ana paula de lima anÁlise bioquÍmica e histolÓgica...
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ANA PAULA DE LIMA
ANÁLISE BIOQUÍMICA E HISTOLÓGICA DA TOXICIDADE DO
SYMPHYTUM OFFICINALE FITOTERÁPICO E HOMEOPÁTICO EM
FÍGADO E RINS DE RATOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São
José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE,
pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Patologia.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão
Co- orientadora: Profa. Dra. Maria Nadir Gasparoto Mancini
São José dos Campos
2009
Livros Grátis
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BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão (Orientadora)
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
Profa. Adjunta Rosilene Fernandes da Rocha
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
São José dos Campos, 21 de julho de 2009.
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus avôs Geraldo de
Lima (in memorian), Amélia Barbosa Arantes de Lima e Etelvina
de Andrade Lemes, por serem meus exemplos de retidão,
coragem e amor.
Aos meus pais Luiz Gonzaga de Lima e Maria Luzia
de Lima por todos os cuidados, carinhos, palavras de incentivo e
discernimento, sabedoria, ensinamentos, orações, correções,
companhia e apoio. Dedico este meu trabalho a vocês. Sou grata
por tudo.
Ao meu irmão Luiz Danilo de Lima, por toda
disposição e cuidado. E por sempre acreditar e confiar em mim.
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Agradeço a Deus pelo dom da minha vida e por
todas as bênçãos que Ele tem derramado sobre mim. Por ter estado comigo em todos os momentos, pelos dons, pela companhia, amizade. Agradeço por Sua presença através das pessoas, dos amigos, dos que me ajudaram, dos que me ensinaram. Enfim sou grata a Ti, Senhor.
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeço de forma especial à Profª. Drª. Adriana
Aigotti Haberbeck Brandão por ter me orientado com grande disposição, intenso trabalho, paciência e abnegação. Agradeço por tudo que me ensinou e por ter estado comigo. Agradeço também pelo relacionamento com uma pessoa tão especial, com grande bondade, sabedoria e capacidade.
Agradeço à minha co-orientadora, Profª. Drª. Maria Nadir Gaparoto Mancini, por toda atenção, carinho, ajuda e convivência. Seus ensinamentos e conhecimentos foram essenciais para a realização deste trabalho.
Agradeço à Profª. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha. Por ter me orientado na graduação, tendo me dado assim, a oportunidade de conhecer a área da pesquisa. Agradeço também pelos conselhos, carinho, além de ter me ajudado sempre que precisei.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, representada pelo Diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj. José Roberto Rodrigues, pela oportunidade da realização do mestrado.
Agradeço à Profª. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito, Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Biopatologia Bucal, da mesma instituição, pela dedicação ao nosso curso.
Agradeço aos professores Dr. Gokithi Akisue e Lincoln Marcelo L. Cardoso da FAPI – Faculdade de Pindamonhangaba, pela preparação do fitoterápico e por toda atenção dispensada ao nosso trabalho.
Agradeço à Profª Titular Yasmin Rodarte Carvalho, pelos concretos ensinamentos em patologia bucal, pela disposição em seu trabalho e por toda ajuda.
Agradeço ao Prof. Adj. Luiz Antônio Guimarães Cabral e Profª. Adj. Janete Dias de Almeida, pelos inúmeros ensinamentos adquiridos na clínica de Propedêutica Estomatológica, que contribuem fortemente na consolidação da minha formação.
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Agradeço ao Prof. Ass. Ivan Balducci pelos ensinamentos sobre estatística. Além da convivência agradável e divertida.
Aos professores Adj. Ana Sueli Rodrigues Cavalcante, Dr. Miguel Angel Castillo Salgado, Adj. Monica Fernandes Gomes, Dr. José Benedito Oliveira Amorim pela ajuda e convivência.
Agradeço aos funcionários: Antônio Domingos Sávio Barbosa Maia Vasconcelos, Lourival Jacobs, Marcos Antonio Correa Alfredo, Walter Cruz. Todos vocês ajudaram de forma indispensável neste trabalho.
Agradeço a todas as bibliotecárias, representadas por Silvana Alvarez.
Agradeço à aluna de iniciação científica: Anita Carolina de Lourdes Ribeiro por toda ajuda durante o trabalho.
Agradeço especialmente às amigas Giselle Segnini Senra e Michelle Cardoso pela ajuda, principalmente nas horas difíceis. Obrigada!
Agradeço aos amigos da pós-graduação Victor Hugo Farina, Ana Lourdes Machado, Cristina Werkman, que ajudaram diretamente em diferentes partes do trabalho.
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Agradeço aos amigos da pós-graduação: Camila Porto de Deco, Cristiane A. Pereira, Lilibeth F. de Brito P. Forte, Mary Anne M. Bárbara, Nívea Cristina Sena Costa, Polyana das G. F. Vilela, Fernanda Bertini Moreira, Fernando A. Perrella, Luís Felipe das C. e S. de Carvalho e Márcia Hatakeyama. Todos vocês de alguma forma de ensinaram muitas coisas.
Agradeço à Profª. Drª. Ana Lia Anbinder, por ter
me orientado na iniciação científica e por toda ajuda. Agradeço aos amigos Ana Paula Pereira Masa,
Andrea Cristina Castanho, Wagner Luis Pereira, pela amizade. Agradeço aos Animais experimentais pelo
sacrifício em benefício dos seres humanos. Agradeço à CAPES pela bolsa de mestrado. Agradeço a todos que de alguma forma me
ajudaram durante o mestrado e em toda minha formação (e não foram poucos). Valeu!!
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“A diferença entre o remédio e o veneno está na dose.”
Paracelsus
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SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................. 12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................. 13
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................15
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................18
2.1 Symphytum officinale L .....................................................................18
2.2 Homeopatia.......................................................................................19
2.3 Fitoterapia.........................................................................................21
2.4 Toxicidade em plantas medicinais.....................................................23
2.5 Avaliações bioquímica de toxicidade.................................................25
2.6. Alcalóides Pirrolizidínicos.................................................................27
2.7 Mecanismo de ação do alcalóide ......................................................32
2.8 Toxicidade do Symphytum officinale L ..............................................33
3 PROPOSIÇÃO.....................................................................................38
4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................39
4.1 Animais .............................................................................................39
4.2 Preparo da droga vegetal constituída das folhas de Symphytum officinale L...............................................................................................40
4.3 Preparo da amostra para administração aos animais ........................42
4.4 Peso corporal dos animais ................................................................43
4.5 Tratamento homeopático ..................................................................44
4.6 Tratamento fitoterápico .....................................................................44
4.7 Tratamento do grupo controle ...........................................................44
4.8 Anestesia ..........................................................................................46
4.9 Coleta do sangue para os exames bioquímicos ................................46
4.10 Eutanásia ........................................................................................47
4.11 Remoção de fígado e rins ...............................................................47
4.12 Análise histológica ..........................................................................47
11
4.13 Avaliação toxicológica bioquímica ...................................................48 4.13.1 Determinação da atividade de Fosfatase alcalina..........................49 4.13.2 Determinação da atividade da Alanina aminotransferase..............49 4.13.3 Determinação da atividade da Aspartato aminotransferase..........50 4.13.4 Determinação da atividade da Gama glutamil transferase............51 4.13.5 Determinação da concentração de uréia.......................................51 4.13.6 Determinação da concentração de creatinina................................52 4.14 Análise estatística ...........................................................................52
5 RESULTADOS.....................................................................................54
5.1 Análises bioquímicas ........................................................................54
5.1.1 Fosfatase alcalina.............................................................................54 5.1.2 Alanina aminotransferase.................................................................58 5.1.3 Aspartato aminotransferase.............................................................61 5.1.4 Gama glutamil transferase...............................................................64 5.1.5 Concentração de Uréia.....................................................................69 5.1.6 Creatinina.........................................................................................72 5.2 Peso corporal....................................................................................76
5.3 Análises histológicas.........................................................................80
5.3.1 Análises histomorfométricas.............................................................80 5.3.1.1 Focos de inflamação.....................................................................80 5.3.1.2 Focos de fibrose............................................................................84 5.3.2 Análise histológica descritiva............................................................89 6 DISCUSSÃO......................................................................................102
7 CONCLUSÃO ....................................................................................118
8 REFERÊNCIAS .................................................................................119
APÊNDICE..............................................................................................128
ANEXO....................................................................................................131
ABSTRACT.............................................................................................132
12
Lima AP. Análise bioquímica e histológica da toxicidade do Symphytum officinale fitoterápico e homeopático em fígado e rins de ratos [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2009.
RESUMO
O Symphytum officinale (confrei) é uma planta usada desde a antiguidade para o tratamento da consolidação de fraturas. Existem relatos de seu uso in natura, como fitoterápico ou como medicamento homeopático. Recentemente foram relatados casos de intoxicação em humanos e em animais que consumiram a planta e desenvolveram lesões hepáticas graves que foram associadas à presença de alcalóides pirrolizidínicos. Tais fatos levaram à proibição do uso interno da planta. No entanto, não há relato de efeitos adversos associados à sua formulação homeopática. O objetivo deste trabalho foi comparar os efeitos do Symphytum officinale, preparado como medicamento fitoterápico e homeopático, avaliando sua toxicidade hepática e renal. Foram utilizados 42 ratos adultos saudáveis, divididos em três grupos de acordo com os diferentes tratamentos: Symphytum officinale 500mg/kg (F), Symphytum officinale 6CH 2 glóbulos (H) e água como placebo no grupo controle negativo (C), que foram administrados diariamente a cada animal por via oral por gavagem. Os sacrifícios foram realizados 30 e 60 dias após o início do tratamento. A avaliação toxicológica foi feita através de análise bioquímica da atividade enzimática da fosfatase alcalina (FA), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transferase (GGT) e da concentração plasmática de uréia e creatinina. Também foi realizada análise histológica e histomorfométrica de fígado e rim. Os dados foram submetidos aos testes estatísticos de t (Student) e ANOVA 1 fator (5%). Tanto as análises bioquímicas quanto histológicas indicaram discretas alterações hepáticas e evidenciaram ausência de alterações renais. As modificações no perfil de atividade enzimática, na uréia e creatinina e no peso dos animais sugeriram alterações no metabolismo hepático interferindo na síntese de proteínas. As alterações histológicas foram compatíveis com hepatite crônica leve com desenvolvimento de fibrose importante apenas no grupo F. A formulação fitoterápica usada foi hepatotóxica e provocou mais alterações que a homeopática.
Palavras-chave: Confrei. Homeopatia. Symphytum officinale. Fitoterapia.
Toxicidade de drogas.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AE = Atividade Enzimática
AGAT = Arginina glicina amidinotransferase
ALT = Alanina Aminotransferase
ANOVA = Análise de Variância
ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AP = Alcalóides Pirrolizidínicos
AST = Aspartato Aminotransferase
C = Grupo Controle
CH = Centesimal Hahnemanniana
cm = Centímetro
DVO = Doença Veno-Oclusiva
EHESo = Extrato hidroetanólico de Shymphytum officinale
EUA = Estados Unidos da América
F = Grupo Fitoterápico
FA = Fosfatase alcalina
FDA = Food and Drug Administration
g = Gramas
GAMT = S-adenosilmetionina guanidinoacetato metiltransferase
GGT = Gama Glutamil Transferase
gl = Grau de Liberdade
H = Grupo Homeopático
HE = Hematoxicilina e eosina
K = Fator de calibração
Kg = Quilograma
mg = Miligrama
mg/dL = Miligrama por Decilitro
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NO = N-Óxido
OMS = Organização mundial de saúde
PCNA = Antígeno nuclear para células em proliferação
SQ = Soma dos Quadrados
SUS = Sistema Único de Saúde
U/l = Unidade Internacional por Litro
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1 INTRODUÇÃO
A regeneração de lesões ósseas causadas por fraturas,
processos infecciosos, neoplasias ou anomalias do desenvolvimento,
representa ainda um grande desafio em procedimentos médicos e
odontológicos, o que leva a vários estudos visando agentes
farmacológicos que facilitem sua modulação.
As desigualdades sociais e regionais em nosso país
deixam uma parcela da população sem a possibilidade de realizar os
tratamentos propostos pelo estado atual da ciência nas diversas doenças
que acometem o ser humano. Por isso é importante ampliar as opções
terapêuticas com o objetivo de realizar uma inclusão social, oferecendo
aos cidadãos a possibilidade de um tratamento adequado e seguro. A
necessidade do uso sustentável da biodiversidade em nosso país reforça
também a necessidade do estudo na área dos fitoterápicos.
Muito embora se reconheça a legitimidade do
conhecimento tradicional, uma planta para ser usada em qualquer
atividade ou programa de fitoterapia deve ser cientificamente validada.
Isso consiste de várias etapas, que vão desde a verificação se a atividade
atribuída existe e a avaliação dos riscos de seu uso, até a sua produção
industrial. É essa luta por uma fitoterapia dita científica que precisa ser
perseguida por todas as pessoas comprometidas com o estudo de plantas
medicinais e o seu retorno social (Albuquerque; Andrade, 2007).
Em 2006, duas importantes Políticas Nacionais na área
de Plantas Medicinais e Fitoterápicos foram aprovadas. A primeira é a
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema
Único de Saúde (SUS), da Portaria 971, do Ministério da Saúde, de 03 de
maio de 2006 e a segunda, a Política Nacional de Plantas Medicinais e
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Fitoterápicos, do Decreto Presidencial 5.813, de 22 de junho de 2006, e
que pretende garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso
sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e
da indústria nacional (Brasil, 2006a; Brasil, 2006b; Brasil, 2007).
O Symphytum officinale, é uma planta indicada no
tratamento de consolidação de fraturas e doenças ósseas, conhecida há
mais de 2000 anos devido às suas propriedades cicatrizantes. Suas
propriedades medicinais se devem à presença de alantoína, taninos e
mucilagens, sendo mais concentrados nas raízes (Carvalho, 2004).
O Symphytum officinale contém também alcalóides
pirrolizidínicos, nas folhas e raízes, que cronicamente podem apresentar
toxicidade hepática provocando enfermidade veno-oclusiva e induzindo
degeneração do hepatócito e cirrose. Devido a estes alcalóides presentes
na planta seu uso interno está proibido no Brasil, entre outros países
(Brasil, 1992).
Apesar da ação tóxica com o uso prolongado, o
Symphytum officinale pode ser indicado como medicamento específico
para casos de traumatologia óssea (fraturas), pois apresenta efeitos sobre
o retardo na consolidação e dores periosteais. Porém, só pode ser usado
de modo tópico, restrito apenas ao período de regeneração, o que
representa um pequeno espaço de tempo. Nesse caso utiliza-se o extrato
veiculado em compressas, cremes ou pomadas. (Pozetti, 1991).
É necessário que se façam estudos sobre a possibilidade
do delineamento do uso racional do Symphytum officinale, não
esquecendo que qualquer medicamento seja homeopático ou alopático,
apresenta reações adversas quando utilizado em doses e posologias
incorretas.
O tratamento com o Symphytum officinale sob
formulação homeopática também é indicado para reparo de lesões
ósseas. Este se baseia no uso de pequenas doses, com altíssimas
17
diluições. Não existe relato de efeito hepatotóxico quando manipulado
conforme técnica homeopática, o que merece uma investigação.
Assim, é valido um estudo comparativo entre as duas
formulações de confrei, avaliando seus efeitos sobre o fígado e também
nos rins, que são os principais órgãos responsáveis pela metabolização
de medicamentos.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Symphytum officinale L
O Symphytum officinale L. é uma planta pertencente à
família Boraginaceae, conhecida popularmente como confrei ou consólida
e é usada como cicatrizante pela medicina tradicional. É conhecida há
mais de 20 séculos e utilizada para consolidar e soldar ossos fraturados e
as bordas das feridas. É natural do norte da Ásia e do leste europeu,
tendo seu emprego medicinal registrado na Grécia, já no tempo de
Hipócrates (377 - 460 AC). Chegou ao Brasil no início do século XX
trazido pelos imigrantes italianos para alimentação de animais domésticos
(Chaves, 2003; Carvalho, 2004).
O confrei, além de seu efeito como planta medicinal,
devido ao seu alto teor de nutrientes, vitaminas e sais minerais foi
utilizado como alimento e fertilizante. Entre todas as plantas do reino
vegetal, o confrei é uma das que contém maior teor em proteínas,
conhecida como a mais rápida na produção de proteínas do mundo
(Carvalho, 2004).
O confrei contém os seguintes compontentes: alantoínas,
mucilagens, taninos, saponinas, colina, açúcares, triterpenos, vitaminas,
aminoácidos, esteróides, ácidos orgânicos e ácido fólico (Goldman et al.,
1985; Vaz; Jorge, 2006).
No início dos anos 80 o confrei foi amplamente divulgado
na mídia como possuidor de propriedades terapêuticas “milagrosas” para
várias doenças, incluindo a leucemia e outros cânceres e a partir daí
houve um grande aumento no consumo e muitas pessoas passaram a
19
ingerir o confrei em saladas, sucos e chás regularmente. O confrei passou
a ser amplamente utilizado como ração para gado. Entretanto, pouco
tempo depois, foram identificados alcalóides pirrolizidínicos (AP) no
confrei, que consumidos em longo prazo poderiam causar doença veno-
oclusiva (DVO) no fígado e câncer hepático, motivo pelo qual o confrei
passou a ser proibido para uso interno. No Brasil essa proibição existe
desde 1992 (Pozetti, 1991; Brasil, 1992; Chaves, 2003).
2.2 Homeopatia
Homeopatia (do grego homoios, semelhante + pathos,
doença) é uma prática médica única em seu gênero, baseada na
integração e na personalização do doente e de seu tratamento (Cornillot,
2005). A homeopatia, ao invés de considerar no indivíduo um conjunto de
sistemas fisiológicos isolados e distintos com um binômio saúde/doença,
analisa o indivíduo segundo uma abordagem dinâmica, integrada e
multifatorial em vista dos aspectos bio/psico/sócio/espirituais que definem
a individualidade humana (Teixeira, 2007).
