Londrina 2009

ANA PAULA ARTIMONTE

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES

PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE

Londrina 2009

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES

PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE

Dissertação apresentada à Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite. Orientador: Profª. Drª. Waleska Schwarcz

ANA PAULA ARTIMONTE

Londrina, 18 de Fevereiro de 2009.

Profª. Drª. Waleska Schwarcz Universidade Norte do Paraná

Profª. Drª. Cristiana M. Pedroso Yoshida Universidade UNICAMP

Prof. Dr. Luiz César da Silva Universidade Norte do Paraná

ANA PAULA ARTIMONTE

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES

PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE

Dissertação apresentada à UNOPAR - Universidade Norte do Paraná, no Centro de

Ciências Biológicas e da Saúde, como requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite, com nota final igual a _______, conferida

pela Banca Examinadora formada pelos professores: Drª. Waleska Schwarcz, Drª.

Cristiana M. Pedroso Yoshida, Dr. Luiz César da Silva.

Primeiramente agradeço a Deus por me guiar

e proteger em todas as etapas da minha vida.

Dedico esse trabalho aos meus queridos pais

Francy Araujo Hollanda e Joelcio Colombo

que em todos os momentos me apoiaram e

investiram em minha educação.

Ao meu namorado Marcelo Resquetti Tarifa,

que de forma especial e carinhosa me deu

força e coragem, me apoiando nos momentos

de dificuldades e compartilhando comigo as

ansiedades na busca da realização

profissional.

AGRADECIMENTOS

Á Profª. Orientadora Drª. Waleska Schwarcz, UNOPAR –

Universidade Norte do Paraná, agradeço pelo constante incentivo, sempre indicando

a direção a ser tomada nos momentos de maior dificuldade. Agradeço

principalmente, pela confiança depositada.

Aos professores Dr. Rafael Braga Gonçalves, Dr. Cláudio Lima

Aguiar, que contribuíram com seus preciosos ensinamentos.

Aos demais professores da Instituição UNOPAR – Universidade

Norte do Paraná, agradeço pelo aprendizado.

Ao Técnico Jorge Donato do Laboratório do Mestrado em Ciência e

Tecnologia do Leite da UNOPAR – Universidade Norte do Paraná pelo auxílio e

colaboração do trabalho.

As queridas estagiárias, Aline Guimarães, Karina Alves Andrioli e

Nathalia Leatti Maturana cuja participação foi fundamental para alcançar os

resultados aqui apresentados.

Aos meus colegas do Mestrado Ciência e Tecnologia do Leite da

UNOPAR – Universidade Norte do Paraná, pelas experiências vividas em sala de

aula que me motivaram para a realização deste trabalho.

Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança toda força de sua alma, todo o universo conspira a seu favor. Johann Wolfgang von Goethe.

ARTIMONTE, Ana Paula. Avaliação da atividade antimicrobiana da lactoferrina bovina e sua aplicação em filmes protéicos à base de soro de leite. 2008. 63. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite) Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2008.

RESUMO

Várias proteínas do soro de leite têm sido estudadas em detalhe recentemente devido ao seu grande potencial como proteínas antimicrobianas e sua possível aplicação em alimentos. Em particular a lactoferrina tem sido estudada, uma glicoproteína ligadora de ferro encontrada em diversas secreções. As embalagens para alimentos têm sido planejadas para proteger o produto, entretanto, as tecnologias envolvendo embalagens ativas visam o planejamento de interações desejáveis com o produto, aumentando ou monitorando sua vida - de - prateleira. O objetivo deste trabalho foi desenvolver filmes protéicos a base de soro de leite acrescidos de lactoferrina, e avaliar a atividade antimicrobiana destes filmes. Para isso, foram selecionadas três culturas de bactérias ATCC: Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus mirabilis. Inicialmente, foi realizado o teste de antibiograma por difusão em discos e ensaios de determinação do MIC da Lf para as bactérias testadas e a concentração mínima inibitória foi de 50 mg/ml. Entretanto a lactoferrina, nesta concentração não foi capaz de inibir totalmente o desenvolvimento dos microrganismos avaliados. Também foi determinado o MBC da Lf que revelou apenas atividade bacteriostática nas culturas testadas. Para o P. mirabilis a concentração de microrganismos obteve uma redução de 1,71 log, para E. coli de 1,74 log e para o S. aureus de 0,7 log. Os resultados obtidos nas curvas de crescimento, com ou sem lactoferrina, confirmaram os dados observados nos ensaios de determinação de MIC e MBC. O P. mirabilis foi o que se mostrou mais sensível ao tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais resistente. Na curva de crescimento com lactoferrina a fase lag para P. mirabilis e para E. coli foi estendida por duas horas e na fase log o crescimento das culturas foi menor sendo que para P. mirabilis a redução foi em média de 77% e para E. coli de 67%. Para o S. aureus não ocorreram alterações significativas no período de tempo na fase lag, entretanto, na fase log o microrganismo teve uma redução de 54% em seu crescimento. Os experimentos de atividade antimicrobiana demonstraram que o filme protéico a base do soro de leite acrescido de lactoferrina apresentou atividade antimicrobiana em todas as culturas avaliadas. O filme protéico sem adição de lactoferrina também foi capaz de inibir parcialmente o crescimento microbiano. Os resultados aqui apresentados confirmam o efeito antimicrobiano da lactoferrina. Desta forma, esta pesquisa demonstra a eficácia da produção de filmes comestíveis a base do soro de leite e sua atividade antimicrobiana testados em amostras de bactérias associadas à toxiinfecção alimentar.

Palavras-chave: Lactoferrina. Soro de Leite. Filmes Protéicos. Antimicrobiano.

ARTIMONTE, Ana Paula. Evaluation of Antimicrobial activity of bovine Lactoferrina end its applications in movies protein the basis of whey. 2008. 63. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite) Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2008.

ABSTRACT

Several milk whey proteins have been studied in detail recently due to its great potential as antimicrobial proteins and their possible application in food. In particular has been studied the lactoferrin, an iron binding glycoprotein found in various biological secretions. The food packing has been designed to protect the product, however, the active packaging has been developed to interact desirably with the product, increasing or checking its shelf life. The aim of this study was to develop whey proteins films containing lactoferrin, and evaluate the antimicrobial activity of these films. For this, were selected three ATCC cultures of bacteria: Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Proteus mirabilis. Initially, was performed the antibiogram obtained by discs diffusion method and tests to determine the MIC of Lf to the bacteria tested and the minimum inhibitory concentration was 50 mg / ml. However, the lactoferrin in this concentration was not able to completely inhibit the development of microorganisms evaluated. It was determined the MBC of Lf which showed only bacteriostatic activity in the tested cultures. For P. mirabilis the concentration of microorganisms obtained a reduction of 1.71 log for E. coli of 1.74 log and the S. aureus by 0.7 log. The results in growth curves, with or without lactoferrin, confirmed the data observed in determination tests of MIC and MBC. The P. mirabilis was more sensitive to treatment with lactoferrin and S.aureus was the most resistant. In the growth curve of lactoferrin with the lag phase for P. mirabilis and E. coli was extended by two hours and the log growth phase of cultures was lower and that for P. mirabilis the reduction was on average 77% and for E. coli at 67%. For S. aureus no significant changes occurred in the period of time in phase lag, however, at the microorganism has a log reduction of 54% in its growth. The experiments showed that antimicrobial activity of the whey protein film containing lactoferrin showed antimicrobial activity in all cultures studied. The film without the addition of lactoferrin protein was also able to partially inhibit the microbial growth. The results confirm the lactoferrin antimicrobial effect. Thus, this research demonstrates the production effectiveness of whey protein films and its antimicrobial activity tested in strains of bacteria associated with foodborne diseases.

Key-words: Lactoferrina, whey, Protein films, Antimicrobials.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 – Funções da lactoferrina 24

Figura 02 – Representação esquemática da estrutura 3D da lactoferrina

bovina 25

Figura 03 – Ilustração do antibiograma 37

Figura 04 – Análise do MIC e do MBC lactoferrina 38

Figura 05 – Fluxograma do preparo do filme protéico comestível 40

Figura 06 – Teste do antibiograma 43

Figura 07 – Filmes protéicos a base de soro de leite 49

Figura 08 – Avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes protéicos

a base de soro do leite 50

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 01 – Principais componentes do leite 20

Gráfico 02 – Atividade antimicrobiana da lactoferrina 44

Gráfico 03 – Ensaio de determinação do MIC 45

Gráfico 04 – Ensaio de determinação do MBC 46

Gráfico 05 – Curvas de crescimento bacteriano na presença e ausência de

Lactoferrina 47

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 – Principais características físico-químicas do leite 20

Tabela 02 – Principais componentes do leite 21

Tabela 03 – Porcentagem média das proteínas presentes no leite 22

Tabela 04 – Propriedades das proteínas do soro do leite 23

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS

Lf Lactoferrina

BSA Albumina do soro bovino

DBO Demanda biológica de oxigênio

α−La Alfa-lactalbumina

Ig Imunoglobulinas

MIC Concentração mínima inibitória

MBC Concentração mínima bactericida

ATCC “American Type Culture Collection”

blf Lactoferrina bovina

Lf Lactoferrina

apo-Lf

Lactoferrina não ligada a ferro

Kda

Kilo Dalton

pH

Potencial hidrogeniônico

MAPA

Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

LB Caldo Luria-Bertani

3D Tri dimensional

UFC Unidades formadoras de colônia

WPC Concentrado de soro protéico

WPI Isolado de soro protéico

PVC Policloreto cloreto de vinila

LPS Lipopolissacarídeos

DTA Doenças transmitidas por alimentos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 OBJETIVOS 17

