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ANA CECÍLIA DE MENEZES GALVÃO
MODULAÇÃO DO ESTRESSE SOCIAL SOBRE PARÂMETROS
FISIOLÓGICOS, COMPORTAMENTAIS, COGNITIVOS E PLASTICIDADE
NEURONAL EM SAGUIS (Callithrix jacchus) JUVENIS: UM MODELO
ANIMAL PSIQUIÁTRICO E COGNITIVO.
NATAL
2015
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ANA CECÍLIA DE MENEZES GALVÃO
MODULAÇÃO DO ESTRESSE SOCIAL SOBRE PARÂMETROS
FISIOLÓGICOS, COMPORTAMENTAIS, COGNITIVOS E PLASTICIDADE
NEURONAL EM SAGUIS (Callithrix jacchus) JUVENIS: UM MODELO
ANIMAL PSIQUIÁTRICO E COGNITIVO.
Defesa da dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Psicobiologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como requisito para a obtenção do título de
mestre em Psicobiologia (Área: Psicologia
Fisiológica).
Orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Junior
Co-orientadora: Profa. Dra. Nicole Leite Galvão Coelho
NATAL
2015
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Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Galvão, Ana Cecília de Menezes.
Modulaçao do estresse social sobre parâmetros fisiológicos,
comportamentais, cognitivos e plasticidade neuronal em saguis (Callithrix
jacchus) juvenis: um modelo psiquiátrico e cognitivo / Ana Cecília de
Menezes Galvão. – Natal, RN, 2015.
111f: il.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Junior.
Coorientadora: Profa. Dra. Nicole Leite Galvão Coelho.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em
Psicobiologia.
1. Cortisol. – Dissertação. 2. Comportamento. – Dissertação. 3.
Depressão. – Dissertação. 4. Memória de trabalho. – Dissertação. I.
Pereira Junior, Antônio. II. Coelho, Nicole Leite Galvão.
RN/UF/BSE-CB CDU 612.453
4
MODULAÇÃO DO ESTRESSE SOCIAL SOBRE PARÂMETROS FISIOLÓGICOS,
COMPORTAMENTAIS, COGNITIVOS E PLASTICIDADE NEURONAL EM
SAGUIS (Callithrix jacchus) JUVENIS: UM MODELO ANIMAL PSIQUIÁTRICO E
COGNITIVO.
ANA CECÍLIA DE MENEZES GALVÃO
Natal, 31 de Agosto de 2015.
Banca Avaliadora
______________________________
Prof.ª Dra. Nicole Leite Galvão Coelho
Departamento de Fisiologia- UFRN
Orientadora
____________________________________
Prof.ª Dra. Maria Bernardete cordeiro de Sousa
Instituto do Cérebro - UFRN
Membro interno
____________________________________
Prof. Dr. Flávio Freitas Barbosa
Departamento de Psicologia - UFPB
Membro externo
5
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO.....................................................................................................................7
RESUMO GERAL......................................................................................................................8
INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................................................10
OBJETIVOS.............................................................................................................................16
Objetivo Geral...........................................................................................................................16
Objetivo Específico...................................................................................................................16
ARTIGO 1 - ALTERAÇÕES FISIOLOGICAS E COMPORTAMENTAIS EM MODELO
ANIMAL DE DEPRESSÃO JUVENIL: CALLITHRIX JACCHUS, UM PRIMATA NÃO-
HUMANO.................................................................................................................................18
RESUMO..................................................................................................................................19
INTRODUÇÃO........................................................................................................................21
METODOLOGIA.....................................................................................................................24
Animais.....................................................................................................................................24
Desenho experimental...............................................................................................................25
Registro comportamental..........................................................................................................26
Coleta de fezes..........................................................................................................................27
Dosagem hormonal...................................................................................................................27
Análise estatística......................................................................................................................28
RESULTADOS.........................................................................................................................28
Perfil hormonal.........................................................................................................................29
Perfil comportamental...............................................................................................................30
Correlações................................................................................................................................39
DISCUSSÃO............................................................................................................................40
REFERÊNCIA..........................................................................................................................47
ARTIGO 2 - ESTRESSE, COGNIÇÃO E PLASTICIDADE NEURONAL EM SAGUIS
(CALLITHRIX JACCHUS).......................................................................................................53
RESUMO..................................................................................................................................54
INTRODUÇÃO........................................................................................................................56
METODOLOGIA.....................................................................................................................59
Manutenção dos animais...........................................................................................................59
Desenho experimental...............................................................................................................60
Registro comportamental..........................................................................................................61
Coleta de fezes..........................................................................................................................62
6
Dosagem hormonal...................................................................................................................62
Testes de memória....................................................................................................................63
Perfusão.....................................................................................................................................65
Procedimentos de imunofluorescência......................................................................................66
Análise estatística......................................................................................................................66
RESULTADOS.........................................................................................................................67
Perfil hormonal.........................................................................................................................67
Perfil Comportamental..............................................................................................................68
Testes de memória....................................................................................................................72
BDNF imunofluorescência.......................................................................................................75
DISCUSSÃO............................................................................................................................76
REFERÊNCIAS........................................................................................................................84
DISCUSSÃO GERAL E CONSIDERAÇÃO FINAL..............................................................92
REFERÊNCIA GERAL............................................................................................................95
7
1. APRESENTAÇÃO
O presente trabalho de dissertação de mestrado se refere a um único projeto de
pesquisa desenvolvido pela autora, que por incluir investigações de enfoques distintos,
embora sobre um único tema, foi organizado em estudos independentes no qual cada um
caracteriza um artigo científico. Deste modo, estes artigos compartilham alguns
procedimentos de coletas de dados e sujeitos experimentais, havendo apenas algumas
alterações realizadas de acordo com o foco de cada estudo.