Há mais de 200 anos, Samuel Hahnemann, na busca por
uma terapêutica menos iatrogênica do que a usada pela medicina de sua
época utilizava, como sangrias, laxantes, sudoríferos e diuréticos,
resolveu parar de clinicar e dedicou-se a traduzir escritos médicos.
Enquanto traduzia a Materia Medica de Cullen, em 1790, interessou-se
pelo uso de uma substância chamada “Cinchona officinalis” (quinina ou
simplesmente quina) usada na Europa para tratamento da malária e a
experimentou em si mesmo. Percebeu então que a partir de determinada
dose, desencadeavam-se nele os mesmos sintomas da enfermidade para
a qual era indicada como curativa. Nascia a partir desta descoberta a
prática da Medicina Terapêutica pelos Semelhantes, teorizada milênios
antes por Hipócrates (Correa et al., 1997; Cornillot, 2005; Mello, 2007;
20
Teixeira, 2007). Similia Similibus Curentur é a lei da cura pelos
semelhantes; segundo a qual a doença pode ser debelada pela aplicação
de pequenas medidas de elementos semelhantes à doença (Correa et al.,
1997).
Em 1799, Hahnemann controlou uma epidemia de
Escarlatina com o medicamento Belladona. Em 1813 tratou a epidemia de
Tifo em Leipizig, curando 178 de 180 casos com apenas uma fatalidade.
Na grande epidemia de cólera de 1831, a Homeopatia perdeu apenas 6
de 154 pacientes enquanto a medicina convencional da época perdeu 821
de 1501 casos (55%). Hahnemann também deu um espantoso
ensinamento de Saúde Pública para a época, publicando conselhos sobre
ventilação, higiene, esterilização, infecção e quarentena. Há que se
lembrar que o bacilo da cólera foi somente descoberto por Koch em 1883,
e isto valoriza a inteligência privilegiada e o poder de observação do Dr.
Hahnemann que não era um teórico, mas um magnífico praticante da
“Arte de Curar” que trouxe um novo conceito de medicina (Mello, 2007).
Como algumas plantas e substâncias eram tóxicas,
algumas vezes ocorriam efeitos adversos importantes. Hahnemann
decidiu, então, diluir os medicamentos ao máximo, de maneira que sua
toxicidade fosse diminuída, obtendo resultados promissores com a nova
terapêutica (Sigolo, 1996; Correa et al., 1997).
No Brasil, a partir de 1979, a homeopatia passou a
constar no Conselho de Especialidades Médicas da Associação Médica
Brasileira e em 1980, do rol de especialidades do Conselho Federal de
Medicina, deixando de fazer parte das medicinas alternativas e passando
a constituir parte do que hoje se chama medicinas integrativas (Correa et
al., 1997).
A homeopatia baseou-se num processo tanto experimental
quanto empírico. No início sua semiologia proveio da experimentação
sobre o homem sadio, efetuada segundo o método Hahneamanniano,
portanto parcialmente experimental e empírico pelo trabalho de
21
observação dos médicos homeopatas e pela aquisição de uma
experiência prática. O desenvolvimento da pesquisa em Homeopatia vem
se efetuando progressivamente, tentando integrar os conhecimentos
destes dois processos. Os trabalhos podem agrupar-se da seguinte
forma: pesquisa biológica experimental, pesquisa clínica, pesquisa físico-
química e pesquisas que integram a dimensão “holística” da homeopatia.
(Cornillot, 2005).
2.3 Fitoterapia
A utilização de plantas com fins medicinais, para
tratamento, cura e prevenção de doenças, é uma das mais antigas formas
de prática medicinal da humanidade. No início da década de 1990, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que 65-80% da
população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas
medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde
(Figueiredo; Kaplan, 1997; Veiga Junior; Pinto, 2005).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
define fitoterápico como todo medicamento obtido empregando-se
exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo
conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança
são validadas através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização
e documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos
fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua
composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem
as associações destas com extratos vegetais (ANVISA, 2004).
22
Existe o conceito de que devem ser usadas as plantas
integrais, com o argumento de que a extração do princípio ativo elimina
outros componentes que interagiriam com a substância principal para
exercer os seus efeitos benéficos. Considera-se também que grande
número de plantas medicinais não contém um princípio ativo específico e
suas propriedades terapêuticas derivariam da totalidade de seus
ingredientes (Clapauch et al., 2002).
As plantas medicinais têm seu uso baseado no
conhecimento popular sobre seus efeitos e geralmente são plantadas,
colhidas e preparadas sem um critério rigoroso, estando sujeitas a uma
série de variações. A diferença destas para o medicamento fitoterápico
reside na elaboração da planta desde seu plantio até uma formulação
farmacêutica específica e padronizada, o que permite conhecer seus
componentes e garante o controle da qualidade do fitoterápico (Veiga
Junior; Pinto, 2005).
Foi através da observação e da experimentação pelos
povos primitivos que as propriedades terapêuticas de determinadas
plantas foram sendo descobertas e propagadas de geração em geração,
fazendo parte da cultura popular (Turolla; Nascimento, 2006; Cunha,
2009).
Vários fatores têm contribuído para o aumento no uso e
interesse em relação às plantas medicinais. Entre outros podemos
destacar que muitos países não impõem prescrição e regularização sobre
preparos de ervas, além de o acesso a esse tipo de terapia ser irrestrito e
de baixo custo. O fato dos tratamentos derivados de plantas não
requererem testes pré-clínicos extensos e síntese farmacêutica
laboratorial, são atraentes. Também há uma crença de que os
tratamentos com ervas medicinais são “naturais” e, portanto seguros,
gerando um sentimento de melhor controle da doença e da conduta em
relação à doença. Por todos esses fatores o interesse pela fitoterapia por
parte dos profissionais e dos órgãos de Saúde Pública tem aumentado.
23
Também se constatou um aumento no uso de ervas medicinais (Stickel et
al., 2005).
Niggemann e Grüber (2003) em sua revisão de literatura
associam a grande procura desse tratamento ao fato da medicina
científica não conseguir curar algumas doenças e somente promover um
alívio.
O Brasil é um país com muitas potencialidades neste
campo, por possuir a maior diversidade vegetal do mundo. Sob o ponto
de vista químico e farmacológico, menos de 1% das espécies vegetais
foram analisadas (Araújo et al, 2007).
2.4 Toxicidade em plantas medicinais
As plantas em relação à saúde do homem se dividem em
duas categorias: aquelas que curam e alimentam e aquelas que causam
injúrias. É importante mencionar que uma planta pode estar em um ou
outro grupo dependendo da concentração ou quantidade do extrato da
planta utilizada. Há sem dúvida, algumas plantas medicinais que podem
produzir lesões perigosas e até envenenamentos fatais (Figueiredo;
Kaplan, 1997).
Muitas vezes os tratamentos à base de plantas são feitos
sob orientação de curandeiros e os pacientes por acharem que plantas
medicinais não são tóxicas devido a sua origem natural, não procuram
uma ajuda profissional (Deng, 2002).
Outro problema em relação a plantas medicinais é a
automedicação. A maioria dos indivíduos que faz uso de plantas
medicinais não relata seu uso, pois não considera as plantas medicinais
como “remédio”, ou por temer não ser levado a sério pelos seus médicos
24
por fazer uso das mesmas (Dasgupta, 2003; Niggemann; Grüber, 2003;
Stickel et al., 2005).
Existe o problema de interação medicamentosa entre
plantas medicinais e substâncias químicas. As medicinas alternativas
podem apresentar certo risco e às vezes severos efeitos colaterais. Em
geral, o padrão de efeito colateral de tratamentos alternativos é similar
aos observados no uso de medicamentos convencionais (Niggemann;
Grüber, 2003).
O risco de qualquer remédio causar efeito colateral
depende da dose e de parâmetros relativos ao paciente como idade,
carga genética, presença de doenças sistêmicas e uso concomitante de
outras substâncias (Niggemann; Grüber, 2003).
Vários fatores contribuem para a toxicidade durante o
tratamento com plantas medicinais. Misturas de plantas, a estação do ano
em que a planta foi colhida, diferentes procedimentos para extração, erros
de identificação botânica. Existe ainda, a contaminação das plantas por
microrganismos, toxinas fúngicas, pesticidas, metais pesados,
substâncias sintéticas; como também a adulteração e a própria
constituição química da planta (Deng, 2002; Dasgupta, 2003; Niggemann;
Grüber, 2003; Stickel et al., 2005; Veiga Junior; Pinto, 2005).
Nos Estados Unidos da América (EUA), produtos
derivados de plantas são caracterizados como suplementos alimentares e
não são fiscalizados como medicamentos, não sendo assim necessário
comprovar sua eficiência e eficácia pela Food and Drug Administration
(FDA). Essa falta de fiscalização e regularização rigorosa nos EUA leva a
uma grande variação na composição e também permite produtos de
qualidade inferior (Dasgupta, 2003; Stickel et al., 2005).
Entre os efeitos colaterais que podem ocorrer associados
ao uso de plantas medicinais são relatadas diversas lesões hepáticas.
Certas plantas têm sido identificadas como causadoras de hepatite aguda
25
e crônica, colestase, lesões autoimunes induzidas pelas plantas, lesões
vasculares, insuficiência hepática e cirrose (Stickel et al., 2005).
Segundo Stickel et al. (2005), aproximadamente 21% dos
pacientes que procuram clínicas de hepatologia fizeram uso de
preparações de plantas, e 13% relatam terem recorrido às plantas
medicinais para tratar doenças do fígado.
Há dificuldade no diagnóstico de envenenamento por
plantas na clínica diária e existe urgência de maior informação sobre os
efeitos tóxicos das plantas, para o melhor reconhecimento e tratamento
dos pacientes com esse problema (Deng, 2002).
O fígado é um órgão central de metabolização de
substâncias sendo o primeiro alvo das doenças relacionadas a
medicamentos. Componentes ingeridos são predominantemente
biotransformados no fígado por ação de enzimas metabolizadoras,
incluindo as enzimas do citocromo P450, monooxigenases, glutationas
transferases, entre outras. A indução de algumas destas enzimas podem
apresentar mecanismos com uma grande variabilidade individual na
susceptibilidade a danos hepáticos (Stickel et al., 2005).
2.5 Avaliações bioquímica de toxicidade
O aumento do nível das enzimas hepatobiliares é um dos
marcadores mais sensíveis da doença hepática induzida por drogas
(Gayotto, 2001).
Em relação às enzimas hepáticas, o aumento da
fosfatase alcalina (FA), da gama glutamiltransferase (GGT), da alanina
aminotransferase (ALT) e da aspartato-aminotransferase (AST) pode
resultar de alterações reversíveis a irreversíveis nas membranas
hepatocelulares associadas com necrose, colestase, hipoxia,
26
hipoperfusão, inflamação, ação de agentes infecciosos e toxinas ou
excesso de depósitos hepatocitários de lipídeos, cobre ou glicogênio
(Bistiner et al., 2002)
A enzima FA está amplamente distribuída nos tecidos
humanos, principalmente mucosa intestinal, fígado (canalículos biliares),
túbulos renais, baço, ossos (osteoblasto) e placenta. A FA sérica tem
grande significado clínico na investigação das desordens hepatobiliares e
ósseas. Nas enfermidades hepatobiliares, as elevações da atividade da
enzima são encontradas, principalmente na obstrução extrahepática.
Neste caso a atividade da FA se eleva devido ao incremento na síntese
da enzima, induzida pela colestase (Motta, 1989).
As aminotransferases AST e ALT que exercem papéis
centrais na catalisação de várias reações tanto para síntese como para
degradação de aminoácidos, estão amplamente distribuídas nos tecidos
humanos. As atividades mais elevadas de AST encontram-se no tecido
cardíaco, fígado, músculo esquelético; e as pequenas quantidades são
encontradas nos rins, pâncreas, baço e eritrócitos. A ALT apresenta-se
em elevados níveis no fígado (Motta, 1989).
Desordens hepatocelulares agudas apresentam um
aumento significativo na atividade dessas enzimas. Na hepatite virótica ou
tóxica, a ALT geralmente apresenta atividade maior que a AST. Na cirrose
hepática, essas enzimas também se encontram elevadas, nestes casos a
atividade da AST é maior que da ALT (Motta, 1989).
A enzima GGT é encontrada predominantemente na
membrana das células do fígado, rim, próstata e pâncreas. A atividade
desta enzima é elevada em todas as formas de desordens hepatobiliares.
Os maiores aumentos são observados nos casos de obstrução biliar intra
ou pós-hepática. A GGT é mais sensível que a FA na detecção de
icterícia obstrutiva e de outras doenças. Além disso, a GGT é utilizada na
diferenciação da fonte de elevação da FA, pois a GGT apresenta valores
normais nas desordens ósseas e durante a gravidez. A GGT é também
27
um indicador do alcoolismo, particularmente, da forma oculta (Motta,
1989).
Na avaliação da função renal, pode-se usar a creatinina
sérica para estimar o ritmo de filtração glomerular. Tanto a creatina-
fosfato como a creatina, em condições fisiológicas, espontaneamente
perdem o ácido fosfórico ou água, respectivamente, para formar a
creatinina, seu anidrido. A creatinina livre não é reutilizada no
metabolismo corporal e assim funciona somente como um produto dos
resíduos de creatina. Valores aumentados indicam a deterioração da
função renal, sendo que o nível sérico geralmente acompanha,
paralelamente, a severidade da doença renal. Os níveis de creatinina
muitas vezes não ultrapassam os limites de referência até que 50 a 70%
da função renal esteja comprometida (Motta, 1989; Kirsztains, 2007).
O nível de uréia no plasma é afetado pela função renal,
pelo conteúdo protéico da dieta e pelo teor do catabolismo protéico e
estado de hidratação do paciente. O nível de uréia serve como um índice
preditivo da insuficiência renal sintomática e no estabelecimento de
diagnóstico na distinção entre várias causas de insuficiência renal. Os
aminoácidos provenientes do catabolismo protéico são desaminados com
a produção da amônia. Sendo a amônia tóxica, esta é convertida em uréia
no fígado associada ao CO2 (Motta, 1989).
2.6. Alcalóides Pirrolizidínicos
Entre seus princípios ativos o confrei contém os
Alcalóides pirrolizidínicos (AP), que despertam interesse em relação ao
risco à saúde associado com o consumo crônico e sistêmico desta planta
e de outras plantas quem também apresentam estes alcalóides (Pozetti,
1991; Rode, 2002).
28
Os AP são tóxicos e muitos vegetais que contém altas
concentrações de tais compostos são conhecidos como responsáveis
pela morte lenta de animais, equinos e bovinos, principalmente, pelos
danos severos que provocam no fígado (Pozetti, 1991).
Os AP formam um grupo diverso com cerca de 360
estruturas, com ocorrência restrita a certas plantas superiores. São
sintetizados nas raízes, folhas e caules, dependendo da família da planta.
Mais de 350 tipos de AP tem sido identificados em mais de 6000
diferentes plantas das famílias das Boraginaceae, Compositae e de
determinadas leguminosas entre outras (Silva, 2000).
São representados por um anel pirrolizidínico. (Figueiredo;
Kaplan, 1997; Silva 2000). Os APs são compostos de uma base necina e
um ácido nécico, que podem formar monoésteres, diésteres ou triésteres
de cadeias abertas e diésteres macrocíclicos, sendo que a base necina
pode apresentar ou não insaturação na posição 1,2 (Figura 1). Estes AP
ocorrem preferencialmente na forma N-óxido em plantas e insetos. Na
espécie de Senecio os AP são sintetizados exclusivamente como N-
óxidos, que são a forma molecular específica para translocação a longa
distância, e armazenamento dentro do vacúolo (Silva, 2000).
O risco de saúde para humanos e animais domésticos é
devido ao fato dos vertebrados terem a capacidade metabólica de
converter muitos AP em pirróis tóxicos, que são hepatotóxicos,
mutagênicos e carcinogênicos (Figueiredo; Kaplan, 1997).
Os alcalóides pirrolizidínicos encontrados nas espécies
Heliotropium, Senecio, Symphytum e Crotalaria são particularmente
hepatotóxicos (Stickel, 2005).
Em relação ao confrei, o conteúdo de alcalóides pode ser
variável de acordo com a época do ano e a idade da planta. Também há
diferença, entre o conteúdo de alcalóides na raiz e nas partes aéreas da
planta, com maior conteúdo nas raízes (Stickel, 2000). O confrei contém
pelo menos 7 tipos de alcalóides: intermedina, licopsamina, acetil
29
intermedina, acetil licopsamina, simlandina, simfitina, equimidina e outros
(Rode, 2002).
A hepatotoxicidade de plantas contendo AP em humanos
é bem estabelecida e dose-dependente. A “doença do senécio” foi
descrita pela primeira vez na África do Sul, seguida por relatos na
Jamaica sobre crianças desenvolvendo ascites, hepatomegalia e
eventualmente cirrose após ingestão de chás. No Afeganistão houve um
surto de hepatotoxicidade causada por AP advindo de plantas do gênero
Heliotropium que apresentavam principalmente a heliotrina e lasiocarpina.
Outra epidemia foi observada na Índia, causada pela planta Crotalaria spp
que contaminou cereais durante a colheita. A espécie Crotalária também
é conhecida como hepatotóxica e é responsável por numerosos casos de
doença veno-oclusiva (DVO) do fígado causada por AP (Winship, 1991;
Stickel, 2000; Stickel, 2005).
A doença veno-oclusiva (DVO) é uma obliteração não
trombótica parcial ou total de pequenos ramos venosos intra-hepáticos,
por tecido conjuntivo frouxo subendotelial. Esta lesão é provavelmente
decorrente de inflamação ou destruição do endotélio venular levando a
edema subintimal, fragmentação e necrose da parede venular,
observando-se freqüentemente necrose de hepatócitos perivenulares com
posterior colagenização e esclerose perivenular. O resultado da obstrução
do fluxo venoso causa congestão hepática e necrose centrolobular
resultadando em falência hepática aguda, fibrose hepática ou cirrose
(Gayotto,2001; Stickel, 2005).