2.1 OBJETIVO GERAL 17

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17

3 REFERENCIAL TEÓRICO 18

3.1 LEITE BOVINO 18

3.1.1 Cadeia Agroindustrial do Leite Bovino e a Importância de sua Produção 18

3.1.2 Generalidades do Leite Bovino 18

3.1.3 Composição do Leite Bovino 19

3.1.4 Proteínas Totais do Leite Bovino 21

3.1.4.1 Proteínas 22

3.1.5 Lactoferrina 24

.1.5.1 Atividade antimicrobiana da lactoferrina 26

3.2 EMBALAGENS ATIVAS 27

3.3 FILMES PROTÉICOS 28

3.3.1 Filmes Protéicos de Soro do Leite 30

3.4 TOXI-INFECÇÃO CAUSADA POR BACTÉRIAS 31

3.4.1 Cultura Bacteriana 33

3.4.1.1 Staphylococcus aureus 33

3.4.1.2 Proteus mirabilis 34

3.4.1.3 Escherichia coli 34

4 MATERIAL E MÉTODOS 36

4.1 REAGENTES 36

4.2 CULTURAS BACTERIANAS 36

4.3 CULTIVO BACTERIANO 36

4.4 LACTOFERRINA 36

4.5 ISOLADO DE SORO PROTÉICO 37

4.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA 37

4.7 ANÁLISE DO MIC E DO MBC LACTOFERRINA 38

4.8 CURVA DE CRESCIMENTO PADRÃO 39

4.9 FORMAÇÕES DOS FILMES 39

4.10 AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS FILMES PROTÉICOS NAS CULTURAS

BACTERIANAS 41

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 42

6 CONCLUSÃO 54

7 REFERÊNCIAS 55

14

1 INTRODUÇÃO

A conscientização crescente dos consumidores sobre a importância

de alimentos nutritivos motivou pesquisadores a concentrar boa parte de seus

esforços no estudo dos efeitos do soro de leite e de suas frações sobre a saúde.

Embora os produtos protéicos do soro possam ser usados apenas em razão de seus

valores nutricionais, suas aplicações como ingredientes funcionais são cada vez

mais importantes, o que motivou pesquisadores a concentrar boa parte de seus

esforços no estudo dos efeitos do soro e de suas frações sobre a saúde

(RICHARDS, 1997).

O soro do leite é obtido por meio da produção de queijos, uma vez

que o soro é um subproduto incontornável na produção de qualquer tipo de queijo.

Apesar de cerca de metade do soro produzido no mundo ser eliminado como

efluente nas terras ou em sistemas hídricos, resultando numa perda importante de

energia alimentar, bem como criando uma grande perda econômica, a outra metade

é processada em vários produtos alimentares ou rações (RODRIGUES & TEIXEIRA,

2007).

Muitos laticínios enfrentam um grande problema com relação ao

soro do leite. O principal problema associado á produção de queijo é o que fazer

com o soro gerado no processo. De modo geral, para a fabricação de 1 kg de queijo,

são necessários 10 L de leite, resultando em 9 kg de soro de leite como sub-produto

(ANTUNES, 2003).

O Brasil é um grande consumidor de queijo, nos últimos anos esse

consumo continua e tem crescido ainda mais. Juntamente com este aumento está

também a necessidade de criar novas alternativas para a utilização do soro. O

tratamento de efluentes é dispendioso e, sendo o soro rico em diversos

componentes utilizados em várias formulações de alimentos. Descartar o soro sem

um tratamento eficiente não é só um crime previsto por lei, mas é também rejeitar

um ingrediente que possui alta qualidade (RICHARDS, 2002; SANTOS &

FERREIRA, 2001).

O soro do leite é rico em diversos nutrientes, porém, é um potente

agente de poluição que pode provocar a destruição da flora e fauna devido a sua

alta demanda biológica de oxigênio (DBO) é a determinação da quantidade de

oxigênio dissolvida na água e utilizada pelos microorganismos na oxidação

15

bioquímica da matéria orgânica, que é cerca de 30.000 a 50.000 mg de oxigênio por

litro de soro, este valor é aproximadamente 100 vezes maior do que o de um esgoto

doméstico. Uma fábrica com produção média de 10.000 l de soro por dia polui o

equivalente a uma população de 5.000 habitantes, isto significa que para cada litro

de soro descartado nos efluentes, cerca de 30g a 50g de oxigênio dissolvido na

água desaparecerão (REDE AMBIENTE, 2007).

A maioria das indústrias de lacticínios não contempla ainda uma fase

de valorização de resíduos, especificamente das proteínas isoladas. Com o

desenvolvimento de tecnologias para a melhoria dos processos de industrialização

do leite, notou-se a possibilidade do aproveitamento industrial do soro no qual tem

despertado atenção de centros de pesquisas, indústrias e governos (RALPH, 1982).

Atualmente em nosso país, as proteínas do soro são empregadas

com grande sucesso na indústria de alimentos, porém com um papel coadjuvante

(SGARBIERI, 2004). Nos EUA, Europa e Pacífico Sul, este soro já é processado e

sua utilização em vários produtos derivados representa uma vantagem econômica

significativa para as indústrias de laticínios, em razão das propriedades nutricionais

e funcionais do soro e de seus componentes (HOMEM, 2003).

Em particular tem sido estudado detalhadamente o papel da

lactoferrina (proteína do soro do leite) devido ao seu grande potencial como proteína

antimicrobiana e para sua possível aplicação em alimentos (JELEN et al., 1998).

Muitas outras funções têm sido atribuídas para a lactoferrina tais como

imunomodulação, crescimento celular, função antitumoral, antioxidante e

antiinflamatório (WARD, URIBE-LUNA & CONNEELEY, 2002). Entretanto, a

concentração destes componentes no soro do leite é relativamente baixa o que

dificulta a pesquisa de suas aplicações funcionais.

Também tem sido estudada a aplicação das proteínas do soro de

leite no desenvolvimento de filmes protéicos comestíveis e biodegradáveis,

substituindo os filmes sintéticos na embalagem de alimentos. Os filmes comestíveis

têm um potencial promissor de crescimento na produção de alimentos, por exercer

diversas funções ainda relativamente pouco exploradas, como por exemplo, como

carreador de antimicrobianos. É importante conhecer e entender cada vez mais as

propriedades funcionais dos filmes em relação não apenas ao alimento, mas

também aos diversos fatores ambientais a que estarão expostos, o que indica a

16

necessidade de novas pesquisas sobre aspectos básicos e aplicações destes

compostos (MAIA et al., 2000).

Analisando a situação econômica e a tendência de ascensão da indústria de

laticínios nacional, tornam-se extremamente necessárias pesquisas que visem à

otimização do uso do soro do leite, uma vez que estes estudos terão um importante

impacto social e econômico.

17

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Esta dissertação teve como objetivo principal avaliar a atividade

antimicrobiana de filmes protéicos a base de soro de leite acrescido de lactoferrina.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Ø Formular filmes protéicos constituídos a base de soro de leite;

Ø Determinar a concentração específica com atividade antimicrobiana da

lactoferrina;

Ø Determinação dos parâmetros para a adição da lactoferrina nos filmes

protéicos a base de soro de leite;

Ø Caracterização da atividade antimicrobiana dos filmes protéicos a base de

soro de leite acrescido de lactoferrina.

18

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 LEITE BOVINO

3.1.1 Cadeia agroindustrial do leite bovino e a importância de sua produção

O Brasil é um dos maiores produtores de leite do mundo, ocupando

o sexto lugar no “rank” mundial. O leite é importante devido ao seu elevado valor

nutritivo. É um alimento essencial a algumas faixas da população, pela geração de

renda de centenas de produtores e ainda pela participação do leite e derivados na

cesta básica e, consequentemente, nos índices que calculam a inflação (GOMES,

1999).

Acredita-se que a cadeia agroindustrial de leite é uma das mais

importantes no cenário brasileiro. Presente em todos os estados da federação, a

pecuária de leite emprega mão-de-obra, gera excedentes comercializáveis e garante

renda para boa parte da população brasileira. Há poucas décadas, o processo de

transformação do leite em produtos lácteos não levava em consideração os

impactos ambientais e sociais associados, permitindo constantemente o surgimento

de problemas que, cada vez mais, tornam-se críticos para o bem estar da

sociedade, como a devastação de solos produtivos, a poluição das águas e do ar

(SANCHES, 1997).

A indústria nacional de leite se deparou com uma concorrência que

exigia medidas imediatas em termos de competitividade como, custos, qualidade

dos produtos e estratégias mercadológicas, além da implantação de alta tecnologia,

escala de produção e uma rede de distribuição eficiente (ALVES, 2005).

3.1.2 Generalidades do leite bovino

Muitas situações relatadas na história dizem que a necessidade de

sobrevivência fez com que o homem identificasse ainda na antiguidade, a

importância do leite como importante fonte nutricional (LEITE, VAITSMAN & DUTRA,

2006).