A dissertação que segue é constituída por: 1. Introdução geral; 2. Objetivo geral e
específicos, sendo cada objetivo específico direcionado para a elaboração de um artigo
científico; 3. Artigo científico 1, intitulado: “Alterações fisiológicas e comportamentais em
modelo animal juvenil de depressão: Callithrix jacchus, um primata não-humano”; 4. Artigo
científico 2, intitulado: “Estresse, cognição e plasticidade neuronal em saguis (Callithrix
jacchus).”; 5. A discussão geral e as considerações finais , que integram e discutem os
resultados encontrados nos dois estudos; 6. As referências bibliográficas gerais, relativas à
introdução e discussão geral e as considerações finais.
8
2. RESUMO GERAL
O desenvolvimento do sistema nervoso é constituído por um conjunto de eventos
celulares complexos, dinâmicos e sequenciais determinados por fatores genéticos e
ambientais. Durante os períodos críticos de plasticidade neuronal ocorre uma maior
permissividade do sistema nervoso ao ambiente, por isto, a ação do estresse, neste período,
sobre o indivíduo, principalmente em áreas responsáveis pelo controle dos sistemas de
resposta ao estresse e por funções cognitivas complexas vem recebendo bastante atenção.
Neste cenário, a utilização de novos modelos experimentais translacionais tem sido
imprescindível, pois permite uma investigação mais detalhada, auxiliando assim na
elucidação destes mecanismos e das patologias. Sendo assim, este trabalho investigou, em
dois estudos, que são apresentados em 2 artigos científicos, os efeitos do estresse social
crônico sobre parâmetros fisiológicos, comportamentais e cognitivos e a sobre a plasticidade
neuronal no córtex pré-frontal durante um período crítico da plasticidade cerebral, a fase
juvenil, em machos de Callithrix jacchus. Durante o experimento, 5 animais foram
acompanhados em seus grupos familiares (GF) e 5 animais foram isolados cronicamente do
convívio social (GI), após um mês de observações em suas famílias (fase basal- FB). Durante
todo o estudo foram realizadas observações comportamentais, coleta de fezes para dosagem
do cortisol e aferições quinzenais do peso dos animais. Ao final do 5º mês foram aplicados
dois testes cognitivos, de aprendizagem reversa, a fim de aferir o funcionamento da memória
de trabalho (MT) dos animais GF e GI. Em seguida, 3 animais de cada grupo foram
sacrificados e análises de imunofluorescência para o BDNF (Brain derived neurotrophic
fator) foram realizadas. Enquanto os animais GF apresentaram variações normais, pertinentes
ao desenvolvimento ontogenético, nos comportamentos e níveis de cortisol, os animais do GI
apresentaram na primeira semana do isolamento um aumento nos níveis de cortisol e no
comportamento de piloereção individual, que indica ativação do sistema nervoso autônomo
9
simpático. A partir do segundo mês de isolamento houve uma redução do cortisol, da
piloereção individual e do peso corporal, concomitantemente ao aumento de comportamentos
estereotipados e da anedonia, alterações estas típicas de um quadro depressivo em primatas
não-humanos. Estes achados foram descritos e discutidos no artigo 1. No artigo 2
apresentarmos os resultados dos testes cognitivos de MT, onde ambos os grupos apresentaram
dificuldades em realizar e aprender as tarefas. Em função disto, foram feitas sugestões de
novos protocolos de testes de MT para machos de saguis juvenis sem conhecimento prévio
aos testes cognitivos. Os testes sugeridos utilizam protocolos que associem tarefas de
aprendizagem social às tarefas de MT, facilitando a aprendizagem dos animais. A presença de
BDNF no córtex pré-frontal, também é apresentada e discutida no artigo 2 e foi independente
do grupo social, mas correlacionou-se com os níveis de cortisol, corroborando estudos com
outras espécies que apontam uma modulação em U invertido do cortisol sobre a neurogênese
e plasticidade neuronal. Sendo assim, os marcadores biológicos e protocolos aqui discutidos
contribuíram na validação desta espécie como modelo animal translacional para desordens de
humor e cognição
Palavras-chave: BDNF, Cortisol, Comportamentos, Depressão, Memória de trabalho.