Os primeiros agentes tóxicos associados a esta doença
foram os AP presentes em chás de ervas, do gênero Senecio e
Heliotropium, particularmente a Crotalária. Atualmente os principais
agentes associados ao desenvolvimento de DVO são citostáticos,
agentes antimetabólicos e alquilantes utilizados na terapia antineoplásica
(Gayotto,2001; Stickel, 2005).
30
O efeito tóxico dos pirróis gerados enzimaticamente
conduz a um defeito no endotélio dos sinusóides com aumento da
permeabilidade e extravasamento de células vermelhas do sangue para
dentro do espaço de Disse. Subseqüentemente fibras reticulares são
geradas dentro da luz de veias centrolobulares terminais com eventual
obstrução das veias (Stickel, 2000). O espessamento das paredes dos
vasos venosos conduz a uma obstrução funcional do fluxo e a uma
congestão centrolobular, resultando em necrose dos hepatócitos
centrolobulares seguida por necrose das células mesenquimais.
Subsequentemente pode se desenvolver fibrose formando septos a partir
de veias centrolobulares em vez de a partir dos espaços porta. Sinais de
inflamação geralmente estão ausentes (Stickel, 2000).
Investigações ultra-estruturais revelaram que a ocorrência
de vesículas no hepatócito, na borda sinusoidal, gera uma obstrução nos
sinusóides. O acúmulo de hepatócitos com vesículas junto com os debris
celulares nas áreas perisinusoidais podem explicar o fato da hipertensão
portal se tornar evidente antes da obstrução do fluxo venoso ter sido
desenvolvida. A detecção das vesículas nos hepatócitos pode ser vista
em outras doenças como as colestases, hepatites alcoólicas, rejeições de
transplantes e outras. (Stickel, 2000; Yeong et al., 1991).
Além da hepatotoxicidade, AP também têm mostrado dano
aos pulmões. Como na DVO, defeitos endoteliais são a causa de
extravasamento de células sanguíneas, oclusão vascular venosa e
subseqüente desenvolvimento de hipertensão pulmonar (Stickel, 2000).
Toxicidade pulmonar por AP foi somente descrita em
roedores experimentalmente expostos a monocrotalina, um AP
encontrado no confrei (Stickel, 2000).
Outros órgãos potenciais para toxicidade incluem o
glomérulo renal, pâncreas e trato gastrintestinal, apesar das lesões terem
sido observadas somente em animais experimentais (Stickel, 2000).
31
Além dos danos agudos e crônicos aos órgãos, os AP
podem induzir tumorigênese, particularmente no fígado. A simfitina, maior
AP constituinte do confrei, tem sido associada com o carcinoma
hepatocelular em ratos. O pressuposto é que, os efeitos alquilantes dos
metabólitos pirrólicos de alta reatividade conduzem a transformação
neoplásica dos hepatócitos. Entretanto esta transformação só foi
observada em animais experimentais (Stickel, 2000).
Uma associação entre AP e câncer em humanos não foi
encontrada. Considerando a exposição de humanos a AP através das
ocorrências mundiais, comparado com os animais de experimentação,
parece improvável que humanos desenvolvam carcinogênese frente a
essa planta (Stickel, 2000).
Figura 1 – Fórmula do AP e seu N-óxido, esquematizado em suas vias de
metabolização. (adaptado de Rode, 2002).
32
2.7 Mecanismo de ação do alcalóide
Os AP contidos nas plantas são quimicamente não
reativos e quando ingeridos, grande parte deles é excretado sem
biotransformação, e o restante é metabolizado no fígado. A ativação do
alcalóide requer de-hidrogenação de AP com produção de pirróis que são
eletrofílicos e reagem com componentes teciduais nucleofílicos, como
ácidos nucléicos e proteínas. Como o fígado é o principal local de
produção desses pirróis tóxicos, ele é um dos dois principais órgãos-alvo,
seguido pelo pulmão (Prakash et al., 1999; Rode, 2002; Stickel, 2005).
Uma primeira via de metabolização dos APs está
relacionada com a clivagem por esterases com liberação de necina ou
ácido nécico, sendo que nenhuma dessas vias é tóxica ou sofre posterior
metabolização. Esta via metabólica é muito importante porque a clivagem
das esterases é uma cadeia de detoxificação que promove a limpeza
gerando produtos não tóxicos.
Uma segunda via de metabolização destes alcalóides é a
formação dos derivados N-óxidos (NO) por monoxigenases microssomais.
A formação de N-oxidos é outra via detoxificante que tem importância
diferente entre as espécies. A monoxigenase considerada como sendo a
mais importante na biotransformação são as monoxigenases
microssomais flavinas do fígado. Muitos estudos mostram que as
monoxigenases microssomais do citocromo P450 também podem ser
responsáveis pela catalização da N-oxidação de alguns alcalóides
pirrolizidínicos em especial (Prakash et al., 1999; Stickel, 2000; Stickel,
2005).
A família de enzimas do citocromo P450, além do papel
detoxificante, também pode formar componentes tóxicos de substâncias
previamente inócuas (Stickel, 2000).
Outra via de conversão dos AP gera metabólitos
pirrólicos tóxicos reativos através da oxidação do alfa-carbono
33
(desidrogenação) catalisado também pelas monoxigenases do citocromo
P450. Esses metabólitos têm alta toxicidade e propriedades alquilantes
que causam dano ao endotélio do fígado e de outros órgãos (Prakash,
1999; Stickel, 2000, Rode, 2002).
Segundo Pearson (1993), os pirróis podem promover um
elo cruzado do DNA de cadeia dupla, podendo desta forma promover um
efeito antimitótico. Ocorrendo nos hepatócitos, leva a expansão do
citoplasma sem haver divisão nuclear, transformando a célula hepática
em megalócitos. À medida que as células morrem são substituídas por
tecido conjuntivo fibroso e o fígado gradualmente começa a se tornar
insuficiente. A doença pode ser de caráter agudo ou crônico e também
acarretar alterações mutagênicas em varias espécies animais.
2.8 Toxicidade do Symphytum officinale
Pessoa et al. (2007) avaliaram histologicamente a ação
sistêmica do Symphytum officinallis homeopático (6CH) diluído em base
hidroalcoólica (BHA) nos tecidos hepático, gástrico e subcutâneo de
camundongos. Utilizaram 18 camundongos machos divididos em quatro
grupos: Symphytum officinallis 6CH e BHA via oral nos períodos de 30 e
60 dias e Symphytum officinallis 6CH e BHA tópico por 60 dias. Obtiveram
biópsias do fígado e do intestino dos animais tratados por via oral e do
tecido subcutâneo dos animais tratados com aplicação tópica. Não houve
alteração morfológica nos tecido subcutâneo e intestinal tanto dos animais
6CH quanto nos BHA. Entretanto, o tecido hepático dos animais tratados
com Symphytum officinaliis 6CH e BHA, demonstrou alterações
degenerativas moderadas, nos dois períodos avaliados. Concluiram assim
que efeitos adversos podem surgir também durante o uso homeopático
indicando a necessidade de mais estudos sobre o assunto, ressaltando a
consideração da ação da base hidroalcoólica no fígado.
34
Yeong et al.(1991) utilizaram três grupos de ratos adultos
jovens que foram alimentados com alcalóides pirrolizidínicos derivados do
confrei russo para estudar os efeitos da erva no fígado. Os animais do
grupo I receberam dose única de 200mg/Kg de peso corporal. O grupo II
recebeu 100 mg/kg três vezes por semana durante 3 semanas e o Grupo
III 50 mg/Kg três vezes por semana por 3 semanas. Todos os ratos
mostraram ao microscópio de luz e ao miscroscópio eletrônico evidências
de danos hepáticos e que a severidade foi dose dependente. Houve
edema nos hepatócitos e necrose hemorrágica nas células perivenulares.
Houve concomitantemente perda das células de revestimento endotelial
com rompimento da parede sinusoidal e os sinusoides foram ocupados
com debris celulares, organelas dos hepatócitos e células vermelhas do
sangue. O extravasamento de células vermelhas do sangue foi evidente.
Vênulas hepáticas terminais foram estreitadas por proliferação da camada
íntima, e no grupo II e III, fibras de reticulina saindo dos vasos foram
observadas. Tais aspectos foram descritos na doença veno-oclusiva
causada por alcalóides pirrolizidínicos de outras fontes de planta como o
Senecio e a Crotalaria. Os autores comentam que a segurança do confrei,
planta largamente usada, em relação ao consumo humano necessita de
mais estudos.
Yeong et al. (1993) destacaram uma deficiência na
literatura sobre a toxicidade em baixas doses dos alcalóides derivados do
confrei. Com o objetivo de sanar essa dúvida os autores utilizaram 8 ratos
adultos jovens que receberam semanalmente uma dose de 50 mg/Kg de
alcalóides derivados do confrei russo, durante 6 semanas. Foram
utilizados dois ratos como controle. O sacrifício foi realizado uma semana
após a última dose e o fígado dos ratos foi examinado por microscópio
óptico e eletrônico. Ao microscópio de luz foi possível observar congestão
vascular, discreta necrose na zona três, perda da definição da membrana
celular dos hepatócitos. Extensas anormalidades ultraestruturais foram
identificadas na forma de desbridamento endolelial e perda da
35
microvilosidade do hepatócito. Um achado interessante neste trabalho foi
a formação difusa de vesículas nas bordas sinusoidais dos hepatócitos.
Muitas vesículas foram localizadas no espaço de Disse, promovendo o
preenchimento deste e algumas vezes chegando a ocluir o lúmen
sinusoidal. Houve evidência de dano tardio com a colagenização do
espaço de Disse. Os autores destacam ainda que a formação de
vesículas nos hepatócitos ocorre em uma variedade de condições
patológicas mas há pouca informação na literatura sobre os efeitos da
formação de vesículas na fibrinogênese e na microcirculação e seu papel
na patogênese da doença hepática. Concluíram que os AP do confrei
podem servir como um modelo experimental para o estudo do processo
de formação de vesículas.
Mei et al., (2005) avaliaram a mutagenicidade do confrei
no gene cII no fígado de ratos transgênicos “Big Blue”. Grupos de 6 ratos
machos com seis semanas de idade foram alimentados com uma dieta
basal ou dieta de confrei. Os ratos do grupo experimental receberam
alimentação com 2% de raiz de confrei. Os animais sofreram eutanásia
após 12 semanas de tratamento. Freqüências de mutação foram
determinadas no gene cII do fígado dos ratos alimentados com confrei. O
resultado indicou que o confrei induz tumor hepático através de
mecanismo genotóxico e o espectro mutacional dos ratos tratados com
confrei sugerem que os alcalóides pirrolizidínicos das plantas são
responsáveis por indução de mutação e iniciação de tumor no fígado de
rato.
Mei et al. (2006) utilizaram 6 ratos machos transgênicos
do tipo “Big Blue” que foram alimentados com uma dieta basal contendo
8% de raiz de confrei. Os animais foram tratados por 12 semanas e
sacrificados um dia após o final do tratamento. Através de análises com
biologia molecular, observaram que a dieta com confrei resultou em
transformações na expressão de genes hepáticos, bem como em uma
significante diminuição no peso dos animais e aumento de freqüência de
36
mutação. Foi utilizado um valor p menor do que 0,001. Foram
selecionados 2726 genes identificados como expressados
diferencialmente nos ratos alimentados com confrei, comparados aos
animais controle. Entre esses genes, há 1617 genes associados a
funções particulares, e diferencialmente expressados no fígado dos ratos
alimentados com confrei. Estes foram envolvidos no metabolismo, injúria
às células endoteliais e injúria ao fígado, além de anormalidades,
incluindo fibrose hepática e desenvolvimento de câncer. O perfil da
expressão gênica mostra um melhor entendimento dos mecanismos
obscuros da toxicidade hepática induzida pelo confrei. Integração da
expressão gênica com as mudanças patológicas pode ser usada para
formular o esquema da toxicidade e tumorigênese induzidos pelo confrei.
Guo et al. (2007) compararam a expressão dos genes e
as funções biológicas que foram alteradas pelo confrei, em relação as
alteradas por um alcalóide puro, usado como protótipo de carcinogênese.
Para tanto, utilizaram grupos de 6 ratos “Big Blue” que foram tratados com
o alcalóide a 1 mg/Kg por gavagem 5 vezes por semana, por 12 semanas
ou foram alimentados com uma dieta contendo 8% de raízes de confrei
por 12 semanas. Os animais foram sacrificados 1 dia após o fim do
tratamento e os fígados foram coletados para análise da expressão
gênica. Houve grande diferença entre os genes e os processos biológicos
que foram encontrados entre os animais do grupo alimentado com o
confrei e o que recebeu alcalóide puro. Entretanto, houve um número de
genes e processos funcionais da carcinogênese, que foi comum para os
dois tratamentos, mostrando uma forte correlação entre os dois
tratamentos, o que sustenta que os AP contidos no confrei são os
principais componentes responsáveis pela carcinogênese causada pela
planta.
Cao et al. (2008) demonstraram preocupação em relação
as técnicas de análise da presença de AP no conteúdo de produtos como
suplementos alimentares e remédios. A maioria das técnicas
37
espectrométricas avalia apenas os AP deixando de contemplar a análise
de seus derivados N-óxidos (NO), que segundo os autores podem ser
igualmente hepatotóxicos, podendo ser pneumotóxicos, genotóxicos e
carcionogênicos. Relatam que essa ineficiência da metodologia coloca em
risco a segurança dos seres humanos. Através de 2 testes os autores
analisaram amostras obtidas comercialmente de extrato de raiz de confrei
e de confrei russo para detectar a presença de AP e seus NO,
questionando a metodologia de 3 trabalhos pré-existentes. Demonstraram
a inadequação dos métodos reportados para detectar a quantidade AP e
seus NO, nesses trabalhos.
Gomes et al. (2007) usaram um protocolo para indução
de carcinogênese hepática em curto período de tempo em ratos. Extrato
de confrei a 10 % foi administrado por gavagem aos animais do grupo
experimental três vezes por semana, e os animais do grupo controle
receberam água destilada. Após análise macroscópica e microscópica
observaram no grupo tratado com confrei, redução do número de lesões
macroscópicas pré-neoplásicas, da porcentagem de células ovais e de
figuras de mitose, de células positivas para antígeno nuclear para células
em proliferação (PCNA) e nódulos pré-neoplásicos acidófilos. Por outro
lado houve um aumento na presença de megalócitos e degeneração
vacuolar. Taxas de fibrose, armazenamento de glicogênio e número de
nucléolos não foram alterados. Os autores concluíram que o tratamento
com confrei reduziu a taxa de proliferação celular neste modelo
experimental.
38
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos do
Symphytum officinalle L. no fígado e rins de ratos comparando o
medicamento fitoterápico na dose de 500mg/Kg/dia com a formulação
homeopática em 6CH, investigando a toxicidade destas duas formulações
após 30 e 60 dias de uso.
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Este estudo foi realizado de acordo com os Princípios
Éticos na experimentação animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), com aprovação fornecida pelo Comitê
de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos – UNESP, sob o Protocolo nº 043/2007-PA/CEP de 06 de
novembro de 2007 (Anexo).
Para este trabalho foram utilizados 42 ratos machos
adultos (Rattus norvegicus, variação albinus, Wistar), com
aproximadamente noventa dias de idade, peso médio de 300 gr, mantidos
em gaiolas em temperatura ambiente e alimentados com ração e água ad libitum, fornecidas pelo Biotério da Faculdade de Odontologia de São
José dos Campos -UNESP.
Aos 90 dias de idade, os animais foram divididos em 3
grupos , de acordo com o tratamento: Homeopático com Symphytum officinale 6CH (H), fitoterápico Symphytum officinale (F) e grupo controle
(C). Destes, foram eutanasiados 8 animais de cada um dos três grupos,
no período de 30 dias e 6 animais de cada um dos três grupos no período
de 60 dias.
40
4.2 Preparo da droga vegetal constituída das folhas de Symphytum officinale
O material vegetal foi coletado no sítio Pinheiros,
localizado no bairro Vila Élvio, pertencente ao município de Piedade, no
Estado de São Paulo e identificado pelo Prof. Dr. Gokithi Akisue no
herbário da Universidade de São Paulo – USP.
As folhas da espécie foram colhidas inteiras e secas naturalmente
a sombra durante 05 (cinco) dias, posteriormente foram submetidas à
secagem complementar em estufa a temperatura controlada de 45 °C
durante 72 horas. Após a secagem, as folhas foram pulverizadas em
moinho de facas de modo que suas partículas tiveram seu diâmetro
máximo padronizado por tamis de malha 20 Mesh.
Para a obtenção do extrato fluido das folhas da espécie
foi empregado o Processo A da Farmacopéia Brasileira 2° ed. (1959)
adaptado para as características do estudo. Assim, 1.000 g da droga
vegetal pulverizada grosseiramente (partículas com diâmetro padronizado
em 20 Mesh) foram submetidos a intumescimento em solução
hidroetanólica 70% (v/v) ficando neste estado de repouso por 30 minutos.
O material já intumescido, após o tempo de 30 minutos,
foi acondicionado em um vaso percolador. Durante este procedimento
tomou-se o cuidado de não compactar o material excessivamente de
modo a não dificultar a passagem do solvente durante o processo de
percolação, resistência esta, resultante do possível aumento da força de
capilaridade frente à pressão hidrostática do sistema (Saito, 1988).
Uma vez acondicionada, a droga vegetal, e todo sistema
para percolação já montado, foi adicionada solução hidroetanólica 70%
(v/v) até que se cobriu 10 cm acima do nível da droga vegetal, que ficou
em repouso neste estado de maceração durante 24 horas. Após o
41
repouso em maceração foi iniciado o processo de percolação com fluxo
controlado de 25 gotas por minuto (Figura 2).
Foram recolhidos os primeiros 850 mL de extrato,
correspondendo à primeira fração extrativa, que foi acondicionada e
reservada em vidro âmbar fechado. Esta primeira fração extrativa foi
armazenada em refrigerador à temperatura de 8 °C. A percolação foi
continuada até o esgotamento da droga vegetal, mantendo-se o fluxo de
25 gotas por minuto até a sua conclusão.