O leite nada mais é que uma secreção fluida das fêmeas de todas as

19

espécies de mamíferos. Cerca de 4 mil espécies de mamíferos o produzem, tendo

como função importante a de suprir as necessidades nutricionais essenciais para os

neonatos, o leite também exerce uma série de funções fisiológicas por meio de suas

proteínas e peptídios, por exemplo, fornecendo imunoglobulinas, enzimas, inibidores

enzimáticos, ligando-se ou transportando proteínas, fatores de crescimento e

agentes antimicrobianos (ANTUNES, 2003). O leite possui uma cor levemente

amarelada, onde a fase contínua é formada de água e substâncias hidrossolúveis, e

a fase descontínua é formada principalmente por micelas de caseína e glóbulos de

gordura (SGARBIERI, 2005). Possui odor suave e gosto levemente adocicado. O

leite é um produto muito sensível e que pode absorver odores do meio em que se

encontra. Quando exposto a temperatura elevada, o mesmo pode adquirir gosto

estranho e desagradável, o que deve ser evitado (BEHMER, 1984; ANTUNES,

2003).

Um item muito importante a considerar sobre o leite, como primeiro e

único alimento dos recém-nascidos, é que a primeira secreção das glândulas

mamárias, após o parto, tem composição muito diferente do leite e recebe o nome

de colostro. O colostro é um líquido amarelado, mais viscoso que o leite e a sua

composição varia muito nas primeiras 72h após o parto. O colostro é mucoso, de

consistência heterogênea, odor peculiar e sabor rançoso (HENG, 1999; BEHMER,

1984).

É extremamente importante o fornecimento do colostro aos bezerros

nas primeiras horas de vida e é reconhecido por vários autores por ser a única fonte

de anticorpos para proteção dos recém-nascidos dessa espécie (BRAMBELL, 1958;

RAJALA & CASTRÉN, 1995; MORIN et al., 1997).

O colostro é muito rico em proteínas (19,2%) sendo 2,65% de

caseínas e 16,56% de imunoglobulinas, sendo que as imunoglobulinas são

anticorpos transmitidos passivamente ao recém-nascido (SGARBIERI, 1996).

3.1.3 Composição do leite bovino

O leite, pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

(MAPA) do Brasil relata que é o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta,

em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas.

Como as necessidades nutricionais e fisiológicas de cada espécie de

20

mamífero são muito peculiares a cada uma delas, a composição do leite apresenta

marcante diversidade interespécies (ANTUNES, 2003).

A Tabela 1 apresenta as principais características físico-químicas do

leite.

Tabela 01: Características físico-químicas do leite. Cor branca pH 6,6 – 6,9 Densidade 1,023 – 1,040 g/mL Viscosidade 1,631 mPa.s (a 20°C) Atividade de água 0,993 Fonte: Adaptado de GONZÁLEZ, 2001.

O leite é uma fonte excelente da maioria dos sais minerais

necessários para o desenvolvimento dos indivíduos (EMBRAPA, 2008).

O leite é uma emulsão líquida em que a fase contínua é formada de

água e substâncias hidrossolúveis ao passo que a fase interna ou descontínua é

formada, principalmente, de micelas de caseína e de glóbulos de gordura. O leite de

vaca é composto de água, 87%, e sólidos totais 12 a 13%, assim distribuídos:

proteínas totais, gordura, lactose, além de minerais e vitaminas (SGARBIERI, 2005).

A gráfico 1 apresenta a porcentagem dos principais componentes do

leite.

Figura 1 – Principais componentes do leite. Fonte: Adaptado de FLEISCHMAN, (1924, p.19).

Gráfico 1- Principais Componentes do Leite

Fonte: Adaptado de DELAVAL, 2006.

Água

Gordura

Lactose

Caseina

Proteína do soro

NPN

Vitaminas e enzimas

Sais

Minerais

21

Tabela 2 – Principais componentes do leite

COMPONENTES PRINCIPAIS COMPOSIÇÃO MÉDIA

Água 87,0% Sólidos Totais 13,0% Gordura 3,9% Proteínas 3,4% Lactose 4,8% Minerais 0,8% Fonte: Adaptado de ANTUNES, 2003.

O leite, a água é o componente em maior quantidade, são

encontrados dissolvidos, suspensos ou emulsionados os demais componentes

(carboidratos, lipídios, sais minerais, vitaminas e proteínas) (PEREIRA et al., 2001).

3.1.4 Proteínas totais do leite bovino

As proteínas totais do leite podem ser consideradas de alta

qualidade nutricional e com excepcionais propriedades funcionais (ANTUNES,

2003).

Segundo Santos & Fonseca (2004), as proteínas totais do leite

podem ser classificadas em dois grandes grupos: as caseínas e as proteínas do

soro. A caseína pode ser definida como a fração da proteína do leite que sofre

precipitação em pH 4,6 enquanto que o restante das proteínas que não sofreram

esta precipitação é chamado coletivamente de proteínas do soro. Na composição

das proteínas totais do leite 20% são de proteínas do soro e 80% de caseínas.

As caseínas são classificadas em quatro subgrupos: caseínas α, β, κ

e γ, sendo que as caseínas α formam uma família de proteínas aparecem com

características diferentes (αs0 a αs5). Dentro de cada grupo de caseínas ainda

variantes genéticas (SGARBIERI, 1996).

A caseína é sintetizada nas células epiteliais da glândula mamária,

constituindo de 4 principais variantes genéticas: αs1, αs2, β e κ-caseína. Este grupo

de proteínas compõe aproximadamente 80% do total de proteínas do leite, o que

determina uma concentração média de 24-28 mg/ml, respectivamente.

Adicionalmente, a estas classes principais, a proteólise da β-caseína produz γ-

caseína (1-2 mg/ml) e outros peptídeos menores. De forma similar, a proteólise das

α-caseínas apresenta como subprodutos a gama-caseína (SANTOS & FONSECA,

2004).

22

As caseínas compreendem uma grande família de fosfoproteínas,

sendo encontradas no leite em concentrações que variam de 2,5 a 3,5%. Em termos

de composição, a caseína é caracterizada por apresentar quantidades relativamente

altas de fósforo (0,85%) e do aminoácido prolina (ANTUNES, 2003).

A Tabela 3 indica a distribuição das caseínas e proteínas do soro

presentes no leite bovino.

Tabela 3 – Porcentagem média das proteínas presentes no leite bovino.

Componentes % Total Caseína Soro

Caseínas 80

caseína α-s1 36 45

caseína α-s2 9 11

β-caseína 21 26

κ-caseína 12 15

γ-caseína 4 5

Proteínas do Soro 20

β-lactoglobulina 10 50

α-lactalbumina 4 20

Imunoglobulinas 2 10

Albumina sérica bovina (BSA) 1 5

Lactoferrina 1-2

Lisozima 0,5

Fonte: Adaptado de ANTUNES (2003).

3.1.4.1 Proteínas do soro

O soro do leite é oriundo da fabricação de queijos, a partir da

separação da caseína durante a fabricação do mesmo (FARREL et al., 2004). O

soro é composto por: glicomacropeptídeo, imunoglobulinas, albumina, lactoferrina,

lactoperoxidase, lisozima, lactolina, relaxina, lactofano, fatores de crescimento IGF-1

e IGF-2, proteoses-peptonas e aminoácidos livres (HARAGUCHI et al., 2006).

A Tabela 4 abaixo mostra os componentes presentes no soro do

leite, suas porcentagens e suas funções.

23

Tabela 4 - Propriedades das proteínas do soro do leite.

COMPONENTE DO SORO DO LEITE % NO SORO FUNÇÕES β-Lactoglobulina 50-55% Fonte de aminoácidos essências de cadeia ramificada (leucina,isoleucina e valina) α-Lactalbumina 20-25% Fonte de aminoácidos essências de cadeia ramificada Imunoglogulinas 10-15% Imunomoduladoras Lactoferrina 1-2% Antioxidante, antibacteriana, antiviral, antifúngica Lactoperoxidase 0.5% Antibacteriana BSA 5-10% Fonte de aminoácidos essências Glicomacropeptídeos 10-15% Fonte de aminoácidos essenciais de cadeia ramificada Fonte: Adaptado de MARSHALL, 2004.

As proteínas presentes no soro do leite apresentam excelente

composição em aminoácidos, alta digestibilidade e biodisponibilidade de

aminoácidos essenciais, portanto elevado valor nutritivo (SGARBIERI, 1996; ZINSLY

et al., 2001). Elas também apresentam excepcionais propriedades funcionais de

solubilidade, formação e estabilidade de espuma, emulsibilidade, geleificação,

formação de filmes e cápsulas protetoras (MODLER, 2000).

Aplicações do soro do leite têm crescido muito nos últimos 10 anos,

quanto ao aperfeiçoamento da filtração por membrana, a troca iônica, bem como o

estudo do soro de leite e seus componentes. Os derivados de soro dos Estados

Unidos são ingredientes multifuncionais utilizados em iogurtes e em milhares de

outras categorias de produtos. Recentemente pesquisas das funcionalidades das

proteínas soro têm demonstrado os benefícios do uso dos produtos de soro de leite

em iogurtes e culturas de produtos lácteos. O concentrado protéico contribui para o

sabor (flavour), textura e a diminuição de sinérese, derivados do soro podem manter

as culturas de bactérias probióticas. Recentemente, pesquisadores têm focado as

propriedades nutracêuticas das frações do soro como a lactoferrina, lactoperoxidase

e peptídeos, alguns dos benefícios terapêuticos das culturas de iogurte estão ligados

as proteínas do leite como (redução da incidência de câncer, realce das

24

propriedades imunológicas, fortificação dos ossos e diminuição do colesterol

sanguineo) (U.S Dairy Export Council, 1997).