10
3. INTRODUÇÃO GERAL
O desenvolvimento do sistema nervoso é constituído por um conjunto de eventos
celulares complexos, dinâmicos e sequenciais determinados por fatores genéticos e ambientais
(Tau & Peterson 2009). Atualmente, sabe-se que ao longo do desenvolvimento do indivíduo
existem janelas biológicas temporais onde o sistema nervoso é mais susceptível às influências
ambientais, os chamados períodos críticos do desenvolvimento (Ganzel & Morris 2011).
Estas modificações que ocorrem no sistema nervoso sob influência de estímulos ambientais,
são chamadas de plasticidade (Kolb et al. 2003). A plasticidade pode se manifestar de três
maneiras: a) Morfológica, ou seja, mediante alterações estruturais no neurônio, nos axônios,
nos dendritos, nas sinapses e nos circuitos neuronais (Rosenzweig & Bennett 1996); b)
Funcional, mediante alterações em funções fisiológicas (Chugani 1998); c) Comportamental e
cognitiva, por exemplo, relacionadas com os fenômenos de aprendizagem e de memória
(Cotman & Berchtold 2002).
Nos humanos, as três principais janelas biológicas ocorrem no período pré-natal, pós-
natal precoce, ou neonatal, e na adolescência (ou fase juvenil). Estudos mostram que
alterações plásticas nestes períodos podem desencadear modificações estruturais, fisiológicas,
comportamentais ou cognitivas permanentes (Pryce et al. 2002; Lupien et al. 2009). A
regulação do início e da duração dos períodos críticos, cujos fechamentos culminam nos
amadurecimentos dos circuitos, não se relaciona apenas com a idade, mas, também dependem
da experiência individual e influência ambiental. Se o sistema não é estimulado
adequadamente, os circuitos neurais passam a apresentar amadurecimentos alterados,
facilitando o surgimento de disfunções físicas e psicológicas (Hensch 2003; Fuchs et al.
2006). Diante disto, uma área de estudo de bastante relevância é a modulação do estresse
sobre o desenvolvimento do sistema nervoso (Preussner et al. 2010).
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Já é bem consolidada a compreensão acerca das reações que um indivíduo ativa frente
a desafios (estressores) ambientais físicos ou psicossociais, conhecidas em seu conjunto como
resposta ao estresse. Esta resposta envolve a ativação de vias neuroendócrinas que sustentam
alterações fisiológicas, cognitivas e comportamentais, que tornam o indivíduo apto lidar com
os desafios (Boere 2002). Mecanismos rápidos da transmissão sináptica ativam de imediato o
sistema nervoso autônomo simpático (SNAS) e vias noradrenérgicas centrais, a partir do locus
coeruleos, causando um alerta cognitivo e comportamental. Além disto, ocorre a liberação
sistêmica, através da ativação de neurônios pós-ganglionares simpáticos, dos hormônios
catecolaminérgicos adrenalina e noradrenalina pela medula da adrenal, que promovem além
do alerta comportamental, aumento da glicemia, maior ativação dos sistemas cardiovascular e
respiratório e ativação do sistema imune inato (Riedemann 2010; Segerstrom 2010). Ainda no
âmbito das respostas rápidas, vias neurais centrais que utilizam o fator liberador de
corticotropina (CRF - corticotropin-releasing factor) como neurotransmissor também são
ativadas corroborando para manutenção do alerta cognitivo e comportamental do indivíduo
(Joëls & Baram 2009; Barsegyan et al. 2010). Essas alterações rápidas são seguidas de
mecanismos de ativação mais lentos que envolvem modulação genômica e acionamento de
eixos endócrinos, como o hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), que incrementam e suportam
as ações rápidas disponibilizando energia e direcionando-a para os sistemas fisiológicos
essenciais à situação vigente, modulando assim escolhas de estratégias adequadas para
enfrentar o desafio (Joëls & Baram 2009).