Após o esgotamento da droga vegetal, a segunda fração
extrativa obtida foi concentrada em aparelho evaporador rotativo acoplado
a vácuo em temperatura de 45 °C, e concluído em aparelho de “banho-
maria”, também a temperatura de 45 °C, até se obter o volume final de
150 mL destra fração extrativa. Este volume foi acrescentado à primeira
fração reservada, totalizando 1.000 mL de extrato fluido na proporção de
1:1 (ativos solúveis presentes em 1.000 g da droga vegetal, dissolvidos
em 1.000 mL de extrato fluido hidroetanólico).
Uma alíquota, equivalente a 500 g, do extrato fluído
obtido foi evaporado para fins de redução do teor de etanol, sendo este
processo iniciado em aparelho evaporador rotativo a 45 ºC, sob vácuo, e
concluído em “banho-maria”. A evaporação foi conduzida, em temperatura
de 45 º C, até uma redução de 75% da massa inicial do extrato, o que
consiste à obtenção de uma massa de extrato hidroetanólico evaporado
equivalente a 125 g (Figura 3). Este extrato hidroetanólico evaporado das
folhas de Symphytum officinale foi identificado como “EHESo”.
42
Figura 2 – Esquema demonstrativo do processo de produção da droga vegetal e do
extrato hidroetanólico.
4.3 Preparo da amostra para administração aos animais
Foi preparada uma dispersão contendo 250 mg.mL-1 de
EHESo em solução aquosa de Tween 80 (monoleato de sorbitano
polioxietileno) a 12,0%. Esta dispersão foi utilizada para administração
oral aos animais conforme as doses referentes a cada grupo
experimental.
Os procedimentos acima descritos foram realizados no
Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Pindamonhangaba –
FAPI.
43
Figura 3 – Esquema demonstrando o processo de evaporação do extrato
hidroetanólico e do preparo da dispersão utilizada para administração aos animais.
4.4 Peso corporal dos animais
Todos os animais foram identificados e pesados no dia do
início do tratamento (peso inicial) e no dia da eutanásia (peso final). Cada
rato foi colocado em gaiola individual e pesado (g) em balança digital e o
percentual de aumento de peso de cada um dos animais foi calculado
conforme a fórmula:
Aumento de peso (%) = (Peso final – Peso inicial) x100/ Peso inicial
44
Além disso, os animais do grupo F foram pesados
semanalmente para cálculo da dose do fitoterápico.
4.5 Tratamento homeopático
Foram administrados a cada animal, do grupo
homeopático (H), através de gavagem, 02 glóbulos de Symphytum officinallis 6CH* dissolvidos em 1 ml de água filtrada por dia (Figura 4).
4.6 Tratamento fitoterápico
Foram administrados a cada animal, através de gavagem,
extrato de Symphytum officinalle na dose de 500 mg/Kg do peso do
animal por dia. O tratamento foi realizado até o dia anterior à eutanásia.
Para tanto, cada animal do grupo fitoterápico (F), foi pesado
semanalmente para cálculo da dose.
4.7 Tratamento do grupo controle
Foram administrados a cada animal, através de gavagem,
02 glóbulos de sacarose* sem componente homeopático, dissolvidos em
um ml de água filtrada por dia, até o dia da eutanásia.
______________ * Pharmaciantiga Homeopatia, São José dos Campos – SP.
45
Figura 4 – Tratamento: a) administração do tratamento através de gavagem; b)
medicamentos homeopático e fitoterápico, seringa e agulha de gavagem.
a
b
46
4.8 Anestesia
Para a eutanásia os animais foram pesados e
anestesiados usando-se uma mistura de Cloridrato de xilasina 2%
(Anasedan), substância sedativa e relaxante muscular, com Cetamina
base (Francotar- Virbac- Roseira, SP, Brasil), anestésico geral, por via
intramuscular, na relação de 0,8:0,5 e administrada na dose de
0.1ml/100gr de peso corporal, por via intramuscular. Os ratos foram
pesados para calcular a dose ideal de anestésico para cada animal.
4.9 Coleta do sangue para os exames bioquímicos
Antes da eutanásia, foi realizada a coleta de uma amostra
de sangue de todos aos animais de todos os grupos. Para realização
deste procedimento os animais foram anestesiados e foi feita uma incisão
na região abdominal do animal para exposição da artéria aorta abdominal.
Em seguida, com o auxílio de uma seringa de plástico (volume 5 ml)
heparinizada, foi removida uma amostra de aproximadamente 4 ml de
sangue. O plasma foi obtido a partir da centrifugação a 5000 rpm das
amostras de sangue por 10 minutos. Estas amostras foram pipetadas,
armazenadas em tubos eppendorf e mantidas a –20 ºC, sendo
submetidas posteriormente às análises espectrofotométricas.
47
4.10 Eutanásia
Para a eutanásia os animais foram submetidos à
anestesia geral profunda e sangria.
Os animais de todos os grupos foram divididos de acordo
com o período experimental de 30 e 60 dias. A eutanásia foi realizada no
dia seguinte ao fim da medicação de cada período experimental.
4.11 Remoção de fígado e rins
Foram removidos o fígado e o rim direito de cada animal
para avaliação histológica. O material foi fixado em formol a 10% por um
período mínimo de 48 horas.
4.12 Análise histológica
Após fixação, o fígado e o rim foram incluídos em blocos
de parafina e foram realizados cortes seriados com espessura de 5 μm,
os quais foram estendidos em lâminas de vidro. Uma lâmina do fígado de
cada animal foi corada com HE e uma lâmina com Tricrômico de Mallory.
Para os rins foi confeccionada uma lâmina de cada animal com a
coloração de HE.
As lâminas de fígado e rim foram submetidas à análise
em microscopia de luz. Com o objetivo de auxiliar a observação foi
48
confeccionada uma Tabela (Apêndice A), cujo os dados serviram de base
para a análise microscópica descritiva, histomorfométrica e para análise
estatística.
A Tabela considerou as alterações microscópicas citadas
na literatura como características de toxicidade hepática por AP e
alterações renais que possam indicar efeitos tóxicos. Para o fígado foram
considerados dados referentes a presença de inflamação, proliferação
canalicular, fibrose, degeneração vacuolar de hepatócitos, necrose de
hepatóxitos, hemorragia, congestão, lesão endotelial e alterações
vasculares. Para os rins foram avaliados a presença de degeneração
vacuolar nos túbulos, inflamação, fibrose, congestão, hemorragia e
alteração glomerulares e vasculares.
Para análise histomorfométrica foi realizada a contagem
dos focos de inflamação e de focos de fibrose em todo o corte do fígado
de todos os animais. A análise microscópica foi feita em duplicada por um
único observador.
4.13 Avaliação toxicológica bioquímica
A avaliação do potencial tóxico das doses homeopáticas e
fitoterápicas administradas de Symphytum officinale foi feita não só
através do exame histológico do fígado e do rim mas também pela análise
bioquímica específica para fígado e rins.
Para avaliação do fígado foram realizadas as análises da atividade
enzimática de fosfatase alcalina (FA), alanina aminotransferase (ALT),
aspartato aminotransferase (AST), gama glutamil transferase (GGT) e
para os rins a análise da concentração de uréia e creatinina.
49
4.13.1 Determinação da atividade de Fosfatase alcalina (FA)
A atividade enzimática da fosfatase alcalina foi avaliada
pelo método descrito por Roy, 1970 através da timolftaleina monofosfato
como substrato, que após hidrólise libera a timolftaleína, que apresenta
cor azul em meio alcalino. Foi usado espectrofotômetro SHIMADZU-UV-
1203 séries a 590 nm. A cor formada é diretamente proporcional à
atividade enzimática.
Para o cálculo da atividade enzimática (AE) em U/I foram
utilizadas, como referência padrão, soluções de timolftaleína
correspondentes à atividade enzimática de 45, 22,5 e 12,25 U/I. As
absorbâncias destes padrões foram medidas e utilizadas no levantamento
da curva padrão utilizando-se o programa computacional Graph-Pad
Prism versão 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego Califórnica, U.S.A).
O fator de calibração (Fc) calculado através da regressão linear foi
utilizado para o cálculo das AE nas amostras séricas através da relação:
AE= Fc x Absorbância da amostra. O levantamento da curva padrão para
obtenção do Fc foi realizado em todas análises bioquímicas deste
trabalho.
Durante as medidas da AE foram utilizadas alíquotas de
50 μl de soro e os ensaios foram realizados em duplicata, no máximo 24
após a coleta do sangue dos animais.
4.13.2 Determinação da atividade da alanina aminotransferase (ALT)
A atividade enzimática da alanina aminotransferase foi
avaliada pelo método descrito em Bergmeyer e Bernt, 1974 no qual esta
enzima catalisa a transferência do grupo amino da alanina para α-
50
acetoglutarato, formando o glutamato e o piruvato. O piruvato formado
reage com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, dando a hidrazona correspondente,
cuja intensidade da cor, em meio alcalino, foi medido no
espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries a 505 nm. Para o cálculo
da atividade enzimática nas amostras de sangue foram utilizadas como
padrões de referências, soluções do substrato e piruvato de sódio
correspondentes à atividade enzimática de 46,8; 27,5 e 13,5 U/I. As
absorbâncias dos padrões foram medidas no espectrofotômetro e
utilizadas para o levantamento da curva padrão para obtenção do Fc, cujo
valor foi utilizado no cálculo da concentração das amostras. Durante os
ensaios, em duplicata, foram utilizadas alíquotas de 0,1 ml de soro.
4.13.3 Determinação da atividade de aspartato aminotransferase (AST)
A atividade enzimática da aspartato aminotransferase foi
avaliada pelo método descrito por Bergmeyer e Bernt, 1974. A enzima
catalisa a transferência do grupo amino do aspartato para α-cetoglutarato,
formando o glutamato e o oxaloacetato. O oxaloacetato formado reage
com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, produzindo a hidrazona correspondente,
cuja intensidade da cor, em meio alcalino, foi medida no
espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries a 505 nm. Para o cálculo
da atividade enzimática da enzima nas amostras de sangue foram
utilizadas como padrões de referências, soluções de substrato e piruvato
de sódio nas concentrações correspondentes à atividade enzimática de
91,6; 54,9; 29,4 e 11,6 U/I. As absorbâncias destes padrões foram
utilizadas para o levantamento da curva padrão com a finalidade de se
obter o Fc, cujo valor foi utilizado no cálculo das concentrações das
51
amostras de sangue. Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas
alíquotas de 0,1 ml de soro.
4.13.4 Determinação da atividade da gama glutamil transferase (GGT)
A atividade enzimática da gama glutamil transferase foi
avaliada pelo método descrito por Szasa modificado, utilizando o kit da
LABTEST.
A gama glutamil transferase catalisa a transferência do
grupamento glutamil da L-�-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a
glicilglicina, formando L-�-glutamilglicilglicina e a p-nitroanilida.
A quantidade de p-nitroanilida formada de coloração
amarelada, que apresenta elevada absorbância em 405 nm, é
diretamente proporcional à atividade da GGT na amostra.
4.13.5 Determinação da concentração de uréia
A concentração de uréia nas amostras de soro foram
avaliada pelo método da diacetilmonoxima, descrito por Moura et al., 1994
que se baseia na reação direta entre a uréia e a diacetilmonoxima (2,3-
butadiona monoxima) na presença da tiossemicarbazida e íons cádmio
em meio ácido.
Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas
alíquotas de 0,1 ml de plasma. Estas amostras foram imersas em água
fervente durante 10 minutos para que ocorresse a reação entre a uréia e
a diacetilmonoxima. Ao final da reação, as amostras apresentaram uma
cor rosa-púrpura, cuja resultante foi proporcional à concentração de uréia.
52
Em seguida, foi adicionado 2ml da amostra na cubeta de vidro do
espectrofotômetro SHIMADZU-UV-1203 séries e foi medida a 540 nm.
Para o cálculo da concentração de uréia nas amostras de soro foram
utilizadas como padrões de referências, soluções do substrato e piruvato
de sódio correspondentes à atividade enzimática de 20, 40, 60, 80 e 100
mg/dl. As absorbâncias dos padrões foram medidas no espectrofotômetro
e utilizadas para o levantamento da curva padrão para obtenção do Fc,
cujo valor foi utilizado no cálculo da concentração das amostras.
4.13.6 Determinação da concentração de creatinina
A dosagem de creatinina plasmática foi realizada pelo
método colorimétrico utilizando o kit da LABTEST, cujo princípio baseia-
se no método de Jaffé (1886) modificado onde a creatinina reage com
solução de picrato, em meio alcalino, produzindo um complexo de picrato
de cratinina de cor amarelo-avermelhado. Decorridos os 10 minutos de
incubação em banho-maria a 37 ºC, a adição do ácido acético 11,4 mol/L
(acidificante) abaixa o pH para 5,0 bloqueando a reação e ao mesmo
tempo promovendo a decomposição do picrato de creatinina,
permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogênos, que foram
medidas espectrofotometricamente.
4.14 Análise estatística
Os dados obtidos nas análises bioquímicas, na
porcentagem de aumento de peso dos animais e na análise
histomorfométrica foram submetidos à análise estatística descritiva e
53
inferencial sob auxílio do programa computacional Minitab (versão 14.12,
Minitab Inc., 2004) e Prism (versão 5.0, Graph Pad., 2007) e Statistix 8.0.
A estatística descritiva consistiu nas medidas de:
tendência central (média), variabilidade (desvio padrão, faixa dos valores);
e tiveram representação gráfica com o gráfico de colunas.
A unidade experimental foi o rato. O nosso experimento
teve 24 ratos no grupo de 30 dias e 18 ratos no período de 60 dias.
Foram analisadas duas variáveis independentes: período
e tratamento. A variável dependente (resposta) para as análises da FA,
ALT, AST, GGT foi a atividade enzimática, para a Creatinina e Uréia foi a
concentração plasmática e para a análise histomorfométrica foi a
quantidade de focos de inflamação e de fibrose no fígado. Também foi
avaliada a variação no ganho de peso dos animais, cuja variável
dependente foi a porcentagem de ganho de peso dos animais.
A estatística inferencial consistiu nos testes t (Student) de amostras independentes que verificou o fator período em cada
tratamento (C, H ou F) e ANOVA (1 fator) que foi realizado entre os
tratamentos possíveis, C, H ou F em cada um dos períodos (30 e 60
dias). O nível de significância adotado para os dois testes foi o valor
convencional de 5%.
54
5 RESULTADOS
A análise dos dados obtidos será apresentada a seguir,
primeiramente os obtidos através das análises bioquímicas, seguido do
peso corporal dos animais e posteriormente aqueles obtidos com a
análise histomorfométrica, finalizando os resultados com a análise
histológica descritiva do fígado e rim dos animais.
5.1 Análises bioquímicas
Serão apresentados os resultados das análises
bioquímicas da Fosfatase alcalina, Alanina aminotransferase, Aspartato
aminotransferase, Gama glutamiltransferase, Creatinina e Uréia. Um dos
ratos do grupo C no período de 30 dias morreu durante a anestesia e não
pode ter seus dados bioquímicos avaliados, portanto o n nesse grupo foi
7.
5.1.1 Fosfatase alcalina
Os dados das absorbâncias obtidos das leituras
espectrofotométricas durante a análise bioquímica da Fosfatase alcalina
(FA) foram convertidos em atividade enzimática expressa em Unidade
internacional/l (U/l), mediante a multiplicação pelo fator final de calibração
55
(K= 121,200), conforme explicado em materiais e métodos. A unidade U/l
representa a quantidade de enzima que libera por hidrólise 1 micromol de
produto por minuto por litro. O valor da atividade enzimática da FA para
cada replicata estão representados na Tabela 37 (Apêndice B).
Os dados da estatística descritiva estão representados
na Tabela 1 e Figura 5.
Tabela 1 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da atividade enzimática (U/l) da FA sanguínea nos grupos controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp)UI/l
C 30 7 20,53±4,25
C 60 6 31,23±4,95
H 30 8 24,57±9,20
H 60 6 35,17±7,33
F 30 8 23,96±5,81
F 60 6 30,70±3,35
n= número de amostras
56
C30 C60 H30 H60 F30 F600
10
20
30
40
50U
I/L
Figura 5 – Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da atividade
enzimática da FA (UI/L) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e tratamento).
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, nos grupos controle e tratados, pode-se verificar
que:
O grupo C60 (31,23±4,95UI/l) teve maior AE que o grupo
C30 (20,53 ± 4,25 UI/l). Essa diferença é estatisticamente significante
segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 4,14; gl = 9;
p=0,003<0.05).
O grupo F60 (30,70±3,35 UI/l) apresentou maior AE que
a o grupo F30 (23,96±5,81 UI/l). Essa diferença é estatisticamente
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
2,73; gl = 11; p=0,020<0,05).
O grupo H60 (35,17±7, 33 UI/l) apresentou maior AE que
o grupo H30 (24,57±9,20 UI/l). Essa diferença é estatisticamente
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
2,40; gl = 11; p=0,035<0,05).
Uma análise comparativa na atividade enzimática da FA
entre os grupos controle, homeopático e fitoterápico para os períodos de
57
30 e 60 dias foi efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados
para o período de 30 dias estão na Tabela 2 e para o período de 60 dias
na Tabela 3.
Tabela 2 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias referentes aos dados da atividade enzimática de FA nos grupos H, C e F.
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 69,15 34,5734 0,74 0,4906
Resíduo 20 936,75 46,8374
Total 22 1005,90
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre o grupo controle,
C(20,53±4,25) e os grupos tratados F(23,96±5,81) e H(24,57±9,20).
Tabela 3 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias referentes aos dados da atividade enzimática de FA nos grupos H, C e F.
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 71,441 35,7203 1,20 0,3290
Resíduo 15 447,075 29,8050
Total 17 518,516
No período de 60 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os grupos controle
C(31,23±4,95) e os grupos tratados F(30,70±3,35) e H(35,17±7,33).
58
5.1.2 Alanina aminotransferase
Os dados das absorbâncias obtidos durante a análise
espectrofotométricas da Alanina aminotransferase (ALT) foram
convertidos em atividade enzimática (U/l), mediante a multiplicação pelo
fator final de calibração (K= 182,00), como explicado anteriormente Os
valores das atividades da ALT para cada replicata estão representados na
Tabela 38 (Apêndice B).