3.1.5 Lactoferrina

Lactoferrina (Lf) é uma proteína verdadeiramente multifuncional que

tem sido muito estudada durante as últimas décadas. É conhecida por sua

capacidade de vincular-se a ferro, que finalmente levou à descoberta de sua

atividade antibacteriana. Além disso, a lactoferrina demonstrou ter atividade antiviral,

antifúngica e antiparasitária (DAIRY, COUNCIL & DIGEST, 2004; NABET & LINDEN,

2001; JENSSEN & HANCOCK, 2008).

A lactoferrina pertencente à família da transferrina, sendo

encontrada em diversas secreções como o leite, a lágrima, a saliva, e pode ser

encontrada predominantemente nos produtos de excreção das glândulas exócrinas

dos aparelhos digestivo, respiratório e reprodutivo. Recentemente muitas outras

funções foram atribuídas a Lf, tais como imunomodulação, regulação do crescimento

celular, função antitumoral, atividade antioxidante e antiinflamatório (WARD,

URIBELUNA, CONNEELEY, 2002; RODRIGUES & TEIXEIRA, 2007). A Figura – 1

ilustra algumas das funções atribuídas á lactoferrina.

Figura 1 – Funções da Lactoferrina

Fonte: Adaptado de BROCK, 2002.

25

A lactoferrina é uma importante proteína presente no soro de leite,

tendo sido isolada do componente-3 dos peptídios derivados da caseína (fragmentos

de β-caseína). É uma proteína com peso molecular da ordem de 76 kDa.

Polimeriza-se rapidamente na presença de íons Ca++ e parece ter ação

antimicrobiana, protegendo superfícies secretórias (SGARBIERI, 2004). Tem

similaridade com a lactoferrina encontrada na corrente sanguínea, onde funciona

como transportadora de ferro. Especula-se que seu papel no leite também envolva a

ligação de ferro, fazendo-o de modo tão eficiente que torna o ferro inacessível para o

crescimento de bactérias (incluindo algumas patogênicas) e fungos dados à

facilidade que apresenta de ligar-se a esse metal. Outras atividades da lactoferrina

também têm sido mencionadas na literatura: transporte de ferro, atividade contra

vírus, ligação de toxinas, promoção do crescimento de certas células animais,

ligação de plaquetas, efeitos imunomoduladores, cicatrização de feridas, ação

antiinflamatória e também que a lactoferrina humana e bovina são efetivas contra

vírus do herpes simples do tipo 1(ANTUNES, 2003).

A Figura - 2 mostra a representação esquemática da estrutura

tridimensional da lactoferrina bovina.

Figura 2: Representação esquemática da estrutura 3D da lactoferrina bovina.

O lobo N e o lobo C são conectados pela α-hélice mostrada em laranja. Em vermelho estão

destacados os aminoácidos que formam o sítio de ligação para ferro. Essa estrutura foi desenhada

para este trabalho utilizando-se o software MolMol (KORADI et al., 1996) a partir de dados

cristalográficos depositados no “Protein Data Bank” sob o nº 1BLF (MOORE et al., 1997).

26

3.1.5.1 Atividade antimicrobiana da lactoferrina

Proteínas e peptídeos antimicrobianos são sintetizados por uma

grande de variedade de organismos com o objetivo de atuarem como a primeira

linha de defesa contra infecções e são encontrados em diversos fluídos corporais.

Das mais abundantes podemos citar a lisozima e lactoferrina (JENSSEN &

HANCOCK, 2008).

Desde sua descoberta e caracterização, a lactoferrina tem sido

sujeita a numerosos estudos devido a sua estrutura, biosíntese, distribuição do

tecido, metabolismo e propriedades biológicas (BAKER & BAKER, 2008; VORLAND,

1999; LEVAY & VILJOEN, 1995).

A Lactoferrina possui várias funções biológicas já descritas, é

necessário um melhor entendimento sobre sua dinâmica estrutural, a fim de que seja

possível correlacioná-la com cada uma de suas funções (BAKER & BAKER, 2008).

Uma das primeiras atividades antimicrobianas descobertas da

lactoferrina foi sua habilidade em seqüestrar ferro do meio tornando-o indisponível

para as bactérias (BULLEN, ROGERS & LEIGH, 1972; ARNOLD, COLE &

MCGHEE, 1977). Durante muito tempo, acreditou-se que esse era o único

mecanismo de ação antimicrobiana da Lf. Muitos estudos demonstram que a apo-Lf

possui atividade antimicrobiana e que essa atividade era reduzida quando a Lf era

saturada por ferro (ARNOLD, BREWER & GAUTHIER, 1980; YAMAUCHI et al.,

1993). Alguns estudos e experimentos de cristalografia por difração de raios-x da Lf

mostraram que a proteína possui regiões catiônicas em sua superfície o que facilita

sua interação com o lipídeo A, que é um componente dos lipopolissacarídeos (LPS)

da membrana de bactérias Gram-negativas. Essa interação ocasiona dano à parede

celular bacteriana, modificando sua permeabilidade, levando a liberação da porção

LPS e o conseqüente colapso da bactéria (APPELMELK et al., 1994; ELISSON et

al., 1988). Devido esses danos causados pela Lf na membrana da bactéria, a Lf é

capaz de aumentar o efeito de drogas comerciais como a rifampicina (ELISSON et

al., 1988).

Outros estudos combinam a Lf a terapias padrão contra infecções

bacterianas a fim de diminuir o tempo de recuperação e minimizar os efeitos

colaterais do tratamento pela diminuição da dosagem dos antibióticos (DE BORTOLI

et al., 2007). Interessante notar que a importância do ferro para o crescimento

27

bacteriano, combinado com a capacidade de elementos do hospedeiro em

sequestrar esse ferro, levaram algumas cepas bacterianas a desenvolverem

estratégias de anular esse efeito. Sob condições de privação de ferro, algumas

bactérias Gram-negativas desenvolveram um mecanismo de obter ferro a partir da Lf

saturada por esse íon. Esse mecanismo envolve a interação da Lf com receptores

localizados na superfície bacteriana (LEWIS et al., 1998).

A lactoferrina conhecida pela sua ação inibitória na proliferação

celular, bem como pelas suas atividades antiinflamatórias e antioxidante, tem sido

também reportada como um agente anti-cancerígeno (BAVEYE et al., 1999; WARD,

2002).

A capacidade bactericida da Lf é atribuída pela interação direta da

molécula ou parte dela com as superfícies bacterianas. Esta interação pode ser

observada tanto em bactérias Gram positivas como em Gram negativas. Estudos

com bactérias Gram positivas m7ostram que tanto a Lf humana com a bovina, são

capazes de unirem-se as superfícies bacterianas, graças a sua carga positiva

(TOMITA et al., 1994; TOMITA et al., 2002; FRANCO et al., 2005).

3.2 EMBALAGENS ATIVAS

As indústrias de alimentos têm sofrido constantes mudanças para se

adaptar às crescentes exigências dos consumidores. A demanda por produtos

minimamente processados, sensorialmente similares aos alimentos in natura, tem

imposto novos requerimentos às embalagens, que devem assegurar uma vida – de -

prateleira adequada aos produtos (AZEREDO et al., 2000).

As embalagens têm sido selecionadas no sentido de ter mínima

interação com o alimento que acondicionam, constituindo assim barreiras inertes.

Entretanto, nas últimas décadas, diversos sistemas de embalagem têm sido

desenvolvidos com o objetivo de interagir de forma desejável com o alimento – são

as embalagens ativas, geralmente planejadas para corrigir deficiências das

embalagens passivas (ROONEY, 1995).

As embalagens ativas para alimentos vêm sendo muito estudadas,

conhecido como embalagem ativa, combinando áreas da tecnologia de alimentos,

biotecnologia, embalagem e ciência dos materiais. Estes sistemas consistem na

incorporação de aditivos tais como, agentes antimicrobianos, antioxidantes,

28

antiumectantes, microrganismos antagonistas, bactericidas, antibióticos, enzimas e

outros, na embalagem ao invés de serem adicionados diretamente nos alimentos

(REIS, 2005).

Embalagem ativa é aquela que exerce algum outro papel na

preservação de alimentos além de promover uma barreira inerte a influências

externas (ROONEY, 1995; GONTARD, 1997).

A embalagem tem como função aumentar a segurança do alimento

de acordo com os seguintes mecanismos: barreiras a contaminações

(microbiológicas e químicas) e prevenção de migração de seus próprios

componentes para o alimento. Já os sistemas de embalagem ativa devem acumular

funções adicionais, entre as quais podem ser destacadas: (a) absorção de

compostos que favorecem a deterioração, (b) liberação de compostos que

aumentam a vida – de - prateleira, e (c) monitoramento da vida – de – prateleira

(HOTCHKISS, 1995).