Um dos mecanismos de ação lenta, os neurônios neurossecretórios do núcleo
paraventricular do hipotálamo (PVN - paraventricular nucleus), que compõe o eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (Young et al. 2001), liberam o hormônio ou fator liberador de
corticotropina (CRF - corticotropin-releasing factor) no sistema porta-hipofisário, na região
do infundíbulo da hipófise (ou pituitária). Este fator atinge a adeno-hipofíse, induzindo a
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síntese e a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH - Adrenocorticotropic
hormone) na circulação sistêmica, que por sua vez induz a produção e a liberação de
glicocorticóides pelo córtex das glândulas adrenais (Joëls & Baram 2009). Nos primatas, o
principal glicocorticóide é o cortisol, que se eleva no plasma aproximadamente dez minutos
após a incidência do estressor (Nelson & Guyer 2000). O cortisol induz a glicólise e
gliconeogênese, elevando a glicemia, e inibe a liberação de insulina, reduzindo a utilização da
glicose em tecidos que não são essenciais para a situação de estresse, como: o sistema
digestivo e reprodutor, assim direciona a glicose para os músculos esqueléticos e cérebro
(Riedemann et al. 2010). Além disto, o cortisol modula a distribuição das células do sistema
imune adquirido, desviando-as do sangue para os tecidos mais susceptíveis a infecções,
(Zimpel 2005; Marques Talon 2008) e também estimula a produção de citocinas anti-
inflamatórias, que auxiliam no retorno do funcionamento do sistema imune aos seus níveis
homeostáticos, anteriormente incrementados pela ação da adrenalina e noradrenalina
(Baumann & Turpin 2010). A regulação do eixo HPA ao estímulo estressor ocorre por
mecanismos de retroalimentação negativa, que se dá pela ligação do cortisol aos seus
receptores intracelulares clássicos, principalmente do tipo GR (glucocorticoid receptor), na
hipófise e no hipotálamo (Ulrich-Lai & Herman 2009). A finalização desta resposta é
importante, pois garante ao indivíduo um ajuste fisiológico e comportamental adequado às
demandas geradas e evita o surgimento de patologias (Anacker et al. 2013).
Algumas regiões do cérebro modulam o funcionamento do eixo HPA, por exemplo, o
hipocampo e o córtex pré-frontal medial dorsal, que inibem a ativação do eixo HPA (Zigmond
et al. 1999; Ulrich-Lai & Herman 2009). Por outro lado, as regiões límbicas (amígdala) e o
córtex pré-frontal medial ventral atuam estimulando diretamente o funcionamento do PVN
(Herman et al. 2012). Adicionalmente, observa-se uma modulação simpática, noradrenérgica,
sobre o CPF e amígdala a partir de vias originadas no locus coeruleos (Smith & Vale 2006;
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Arnsten 2009). Além disto, os receptores do CRF (rcrf1 e rcrf2) e do cortisol (MR-
mineralocorticóide receptor e GR- glicocorticóides receptor) são amplamente distribuídos no
córtex pré-frontal (CPF), hipocampo e amígdala, permitindo que tanto o CRF quanto o
cortisol influenciem, em conjunto com as vias noradrenérgicas, a estrutura e o funcionamento
destas áreas e consequentemente dos processos cognitivos associados às mesmas, como
memórias, tomada de decisões e emoções (Bremner 1999; Joëls & Baram 2009).
As alterações fisiológicas, comportamentais e cognitivas induzidas pelo estresse
podem resultar tanto em respostas adaptativas, quanto mal adaptativas. Observa-se uma
relação em curva de U invertido entre o estresse e o desempenho do indivíduo, ou seja, tanto
baixos níveis de estresse, quanto altos níveis, induzem prejuízos físicos, psicológicos e
cognitivos, sendo os níveis intermediários ótimos para promover melhor desempenho
(Arnsten et al. 2009). Por exemplo, estudantes durante os exames finais relatam aumento do
estresse percebido, porém, esta percepção é associada a um incremento no desempenho da
memória de curto prazo, mostrando que o estresse agudo modula positivamente os processos
cognitivos (Vedhara et al. 2000). Um estudo que investiga a atividade do córtex pré-frontal
(CPF) em homens jovens, através do uso da técnica de ressonância magnética, demonstra que
estressores físicos agudos, como a imersão da mão em água fria ou morna, aumentam a
atividade nesta região (Porcelli et al. 2008). Ou seja, estímulos estressores agudos
normalmente induzem alterações benéficas no indivíduo (Sapolsky 2002; Hill et al. 2010).
Estudos com modelos animais, com roedores machos pré-púberes, corroboram os resultados
observados em humanos e demonstram que estressores agudo, como o nado forçado,
incrementam a memória de trabalho, mediada pelo córtex pré-frontal, e avaliada por testes
realizados no labirinto elevado em T, 4 horas ou 1 dia após o estresse agudo (Yuen et al.
2009).
14
Por outro lado, estressores crônicos causam desequilíbrio orgânico, psicológico e
comportamental, devido a ativação exacerbada noradrenérgica e do eixo HPA, que modulam
inadequadamente outros sistemas fisiológicos levando ao surgimento de patologias físicas e
mentais (McEwen 1998; McEwen 2000; McEwen & Norton 2003). Por exemplo, uma doença
de alta prevalência populacional e intimamente associada a incidência de estressores crônicos
é a Depressão Maior. Esta doença atinge cerca de 17 % da população adulta e a Organização
Mundial de Saúde (OMS) afirma ser a quarta maior causa de morbidade, prevendo que em
2020 será a segunda entre as doenças que mais causam perda de vida produtiva, além disso,
será em 2030 o mal mais prevalente do planeta (Fava & Kendler 2000; Anacker et al. 2011;
Penninx et al 2013). A Depressão Maior é um transtorno de humor caracterizado por um
intenso sofrimento pessoal (Joca et al. 2003; Heim et al. 2004) e que em casos mais graves
pode levar a morte, por suicídio (Ebmeier et al. 2006). Por se tratar de uma doença
multifatorial existe uma considerável dificuldade em se realizar diagnósticos adequados, o
que prejudica o início do tratamento (Anacker et al. 2011). Além disto, cerca de um terço dos
pacientes com depressão não consegue alcançar a remissão mesmo após realizar quatro
tratamento sistematicamente aplicados (Warden et al. 2007).