Os dados da estatística descritiva estão representados
na Tabela 4 e Figura 6.
Tabela 4 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da atividade enzimática (U/l) da ALT nos grupos controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação.
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp) U/l
C 30 7 22,35±3,24
C 60 6 17,79±1,281
H 30 8 16,85±4,32
H 60 6 19,26±2,80
F 30 8 20,83±5,22
F 60 6 22,52±3,05
n= número de amostras
59
C30 C60 H30 H60 F60 F300
5
10
15
20
25U
I/L
Figura 6 - Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da atividade
enzimática da ALT (UI/L) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias nos grupos controle e tratados, pode-se verificar
que:
O grupo C30 (22,347±3.241UI/l) apresentou AE maior
em relação ao grupo C60 (17,790±1.281UI/l). Essa diferença é
estatisticamente significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 3,42; gl = 8; p=0,009<0.05).
O grupo F60 (22,52±3,05 1UI/l) apresentou AE diferente
do grupo F30 (20,83±5,22 UI/l). Essa diferença é estatisticamente não
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
0,76; gl = 11; p=0,462>0,05).
O grupo H60 (17,790±1,281 UI/l) apresentou AE
diferente do grupo H30 (16,85±4,321 UI/l). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 1,27; gl = 11; p=0,232>0,05).
Uma análise comparativa da atividade enzimática da ALT
entre os grupos controle, homeopático e fitoterápico para o período de 30
e 60 dias foi efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados
60
para o período de 30 dias estão na Tabela 5 e para o período de 60 dias
na Tabela 6.
Tabela 5 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias referentes aos dados da atividade enzimática da ALT nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 123,395 61,6975 3,21 0,0618
Resíduo 20 384,416 19,2208
Total 22 507,811
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os grupos controle
C(22,35±3,24 U/l), fitoterápico F(20,83±5,22 U/l) e homeopático
H(16,85±4,32 U/l).
Tabela 6 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias referentes aos dados da atividade enzimática da ALT nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 70,378 35,1892 5,63 0,0150*
Resíduo 15 93,677 6,2452
Total 17 164,056
*p<0,05
No período de 60 dias, verifica-se que a hipótese de
igualdade (Ho) entre os grupos C (17,79±1,281 U/l), H (19,26±2,80 U/l) e
F (22,52±3,05 U/l) foi rejeitada (p= 0,0150 < 0,05). Quando se aplica o
61
teste de comparação múltipla de Tukey (5%), observam-se os efeitos dos
tratamentos neste período conforme a Tabela 7.
Tabela 7 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%) no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos tratamentos, para a atividade enzimática da ALT
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
F 22,522 A
H 19,262 A B
C 17,790 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente
significante
Através dos resultados estatísticos apresentados na
Tabela 6, verifica-se que o grupo F60 apresenta AE de ALT maior em
relação ao grupo C60. Sendo esta diferença estatisticamente significante.
Ainda, constata-se que não há diferença estatística entre o grupo H60 em
relação aos grupos C60 e F60.
5.1.3 Aspartato aminotransferase
Os dados das absorbâncias obtidos após as leituras
espectrofotométricas durante a análise bioquímica da Aspartato
aminotransferase (AST) foram transformados em atividade enzimática
(U/l), mediante a multiplicação pelo fator final de calibração (K= 286,40).
62
Os valores originais de AST para cada replicata estão representados na
Tabela 39 (Apêndice B).
Os dados da estatística descritiva estão representados
na Tabela 8 e Figura 7.
Tabela 8 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio
padrão) dos valores da atividade enzimática (UI/L) de AST sanguínea nos grupos C, H e F, segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp) U/l
C 30 7 44,33±5,43
C 60 6 42,89±3,58
H 30 8 40,97±2,49
H 60 6 46,02±4,31
F 30 8 40,74±6,47
F 60 6 45,08±3,00
C30 C60 H30 H60 F30 F600
20
40
60
UI/L
Figura 7 - Gráfico de colunas (Média ± desvio padrão) dos valores da atividade
enzimática da AST (UI/L) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e tratamento).
63
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, nos grupos controle e tratados, pode-se verificar
que:
O grupo C30 (44,33±5,43 UI/l) apresenta AE diferente do
grupo C60(42,89±3,58 UI/l). Essa diferença é estatisticamente não
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
0,57; gl = 10; p= 0,580>0.05).
O grupo F60 (45,08±3,00 UI/l) apresenta AE diferente do
grupo F30 (40,74±6,47 UI/l) Essa diferença é estatisticamente não
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
1,67; gl = 10; p=0,125>0,05).
O grupo H60 (46,02±4,31 UI/l) apresenta atividade
enzimática maior que o grupo H30 (40,97±2,49 UI/l) Essa diferença é
estatisticamente significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 2,56; gl = 7; p=0,038<0,05).
Uma análise comparativa da atividade enzimática da
AST entre o grupo controle e os grupos tratados para o período de 30 e
60 dias foi efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados para
o período de 30 dias estão na Tabela 9 e para o período de 60 dias na
Tabela 10.
Tabela 9 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias referentes aos dados da atividade enzimática da AST nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 58,978 29,4888 1,15 0,3371
Resíduo 20 513,415 25,6707
Total 22 572,392
64
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os grupos,
C(44,33±5,43), F(40,74±6,47) e H(40,97±2,49).
Tabela 10 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias, referentes aos dados da atividade enzimática da AST nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 30,921 15,4606 1,15 0,3434
Resíduo 15 201,897 13,4598
Total 17 232,818
No período de 60 dias, através da ANOVA não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os medicamentos,
C(42,89±3,58), F(45,08±3,00) e H(46,02±4,31).
5.1.4 Gama glutamiltransferase
Durante as dosagens espectrofotométricas da Gama
glutamiltransferase (GGT), as absorbâncias registradas foram
transformadas em atividade enzimática (U/l) através da multiplicação pelo
fator final de calibração (K= 801,30). Os valores da atividade enzimática
da GGT obtidos para cada réplica estão representados na Tabela 40
(Apêndice C).
No grupo C, no período de 30 dias um animal não foi
utilizado por apresentar valores muito discrepantes, portanto o n para
65
esse grupo foi de 6. Os dados da estatística descritiva estão
representados na Tabela 11 e Figura 8.
Tabela 11 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da atividade enzimática (U/l) de GGT nos grupos C, H e F, segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp)
C 30 dias 6 68,85±21,77
C 60 dias 6 77,66±27,13
H 30 dias 8 40,72±18,71
H 60 dias 6 50,35±11,15
F 30 dias 8 47,73±19,74
F 60 dias 6 50,21±14,14
C30 C60 H30 H60 F30 F600
20
40
60
80
100
UI/l
Figura 8 - Gráfico de colunas (Média ± desvio padrão) dos valores da atividade
enzimática da GGT (UI/L) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
66
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, nos grupos controle e tratados, pode-se verificar
que:
O grupo C60 (77,66±27,13 U/l) apresenta AE diferente
do grupo C30 (68,8±21,8 UI/l). Essa diferença é estatisticamente não
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
0,62; gl = 9; p=0,550>0.05).
O grupo F60 (50,2±14,1 U/l) tem AE diferente do grupo
F30 (47,7±19,7 U/l). Essa diferença é estatisticamente não significante
segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 0,27; gl = 11;
p=0,789>0,05).
O grupo H60 (50,3±11,1 U/l) apresenta AE diferente do
grupo H30 (40,7±18,7 U/l). Essa diferença é estatisticamente não
significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t =
1,20; gl = 11; p=0,255>0,05).
Uma análise comparativa da atividade enzimática da
GGT entre os 3 grupos para o período de 30 e 60 dias foi efetuada por
meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados para o período de 30 dias
estão na Tabela 12 e para o período de 60 dias na Tabela 14.
Tabela 12 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias, referentes aos dados da atividade enzimática da GGT nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 2842,3 1421,17 3,58 0,0480*
Resíduo 19 7547,9 397,26
Total 21 10390,2
* p< 0,05
67
Pode-se verificar que a hipótese de igualdade (Ho) foi
rejeitada (p= 0,0480 < 0,05). Quando se aplica o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), pode-se verificar a formação de grupos
homogêneos em relação aos tratamentos neste período, Tabela 13.
Tabela 13 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%), no período de 30 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos tratamentos, para a atividade enzimática da GGT
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 68,845 A
F 47,727 A B
H 40,716 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante.
A maior AE é aquela estabelecida pelo grupo C e a menor
AE é aquela estabelecida pelo grupo H, no período de 60 dias. Essa
diferença é estatisticamente significante. O grupo F ocupa posição
intermediária.
68
Tabela 14 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias, referentes aos dados da atividade enzimática da GGT nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 2998,20 1499,10 4,24 0,0347*
Resíduo 15 5302,84 353,52
Total 17 8301,04
*p<0,05
Pode-se verificar que a hipótese de igualdade (Ho) foi
rejeitada (p= 0,0347 < 0,05). Quando se aplica o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), podem-se verificar os efeitos dos tratamentos
neste período. Tabela 15.
Tabela 15 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%), no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos tratamentos, para a atividade enzimática da GGT
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 77,659 A
H 50,349 B
F 50,215 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
A maior AE é aquela estabelecida pelo grupo C. A
diferença entre esta e os demais grupos é estatisticamente significante.
69
5.1.5 Concentração de Uréia
Os dados das absorbâncias obtidos durante a análise
espectrofotométrica da uréia foram convertidos em concentração (mg/dl)
através da multiplicação pelo fator final de calibração (K= 150,20). Os
valores das concentrações de Uréia para cada replicata estão
representados na Tabela 41 (Apêndice C).
Os dados da estatística descritiva estão representados
na Tabela 16 e Figura 9.
Tabela 16 - Medida de tendência central (média) e de dispersão
(desvio padrão) dos valores da concentração de Uréia (mg/dl) nos grupos controle, homeopático e fitoterápico segundo os períodos de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp) mg/dl
C 30 7 34,01±1,37
C 60 6 35,74±6,90
H 30 8 32,31±2,91
H 60 6 34,92±4,46
F 30 8 29,64±3,43
F 60 6 34,65±2,11
70
C30 C60 H30 H60 F30 F600
10
20
30
40
50m
g/dL
Figura 9 - Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da concentração
de Uréia (mg/dL) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, no grupo C e nos grupos tratados F e H, pode-
se verificar que:
O grupo C30 (34,01±1,37 mg/dL) apresentou
concentração de Uréia diferente do grupo C60 (35,74±6,90 mg/dL). Essa
diferença é estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 0,60; gl = 5; p=0,573>0.05).
O grupo F30 (29,64±3,43 mg/dl) apresentou menor
concentração de Uréia que o grupo C60 (34,65±2,11 mg/dl). Essa
diferença é estatisticamente significante segundo o teste t (Student) de
amostras independentes (t = 3,37; gl = 11; p=0,006<0,05).
O grupo H30 (32,31±2,91 mg/dl) apresentou
concentração de uréia diferente do grupo H60 (34,92±4,46 mg/dl). Essa
diferença é estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 1,25; gl = 8; p=0,247>0,05).
Uma análise comparativa na concentração de Uréia entre
o grupo C e os grupos tratados F e H para o período de 30 e 60 dias foi
71
efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados para o período
de 30 dias estão na Tabela 17 e para o período de 60 dias na Tabela 18.
Tabela 17 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias, referentes aos dados da concentração de Uréia nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 3,450 1,725 2,12 0,1465
Resíduo 20 1,629 8,147
Total 22 1,974
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os três medicamentos,
C(34,01±1,37 mg/dL), F (29,64±3,43 mg/dl), H (32,31±2,91 mg/dl) .
Tabela 18 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias, referentes aos dados da concentração de Uréia nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 3,848 1,9240 0,08 0,9233
Resíduo 15 359,515 23,9677
Total 17 363,363
No período de 60 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os três medicamentos,
C(35,74±6,90 mg/dL), F(34,65±2,11 mg/dl), H(34,92±4,46 mg/dl).
72
5.1.6 Creatinina
Os dados das absorbâncias obtidos após as leituras
espectrofotométricas durante a análise bioquímica da Creatinina foram
transformados em concentração de Creatinina (mg/dl), mediante a
multiplicação pelo fator final de calibração (K= 55,250 mg/dl). Os valores
originais de Creatinina para cada réplica estão representados na Tabela
42 (Apêndice C). Os dados da estatística descritiva estão representados
na Tabela 19 e Figura 10.
Tabela 19 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da concentração de creatinina (mg/dl) nos grupo controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp) mg/dl
C 30 7 6,83±3,22
C 60 6 6,179±2,12
H 30 8 2,234±1,348
H 60 6 4,894±1,198
F 30 8 3,654±1,771
F 60 6 3,766±1,17
73
C30 C60 H30 H60 F30 F600
2
4
6
8
10m
g/dL
Figura 10 - Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da concentração
de Creatinina (mg/dl) segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, nos grupos C e tratados F e H, pode-se verificar
que:
O grupo C30 (6,83±3,22 mg/dl) apresentou concentração
de creatinina diferente do grupo C60 (6,18±2,12 mg/dl). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,43; gl = 10; p=0,673> 0.05).
O grupo F30 (3,65±1,77 mg/dl) apresentou concentração
de creatinina diferente do grupo F60 (3,77±1,18 mg/dl). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,14; gl = 11; p=0,889>0,05).
O grupo H30 (2,23±1,35 mg/dl) apresentou
concentração de creatinina menor que o grupo H60(4,89±1,20 mg/dl).
Essa diferença é estatisticamente significante segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 3,89; gl = 11; p=0,002< 0,05).
Uma análise comparativa na concentração de creatinina
entre os grupos C e tratados F e H, para o período de 30 e 60 dias foi
74
efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados para o período
de 30 dias estão na Tabela 20 e para o período de 60 dias na Tabela 22.
Tabela 20 - Resultados da ANOVA para o período de 30 dias, referentes aos dados da concentração de Creatinina nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F P
Tratamento 2 81,494 40,7472 8,42 0,0022*
Resíduo 20 96,809 4,8404
Total 22 178,303
*p<0,05
Pode-se verificar que a hipótese de igualdade (Ho) foi
rejeitada (p= 0,0022 < 0,05). Quando se aplica o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), podem-se verificar os efeitos dos tratamentos
neste período. Tabela 21.
Tabela 21 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%), no período de 30 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos tratamentos, para a concentração de creatinina
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 6,8273 A
F 3,6535 B
H 2,2343 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
75
Com a informação apresentada na Tabela 21, verifica-se
que no período de 60 dias, no grupo C a concentração de creatinina é
maior em relação aos demais grupos. Esta diferença é estatisticamente
significante. A maior média é aquela estabelecida pelo grupo C. Essa
diferença é estatisticamente significante.
Tabela 22 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias,
referentes aos dados da concentração de creatinina nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 17,4874 8,74371 3,59 0,049*
Resíduo 15 36,5806 2,43871
Total 17 54,0680
*p<0,05
Pode-se verificar que a hipótese de igualdade (Ho) foi
rejeitada (p= 0,049 < 0,05). Quando se aplica o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), podem-se verificar os efeitos dos tratamentos
neste período conforme a Tabela 23.
76
Tabela 23 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%), no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos tratamentos para a concentração de.creatinina
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 6,1788 A
H 4,8942 A B
F 3,7662 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
A maior média é aquela estabelecida pelo grupo C e a
menor média é aquela estabelecida pelo grupo F, no período de 60 dias.
Essa diferença é estatisticamente significante. O grupo H ocupa posição
intermediária.
5.2 Peso corporal
Os valores dos pesos dos animais foram transformados
em porcentagem de ganho de peso, conforme explicado em materiais e
métodos.
Esses dados foram submetidos à análise descritiva,
cujos resultados podem ser observados na Tabela 24 e Figura 11.
77
Tabela 24 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da porcentagem de ganho de peso nos animais do grupo controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp) %
C 30 8 3,77±6,73
C 60 6 16,24±5,53
H 30 7 3,18±6,19
H 60 6 6,87±2,51
F 30 8 -0,589±10,82
F 60 6 8,25±6,66
C30 C60 H30 H60 F30 F60-5
0
5
10
15
20
%
Figura 11 - Gráfico de colunas (Média ± desvio padrão) dos valores de porcentagem
de ganho de peso dos animais segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
78
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias, na porcentagem de ganho de peso, nos grupos
C e tratados F e H, pode-se verificar que:
O grupo C60 (16,24 ± 5,53 %) supera o grupo C30 (3,77
± 6,73 %). Essa diferença é estatisticamente significante segundo o teste t
(Student) de amostras independentes (t =3,80; gl = 11; p=0,003<0.05).
O grupo F60 (8,25±6,66 %) difere do grupo F30 (-
0,589±10,82 %). Essa diferença é estatisticamente não significante
segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 1,88; gl = 11;
p=0,086>0,05).
O grupo H60 (6,87±2,51 %) difere do grupo H30
(3,18±6,19 %). Essa diferença é estatisticamente não significante
segundo o teste t (Student) de amostras independentes (t = 1,44; gl = 8;
p=0,187>0,05).
Uma análise comparativa da porcentagem de ganho de
peso entre os 3 grupos para o período de 30 e 60 dias foi efetuada por
meio do teste ANOVA 1 fator. Os resultados para o período de 30 dias
estão na Tabela 25 e para o período de 60 dias na Tabela 26.
Tabela 25 - Resultados da ANOVA referentes aos dados de porcentagem de ganho de peso no período de 30 dias nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 88,48 44,2384 0,65 0,5340
Resíduo 20 1366,61
Total 22 1455,09
79
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os três medicamentos,
C(3,77±6,73), F(-0,589±10,82) e H(3,18±6,19).
Tabela 26 - Resultados da ANOVA referentes aos dados de porcentagem de ganho de peso no período de 60 dias nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 306,997 153,498 5,67 0,0147*
Resíduo 15 406,259 27,084
Total 17 713,256
*p<0,05
Pode-se verificar que a hipótese de igualdade (Ho) foi
rejeitada (p= 0,0147 < 0,05). Quando se aplica o teste de comparação
múltipla de Tukey (5%), podem-se verificar os efeitos dos tratamentos
neste período conforme a Tabela 27.