3.3 FILMES PROTÉICOS

Nos últimos anos, recobrimentos e filmes comestíveis têm recebido

interesse na indústria de alimentos devido às vantagens que os diferenciam das

embalagens não-comestíveis. A biodegradabilidade inerente ao filme é uma de suas

vantagens. Em adição a sua compatibilidade com o meio ambiente, maior segurança

alimentar pode ser alcançada pela incorporação de agentes ativos no filme

(GUILBERT et al., 1996; KESTER & FENNEMA, 1986; BOTREL, 2007). O caráter

comestível, sua biodegradabilidade e o aumento da segurança alimentar são os três

principais benefícios dos filmes comestíveis ativamente funcionais. Devido aos seus

aspectos ambientais, eles apresentam-se como alternativas para sistemas de

embalagens, sem os custos ambientais dos materiais sintéticos não degradantes.

Futuramente, poderão substituir total ou parcialmente algumas embalagens

sintéticas. (KESTER & FENNEMA, 1986).

Embora o uso de filmes e recobrimentos comestíveis para preservar

a qualidade dos alimentos não seja um conceito moderno, pesquisas neste campo

têm se intensificado recentemente, tanto em laboratórios acadêmicos e

governamentais, como na indústria privada. Os fatores que contribuem pelo

renovado interesse no desenvolvimento de recobrimentos comestíveis incluem

29

demanda do consumidor por alimentos de alta qualidade, preocupações ambientais

em relação ao acúmulo de embalagens não biodegradáveis e oportunidades para

criar alternativas de mercado para produção de filmes de fontes renováveis (GARG,

1990; ROLLER, 1999; BOTREL, 2007).

Os filmes comestíveis e revestimentos recentes não são senão o

aperfeiçoamento de técnicas aplicadas desde longa data. O revestimento de laranjas

e limões frescos com cera para retardar a desidratação foi praticado na China nos

séculos XII e XIII (HARDENBURG, 1967). O processo de envolver alimentos em

gordura com o intuito de reduzir a perda de umidade foi usado na Inglaterra no

século XVI (LABUZA & CONTRERAS-MEDELLIN, 1981).

Os filmes comestíveis são películas de variadas espessuras

constituídas por diferentes substâncias naturais e/ou sintéticas que se polimerizam e

isolam o alimento, sem riscos à saúde do consumidor, uma vez que não são

metabolizados pelo organismo e sua passagem pelo trato gastrointestinal se faz de

maneira inócua (MAIA et al., 2000).

Segundo Krochta & De Mulderjohnston (1997), filme comestível é

definido como fina camada de material comestível, formado diretamente como

revestimento, ou como revestimento pré-formado e colocado sobre o alimento ou

entre seus componentes.

Kester & Fennema, (1986), propuseram a utilização de filmes de

gelatina na preservação de carnes e outros gêneros alimentícios. Na década de 50,

emulsões de cera de carnaúba foram desenvolvidas para o revestimento de frutas e

vegetais frescos (KAPLAN, 1986). Mesmo assim, foram nessas últimas décadas que

se ampliaram às pesquisas e a produção de filmes de revestimento para uso na

indústria de alimentos, visando melhoria da qualidade e extensão da vida de

prateleira de vários tipos de produtos.

Coberturas com polímeros, como carboidratos, lipídios e proteínas,

têm sido utilizadas para modificar as atmosferas internas de frutas e vegetais

(CISNEROS-ZEVALLOS & KROCHTA, 2003). A função a ser desempenhada pelo

filme depende do produto alimentício e principalmente do tipo de deterioração a que

este produto está submetido (KESTER & FENNEMA, 1986).

Kester & Fennema, (1986); Krochta & De Mulderjohnston, (1997);

Nelson & Fennema, (1991) relatam que as principais funções dos filmes comestíveis

são: inibir a migração de umidade, oxigênio, dióxido de carbono, aromas, lipídios e

30

outros solutos; carrear aditivos alimentares e agentes antimicrobianos; melhorar a

integridade mecânica e as características de manuseio de alimentos.

Para a formação dos filmes comestíveis se faz necessário à adição

de um biopolímero, para promover a matriz estrutural, e de um plastificante de baixo

peso molecular, para aumentar a flexibilidade do filme (SHAW et al., 2002).

Plastificante é uma substância não-volátil que, quando adicionada a um material

altera suas propriedades mecânicas e/ou físicas. O sorbitol e o glicerol são

plastificantes por suas habilidades em reduzir as pontes de hidrogênio, enquanto

aumentam os espaços intermoleculares, e em diminuir as interações entre as

cadeias de polímeros, aumentado à flexibilidade e diminuindo as propriedades de

barreiras dos filmes (BANKER, 1996).

As proteínas do soro de leite possuem numerosas propriedades

funcionais importantes para a formação de filmes comestíveis tais como solubilidade

em água, gelatinização e atuar como emulsificantes. Os filmes protéicos de soro de

leite são transparentes, flexíveis e não apresentam odor nem sabor. Os filmes

protéicos podem também atuar como agentes antimicrobianos, antioxidantes entre

outros. Estes biopolímeros podem exercer diversas funções ainda relativamente

pouco exploradas, como carreador de aditivos (conservantes, flavorizantes, etc.) e

agentes antimicrobianos, barreiras a óleos e gorduras, minimização de danos

durante o transporte e comercialização, otimização dos efeitos de outros métodos de

conservação (como na refrigeração de frutas), e ainda, redução de gastos com

embalagens externas (MCHUGH & KROCHTA, 1994).

3.3.1 Filmes Protéicos de Soro do Leite

Os filmes possuem as características necessárias a filmes

comestíveis que são o controle de transferência de massas (gases, aromas,

umidade e solutos) e podem também atuar como veículo de ingredientes no

alimento tais como agentes antimicrobianos, antioxidantes entre outros. A formação

de filmes protéicos a base de soro de leite apresenta vantagens em relação às

embalagens sintéticas pela redução de resíduos e da poluição ambiental. O

potencial promissor de crescimento em diversos outros segmentos da produção de

alimentos depende do aperfeiçoamento e adaptação da estrutura físico-química e

dos métodos de aplicação dos revestimentos às características composicionais dos

31

alimentos (MAIA et al., 2000).

O transporte de gases como o oxigênio e o dióxido de carbono, tal

como a transmissão de umidade pode influenciar a estabilidade do armazenamento

de alguns alimentos, já que o oxigênio é um meio de deterioração de alimentos pela

oxidação de lipídios, vitaminas, pigmentos e componentes de “flavor”. Desta forma, o

emprego de filmes de proteínas do soro com propriedades de barreira ao oxigênio

em alimentos, visa estender a vida de prateleira e reduzir o custo da embalagem

(KESTER & FENNEMA, 1986).

Neste sentido, é importante conhecer cada vez mais as

propriedades funcionais dos filmes em relação não apenas aos alimentos, mas

também aos diversos fatores ambientais a que estão expostos. Analisando a

situação econômica e a tendência de ascensão da indústria de laticínios nacional,

tornam-se extremamente necessárias pesquisas que visem à otimização do uso do

soro do leite, uma vez que estes estudos terão um importante impacto social e

econômico (MAIA et al., 2000).

3.4 TOXI-INFECÇÃO ALIMENTARES CAUSADA POR BACTÉRIAS

Muitas das doenças transmitidas por alimentos (DTA) são

conhecidas desde épocas muito remotas. No ano 2000 AC. foi determinado algumas

leis sobre os alimentos que se podiam comer e os que se deveria rejeitar, e também

os métodos de preparação e a importância da higienização das mãos antes de

consumir os alimentos (SECRETARIA DA VIGILANCIA SANITÁRIA, 2005).

Antigamente, relacionavam-se os alimentos contaminados com o seu estado de

putrefação. Hoje, sabe-se que os alimentos contaminados com microrganismos

patogênicos podem ter aspecto, odor e sabor normais. DTA é um termo genérico,

aplicado a uma síndrome, geralmente, constituída de anorexia, náuseas, vômitos

e/ou diarréia. As DTA são atribuídas à ingestão de alimentos ou água contaminados

por bactérias, vírus, parasitas, toxinas, agrotóxicos, produtos químicos e metais

pesados. Além dos sintomas digestivos, podem ocorrer afecções extra-intestinais

em diferentes órgãos e sistemas, como: meninges; rins; fígado; sistema nervoso

central; terminações nervosas periféricas; e outros, de acordo com o agente

etiológico envolvido. O quadro clínico das DTA depende, portanto, do agente

etiológico envolvido e varia desde leve desconforto intestinal até quadros

32

extremamente sérios, com desidratação grave, diarréia sanguinolenta, insuficiência

renal aguda (síndrome hemolítica urêmica) e insuficiência respiratória (botulismo). A

alergia, por hipersensibilidade individual, a certos alimentos não é considerada uma

DTA. Existem vários mecanismos patogênicos envolvidos com a determinação das

DTA, que podem se manifestar por meio de:

Ø Infecções transmitidas por alimentos: são doenças que resultam da ingestão

de alimentos que contêm microorganismos patogênicos vivos. Exemplos:

salmoneloses, hepatite viral tipo A e toxoplasmose.

Ø Intoxicações causadas por alimentos: ocorrem quando as toxinas das

bactérias ou fungos estão presentes no alimento ingerido. Essas toxinas, na

maioria das vezes, não possuem cheiro ou sabor e são capazes de causar

doenças depois que o microrganismo é eliminado. Algumas toxinas podem

estar presentes, de maneira natural, no alimento, como no caso de alguns

fungos ou peixes. Exemplos: botulismo e toxina do Staphylococcus aureus.