A Depressão Maior também é a forma mais prevalente de transtorno afetivo entre os
adolescentes (Lewinsohn et al. 1998), cerca de 14% dos adolescentes entre 15 a 18 anos
apresentam depressão (Hankin 2006). Estudos associam o surgimento da depressão nesta
faixa etária à fatores sociais, como o excesso de responsabilidade exigido pela sociedade
moderna, que gera diversos eventos estressantes de rotina (Gilmer & Mcknney 2003), a
fatores individuais, como o aspecto emocional negativo e a baixa autoestima, normalmente
observados nesta faixa etária, e ao histórico familiar de depressão (Thapar et al. 2012). Além
disto, existe uma alta correlação entre o surgimento de depressão na vida adulta e a incidência
anterior de sintomas depressivos na adolescência (Aalto-Setälä et al. 2002). Ainda relaciona-
15
se a depressão na adolescência com o aparecimento de déficit de aprendizagem crônico
(Thapar et al. 2012).
Por estes motivos, diversos grupos de estudo buscam por biomarcadores específicos
para a Depressão Maior (DM), que possam auxiliar na rotina clínica, no diagnóstico e no
tratamento (Anacker et al. 2011; Belzung 2014; Palhano-Fonte et al. 2014). Assim como
buscam novas terapias farmacológicas, que atuem fora do sistema monoaminérgico, onde
atuam os antidepressivos convencionais (Palhano-Fonte et al. 2014). Na tentativa de elucidar
melhor os transtornos de humor e os prejuízos cognitivos decorrentes deste e do estresse
crônico, modelos animais translacionais vêm sendo cada vez mais utilizados em estudos
anatômicos, funcionais e comportamentais (Rosenzweig & Bennett 1996; Cotman &
Berchtold 2002). O modelo animal translacional mais empregado são os roedores devido ao
fácil manuseio e a existência de protocolos já bem estabelecidos (Willner et al. 1992). No
entanto, como os roedores e os humanos apresentam consideráveis diferenças estruturais,
funcionais, comportamentais, além de histórias evolutivas e organizações sociais distintas,
buscam-se modelos animais filogeneticamente mais próximos aos humanos, que possam
melhor mimetizar as suas patologias (Pryce et al. 2005).
Callithrix jacchus ou sagui, um pequeno primata neotropical, vem sendo amplamente
utilizado em estudos de estresse crônico, pois apresentam uma gama de alterações de estados
fisiológicos e comportamentais que se assemelham ao observado em humanos, de forma que
podem contribui para investigações de patologias associadas ao estresse, como é o caso da
depressão (Galvão-Coelho et al. 2008; Galvão-Coelho et al. 2012; Li et al. 2013; Sousa et al.
2015). Esta espécie também vem sendo usada com sucesso em estudos de ansiedade (Johnson
et al. 1996) e cognição (Murai et al. 2013; Spinelli et al. 2004). Tradicionalmente, grande
parte destes estudos com estresse em saguis utilizam animais adultos (Leuner et al. 2007;
Marlatt et al. 2011; Galvão-Coelho et al. 2008) ou infantes (Dettling et al. 2002; Pryce et al.
16
2002), porém recentemente após o entendimento que a fase juvenil é um período crítico de
plasticidade neuronal, estudos com animais juvenis começaram a surgir (Taylor et al. 2014,
Sousa et al. 2015; Taylor et al. 2015).
Sendo assim, tendo em vista a importância do período juvenil como uma janela
biológica, cujas alterações plásticas podem perdurar por toda a vida do indivíduo,
considerando o aumento da incidência da depressão na adolescência e dos prejuízos
cognitivos gerados em função da depressão e do estresse crônico, este trabalho investigou os
efeitos do estresse social crônico em machos juvenis de Callithrix jacchus a partir da análise
de parâmetros fisiológicos (cortisol fecal e o peso), comportamentais e cognitivos (memória
de trabalho) e da plasticidade neuronal no córtex pré-frontal, a fim de corroborar na validação
desta espécie como modelo animal translacional para desordens de humor e cognição.
4. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar os efeitos do estresse social crônico sobre parâmetros fisiológicos (cortisol
fecal e peso), comportamentais e cognitivos e sobre a plasticidade neuronal no córtex pré-
frontal durante a fase juvenil, em machos de Callithrix jacchus, buscando a validar esta
espécie como modelo animal translacional para desordens de humor e cognição.
Objetivo Específico
1. Investigar os efeitos do isolamento social crônico sobre parâmetros fisiológicos
(cortisol fecal e peso) e comportamentais em animais juvenis machos de Callithrix
jacchus, com objetivo de caracterizar biomarcadores e um protocolo indutor de
depressão para animais juvenis desta espécie (Artigo 1).