Tabela 27 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%), no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação à porcentagem de ganho de peso
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 16,238 A
F 8,2484 B
H 6,8694 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
80
A média de maior porcentagem de ganho de peso é
aquela estabelecida pelo grupo C. A diferença desta média para as
demais é estatisticamente significante.
5.3 Análises histológicas
5.3.1 Análises histomorfométricas
5.3.1.1 Focos de inflamação
Os dados obtidos através da análise histomorfométrica,
pela contagem dos focos de infiltrado inflamatório no fígado de cada um
dos animais foram submetidos à análise estatística descritiva e estão
representados na Tabela 28 e Figura 12.
81
Tabela 28 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da quantidade de focos inflamatórios no fígado dos animais, nos grupos controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp)
C 30 8 28,63±10,13
C 60 6 23,50±9,25
H 30 8 23,00±12,78
H 60 6 7,17±3,06
F 30 8 23,13±8,01
F 60 6 20,00±6,72
C30 C60 H30 H60 F30 F600
10
20
30
40
Foco
s de
Infla
maç
ão
Figura 12 - Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da contagem de
focos inflamatórios, segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
82
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias nos grupos controle e tratados, pode-se verificar
que:
O grupo C30 (28,63±10,13) apresentou quantidade de
focos inflamatórios diferente do grupo C60(23,50±9,25). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,99; gl = 11; p=0,346>0.05).
O grupo F60 (20,00±6,72) apresentou quantidade de
focos inflamatórios diferente do grupo F30 (23,13±8,01). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,79; gl = 11; p=0,445>0,05).
O grupo H60 (7,17±3,06) apresentou quantidade menor
de focos inflamatórios em relação ao grupo H30 (23,00±12,78). Essa
diferença é estatisticamente significante segundo o teste t (Student) de
amostras independentes (t = 3,38; gl = 8; p=0,010<0,05).
Uma análise comparativa da quantidade de focos
inflamatórios entre os grupos controle, homeopático e fitoterápico para o
período de 30 e 60 dias foi efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os
resultados para o período de 30 dias estão na Tabela 29 e para o período
de 60 dias na Tabela 30.
Tabela 29 - Resultados da ANOVA referentes aos dados da quantidade de focos inflamatórios no período de 30 dias nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Tratamento 2 165,08 82,542 0,75 0,4845
Resíduo 21 2310,75 110,036
Total 23 2475,83
83
No período de 30 dias, através da ANOVA, não foi
possível rejeitar a hipótese de igualdade (Ho) entre os grupos controle
C(28,63±10,13), fitoterápico F(23,13±8,01) e homeopático
H(23,00±12,78).
Tabela 30 - Resultados da ANOVA 1 fator referentes aos dados da quantidade de focos inflamatórios no período de 60 dias nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F P
Medicamento 2 887,44 443,722 9,5 0,0022
Resíduo 15 700,33 46,689
Total 17 1587,78
*p<0,05
No período de 60 dias, verifica-se que a hipótese de
igualdade (Ho) entre os grupos C (23,50±9,25), H (7,17±3,06) e F
(20,00±6,72) foi rejeitada (p= 0,0022< 0,05). Quando se aplica o teste de
comparação múltipla de Tukey (5%), observam-se os efeitos dos
tratamentos neste período conforme a Tabela 31.
84
Tabela 31 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%) no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação aos focos de infiltrado inflamatório.
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
C 23,500 A
F 20,000 A
H 7,1667 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
Através dos resultados estatísticos apresentados na
Tabela 21, verifica-se que o grupo H60 foi menor em relação aos demais.
Essa diferença foi estatisticamente significante.
5.3.1.2 Focos de fibrose
Os dados obtidos através da análise histomorfométrica,
pela contagem dos focos de fibrose no fígado de cada um dos animais
foram submetidos à análise estatística descritiva e estão representados
na Tabela 32 e Figura 13.
85
Tabela 32 - Medida de tendência central (média) e de dispersão (desvio padrão) dos valores da quantidade de focos de fibrose no fígado dos animais, nos grupos controle, homeopático e fitoterápico segundo o período de avaliação
Tratamento Tempo (dias) n (m±dp)
C 30 8 0,375±1,061
C 60 6 0,333±0,516
H 30 8 0,500±0,756
H 60 6 0,000±0,000
F 30 8 2,625±2,504
F 60 6 2,670±2,80
C30 C60 H30 H60 F30 F600
1
2
3
4
5
Fibr
ose
Figura 13 - Gráfico de colunas (média ± desvio padrão) dos valores da contagem de
fibrose, segundo as 6 condições experimentais estabelecidas pelas variáveis do estudo (período e medicamento).
86
Quando se avalia comparativamente a influência dos
períodos de 30 e 60 dias nos grupos C e tratados H e F, pode-se verificar
que:
O grupo C30 (0,375±1,061) apresentou quantidade de
focos de fibrose diferente do grupo C60 (0,333±0,516). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,10; gl = 10; p=0,925>0.05).
O grupo F60 (2,670±2,80) apresentou quantidade de
focos de fibrose diferente do grupo F30 (2,625±2,504). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 0,03; gl = 10; p=0,978>0,05)
O grupo H60 (0,00±0,00) apresentou quantidade de
focos de fibrose diferente do grupo H30 (0,500±0,756). Essa diferença é
estatisticamente não significante segundo o teste t (Student) de amostras
independentes (t = 1,87; gl = 7; p=0,104>0,05).
Uma análise comparativa da quantidade de focos de
fibrose entre os grupos controle, homeopático e fitoterápico para o
período de 30 e 60 dias foi efetuada por meio do teste ANOVA 1 fator. Os
resultados para o período de 30 dias estão na Tabela 33 e para o período
de 60 dias na Tabela 35.
Tabela 33 - Resultado da ANOVA referentes aos dados da fibrose no período de 30 dias nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 25,5833 12,7917 4,82 0,0190
Resíduo 21 55,7500 2,6548
Total 23 81,3333
*p<0,05
87
No período de 30 dias, verifica-se que a hipótese de
igualdade (Ho) entre os grupos C (0,375±1,061), H (0,500±0,756) e F
(2,625±2,504) foi rejeitada (p= 0,0190< 0,05). Quando se aplica o teste de
comparação múltipla de Tukey (5%), observam-se os efeitos dos
tratamentos neste período conforme a Tabela 34.
Tabela 34 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%) no período de 30 dias. Formação de grupos homogêneos em relação à fibrose
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
F 2,6250 A
H 0,5000 B
C 0,3750 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
Através dos resultados estatísticos apresentados na
Tabela 34, verifica-se que no período de 30 dias, o grupo F apresentou
maior quantidade de fibrose em relação aos demais. Essa diferença foi
estatisticamente significante.
Tabela 35 - Resultados da ANOVA para o período de 60 dias, referentes aos dados da fibrose nos grupos H, C e F
Efeito gl SQ QM F p
Medicamento 2 25,3333 12,6667 4,67 0,0265
Resíduo 15 40,6667 2,7111
Total 17 66,0000
*p<0,05
88
No período de 60 dias, verifica-se que a hipótese de
igualdade (Ho) entre os grupos C (0,333±0,516), H (0,000±0,000) e F
(2,670±2,80) foi rejeitada (p= 0,0265< 0,05). Quando se aplica o teste de
comparação múltipla de Tukey (5%), observa-se os efeitos dos
tratamentos neste período conforme a Tabela 36.
Tabela 36 - Resultados do teste de comparação múltipla de Tukey (5%) no período de 60 dias. Formação de grupos homogêneos em relação à fibrose
Tratamento Média Grupos Homogêneos*
F 2,6667 A
C 0,3333 A B
H 0,000 B
*conjuntos que apresentam letras iguais indicam diferença não estatisticamente significante
Através dos resultados estatísticos apresentados na
Tabela 36, verifica-se que no período de 60 dias, o grupo F apresentou
maior quantidade de fibrose em relação ao grupo H. Essa diferença foi
estatisticamente significante. E o grupo C teve quantidade de focos de
fibrose intermediária entre os outros grupos.
89
5.3.2 Análise histológica descritiva
Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos do confrei no
fígado e nos rins dos ratos foram usadas como base as alterações citadas
na literatura por pesquisadores que estudaram os efeitos do confrei ou
dos AP isoladamente, como pode ser verificado no quadro apresentado
no apêndice A. Foram analisados aspectos indicativos de intoxicação
aguda e crônica como reação inflamatória e suas seqüelas e alterações
vasculares e circulatórias.
As alterações observadas foram semelhantes nos grupos
controle e tratados com as duas formulações de confrei, variando apenas
na quantidade ou intensidade dos itens avaliados. Os dados são descritos
a seguir.
5.3.2.1 Grupos controle de 30 e 60 dias: análise histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos
acúmulos de leucócitos, que na grande maioria dos casos eram de
células mononucleares, basicamente linfócitos. Raramente foram
observados alguns neutrófilos em meio ao foco inflamatório. Não foram
encontrados eosinófilos, macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os
focos inflamatórios (Figura 14) se localizaram nos espaços porta, em
áreas intralobulares ou na região centrolobular, por vezes atingindo a
parede da veia centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da
localização portal, seguida pela intralobular e depois pela centrolobular.
Aos 60 dias predominou a localização portal, seguida pela intralobular e
depois pela centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios em espaço
90
porta foi praticamente a mesma nos 30 e 60 dias, porém, a inflamação
nas outras localizações diminuiu sensivelmente.
A necrose de hepatócitos (Figura 15) isolados ocorreu
em pequena proporção, sendo 5 focos aos 30 dias e 1 foco aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos em grandes espaços porta
foi encontrada em 1 caso aos 30 dias e em 2 casos aos 60 dias.
A proliferação canalicular foi um achado pouco
consistente uma vez que só foi observado em grandes espaços porta,
como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e não
foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos
inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 3 animais e aos 60 dias em
5 animais.
A fibrose foi observada em apenas um foco em um
animal aos 30 dias, como delicada radiação que se estendia a partir de
uma veia centrolobular. Aos 60 dias foi observado um discreto aumento
das fibras colágenas em um espaço porta de 1 animal e em um foco
intralobular de outro animal.
Entre as alterações vasculares foi observado congestão
discreta em região centrolobular em várias áreas em 1 animal aos 30 dias
e em 2 animais aos 60 dias. Não foram encontradas lesões endoteliais,
áreas de hemorragia, espessamento ou obliteração da luz de veia em
nenhum animal nos dois tempos experimentais. Um animal do grupo C60
exibia espessamento de parede em uma única artéria em um grande
espaço porta.
Degeneração vacuolar representada por discreta
quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados
difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os
animais. Esta alteração era mais evidente nas zonas periféricas
subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao
acaso ou em áreas centro lobulares.
91
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em
nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam
presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente
próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de
destaque.
5.3.2.2 Grupos controle de 30 e 60 dias: análise histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas
de nota. Não foram encontrados focos de inflamação ou de fibrose,
congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes
vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos
contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos
experimentais.
5.3.2.3 Grupos tratados com confrei homeopático de 30 e 60 dias: análise
histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos
acúmulos de leucócitos, que eram de células mononucleares,
basicamente linfócitos. Não foram observados no foco inflamatório
neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os
focos inflamatórios se localizaram principalmente nos espaços porta, e
por vezes em áreas intralobulares ou na região centrolobular e na parede
da veia centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da localização em
espaço porta, com cerca de 50% dos focos, seguida pela localização
intralobular e pela centrolobular. Aos 60 dias predominou a localização
92
portal, com cerca de 2 terços dos focos, seguida pela intralobular e depois
pela centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios foi maior aos 30
dias que aos 60 dias, sendo que em espaço porta foi 3,7 vezes maior e
nas outras localizações foi 6 vezes maior, evidenciando que a intensidade
de inflamação diminuiu sensivelmente com o tempo.
A necrose de hepatócitos isolados ocorreu em pequena
proporção, sendo 4 focos aos 30 dias e nenhum foco aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos (Figura 19) em grandes
espaços porta foi encontrada em 3 casos aos 60 dias e em nenhum caso
aos 30 dias.
A proliferação canalicular aqui também foi um achado
pouco consistente uma vez que só foi observado em grandes espaços
porta, como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e
não foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos
inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 10 animais e aos 60 dias em
3 animais.
A fibrose aos 30 dias foi observada em apenas 3
animais, somando um total de 4 focos, como delicada radiação que se
estendia a partir de 2 veias centrolobulares ou como delicada trama em
dois pequenos focos intralobulares. Aos 60 dias não foi observado
nenhum foco de fibrose nos animais.
Aos 30 dias, entre as alterações vasculares foi
observada congestão discreta, na região centrolobular, somando um total
de 5 áreas em dois animais. Também foram encontradas 8 áreas de
hemorragia discreta, aparentemente associadas com pequenas lesões
endoteliais focais. Não foi observada congestão, hemorragia ou lesão
endotelial aos 60 dias, nem espessamento ou obliteração da luz de veia
em nenhum animal nos dois tempos experimentais.
Degeneração vacuolar (Figura 17) representada por
discreta quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados
difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os
93
animais. Esta alteração foi mais evidente nas zonas periféricas
subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao
acaso ou em áreas centro lobulares. Em cerca de metade dos animais a
vacuolização foi de intensidade moderada na região periférica.
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em
nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam
presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente
próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de
destaque.
5.3.2.4 Grupos tratados com confrei homeopático de 30 e 60 dias: análise
histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas
de nota. Não foram encontrados focos de inflamação ou de fibrose,
congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes
vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos
contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos
experimentais.
5.3.2.5 Grupos tratados com confrei fitoterápico de 30 e 60 dias: análise
histológica do fígado
As alterações inflamatórias consistiram de pequenos
acúmulos de leucócitos, que eram de células mononucleares,
basicamente linfócitos. Assim como no tratamento homeopático, não
foram observados no foco inflamatório neutrófilos, eosinófilos,
94
macrófagos, plasmócitos ou células gigantes. Os focos inflamatórios se
localizaram principalmente nos espaços porta e por vezes em áreas
intralobulares ou na região centrolobular e na parede da veia
centrolobular. Aos 30 dias houve predomínio da localização em espaço
porta, com cerca de 50% dos focos, seguida pela localização intralobular
e pela centrolobular. Aos 60 dias predominou a localização portal, com
cerca de 75% dos focos, seguida pela intralobular e depois pela
centrolobular. A quantidade de focos inflamatórios foi maior aos 30 dias
que aos 60 dias, sendo que em espaço porta foi 1,3 vezes maior, na
região intralobular foi 2 vezes maior e na área centrolobular foi 4 vezes
maior. A intensidade de inflamação diminuiu sensivelmente com o tempo,
principalmente fora do espaço porta.
A necrose de hepatócitos isolados ocorreu em pequena
proporção, sendo 5 focos aos 30 dias e 3 focos aos 60 dias.
A dilatação de vasos linfáticos em grandes espaços porta
foi encontrada em 3 casos aos 30 dias e em 4 casos aos 60 dias.
A proliferação canalicular foi observada em grandes
espaços porta, como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto
maior, e não foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a
focos inflamatórios. Aos 30 dias foram notados em 9 focos e aos 60 dias
em11 focos.
A fibrose (Figura 16 b) aos 30 dias foi observada em
todos os animais, somando um total de 22 focos, sendo 1 em espaço
porta, 16 em região centrolobular e 5 em áreas intralobulares. Os focos
consistiam em fibrose delicada com radiação que se estendia a partir de
veias centrolobulares ou de delicada trama focal envolvendo alguns
hepatócitos em áreas intralobulares. Aos 60 dias foi observada fibrose em
2 terços dos animais, distribuídas de modo semelhante nas diversas
localizações.
Aos 30 dias, entre as alterações vasculares foi
observada congestão discreta (Figura 16 a), na região centrolobular, em
95
75% dos animais, somando um total de 25 áreas nos seis animais.
Também foram encontradas 2 áreas de hemorragia intralobular discreta
em dois ratos. Aos 60 dias foi encontrada congestão discreta em todos os
ratos e um foco de hemorragia. O espessamento de parede de artéria
(Figura 19) em grandes espaços porta foi observado em 13% dos animais
aos 30 dias e em 50% dos animais aos 60 dias. Lesão endotelial ou veias
com espessamento de parede ou obliteração da luz não ocorreu em
nenhum animal nos dois tempos experimentais.
Degeneração vacuolar representada por discreta
quantidade de vacúolos pequenos mal delimitados e espalhados
difusamente no citoplasma dos hepatócitos foi encontrada em todos os
animais. Esta alteração foi mais evidente nas zonas periféricas
subcapsulares do fígado, porém também ocorreu em focos distribuídos ao
acaso ou em áreas centro lobulares. Em um terço dos animais a
vacuolização foi de intensidade moderada.
Vacúolos intranucleares não foram encontrados em
nenhum rato. Os hepatócitos hipertrofiados (megalócitos) estavam
presentes em quase todos os ratos, distribuídos ao acaso, geralmente
próximos a focos de inflamação, mas, não constituíram um achado de
destaque.
5.3.2.6 Grupos tratados com confrei fitoterápico de 30 e 60 dias: análise
histológica do rim
Os rins não apresentaram alterações histológicas dignas
de nota (Figura 18). Não foram encontrados focos de inflamação ou de
fibrose, congestão ou áreas de hemorragia, nem alterações em paredes
vasculares. Pequenas áreas de vacuolização discreta em alguns túbulos
contornados foram observadas em alguns animais nos dois períodos
experimentais.