Ø Toxinfecção causada por alimentos: é uma doença que resulta da ingestão de

alimentos com certa quantidade de microrganismos causadores de doenças,

os quais são capazes de produzir ou liberar toxinas após serem ingeridos.

Exemplos: cólera, síndrome hemolítica urêmica. (SECRETARIA DA

VIGILANCIA SANITÁRIA, 2005).

Segundo Franco & Landgraf (1996), as bactérias são

microrganismos amplamente distribuídos na natureza, sendo encontradas em todos

os ambientes. Podem ser responsáveis por doenças no homem, nos animais e nas

plantas ou por deteriorarem os alimentos e materiais diversos. Por outro lado,

podem ser úteis de diversas formas, tais como: compondo o que se denomina

microbiota normal do homem, sendo utilizados na produção de alimentos, como

simbióticos na agricultura e na medicina. Em condições ideais, as bactérias são os

microrganismos com maior velocidade de crescimento (exponencial), sendo o tempo

de geração, em condições ótimas de multiplicação, geralmente, de 15 a 20 minutos.

As bactérias são as responsáveis pela maior incidência de casos de contaminação

em alimentos.

Os contaminantes microbiológicos são as bactérias, os fungos, os

vírus e as parasitas. Alguns microrganismos possuem poucas exigências

alimentares, enquanto outros necessitam de alimentos bem específicos. Para cada

33

micróbio existe determinados pH, temperatura, umidade e oxigenação mínimas,

ótimas e máximas. De modo geral, os alimentos que satisfazem aos seres humanos,

também satisfazem algum tipo de microorganismo. Os alimentos podem ser

contaminados pelos micróbios de diversas maneiras, tornando necessária a criação

de mecanismos de defesa da produção contra sua ação. As bactérias são os

principais microrganismos causadores de toxinfecções. Durante a fase de

crescimento, ele ocorre de forma exponencial. As bactérias estão presentes em uma

gama variada de alimentos e são causadoras de diversas enfermidades. A grande

maioria dos alimentos pode servir como veículo de surtos de toxinfecções

alimentares decorrentes de contaminação bacteriana (PEETERS, 1999).

3.4.1 Culturas Bacterianas

3.4.1.1 Staphylococcus aureus

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos,

pertencentes á família Micrococcaceae e por dividirem-se em planos diferentes,

quando vistos ao microscópio aparecem na forma de cacho de uva. São facultativas

anaeróbias, com maior crescimento sob condições aeróbias, quando, então,

produzem catalase. A espécie S. aureus é a que está associada mais

frequentemente ás doenças estafilocócicas, quer sejam de origem alimentar ou não.

As cepas de S. aureus são sensíveis a uma série de bacteriófagos, o que auxilia no

estudo de surtos de intoxicação, levando muitas vezes á fonte de infecção. Os

estafilococos são bactérias mesófilas apresentando temperatura de crescimento na

faixa de 7°C á 47°C; as enterotoxinas são produzidas entre 10°C e 46°C, com ótimo

entre 40°C e 45°C. Os extremos de temperatura estão na dependência dos demais

parâmetros que devem encontra-se em condições ótimas. Os surtos de intoxicação

alimentar são provocados por alimentos que permaneceram neste intervalo de

temperatura por tempo variável, de acordo com o nível de inóculo e temperatura de

incubação. Em geral, quanto mais baixa for à temperatura, maior será o tempo

necessário para a produção de enterotoxinas. Em relação ao pH, S. aureus cresce

na faixa de 4 á 9,8, com o ótimo entre 6 e 7. A S. aureus causa intoxicação

34

provocada pela ingestão do alimento que apresenta a toxina pré-formada. Portanto,

o agente causal não é a bactéria per se, mas várias toxinas (A, B, C1, C2, C3, D, E)

produzidas por esta bactéria, conhecidas como enterotoxinas. Os sintomas variam

com o grau de suscetibilidade do indivíduo, concentração da enterotoxina no

alimento e a quantidade consumida do alimento (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

3.4.1.2 Proteus mirabilis

São bastonetes entéricos Gram-negativos, são aeróbios e

frequentemente apresentam pleomorfismo, daí seu nome. Apresentam crescimento

que se espalha muito, formando camadas sobre as placas de ágar úmido. São

bactérias entéricas típicas e estão presentes no trato intestinal de humanos e

animais. Podem ser isolados de uma grande variedade de produtos vegetais e de

carnes, sobretudo daquelas que sofreram deterioração em temperaturas mesofílicas

(JAY, 2005).

São bacilos móveis, com flagelos peritríquios, e são patógenos em

potencial, embora seu envolvimento com doenças de origem alimentar seja ainda

discutível. No entanto, possuem um papel importante na deterioração de alimentos e

estão relacionados à infecções do trato urinário, feridas e diarréia (FRANCO &

LANDGRAF, 1996).

3.4.1.3 Escherichia coli

A Escherichia coli é um dos microrganismos mais prolíficos no trato

intestinal humano e pertence ao grupo dos coliformes fecais, assim o principal meio

de contaminação de alimentos é por fezes. É uma espécie predominante entre os

diversos microrganismos anaeróbicos facultativos que fazem parte da flora intestinal

de animais de sangue quente. Esse microrganismo pertence á família

Enterobacteriaceae e entre suas principais características destacam-se: bacilos

Gram-negativos, não-esporulados, capazes de fermentar glicose com produção de

ácido e gás. A maioria fermenta também a lactose, com produção de ácido e gás,

embora alguns sejam anaeróbicos. (FRANCO & LANDGRAF, 1996; TORTORA

2000).

A E. coli normalmente é inócua, entretanto algumas cepas podem

35

ser patogênicas. Todas as cepas patogênicas possuem fímbrias especializadas que

permitem que elas se liguem a certas células do epitélio intestinal. Além disso, elas

produzem toxinas que causam distúrbio gastrointestinais denominados de

gastroenterite por E.coli. (TORTORA, 2000).

Existem vários grupos patogênicos distintos de E. coli, e estes

grupos são responsáveis por 50 a 65% das diarréias dos viajantes, e boa parte da

diarréia de lactantes em países em desenvolvimento. Segundo Trabulsi (2004), as

Escherichia coli podem causar infecções intestinais, urinárias, septicemicas,

meningites e outros tipos de infecções. Provavelmente nenhuma bactéria seja tão

diversificada em sua patogenicidade como a Escherichia coli. Em relação ás

infecções intestinais pelo menos á seis categorias: Escherichia coli enteroinvasora

(EIEC), enterotoxigênica (ETEC), enteropatogênica (EPEC), entero-hemorrágica

(EHEC), enteroagregativa (EAggEC) e que adere difusamente (DAEC).

O significado da presença de E. coli em um alimento deve ser

avaliado sob dois ângulos. Inicialmente, E. coli, por ser uma enterobactéria, uma vez

detectada no alimento, indica que esse alimento tem uma contaminação microbiana

de origem fecal e, portanto está em condições higiênicas insatisfatórias (FRANCO &

LANDGRAF, 1996).

36

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 REAGENTES

Todos os reagentes utilizados neste trabalho são de grau analítico. A

água destilada. Todos os meios e materiais foram esterilizados em autoclave vertical

(PHOENIX), EUA.

4.2 CULTURAS BACTERIANAS

Foram utilizadas culturas puras ATCC de microrganismos

associados à “intoxicação alimentar”:

ØØØØ Staphylococcus aureus ATCC 25923;

ØØØØ Proteus mirabilis ATCC 25933;

ØØØØ Escherichia coli ATCC 25922.

4.3 CULTIVO BACTERIANO

As culturas de bactérias foram crescidas em meio líquido LB

“overnight” a 37 °C (FANEM), EUA, e posteriormente isoladas e em meio sólido ágar

Muller Hinton incubados overnight a 37 °C. As culturas estoques foram distribuídas

em placas em meio ágar nutriente “overnight” a 37°C e posteriormente armazenadas

a 4 °C.

4.4 LACTOFERRINA

A lactoferrina utilizada neste estudo foi adquirida da (SIGMA-

ALDRICH), EUA. As soluções de lactoferrina utilizadas nos experimentos de

atividade antimicrobiana foram diluídas em água deionizada.

37

4.5 ISOLADO DE SORO PROTÉICO

O isolado de soro protéico (WPI) utilizado foi adquirido da Davisco,

WPI BIPRO 95%, EUA.

4.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA

Para a análise da atividade antimicrobiana foi realizado por meio do

método de difusão em disco. As culturas bacterianas foram inoculadas em meio LB

“overnight” a 37 °C (FANEM), EUA, em mesa agitadora. Terminado o período de

incubação, 0,1 mL do inoculo em meio LB foi disperso em placas contendo meio

Agar Muller Hinton com auxílio de uma alça Drigalski. Discos de papel de filtro

contendo diferentes concentrações de lactoferrina (10, 25, 50 mg/ml) foram

adicionados à placa com auxílio de uma pinça. Como controle negativo foi utilizado

disco com água deionizada e como controle positivo discos com antibióticos

(sulfadoxina- 2mg/mL e trimetoprima- 40 µg/mL).