17
2. Avaliar os efeitos do isolamento social crônico sobre os níveis de cortisol, o
desempenho da memória de trabalho e a relação de ambos com a presença de BDNF
no córtex pré-frontal na fase juvenil, em machos juvenis de Callithrix jacchus (Artigo
2).
18
ARTIGO 1
ALTERAÇÕES FISIOLOGICAS E COMPORTAMENTAIS EM MODELO ANIMAL DE
DEPRESSÃO JUVENIL: CALLITHRIX JACCHUS, UM PRIMATA NÃO-HUMANO
Ana Cecília de Menezes Galvão1 & Nicole Leite Galvão Coelho².
¹ Mestranda do Programa de Pós-graduação em Psicobiologia, Departamento de Fisiologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
2 Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brasil
Título curto: CALLITHRIX JACCHUS, modelo animal de depressão juvenil.
Endereço de correspondência:
Nicole L. Galvão-Coelho
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Departamento de Fisiologia
Caixa Postal, 1511
59078-970 NATAL, RN, BRASIL
Tel 55 84 3215-3410
Fax 55 84 3211-9206
E-mail: [email protected]
19
RESUMO
A Depressão Maior (DM) é um transtorno psiquiátrico bastante comum na população
e cujo os sintomas incluem alterações no apetite, psicomotoras e no sono (insônia ou
hipersonia), perda ou ganho de peso considerável, fadiga, mudanças no humor, baixa
autoestima, prejuízos cognitivos, ocupacionais e sociais, associados a disfunções
neurovegetativas e em alças endócrinas. Esta enfermidade, muitas vezes, tem início na
adolescência, com taxas de prevalência por volta de 14% para jovens entre 15 a 18 anos, e se
apresenta de maneira crônica, não apresentando remissão mesmo após vários tratamentos
farmacológicos. Diante disto, vários modelos animais e protocolos para o estudo da depressão
vêm sendo desenvolvidos tanto para auxiliar no entendimento desta patologia, quanto para
buscar novas terapias. Este estudo investigou os efeitos do isolamento social crônico (13
semanas) sobre parâmetros fisiológicos (cortisol fecal e peso) e comportamentais em machos
juvenis de Callithrix jacchus, com objetivo de caracterizar biomarcadores e um protocolo
indutor de depressão em animais juvenis nesta espécie. No 1° mês do estudo, durante 4
semanas, as coletas de dados foram realizadas em dias alternados, em 10 animais que
habitavam gaiolas com os familiares (Fase basal- FB). Posteriormente, foram formados dois
grupos: grupo familiar (GF; n = 5), onde os animais permaneceram na família, e o grupo de
isolamento social (GI; n = 5), onde os animais foram separados da família por 13 semanas.
Durante as 13 semanas, correspondente ao período de isolamento para o GI, as coletas de
dados foram realizadas diariamente durante a primeira semana de cada mês para ambos os
grupos (GF e GI). O peso dos animais foi aferido quinzenalmente ao longo de todo o estudo.
O GF não apresentou variações significativas do cortisol ao longo do estudo. O GI apresentou
na primeira semana do isolamento social um aumento significativo nos níveis de cortisol e
piloereção individual, comportamento que indica ativação do sistema nervoso autônomo
simpático. A partir do segundo mês de isolamento, os animais GI apresentaram uma redução
20
significativa no cortisol, simultaneamente a um aumento na expressão da autocatação, de
comportamentos estereotipados e da anedonia. Foi observada uma redução significativa no
peso dos animais GI no terceiro mês de isolamento, que não foi acompanhada de redução na
ingestão alimentar, e que foi recuperado ao final do estudo. As alterações fisiológicas e
comportamentais encontradas em função do isolamento social crônico para os animais GI são
características de quadros depressivos em primatas não-humanos, e podem ser utilizadas
como biomarcadores para depressão nesta espécie, sexo e faixa etária, e corroboram no
processo de validação do isolamento social crônico como protocolo indutor de depressão e do
C. jacchus como modelo translacional de depressão juvenil.
Palavras-chave: Cortisol, comportamentos, depressão, modelo animal translacional, estresse
crônico, sagui.
21
INTRODUÇÃO
A Depressão Maior (DM) é um transtorno de humor bastante comum, estando
classificada atualmente como a terceira principal causa de doença na população, de acordo
com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a depressão será a segunda entre as doenças
que mais causam incapacidade de vida produtiva em 2020 (Anacker et al. 2011), podendo
atingir o primeiro lugar em 2030 (Penninx et al 2013). Os sintomas incluem intenso
sofrimento pessoal, normalmente induzido por estresse crônico ou trauma emocional,
associados a alterações no apetite, psicomotoras e no sono (insônia ou hipersonia), perda ou
ganho de peso considerável, fadiga, mudanças no humor, baixa autoestima, prejuízos
cognitivos, ocupacionais e sociais, associados a disfunções neurovegetativas e em alças
endócrinas e nos casos mais severos pode levar a morte, por suicídio (Fava & Kendler 2000;
Joca et al. 2003; Heim et al. 2004; Ebmeier et al 2006).
