste de Tukey. C = controle, M = Melatonina

100 nM.

Dessa forma, foi escolhida a concentração de 100nM, por 12h, para verificar a

expressão dos genes das proteínas determinantes do processo de gliconeogênese, G6pc,

gene que codifica a G6Pase e Pck, gene que codifica a PEPCK (Gráfico 11).

C M3h M6h M12h M24h

2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5

ATF

-6/P

once

au (U

A)

ATF-6

Ponceau C 3h 6h 12h 24h

C M3h M6h M12h M24h

XB

P-1/

Ponc

eau

(UA

)

XBP-1 spliced

Ponceau

C 3h 6h 12h 24h 2.5

2.0

1.0

1.5

0

0.5

50

A) B)

Gráfico 11. Real time RT-PCR para a expressão relativa de mRNA de Pck (gene que

codifica PEPCK) e G6pc (G6Pase) em HepG2. Tratamento com melatonina por 12h, a

100nM, na ausência e presença de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 5µM e exametasona

100nM em células HepG2. A) PCK e B) G6pc. C= Controle, M100nM= Melatonina

100nM por 12h, D+I= Dexametasona 100nM e IBMX 5µM por 12h, D+I+M =

Dexametasona 100nM, IBMX 5µM e Melatonina 100nM por 12h e INS = insulina 10 µM,

n=5. Os valores são expressos Média+Erro com pós-teste de Tukey. *p<0,05 C vs. INS, **

p<0,05 C vs. INS, ** p<0,05 M100nM vs. INS, ***p<0,005 D+I vs. INS e ***p<0,005

D+I+M vs. INS.

A insulina foi utilizada como controle para determinar se essa linhagem respondia

como hepatócito, uma vez que no organismo esse hormônio inibe a expressão da G6Pase e

PEPCK. Além disso, hepatócitos também aumentam a expressão de proteínas

gliconeogênicas quando expostos a glicocorticoides e ao IBMX. No caso desse último, por

ser um inibidor de fosfodiesterases, ocorre aumento da razão AMPc/ATP, aumentando com

isso, a velocidade da reação.

De acordo com os resultados do Gráfico 11A, foi possível observar que o Pck não

sofre inibição pela insulina e nem é estimulado pelo meio com dexametasona e IBMX. Por

isso, continuamos as análises somente com a expressão do G6pc, com meio enriquecido

com os substratos para a gliconeogênese, lactato e piruvato de sódio. Contudo, como não

Expr

essã

o gê

nica

rela

tiva

de P

ck

2.0 1.5 1.0 0.5 0

C M100 D+I D+I+M INS

Expr

essã

o gê

nica

rela

tiva

de G

6pc

2.0 1.5 1.0 0.5 0

C M100 D+I D+I+M INS

*

**

***

51

houve diferença entre os tratamentos com dexametasona e IBMX na ausência e na presença

de melatonina, acrescentamos mais uma dose de melatonina, de 1.000nmol/L (Gráfico 12).

Gráfico 12. Real time RT-PCR para mRNA de G6pc (gene que codifica G6Pase) em

HepG2. Tratamento com melatonina por 12h, a 100nM e 1000nM, com Lactato de Sódio

20µmol/L e Piruvato de Sódio 2µmol/L, na ausência e presença na IBMX 5µM e

Dexametasona 100nM em células HepG2. S = Lactato + Piruvato, M100= Melatonina 100

por 12h, M1.000= Melatonina 1.000nM por 12h, S+D+I = Lactato + Piruvato +

Dexametasona 100nM e IBMX 5µM por 12h e INS= insulina 10 µM, n=12. Os valores são

expressos Média+Erro com pós-teste de Tukey. *p<0,05 todos os tratamentos vs. Insulina,

***p<0,005 todos os tratamentos Lactato e Piruvato vs. todos os tratamentos Lactato,

Piruvato, Dexa e IBMX.

A partir desse resultado, concluímos que o tratamento com melatonina, nas doses de

100 e 1000 nmol/L por 12h, nas células HepG2, não diminuiu a expressão do gene que

codifica a G6Pase.

Assim, esses resultados mostram que a melatonina não suprime a expressão da

G6Pase agindo diretamente em células HepG2. Isso pode ser interpretado de duas formas.

Na primeira, entendemos que a ação da melatonina in vivo, em diminuir a gliconeogênese,

Expr

essã

o gê

nica

rela

tiva

de G

6pc

4.0 3.0 2.0 1.0 0

S S+M S+M S+D+I S+D+I S+D+I S+INS 100 1.000 M100 M1.000

***

*

52

pode decorrer exclusivamente de uma ação extra-hepática. Já existem relatos na literatura,

nossos e de outros grupos, que mostram que a ação da melatonina no sistema nervoso

central reduz a glicemia e a gliconeogênese hepática [101, 102]. Em concordância com esse

fato, lesões no núcleo supraquiasmático, a região com maior concentração de receptores de

melatonina do sistema nervoso central, também resulta em aumento da gliconeogênese

[112].

A segunda é de que a célula HepG2 não responde à melatonina como um hepatócito

primário. De fato, os resultados obtidos por Lau e colaboradores (2012) mostrando ativação

do STAT3 pela iodomelatonina partiram de células HepG2 que superexpressam os

receptores MT1/MT2 [113].

53

6. Conclusão

6.1. MIN6

A melatonina não alterou a apoptose gerada pelo palmitato nas células da linhagem

de insulinoma MIN6.

6.2. Miotubos de L6

Concordantemente à literatura, a melatonina diminui a resistência à insulina gerada

por palmitato. No entanto, essa modulação ocorre somente em duas passagens após o

descongelamento. Depois desse período, provavelmente a célula diminui a sua capacidade

de diferenciação de mioblasto para miotubo, perdendo as características que a fazem

responder como músculo esquelético nos nossos experimentos.

6.3. HepG2

Quanto a linhagem de hepatoma humano, HepG2, não há regulação direta da

expressão da G6Pase pela melatonina. Esses resultados são reafirmados indiretamente pela

literatura, na qual verificamos que as ações da melatonina, quanto a sua capacidade em

controlar a glicemia, só foram demonstradas in vitro quando usado células primárias e/ou

superexpressão de receptores MT1/MT2.

54

6.4. Conclusão Geral

De forma geral, as ações da melatonina que podem explicar sua capacidade em

controlar a glicemia só foram demonstradas in vitro quando usado células primárias e/ou

superexpressão de receptores MT1/MT2

Dessa forma, diante dos resultados obtidos, podemos concluir que as linhagens

MIN6 e HepG2 não mostraram resultados que expliquem a ação metabólica da melatonina

observada in vivo, enquanto que para miotubos de L6, a melatonina diminuiu a resistência à

insulina gerada por palmitato, mas somente em passagens baixas.

55

7. Referências Bibliográficas

1. IDF – International Diabetes Federation , 2013,

<http://www.idf.org/worlddiabetesday/toolkit/gp/facts-figures>. Acesso em 05 de setembro

de 2014.

2. Abdul-Ghani MA, DeFronzo RDM. Plasma glucose concentration and prediction of

future risk of Type 2 Diabetes. Diabetes Care, 2009; 32 (2):S194-8.

3. ADA, Diabetes Care Volume 37, Supplement 1, January 2014.

http://media.mycme.com/documents/90/ada_2014_standards_of_medical__22444.pdf.

Acesso em setembro de 2014.

4. Sattar N, Gill JM. Type 2 diabetes as a disease of ectopic fat? BMC Med.

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