Antibiograma

Agar Muller Hinton

Figura 03 – Ilustração do antibiograma por discos de difusão

38

4.7 ANÁLISE DO MIC E DO MBC LACTOFERRINA

l MIC - Concentração Mínima Inibitória

l MBC – Concentração Mínima Bactericida

Para o ensaio de MIC, 106 UFC/ml de cada culturas bacterianas

foram inoculadas em meio de LB, com diferentes concentrações de lactoferrina

(SIGMA-ALDRICH), EUA. (10-50 mg/ml) nas amostras;

Como controle positivo foi utilizado antibiótico (sulfadoxina- 2mg/mL

e trimetoprima- 40 µg/mL) diluídos em LB; e como controle negativo, meio LB;

No início do experimento e ao final do período de incubação

alíquotas de meio das culturas foram retiradas e lida a 660 nm, (SINTRA), EUA;

Para o ensaio de MBC as amostras e os controles, positivo e

negativo, foram diluídos em meio LB e as diluições foram distribuídas em placas

contendo ágar Mueller Hinton. Após a incubação a 37°C (FANEM), EUA, por 18

horas, as unidades formadoras de colônia (UFC) foram contadas.

Figura 04 – Ilustração do método do MIC e do MBC Lactoferrina

MBC

MIC

39

4.8 CURVA DE CRESCIMENTO PADRÃO

Para determinação da curva de crescimento padrão as culturas

bacterianas foram plaqueadas em Agar Muller Hinton “overnight” a 37 °C (FANEM),

EUA. Terminado o período de incubação foram inoculadas 5 a 10 colônias de cada

cultura bacteriana em 5 mL de meio LB, e incubadas em uma mesa agitadora a 3 °C

durante 8-10 horas até cada cultura atingisse a fase estacionária de crescimento. A

cada 60 min uma alíquota foi colhida e a absorbância foi lida em espectrofotômetro,

(SINTRA), EUA, a 660 nm. Foi comparada a curva de crescimento de cada cultura

na ausência e na presença de 50 mg/ml de lactoferrina.

4.9 FORMAÇÃO DO FILME PROTÉICO

Para a formação dos filmes protéicos foram preparadas amostras com 7 % de

isolado de soro protéico - WPI (Bipro, Davisco). Como agente plastificante foi

utilizado 5 % de glicerol (MERCK), EUA. As amostras foram aquecidas a 90°C

durante 30 minutos e depois resfriadas até a temperatura de 25ºC

aproximadamente, e depositadas em placas de petri de plástico (poliestireno) por

24-48 horas a temperatura ambiente para a evaporação do solvente. Como agente

antimicrobiano foi utilizado 50 mg/ml de lactoferrina, e esta foi adicionada aos filmes

após o resfriamento das amostras. Depois de prontos os filmes foram armazenados

em dessecador a 75% de umidade relativa. A Figura – 5 mostra as etapas e os

componentes utilizados para a elaboração dos filmes.

40

Figura 5 - Fluxograma do Preparo do Filme Protéico Comestível

Isolado Protéico (WPI)

Água Destilada

Agitação

Plastificante

Água Destilada

Agitação

Banho-maria90ºC/30 min

Resfriamento

Placas

Lactoferrina

41

4.10 AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS FILMES PROTÉICOS NAS CULTURAS

BACTERIANAS

As culturas bacterianas foram incubadas em meio LB, a 37°C

“overnight” (FANEM), EUA. Ao final do período de incubação, 0,1 mL do inóculo em

meio LB foi disperso em placas contendo meio ágar Muller Hinton com auxílio de

uma alça Drigalski. Discos do filme protéico de 15 mm contendo diferentes

concentrações de lactoferrina (SIGMA-ALDRICH), EUA, foram adicionados à placa

com auxílio de uma pinça. Como controle foi utilizado discos de PVC. As placas

foram mantidas a 4°C por três horas para permitir a difusão da lactoferrina (SIGMA-

ALDRICH), EUA, no meio e posteriormente foram incubadas em estufa a 37°C

“overnight” (FANEM), EUA.

42

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

A lactoferrina é uma glicoproteína ligadora de ferro encontrada no

leite das mais variadas espécies. Uma de suas funções mais importantes é a de ser

a primeira linha de defesa contra infecções. Além disso, ela possui um importante

papel de inibir o desenvolvimento de microrganismos por remover o ferro, que é um

importante nutriente das bactérias, do microambiente. Entre as proteínas do soro do

leite, optamos inicialmente trabalhar com a lactoferrina, por ser a mais bem descrita

como tendo atividade antimicrobiana.

Inicialmente, foi realizado o teste de antibiograma por difusão em

discos para determinar a concentração da lactoferrina com atividade antimicrobiana

para cada bactéria testada. Os resultados obtidos demonstraram que lactoferrina em

concentrações de 10 e 25 mg/ml (dados não apresentados) não promoveram

inibição no desenvolvimento dos microrganismos testados. Somente na

concentração de 50 mg/ml de Lf a formação de halos de inibição foram observados

(Figura - 6). Entre as bactéras testadas somente o P. mirabilis, se mostrou sensível

a ação da Lf (halo de 20mm). Para as demais bactérias não foi observado halos de

inibição significativos quando comparado com os controles de antibiótico (Gráfico -

2). Entretanto, como já é descrito na bibliografia, para algumas bactérias o efeito

inibitório só é observado quando a bactéria se encontra em fase log de crescimento,

ou seja, os experimentos devem ser conduzidos em meio líquido.

Foram realizados ensaios de determinação da MIC da Lf em meio

líquido e conforme ilustrado no (Gráfico – 3) para as bactérias testadas a

concentração mínima inibitória da Lf foi de 50 mg/ml. Entretanto a lactoferrina, nesta

concentração não foi capaz de inibir totalmente o desenvolvimento dos

microrganismos avaliados.

As bactérias neste trabalho avaliadas não apresentaram o mesmo

perfil de sensibilidade a Lf. Entre as culturas testadas o P. mirabilis foi o que se

mostrou mais sensível ao tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais

resistente. No ensaio de MIC a concentração de P. mirabilis foi reduzida em 84%, da

E. coli de 64,5% e para o S. aureus de 43% (Gráfico – 3).

43

FFiigguurraa 66 --TTeessttee ddee AAnnttiibbiiooggrraammaa

A B

C

Ab

Ab

Ab

LF

LF

LF

H2O

LF

H2O

H2O

LF

LF

44

GGrrááffiiccoo 22 -- AAttiivviiddaaddee AAnnttiimmiiccrroobbiiaannaa ddaa LLaaccttooffeerrrriinnaa

Halo de inibição (mm)

0

10

20

30

40

50Antibiótico P. mirabilis

S.aureus

E. coli

Água

45

(A) Proteus mirabilis

[Lactoferrina] mg/ml

0 10 20 30 40 50 60

Absorbãncia660nm (D.O)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

(B) E. coli

(C) S. aureus

[Lactoferrina] mg/ml

0 10 20 30 40 50 60

Absorbância660nm (D.O)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

GGrrááffiiccoo 33 -- EEnnssaaiioo ddee DDeetteerrmmiinnaaççããoo ddoo MMIICC (A) P. mirabilis, no (B) para E. coli e no (C) para S. aureus.

[ L a c t o f e r r i n a ] m g /m l

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

Absorbância660nm (D.O)

0 , 0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

0 , 8

1 , 0

46

Também foi determinada a concentração mínima bactericida (MBC)

da Lf para as culturas estudadas. Conforme mostrado no (Gráfico – 4), a lactoferrina

exerceu apenas atividade bacteriostática nas culturas testadas. Para o P. mirabilis a

concentração de microrganismos obteve uma redução de 1,71 log, para E. coli de

1,74 log e para o S. aureus de 0,7 log.

[Lactoferrina] mg/ml

0 50

Log de UFC/ml

0

2

4

6

8

10

12

14P. mirabilis

E.coli

S.aureus

GGrrááffiiccoo 44 -- EEnnssaaiioo ddee DDeetteerrmmiinnaaççããoo ddoo MMBBCC

Também foram realizadas curvas de crescimento bacteriano na

presença e na ausência de lactoferrina (Gráfico 5). Nestes experimentos é possível

identificar em que etapa da curva de crescimento a LF está exercendo seu efeito

inibitório.

47

(A) Proteus mirabilis

(B) E. coli B

(C) S. aureus

Gráfico 5 – Curvas de Crescimento Bacteriano na Presença e Ausência de Lactoferrina

(A) P. mirabilis, no (B) para E. coli e no (C) para S. aureus.

T e m p o ( h )

0 2 4 6 8

Absorbância660nm (D.O)

0 , 0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

0 , 8

1 , 0

1 , 2 C o n t r o l e

L F 5 0

T e m p o ( h )

0 2 4 6 8

Absorbância660nm (D.O)

0 , 0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

0 , 8

1 , 0

C o n t r o l e

L F 5 0

T e m p o ( h )

0 2 4 6 8

Absorbância660nm (D.O)

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0C o n t r o l e

L F 5 0

48

Os resultados obtidos nas curvas de crescimento, com ou sem

lactoferrina, confirmaram os dados observados nos ensaios de determinação de MIC

e MBC (Gráficos 2 e 3). O P. mirabilis foi o que se mostrou mais sensível ao

tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais resistente. Na curva de

crescimento com lactoferrina a fase lag para P. mirabilis e para E. coli foi estendida

por duas horas e na fase log o crescimento das culturas foi menor sendo que para P.

mirabilis a redução foi em média de 77% e para E. coli de 67%. Para o S. aureus

não ocorreram alterações significativas no período de tempo na fase lag, entretanto,

na fase log o microrganismo teve uma redução de 54% em seu crescimento.