Apesar do progresso substancial no desenvolvimento de novos medicamentos, menos
da metade dos pacientes alcançam remissão após um tratamento antidepressivo, e mesmo
após quatro tratamentos sistematicamente aplicados cerca de um terço não consegue alcançar
a remissão (Warden et al. 2007). Uma das grandes dificuldades inerente tanto ao diagnóstico,
quanto ao tratamento, da depressão diz respeito à ausência de biomarcadores específicos
relacionados a essa doença. Diante disso, nos últimos anos alguns grupos de pesquisa de têm
buscado identificar biomarcadores que auxiliem no diagnóstico da DM (Anacker et al. 2011;
Palhano-Fonte et al. 2014) e que possam servir para avaliação laboratorial complementar,
auxiliando, assim, na rotina clínica (Belzung 2014). Para isto, diversas espécies vêm sendo
utilizadas como modelo animal translacional e vários protocolos de estresse estão sendo
testados, na tentativa de desenvolver um modelo que mimetize os estados fisiológicos e
comportamentais observados no transtorno depressivo em humanos (Li et al. 2013).
22
Um dos modelos animais translacionais mais utilizados para investigação da depressão
e de seus tratamentos farmacológicos são os roedores, devido ao fácil manuseio e a existência
de protocolos já bem estabelecidos (Willner et al. 1992). No entanto, vem sendo observadas
discrepância na eficácia dos tratamentos farmacológicos utilizado nos humanos e testados
com sucesso em roedores, uma vez que menos da metade dos pacientes com depressão
respondem às terapias farmacológicas validadas nestas espécies (Belzung 2014). Muito
provavelmente esta discrepância se deve aos distintos estados patológicos dos humanos e dos
roedores, as diferentes organizações morfofuncionais cerebrais entre estas espécies e também
as diferenças na organização social e na história evolutiva (Pryce et al. 2005). A DM nos
humanos normalmente é decorrente de um forte estresse de natureza psicossocial, enquanto
que nos roedores a indução de um estado patológico similar a DM muitas vezes é gerado por
protocolos de natureza física (exposição ao frio intenso ou choque elétrico) (Frazer & Morilak
2005) ou sociais (separação materna) (Pryce et al. 2002; Lupien et al. 2009), com baixa
validade etológica, já que em sua grande maioria os roedores são animais de hábitos solitários
e cuidado parental reduzido, se comparado com primatas. Além disto, também observa-se
divergências com relação a duração do estressor, geralmente os protocolos utilizados para
induzir DM em roedores são agudos, enquanto nos humanos a DM normalmente é associada a
incidência crônica de um agente estressor (Joca et al. 2003; Shively & Willard 2012).
Diante disto, alguns estudos vêm utilizando espécies com organizações sociais e
filogenia mais próximas aos humanos, como os primatas não-humanos, para estudar a
depressão (Pryce et al. 2005). Os primatas não-humanos, assim como os humanos, necessitam
da interação social para apresentarem uma boa adaptação ambiental, a qual é um reflexo do
bom funcionamento dos seus mecanismos comportamentais, neurais, hormonais, celulares e
genéticos (Cacioppo et al. 2011). Nestas espécies, dependendo da sua organização social,
usam-se protocolos prolongados de alterações do posto social ou isolamento social para
23
induzir alterações fisiológicas e comportamentais similares as observadas em um quadro
depressivo nos humanos (Cacioppo et al. 2011; Shively & Willard 2012; Li et al. 2013; Cinini
et al. 2014).
Apesar da maior parte dos estudos com modelos translacionais para os transtornos de
humor utilizarem animais adultos (Qin et al. 2015), cada vez mais observa-se um aumento na
incidência de episódios depressivos em adolescentes. As taxas de Depressão Maior entre
jovens de 15 a 18 anos atingem os 14% da população, com aproximadamente 40% de
recorrência entre 3-5 anos (Hankin 2006). Estudos associam o surgimento da depressão nesta
faixa etária à fatores sociais, como o excesso de responsabilidade exigido pela sociedade
moderna, que gera diversos eventos estressantes de rotina (Gilmer & McKnney 2003), a
fatores individuais, como aspecto emocional negativo e baixa autoestima, normalmente
observados nesta faixa etária, e ao histórico familiar de depressão (Heim & Binder 2012;
Thapar et al. 2012). Diante disso, alguns grupos de pesquisas além de buscarem por
biomarcadores para DM e por tratamentos mais eficazes, discutem sobre a incidência da
depressão na adolescência, os prejuízos induzidos pela doença, assim como o uso de
antidepressivos nesta faixa etária, vez que os tratamentos usados podem levar a alterações
cerebrais permanentes (Thapar et al. 2012; Ambrosini 2000). Pois, sabe-se hoje, que a fase
juvenil, ou adolescência, é uma importante etapa da ontogênese do individuo, onde ocorre
uma das principais janelas biológicas do sistema nervoso, sendo este mais plástico e
susceptível a influências ambientais, que podem induzir alterações permanentes tanto
cognitivas quanto nos sistemas de resposta ao estresse. Se tais alterações forem mal
adaptativas levam a sérias repercussões na vida adulta e aumentam a probabilidade do
surgimento de distúrbios de humor, como a depressão (Hankin 2006; Ganzel & Morris 2011).