96
Figura 14 - Alterações inflamatórias no fígado. a) inflamação crônica ao redor de
veia centrolobular. Grupo F, 60 dias, HE 200X b) região centrolobular mostrando inflamação destruindo parte da parede da veia e provocando um foco de hemorragia. Grupo F, 60 dias, HE 400X.
aa
b
97
Figura 15 - Alterações inflamatórias no fígado. a) focos de inflamação crônica na
parede de veias centrolobulares se difundindo para áreas intralobulares, grupo F, 60 dias. HE 400X. b) foco em região intralobular ao redor de hepatócito necrosado, grupo F, 30 dias. HE 400X.
a
b
98
Figura 16 - Alterações microscópicas no fígado. a) congestão na região
centrolobular, grupo C, 30 dias. HE 400X. b) região centrolobular, com congestão, focos de inflamação na parede de veia centrolobular e fibrose discreta se irradiando em direção aos hepatócitos, grupo F, 30 dias. Tricrômico de Mallory 400X.
b
a
99
Figura 17 - Alterações microscópicas. a) Degeneração vacuolar em fígado na região
periférica subcapsular, grupo H, 30 dias. HE 400X. b) Degeneração vacuolar na região centrolobular, grupo C, 30 dias. Tricrômico de Mallory 400X.
b
a
100
Figura 18 - Alterações microscópicas. a) rim exibindo túbulos normais na região
medular, grupo F, 30 dias. b) cortical renal exibindo glomérulos e túbulos contorcidos normais, grupo F, 60 dias. HE 400X.
b
a
101
Figura 19 - Alterações em espaço porta. Artéria com espessamento de parede,
proliferação de canalículos biliares, dilatação de vasos linfáticos e inflamação crônica, grupo H, 60 dias. a) HE 200X . b) Tricrômico de Mallory 200X.
b
a
102
6 DISCUSSÃO
As enzimas, catalisadores orgânicos que são
responsáveis pela maioria das reações químicas do corpo, são
encontradas em todos os tecidos. Algumas são identificadas no plasma
ou no soro e a mensuração de sua taxa sanguínea pode indicar um
estado de normalidade ou de dano celular (Pincus et al., 1995).
A FA trata-se não de uma enzima, mas de uma família de
enzimas, produzida em vários tecidos incluindo ossos, fígado, rins,
intestino, pulmões, placenta, leito vascular, neutrófilos e linfócitos T
ativados e é encontrada normalmente no sangue de pessoas sadias
(Alves e Arruti, 2008; Motta, 1989).
Podem-se observar valores diminuídos da atividade da FA
no hipotiroidismo do adulto ou no cretinismo e também no escorbuto. A
taxa de FA pode aumentar em casos de lesões hepáticas como fibrose,
cirrose, obstrução biliar (colelitíase), hepatocarcinoma e metástases
(Motta, 1989). Também aumenta sempre que aumente a atividade de
osteoblastos, em situações como na fase de consolidação óssea de
fraturas, durante o período de crescimento em crianças e jovens e em
situações que resultem em alterações na remodelação óssea em doenças
como a osteomalácia, a Doença de Paget e o câncer ósseo primário ou
secundário (mieloma múltiplo, sarcomas, metástases) (Gorina, 1984).
Valores aumentados de FA são observados em muitas
outras doenças como raquitismo renal, insuficiência renal crônica,
diabetes mellitus, septicemia, colite ulcerativa ou outras doenças
intestinais inflamatórias, tireotoxicose, hiperparatiroidismo, má absorção
intestinal de vitamina D, infartos do miocárdio, pulmonares e renais e
algumas doenças autoimunes. Também é observado um aumento
discreto, considerado fisiológico, na ingestão aumentada de gorduras e na
gestação normal (Jorge, 2006).
103
Segundo Nobre et al. (2004), nos animais em que foi
dosada a fosfatase alcalina houve um aumento marcante da mesma. Esta
enzima apesar de não ser hepato-específica aumenta nos casos de
danos hepáticos em decorrência de sua liberação na superfície sinusoidal
dos hepatócitos, bem como na regurgitação das iso-enzimas biliares nos
casos de colestase. A intoxicação por alcalóides pirrolidizínicos (AP) pode
alterar a face sinusoidal dos hepatócitos e também provocar colestase.
Em nosso trabalho não foi observado aumento
significante da atividade enzimática da FA relacionado ao tratamento com
confrei, tanto na forma fitoterápica quanto na homeopática. Entretanto, foi
observado um aumento da atividade no período de 60 dias em relação ao
de 30 dias, em todos os grupos, inclusive nos grupos controle.
Julgando-se pela idade dos animais na época do sacrifício
(4 e 5 meses de idade) pode se aventar uma influência discreta na
atividade enzimática da FA devido aos animais estarem em fase de
crescimento ósseo e do organismo como um todo. Também não se pode
concluir que indica a presença de alterações hepáticas causadas
especificamente pelo confrei, uma vez que ocorreu também no grupo
controle. Esta variação deve refletir outras alterações teciduais às quais
todos os animais estiveram sujeitos ao longo do experimento e que
aumentaram com o tempo de exposição. Alguns autores relatam aumento
de FA em situações de inflamação intestinal, como a retocolite ulcerativa
e a Doença de Crohn (Jorge , 2006). No entanto, não foram avaliadas
neste trabalho alterações inflamatórias no trato gastrointestinal, lesões
consecutivas ao uso repetitivo de gavagem ou lesões associadas ao
estresse da manipulação diária.
A atividade das aminotransferases tem sido usada como
indicadora de danos hepatocelulares desde 1955. A ALT é encontrada no
fígado e catalisa a transferência do grupo amino da alanina,
permanecendo o ácido pirúvico (Pincus et al., 1995).
104
A atividade da ALT é significativamente elevada em uma
variedade de alterações hepáticas incluindo infecções virais, cirrose,
esteatose não alcoólica e toxicidade por drogas. Entretanto, também há
relatos de casos em que a ALT não se encontra aumentada em alguns
pacientes com doenças hepáticas histologicamente confirmadas como
cirrose, esteatose não alcoólica ou hepatite C (Yang et al., 2009).
O aumento da atividade da ALT sérica também pode ser
observado em condições não associadas a danos hepáticos como
doenças musculares e doença celíaca e também pode aparecer em
pessoas aparentemente saudáveis (Yang et al., 2009).
Na avaliação de toxicidade por drogas há alguns
exemplos em que a elevação de ALT sérica em roedores ocorreu mesmo
na ausência de danos histológicos ao fígado (Yang et al., 2009).
Em nosso trabalho observamos que houve diferença
significante na atividade enzimática de ALT no período de 30 dias quando
C60 foi menor que C30 e no período de 60 dias quando o grupo F60 foi
maior que C60. O tratamento homeopático levou a aumento discreto não
significante de 30 para 60 dias. Estes dados podem sugerir, em nosso
modelo experimental, uma lesão hepática discreta e crescente
dependente do tempo e do tipo de tratamento. Nessas condições o
aumento da permeabilidade da membrana plasmática hepática permite o
extravasamento da enzima do meio intracelular para o plasma sanguíneo.
A enzima AST, que catalisa a transaminação de L-
aspartato e alfa-cetoglutarato em oxalacetato e glutamato, é encontrada
em quase todos os tecidos, logo, a atividade sérica da AST não é
específica para nenhum tecido, porém o músculo e o fígado podem ser
considerados suas maiores fontes (Silva et al., 2007).
A AST está elevada nas doenças que envolvem os
tecidos que são ricos nesta enzima, sendo estes o coração, fígado,
músculo esquelético, rins, cérebro, pâncreas, baço e pulmões. Observa-
se diminuição da AST durante a gravidez e aumento durante o infarto do
105
miocárdio, hepatite aguda (viral ou tóxica), cirrose, congestão hepática e
icterícia obstrutiva entre outras doenças. Apesar de a enzima AST
apresentar grande atividade no infarto do miocárdio, existe outras
enzimas que são indicadores suficientes e confiáveis de necrose
miocárdica, tornando o uso da AST redundante (Pincus et al., 1995).
Oitenta por cento da AST dos hepatócitos está nas
mitocôndrias. Teoricamente, no dano hepatocelular leve, quando a
membrana plasmática do hepatócito está danificada, mais AST e ALT
citoplasmático são liberados no soro. Com dano hepatocelular mais
grave, os danos mitocondriais causam a liberação da AST mitocondrial,
elevando a atividade catalítica da AST. Assim, a AST é usada para
monitorar a terapia com drogas potencialmente hepatotóxicas; um
resultado acima de três vezes o limite superior normal deverá sinalizar o
término da terapia (Pincus et al., 1995).
Em nossos resultados não foi observada diferença
estatisticamente significante entre o grupo controle e os grupos tratados
aos 30 ou aos 60 dias. Em relação a cada tratamento, individualmente, foi
observado que a atividade enzimática de AST no grupo controle diminuiu
discretamente aos 60 dias e que aumentou discretamente nos grupos
tratados. Porém, só houve diferença significante entre os grupos H30 e
H60. Estes dados parecem não demonstrar toxicidade hepática associada
ao uso do confrei fitoterápico em nosso modelo experimental. A pequena
diferença observada com o tratamento homeopático pode estar
relacionada à ação da medicação homeopática no fígado ou em algum
outro tecido não identificado pela nossa metodologia. A literatura científica
atual não sugere os mecanismos de ação do confrei homeopático o que
dificulta nossa discussão sobre os achados.
A enzima GGT está presente na membrana celular e nas
frações microssomais e pode estar envolvida no transporte de aminoácido
através das membranas celulares e no metabolismo da glutationa. Os
rins, o fígado e o pâncreas são ricos em GGT. O principal valor clínico da
106
medida de GGT está no estudo de doença hepatobiliar (Pincus et al.,
1995).
A atividade desta enzima aumenta no soro de pacientes
com lesões hepatobiliares, nas hepatites virais agudas e na hepatite
alcoólica, assim como nas hepatites crônicas e na obstrução biliar. Esta
enzima é particularmente interessante no reconhecimento das metástases
hepáticas de uma neoplasia e constitui a enzima de maior sensibilidade
como teste de triagem de distúrbio hepático (Gorina, 1984).
Bondan (2006), que estudou bovinos intoxicados por
Senécio, observou que a atividade das enzimas AST e GGT no soro foi
significativamente maior no grupo intoxicado por Senécio quando
comparadas ao grupo controle.
Segundo Nobre et al. (2004), GGT é um bom marcador
para doença subclínica nos equinos. A elevação dos níveis séricos de
GGT tem um alto grau de especificidade para danos hepáticos. A GGT
normalmente está limitada ao retículo endoplasmático liso, onde o
sistema de oxidase mista é ativo. Os AP são ativados por este sistema,
causando danos e levando a liberação da GGT no soro.
No presente trabalho não houve diferença
estatisticamente significante em cada grupo C, F e H entre os períodos de
30 e 60 dias. Entretanto, no período de 30 dias o grupo C apresentou
atividade enzimática estatisticamente maior em relação ao grupo H,
enquanto o grupo F teve atividade enzimática intermediária. No período
de 60 dias, o grupo C também apresentou atividade enzimática maior que
os grupos H e F. O grupo controle apresentou atividade enzimática
sempre maior que os tratados.
A diminuição da atividade da GGT dos animais tratados
tanto com a formulação fitoterápica quanto com a homeopática nos
períodos de 30 e 60 dias, em relação aos respectivos controles ocorre,
possivelmente em função do decréscimo na sua síntese hepática, como
resultado da ação da planta inteira ou dos alcalóides no fígado. Talvez
107
tenham ocorrido outras alterações no metabolismo hepático, discretas e
fora do padrão das alterações tóxicas esperadas.
Não é possível explicar porque a medicação
homeopática diminuiu a atividade enzimática da GGT. Através da
manipulação farmacêutica da planta, em alta diluição, não seria esperado
presença tóxica ou perigosa de nenhum componente. Diversas
substâncias tóxicas e venenos são usados como medicamento
homeopático sem apresentar risco aos pacientes (Correa, 1997).
Um fato importante da intoxicação por AP presentes em
plantas é a ocorrência de lesão hepática progressiva, podendo se
observar os sinais clínicos da doença vários meses após a ingestão
(Nobre, 2004).
A uréia é o maior produto final do catabolismo de
aminoácidos e proteínas, e é gerada no fígado através do ciclo da uréia.
Do fígado, a uréia entra no sangue para ser distribuída a todos os fluidos
intracelulares e extracelulares, já que a uréia é livremente difundida
através da maioria das membranas celulares. A maior parte da uréia é
finalmente excretada pelos rins, porém quantidades mínimas são também
excretadas pela transpiração e degradadas por bactérias nos intestinos.
As concentrações séricas de uréia variam amplamente no indivíduo
saudável e são influenciadas por fatores diversos como a ingestão
dietária de proteínas e o estado de hidratação. As causas da azotemia
incluem desidratação, choque, volume sanguíneo diminuído e
insuficiência cardíaca congestiva. Uma causa adicional do aumento da
uréia sérica é o catabolismo protéico aumentado, por exemplo, como na
febre, estresse e queimaduras (Woo; Cannon, 1995).
Em nosso trabalho, foi observado que no grupo F a
concentração de uréia no período de 30 dias foi menor que em todos os
outros grupos. Este valor aumentou em F60, sendo estatisticamente
diferente. Não foi verificada diferença estatisticamente significante entre
os grupos C30, C60, F60, H30 e H60. Este resultado indica que o
108
tratamento com o fitoterápico exerceu uma ação importante aos 30 dias
que provocou a queda da uréia plasmática. É possível que tenha agido no
fígado prejudicando o ciclo de geração da uréia.
A uréia sempre está elevada na insuficiência renal, mas
não é um marcador confiável de função renal, pois sua elevação depende
muito da alimentação e do estado de hidratação do animal.
Neste estudo em função da ação da planta utilizada não
podemos descartar a possibilidade de uma insuficiência hepática com
diminuição na atividade metabólica do fígado, interferindo no ciclo da
uréia, ainda que discretamente.
A creatinina é um composto orgânico nitrogenado não
protéico formado irreversivelmente pela hidrólise não enzimática da
creatina liberada durante a defosforilação da creatina fosfato. Embora
muitos tecidos utilizem a creatina, o músculo esquelético é o principal
estoque (95%) de creatina e fosfocreatina corporal e dessa forma é o
principal sítio de produção de creatinina. Uma vez gerada, a creatinina
entra na circulação por difusão simples e é filtrada pelos rins, sendo
posteriormente excretada na urina (Heymsfield et al., 2005). Como a
produção de creatinina é relativamente constante, aumentos na
concentração plasmática desse composto indicam redução na excreção
renal. Ainda, tendo em vista que a concentração da creatinina plasmática
é influenciada por poucas variáveis extra-renais e não é reabsorvida pelos
túbulos renais, a sua concentração serve como melhor índice da taxa de
filtração glomerular que a uréia plasmática, sendo, portanto um indicador
mais sensível da capacidade funcional dos rins.
A origem endógena da creatinina é determinada pela
síntese de seu precursor, a creatina, no fígado e nos rins. A síntese da
creatina envolve duas reações sucessivas. A primeira reação, catalisada
pela enzima arginina:glicina amidinotransferase (AGAT), envolve os
aminoácidos arginina e glicina formando o ácido guanidinoacético,
processo que ocorre no rim. A segunda reação, que ocorre no fígado,
109
envolve a metilação do ácido guanidoacético catalisada pela enzima s-
adenosilmetionina:guanidinoacetato metiltransferase (GAMT), com a
participação do aminoácido metionina, formando a creatina (Rodwell,
1996). A creatina assim formada é então distribuída para diversos tecidos
do organismo, especialmente músculo, através do sangue (Figura 20).
A quantidade de creatinina plasmática é derivada,
praticamente em sua totalidade, da degradação da creatina e creatina
fosfato que estão presentes no tecido muscular. Sua produção é
proporcional à massa muscular total em indivíduos saudáveis (Devlin,
1998). Assim, a creatinina vem sendo usada para estimar o índice de
massa muscular esquelética ou massa corporal magra. Por este motivo,
em situações de atrofia muscular e outras enfermidades relacionadas,
ocorre diminuição do teor de creatinina plasmática (Lukaski, 2005).
110
Figura 20 - Esquema da formação da creatina endógena. (adapato de Rodwell, 1996)
Entre as causas da diminuição dos níveis de creatinina
no plasma são consideradas a hidratação excessiva, a insuficiência
hepática e algumas doenças musculares degenerativas (González, 2009).
A excreção de creatinina só é realizada por via renal,
uma vez que ela não é reabsorvida nem reaproveitada pelo organismo.
Por isso, os níveis de creatinina plasmática refletem a taxa de filtração
renal, de forma que níveis altos de creatinina indicam uma deficiência na
funcionalidade renal.
Entre as causas de aumento plasmático da creatinina,
devem ser consideradas a azotemia pré-renal por diminuição da perfusão
renal, como por exemplo na desidratação, a azotemia renal devido à
111
insuficiência renal, a azotemia pós-renal por obstrução do fluxo urinário ou
ruptura de bexiga ou simplesmente uma atividade muscular intensa ou
prolongada.
Na prática, a produção de creatinina é constante e muito
pouco afetada pelo aumento do catabolismo das proteínas tissulares e da
dieta.
Em nosso trabalho verifica-se uma diminuição na
concentração de creatinina plasmática nos grupos H e F (p = 0,0022) em
relação ao grupo C, no período experimental de 30 dias. Da mesma
forma, os grupos H60 e F60 apresentaram diminuição significativa (p =
0,049) em relação ao grupo controle. No período de 60 dias, verifica-se
que o grupo F teve menor concentração de creatinina que o grupo C,
estatisticamente significante, e que o grupo H também apresentou menor
concentração em relação ao C, porém esta diferença não foi
estatisticamente significante.
A creatinina é eliminada do plasma pela filtração
glomerular e não é reabsorvida nos túbulos em grau significativo,
portanto, é excretada na urina. A dosagem de creatinina no sangue é útil
na avaliação da função renal, pois o seu valor aumenta na medida em
que diminui a velocidade de filtração glomerular. Desta forma, quando a
creatinina encontra-se elevada no sangue pode-se inferir uma
insuficiência renal. Por outro lado, a diminuição dos níveis plasmáticos de
creatinina pode estar relacionada a um aumento na taxa de filtração
glomerular que aumenta a velocidade do fluxo urinário e
conseqüentemente eleva a excreção urinária de creatinina diminuindo a
sua concentração plasmática. O aumento do fluxo urinário pode ser
causado por uma diurese excessiva ou aumento na ingestão de água
(hidratação excessiva) pelos animais quando submetidos ao tratamento.