Os resultados obtidos pelos ensaios de MIC e MBC revelaram que a

concentração de lactoferrina de 50 mg/ml seria a ideal para a obtenção dos efeitos

bacteriostáticos nas culturas testadas. Seguindo os objetivos deste trabalho foram

formulados então filmes protéicos a base de soro de leite bovino, que seriam

acrescidos então de 50 mg/ml de lactoferrina.

Nossos resultados confirmaram que as proteínas do soro de leite possuem

numerosas propriedades funcionais importantes para a formação de filmes

comestíveis tais como solubilidade em água, gelatinização e atuação como

emulsificantes.

Os filmes protéicos de soro de leite obtidos em nossos experimentos

são transparentes, flexíveis, de uma espessura fina (em média 0,100 mm), como

mostra a Figura- 12. Eles também não apresentam odor nem sabor acentuado. Os

filmes acrescidos de lactoferrina apresentavam uma coloração levemente

avermelhada (dados não apresentados), mas não apresentou nenhuma outra

alteração visível em suas características quando comparados ao filmes sem adição

de lactoferrina.

49

FFiigguurraa 77 -- FFiillmmeess PPrroottééiiccooss aa BBaassee ddee SSoorroo ddoo LLeeiittee

Tendo definido as concentrações de isolado protéico e de glicerol

para a formulação dos filmes protéicos e as condições para adição de lactoferrina

foram encaminhados os ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes

protéicos (Figura - 8).

50

FFiigguurraa 88 -- AAttiivviiddaaddee AAnnttiimmiiccrroobbiiaannaa ddooss FFiillmmeess PPrroottééiiccooss aa BBaassee ddee SSoorroo ddee LLeeiittee

Os experimentos de atividade antimicrobiana dos filmes

demonstraram que o filme protéico a base do soro de leite acrescido de lactoferrina

apresentou atividade antimicrobiana em todas as culturas avaliadas (Figura - 8). Foi

possível observar que não só ocorreu inibição das bactérias no local de adição dos

filmes, como também a formação de halos de inibição. O filme protéico sem adição

de lactoferrina também foi capaz de inibir parcialmente o crescimento microbiano.

Como se sabe além da lactoferrina, entre as proteínas do soro existe outras

proteínas com atividade antimicrobiana, tais como a lisozima e a lactoperoxidase, o

51

que explicaria a atividade antimicrobiana dos filmes sem adição de lactoferrina.

Os resultados aqui apresentados confirmam o efeito antimicrobiano

da lactoferrina, como observado nos isolados testados associados à toxinfecção

alimentar testados. O S. aureus e a E. coli são microrganismos de grande

importância econômica por estarem associados à DTAs,. Quanto ao P. mirabilis

apesar de não haver uma associação clara ainda de sua participação em casos de

toxinfecção alimentar é um importante microrganismos deteriorante de alimentos.

A cultura de Proteus mirabilis foi a que se mostrou mais sensível ao

tratamento com lactoferrina, corroborando os dados da literatura dos efeitos da

lactoferrina em bactérias gram negativas (JENSSEN & HANCOCK, 2008; TOMITA et

al., 2008). Experimentos de cristalografia por difração de raios-x da Lf mostraram

que a proteína possui regiões catiônicas em sua superfície o que facilita sua

interação com o lipídeo A, que é um componente dos lipopolissacarídeos (LPS) da

membrana de bactérias Gram-negativas. Essa interação ocasiona dano à parede

celular bacteriana, modificando sua permeabilidade, levando a liberação da porção

LPS e o conseqüente colapso da bactéria (APPELMELK et al., 1994; ELISSON et

al., 1988).

Poucos trabalhos na literatura demonstram a ação de lactoferrina em

cepas de S. aureus associado á infecção alimentar, a maioria avalia a atuação de

isolados deste microrganismo associados à mastite bovina (HYVONEN et al., 2008 e

LEE et al., 2004). Lee et al., (2004) testou dez isolados de S. aureus e quatro

apresentaram resistência a lactoferrina. Hyvönen et al., (2008), testou 22 isolados de

espécies de Staphylococcus coagulase-negativa e destes somente 3 foram

sensíveis ao tratamento com lactoferrina; 17 espécies apresentaram uma

sensibilidade intermediária e 2 foram resistentes. De uma forma geral a resistência

ou sensibilidade do Staphylococcus a Lf parece ser espécie específica.

Os resultados obtidos neste trabalho sobre atividade bacteriostática

da lactoferrina sobre a E. coli vão de encontro aos observados pela literatura

(BRANEM & DAVIDSON, 2004; AL-NABUSI & HOLLEY, 2007). Al-Nabusi & Holley

(2007), testou 5 cepas de E. coli e destas apenas duas se mostram sensíveis a LF

(redução de 1 log de crescimento comparado ao controle). Branem & Davidson

(2004), não observaram efeito bacteriostático da lactoferrina em nenhum dos dois

isolados de E. coli testados. Nestes trabalhos a atividade antimicrobiana da

52

lactoferrina foi amplificada quando combinadas com outros agentes antimicrobianos

(EDTA, nisina e lisozima).

As propriedades biológicas das proteínas dependem da sua

estrutura tridimensional e esta pode ser influenciada por fatores químicos e físicos

(ligantes, pH, temperatura, pressão, etc.) (PRIVALOV et al., 1986). Sendo a

lactoferrina uma proteína a sua atividade antimicrobiana também pode ser afetada

por diversos fatores físico-químicos. Um desdobramento deste trabalho seria

combinar a lactoferrina a compostos que otimizariam a sua atividade biológica.

Diversos estudos demonstravam que a apo-Lf possuía atividade

antimicrobiana e que essa atividade era reduzida quando a Lf era saturada por ferro

(ARNOLD, BREWER & GAUTHIER, 1980; YAMAUCHI et al., 1993). Desta forma

alguns trabalhos têm combinado o uso de lactoferrina com EDTA e sais de

bicarbonato para potencializar sua ação (BAKER & BAKER, 2008). Outros estudos

combinam a Lf a terapias padrão contra infecções bacterianas a fim de diminuir o

tempo de recuperação e minimizar os efeitos colaterais do tratamento pela

diminuição da dosagem dos antibióticos (DE BORTOLI et al., 2007). E por último a

combinação da Lf com outras substâncias antimicrobianas (BRANEM & DAVIDSON,

2004; AL-NABUSI & HOLLEY, 2007).

Os resultados aqui apresentados mostraram que o filme protéico a

base do soro de leite acrescido com lactoferrina teve atividade antimicrobiana em

todas as cepas avaliadas. Este resultado tem uma grande relevância principalmente

porque o S. aureus e uma das principais bactérias relacionada a surtos de

intoxicação alimentar. Estes resultados divergem de alguns estudos apresentados

na literatura. Min, Harris e Krochta (2005), não conseguiram inibir de forma efetiva

cepas de Salmonella entérica e de E. coli O157:H7 com filmes protéicos a base de

soro de leite acrescidos de lactoferrina. Entretanto neste estudo a concentração

máxima de Lf testada foi de 20 mg/ml; e nos ensaios conduzidos neste trabalho essa

concentração de Lf também não apresentou efeito inibitório. Brown, Wang & Oh

(2008), desenvolveram filmes a base de quitosana acrescidos com lactoferrina, e só

observaram a inibição de E. coli O157:O7 e Listeria monocytogenes quando

combinaram Lf e lisozima. A concentração máxima de lactoferrina utilizada neste

estudo foi de 2 mg/ml, e os autores comentam que a atividade da lactoferrina

utilizada poderia estar sendo afetada pela saturação com ferro. Desta forma, este

53

trabalho apresenta resultados promissores para o desenvolvimento de filmes

protéicos a base de soro de leite acrescido de lactoferrina.

54

6 CONCLUSÃO

A importância deste trabalho inicialmente foi a de explorar o

potencial da lactoferrina como uma alternativa para adição de conservantes

sintéticos nos alimentos Os resultados, ainda que iniciais, confirmam o efeito

antimicrobiano da lactoferrina, como observado nos isolados associados a

toxinfecção alimentar testados. Esse estudo é promissor, pois o desenvolvimento de

conservantes naturais é imprescindível devido ao fato de que aditivos sintéticos

podem fazem mal a saúde causando reações alérgicas dentre outros problemas.

Desta forma, este trabalho confirma a eficácia da produção de filmes

comestíveis a base do soro de leite e sua atividade antimicrobiana testados em

cepas de bactérias associadas à infecção alimentar. A lactoferrina adicionada ao

filme protéico inibiu completamente o crescimento das bactérias Proteus mirabilis, E.

coli, S. aureus testadas.

Estes filmes protéicos seriam uma opção de baixo custo e

biodegradável ao uso de embalagens e aditivos sintéticos, para a melhor

conservação dos alimentos. Estes biopolímeros podem exercer diversas funções

ainda relativamente pouco exploradas, como carreador de aditivos (conservantes,

flavorizantes, etc.) e agentes antimicrobianos, barreiras a óleos e gorduras,

minimização de danos durante o transporte e comercialização, otimização dos

efeitos de outros métodos de conservação (como na refrigeração de frutas), e ainda,

redução de gastos com embalagens externas.

55

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