No entanto, como os animais tratados (F e H) nos
períodos de 30 e 60 dias não apresentaram variações significativas nos
níveis plasmáticos de uréia em relação ao controle, pode-se eliminar a
112
possibilidade de insuficiência renal, mesmo observando baixa creatinina
no sangue dos animais tratados.
Outra explicação para os valores diminuídos de
creatinina é a redução da massa muscular observada nos animais
tratados em nosso estudo. Animais intoxicados com AP apresentam entre
os sinais clínicos um quadro caracterizado por emagrecimento
progressivo.
Em relação ao peso corporal dos animais utilizados nesta
pesquisa, verificamos que apenas no grupo C houve aumento,
estatisticamente significante, da porcentagem de ganho de peso no
período de 60 dias em relação ao de 30 dias. Comparando o grupo
controle com os tratados, verifica-se que aos 60 dias os animais do grupo
C tiveram porcentagem de ganho de peso superior aos animais tratados
tanto com a formulação homeopática quanto a fitoterápica
Esses dados em relação à porcentagem de ganho de
peso dos animais podem explicar a maior concentração de creatinina nos
animais do grupo controle, uma vez que a creatinina é obtida através da
creatina, que é armazenada nos músculos.
Os valores de referência da creatinina variam com a
massa muscular, já que ela é derivada da creatina dos músculos.
(Kirsztajn, 2007). Portanto a maior concentração de creatinina no grupo C
seria devido à diminuição de creatina e fosfocreatina nos grupos tratados
e não à deficiência renal.
Valores diminuídos de creatinina também podem estar
relacionados com o decréscimo na síntese hepática de creatina. Neste
caso, uma insuficiência hepática causada pelos AP, presentes no extrato
administrado aos animais tratados pode diminuir a atividade da enzima
GAMT que promove a metilação do acido guanidoacético, diminuindo a
biosíntese de creatina a precursora da creatinina.
A análise histológica e histomorfométrica fornecem dados
mais seguros em relação às alterações que acontecem nos tecidos.
113
Segundo Barros et al. (2007), que estudaram em bovinos
o diagnóstico da intoxicação por Senecio brasiliensis, planta com alto teor
de AP, os testes laboratoriais da função hepática nem sempre são
indicadores confiáveis de animais subclinicamente afetados por AP. A
biopsia hepática de animais foi um método mais seguro para diagnóstico.
As principais lesões histopatológicas encontradas pelos autores,
localizadas no fígado de animais intoxicados por AP, consistiram de graus
varáveis de fibrose hepática, proliferação de ductos biliares e
hepatomegalocitose. Vacuolização do núcleo de hepatócitos,
acompanhada por marginação da cromatina para a periferia nuclear e
ocasionais pseudo-inclusões acidófilas intranucleares, também foram
observadas. Estes autores não encontraram perda de peso nos animais
(Barros et al., 2007).
Nobre et al., 2004, estudando a intoxicação por Crotalaria retusa em eqüinos, observaram perda de peso dos animais e anorexia
entre outros sinais clínicos. As principais lesões histopatológicas
observadas foram graus variados de fibrose, principalmente periportal,
megalocitose caracterizada pelo aumento do citoplasma e do núcleo dos
hepatócitos, cromatina nuclear distribuída irregularmente e proliferação de
células dos ductos biliares. Áreas multifocais de hemorragias
centrolobulares ou mediozonais foram também observadas. A maioria dos
cortes exibia infiltrado inflamatório, principalmente mononuclear, necrose
hemorrágica centrolobular, associada à congestão e hemorragias, que
coaleciam com áreas vizinhas em alguns cortes e vacuolização de
hepatócitos, principalmente os centrolobulares. Nos rins observaram
marcada congestão com focos de hemorragia preferencialmente na
medular, sendo mais acentuados em alguns eqüinos. Discreta
vacuolização no epitélio tubular, cilindros hialinos e megalocitose em
alguns eqüinos também foram observados.
Correa, et al. (2008) estudando a intoxicação por Senecio
brasiliensis em bovinos e observaram desorganização celular do
114
parênquima hepático com megalocitose, vacuolização, fibrose difusa e
moderada, especialmente evidente na região portal, colestase e
proliferação do ducto biliar. Os hepatócitos mostraram corpos de pseudo-
inclusão e núcleos vacuolados. Fibrose e oclusão da veia centrolobular,
regeneração micronodular de hepatócitos e necrose individual dos
hepatócitos foram também achados significantes, facilmente observados
na coloração de Tricrômico de Masson.
Bondan (2006), que estudou bovinos intoxicados por
Senécio, observou através da histopatologia do fígado de animais
intoxicados por AP a presença de danos nos hepatócitos, com fibrose e
hiperplasia de ductos biliares, hepatomegalocitose e variados graus de
colestase.
Torres (2003), que estudou lesões hepáticas de bovinos
intoxicados experimentalmente por Senecio brasiliensis observou figuras
de apoptose, necrose em células isoladas, esteatose microgoticular e
macrogoticular, inclusões hialinas intracitoplasmáticas e megalocitose. A
fibrose foi uma lesão constante em todos os animais, nas localizações
portal, centrolobular e pericelular. Alguns animais apresentaram DVO. O
infiltrado inflamatório portal e intralobular foram pouco significantes.
A análise histológica, em nosso trabalho, mostrou uma
hepatite crônica leve em todos os grupos (controles e tratados),
caracterizada pela presença de pequenos focos de infiltrado inflamatório
basicamente de linfócitos. A principal localização foi em espaço porta,
tanto aos 30 quanto aos 60 dias, em todos os grupos. As localizações
intralobulares e ao redor de veias centrolobulares variou de acordo com
os tratamentos e diminuiu aos 60 dias. Hepatócitos necrosados foram
observados apenas em alguns animais, tanto nos grupos controles como
nos tratados, associados a focos de inflamação.
A análise histomorfométrica mostrou maior quantidade de
focos inflamatórios no período de 30 dias em relação ao período de 60
dias em todos os grupos, porém apenas o grupo homeopático apresentou
115
diferença estatística entre os períodos (p=0,010). O grupo H no período
de 60 dias foi o grupo que apresentou menor quantidade de focos
inflamatórios (p=0,0022).
Pode-se aventar a possibilidade de que os animais
reagiram adequadamente ao agente agressor que causou essa
inflamação, uma vez que esta foi observada com maior intensidade no
período de 30 dias e diminuiu aos 60 dias.
Pode-se ainda relacionar a expressiva diminuição da
inflamação à ação do medicamento na formulação homeopática.
Vários trabalhos, relacionados com a intoxicação por AP
mostram que a inflamação não é uma característica dessa intoxicação
(Torres, 2003; Stickel, 2002).
Através destes resultados histomorfométricos pode-se
observar que a presença dos focos de infiltrado inflamatório parece não
ter relação com o tratamento com o confrei, tanto na formulação
fitoterápica como na homeopática, no período de 30 dias. É possível que
esteja associado a algum outro fator relacionado com nosso modelo
experimental, pois o grupo controle apresentou maior quantidade de focos
de inflamação em relação aos grupos tratados. Pode-se suspeitar da via
de administração ou de outras condições comuns a todos os animais.
Em relação à quantidade de focos de fibrose observou-se
presença significativamente maior no grupo F nos dois períodos
experimentais, o que coincide com a maioria dos trabalhos associados
com a intoxicação por AP.
Tanto no grupo F quanto nos demais grupos que
apresentaram fibrose, esta foi caracterizada por focos de fibrose delicada
com radiação que se estendia a partir de veias centrolobulares ou por
delicada trama focal envolvendo hepatócitos isolados em áreas
intralobulares. É importante ressaltar que no grupo tratado com
homeopatia nenhum animal apresentou fibrose aos 60 dias, exibindo
comportamento muito diferente do grupo tratado com fitoterápico. Embora
116
no confrei homeopático tenha se desenvolvido inflamação não ocorreram
seqüelas deste processo.
A DVO é uma obliteração não trombótica parcial ou total
de pequenos ramos venosos intra-hepáticos, por tecido conjuntivo frouxo
subendotelial (Gaotto, 2001; Stickel, 2005). Em nosso modelo
experimental não ocorreu DVO em nenhum animal. Apesar de este
achado ser citado na literatura, esta importante alteração foi relatada
quando se usou a planta em altas concentrações. (Magnabosco et al,
1997).
A proliferação canalicular foi um achado pouco
consistente uma vez que só foi observado em grandes espaços porta,
como presença de pequenos ductos ao redor de um ducto maior, e não
foi encontrado em regiões intralobulares ou associado a focos
inflamatórios como é observado na literatura.
A proliferação canalicular observada em nosso estudo
teve pouca expressão em comparação ao observado na literatura de
intoxicação por AP. Foi observada maior proliferação canalicular no
período de 60 dias em relação ao de 30 em todos os grupos, porém
somente alguns animais dos grupos apresentaram esta alteração,
constituindo assim um número muito pequeno para análise estatística.
Foi observada degeneração vacuolar em todos os animais
de todos os grupos. No grupo tratado com homeopatia esta alteração foi
mais intensa em alguns animais. No entanto, estes dados não parecem
ter relação com os medicamentos usados.
Os rins de todos os animais não apresentaram alterações
histológicas, confirmando a avaliação bioquímica que não evidenciou
alterações metabólicas neste órgão.
Quanto às alterações vasculares observamos congestão
discreta na região centrolobular em apenas alguns grupos. No grupo
controle ocorreu em 12,5% dos animais aos 30 dias e em 33% aos 60
dias. No grupo homeopático ocorreu em 25% dos animais aos 30 dias e
117
no fitoterápico em 75% aos 30 dias e em 100% aos 60 dias. Tais dados
estão de acordo com a literatura que também descreve congestão
centrolobular.
Apesar de não haver relato na literatura de alterações em
artérias foi encontrado em nosso material espessamento da parede de
artéria em espaço porta em 16,6% dos ratos do grupo C60, em 13% de
F30 e em 50% de F60. Tal achado histológico é sugestivo de lesão por
hipertensão, porém como foi encontrado apenas no exame microscópico
não foram realizados outros exames para verificação clínica deste
achado.
Em nosso trabalho, com nosso modelo experimental não
foram observados sinais de carcinogênese em nenhum dos animais.
Cabe ainda a consideração que o número da nossa
amostragem foi pequeno e que se faz necessária uma melhor
investigação destes achados com um “n” maior de animais que garantam
uma análise estatística mais consistente.
118
7 CONCLUSÃO
Conclui-se que, com a metodologia empregada :
a) O confrei na formulação homeopática e
fitoterápica apresentou efeitos de pouca intensidade
sobre o fígado comprovado pelas alterações
bioquímicas e histológicas.
b) As alterações no perfil bioquímico e no peso dos
animais sugerem alteração no metabolismo hepático
interferindo na síntese de proteínas.
c) A formulação fitoterápica provocou mais
alterações que a homeopática.
d) A análise microscópica foi compatível com o
desenvolvimento de hepatite crônica
e) A formulação homeopática interferiu
positivamente na diminuição da inflamação hepática
de acordo com o tempo.
f) Não foi observada DVO causada por AP em nosso
modelo experimental.
g) Não foram encontradas alterações carcinogênicas
em nosso modelo experimental.
h) Os animais do grupo controle também
apresentaram alterações inflamatórias, sugerindo
ação de outros fatores além do confrei.
i) Em relação aos períodos de 30 e 60 dias o perfil
bioquímico mostrou diferenças variáveis entre os
diversos grupos.
119
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128
APÊNDICE A - Quadro da análise histomorfométrica e histológica. FÍGADO INFLAMAÇÃO – pequenos focos de Espaço porta Centrolobular Intralobular Parede de veia
centrolobular Parede de veia hilar
Hilo
PROLIFERAÇÃO CANALICULAR Espaço porta Hilo Outros locais
FIBROSE Espaço porta Centrolobular Intralobular Hilo Parede de veia
centrolobular Parede de veia hilar
DEGENERAÇÃO VACUOLAR DE HEPATÓCITOS Periférica Periportal Centrolobular Focos
aleatórios
HEMORRAGIA Hemorragia intralobular
Hemorragia espaço porta
Hemorragia hilo
Congestão Lesão endotélio
Dilatação de linfáticos
OUTROS Necrose de hepatócitos
Hepatócito hipertrofiado
Vacúolo intranuclear
Espessamento artéria espaço porta
Espessamento artéria hilo
RIM Inflamação Cortical Inflamação Medular Inflamação em
Glomérulos
Degeneração vacuolar em túbulos contornados
Degeneração vacuolar em túbulos excretores
Fibrose cortical Fibrose medular Lesão endotelial
129
APÊNDICE B - Dados originais de FA, ALT e AST Tabela 37 - Valores de FA, obtidos por espectrofotometria após
multiplicação pelo fator de calibração da FA C30 C60 H30 H60 F30 F60 22.725 26.664 21.998 25.270 18.301 31.997 17.635 33.633 26.725 35.209 34.966 30.967 17.574 33.088 20.180 41.875 21.877 35.209 17.877 24.301 42.238 28.785 18.968 27.755 18.301 37.875 33.330 35.512 22.786 25.937 29.149 31.815 14.847 44.359 19.453 32.360 20.483 16.726 29.209 20.483 26.119
Tabela 38 - Valores da ALT obtidos por espectrofotometria após multiplicação pelo fator de calibração da ALT
H30 F30 C30 H60 F60 C60 14.924 25.207 18.018 13.650 21.385 18.291 18.200 21.021 25.025 20.020 27.118 15.379 8.918 16.926 20.657 21.294 21.840 18.109 18.382 12.558 22.022 19.929 18.746 18.018 21.749 17.472 26.481 20.111 20.930 17.745 19.565 29.211 19.201 20.566 25.116 19.201 20.293 23.296 25.025 12.740 20.930
Tabela 39 - Valores da AST obtidos por espectrofotometria após multiplicação pelo fator de calibração da AST
F30 F60 C30 C60 H30 H60 40.526 39.810 43.533 39.810 40.955 39.380 50.263 43.819 53.414 39.953 37.948 42.817 35.227 45.394 43.103 41.385 42.101 45.681 30.072 46.254 43.819 41.528 37.948 47.829 38.521 46.826 42.387 46.254 40.526 49.690 47.686 48.402 35.800 48.402 45.824 50.693 40.669 48.258 41.385 42.960 41.098
130
APÊNDICE C - Dados originais da GGT, Creatinina e Uréia. Tabela 40 - Valores de GGT obtidos por espectrofotometria após
multiplicação pelo fator de calibração da GGT H30 H60 C30 C60 F30 F60 26.443 36.059 50.081 45.674 30.449 33.655 29.648 43.270 54.488 51.684 31.251 41.668 32.052 46.075 57.694 64.104 32.052 43.270 37.260 50.482 59.697 93.752 39.664 54.088 50.883 59.697 86.140 103.768 48.078 54.488 59.296 66.508 104.970 106.974 52.485 74.120 72.918 58.896 17.228 88.944
Tabela 41 - Valores da uréia obtidos por espectrofotometria após multiplicação pelo fator de calibração da uréia
C30 C60 F30 F60 H30 H60 33.344 26.811 24.858 32.293 29.289 28.763 33.344 29.815 27.336 33.420 31.767 32.443 33.870 35.222 27.412 33.570 31.993 33.645 34.246 37.625 28.087 34.471 32.068 34.546 34.922 38.677 30.641 35.973 33.945 39.578 36.348 46.262 30.791 38.151 34.321 40.554 31.993 32.143 37.175 35.823 27.937
Tabela 42 - Valores da creatinina obtidos por espectrofotometria após
multiplicação pelo fator de calibração da creatinina
C30 C60 F30 F60 H30 H60 4.669 3.398 2.403 1.823 3.840 3.232 5.166 3.840 2.569 3.149 3.812 4.475 5.663 6.078 3.398 3.812 1.133 4.696 8.481 7.707 3.785 4.144 1.437 4.945 10.000 7.790 4.807 4.420 2.348 5.083 11.409 8.260 4.917 5.249 3.619 6.934 2.403 0.829 0.884 6.520 0.801
131
ANEXO – Certificado do comitê de ética em pesquisa animal.
132
Lima AP. Biochemical and histological analysis of Symphytum officinale renal and hepatic toxicity in rats treated with the plant phytotherapic and homeopathic formulations [dissertation]. São José dos Campos: School of Dentistry of São José dos Campos, UNESP - São Paulo State University; 2009.
ABSTRACT
Symphytum officinale (comfrey) is a plant used over thousands of years to treat bone fractures consolidation. There are reports of its use in natura, as phytotherapic and as homeopathic medication. Recent scientific reports described cases of human and animal intoxication, with development of severe hepatic lesions after consumption of this plant, associated with the presence of pyrrolizidine alkaloids. Because of these facts its internal use was prohibited. However, there are no reports of adverse effects of Symphytum officinale´s homeopathic formulation. The aim of this work was to compare the effects of Symphytum officinale used as phytotherapic and as homeopathic formulations, evaluating its hepatic and renal toxicity. Adult healthy rats (n=42) were divided in 3 groups according to treatment with Symphytum officinale 500mg/kg (F), Symphytum officinale 6CH 2 globules (H), and water as placebo for negative control (C), given daily orally by gavage to each animal. They were sacrificed 30 and 60 days after beginning of treatments. The toxicological evaluation was realized by biochemical analysis of the enzymatic activity of alkaline phosphatase (AF), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transferase (GGT) and of creatinine and urea plasmatic concentration. Histological and histomorphometric analysis of liver and kidney was also conducted. Data were submitted to statistical t (Student) and ANOVA 1 factor (5%) tests. Both biochemical and histological analysis showed mild hepatic alterations and no renal alterations. The modifications of the enzymatic activity, of urea and creatinine, and of rats’ weight suggested hepatic metabolic alterations interfering on protein synthesis. Histological analysis was compatible with chronic mild hepatitis with development of important fibrosis only in the F group. The phytotherapic formulation used was hepatotoxic and induced more alterations than the homeopathic one.
Keywords: Comfrey. Symphytum officinale. Homeopathy. Phytotherapy, Drug Toxicity
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