Sendo assim, este estudo utilizou machos juvenis da espécie Callithrix jacchus para
investigar os efeitos do isolamento social crônico (13 semanas) sobre parâmetros fisiológicos
24
(cortisol fecal e peso) e comportamentais, com objetivo de caracterizar biomarcadores e um
protocolo indutor de depressão em animais juvenis nesta espécie. O C. jacchus é um primata
não- humano de pequeno porte e de vida social que apresenta uma boa adaptação ao cativeiro
e uma alta taxa de fecundidade, quando comparado com os primatas do Velho Mundo (Abbott
& Hearn 1978; Dixson & Lunn 1987). Esta espécie apresentam uma gama de alterações de
estados fisiológicos e comportamentais que se assemelham ao observado em humanos, de
forma que podem contribuir para investigações de patologias associadas ao estresse, como é o
caso da depressão (Galvão-Coelho et al. 2008; Galvão-Coelho et al. 2012; Li et al. 2013;
Sousa et al. 2015). Além disso, possui um etograma bem definido (Stevenson & Poole 1976),
e técnicas não invasivas para a medição de hormônios esteróides (cortisol, progesterona e
andrógenos) em fezes (Sousa & Ziegler 1998), o que facilita ainda mais a sua utilização como
modelo experimental em desordens associadas ao eixo Hipotálamo-Hipofise-Adrenal (HPA)
(Galvão-Coelho et al. 2008).
METODOLOGIA
Animais
Este estudo utilizou 10 machos juvenis, (segundo a classificação de Leão et al. 2009),
com a faixa etária aproximada de 7 meses no início do estudo. Todos os animais viviam em
cativeiro, no Laboratório de Estudos Avançados em Primatas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (LEAP), em gaiolas familiares localizadas na área externa da colônia, em
condições naturais de iluminação, umidade e temperatura. As gaiolas mediam 3.0 x 2.0 x 1.0
m, eram construídas em alvenaria, possuíam na sua parede anterior um visor unidirecional e
na parede posterior uma porta em tela de arame, na qual eram encaixados o bebedouro e o
prato de alimentação. No interior da gaiola havia uma caixa ninho para descanso e pranchas
de madeiras e poleiros de galhos de plantas para o deslocamento dos animais. A alimentação
25
de rotina dos animais foi à base de frutas e uma papa nutritiva constituída de leite, aveia, ovo
e pão. Foi ainda administrado, duas vezes na semana, o suplemento multivitamínico, glicocan.
Os animais foram pesados, aproximadamente, a cada 15 dias. Anteriormente ao início do
estudo, todos os animais foram habituados à presença do tratador e dos experimentadores. Os
animais foram acompanhados durante todo o estudo pelo médico veterinário e tratados de
acordo com as normas estabelecidas pela Instrução Normativa 169 do IBAMA de 20 de
fevereiro de 2008 e as normas de cuidados estabelecidos pelo CONCEA – Conselho Nacional
de Controle de Experimentação Animal, da Lei N 11.794, de 08 de outubro de 2008 (Lei
Arouca). O criadouro segue as normas internacionais de manutenção de animais ex situ
propostas pela Animal Behavior Society e International Primatological Society. Os
procedimentos realizados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de
Animal (CEUA – UFRN), segundo o protocolo 019/2013.
Desenho experimental
1. Grupos:
Grupo familiar (GF): Cinco machos juvenis foram acompanhados por 17 semanas em seu
ambiente familiar.
Grupo de isolamento social (GI): Cinco machos juvenis foram acompanhados por 4
semanas em seu ambiente familiar e posteriormente isolados socialmente, por 13 semanas, em
uma nova gaiola (2.0 x 2.0 x 1.0 m) de dimensões diferentes da gaiola anterior, mas sem
restrições espaciais. Os animais GI nunca haviam sido separados da família. Durante o
isolamento social, o animal não teve contato visual com outros co-especificos, porém tiveram
contato auditivo e olfatório, com outros animais da colônia, porém não com seus familiares.
Não houve restrição alimentar ou de ingestão de água. A duração do isolamento social foi
26
determinada de acordo com outros estudos relacionados com estresse crônico em primatas
não-humanos (Cacioppo et al. 2011; Li et al. 2013; Cinini et al. 2014).
2. Fases:
Fase basal (FB)- Em ambos os grupos, os animais foram incialmente observados durante 4
semanas na gaiola com a família com coletas de dados (comportamentais e fezes) em dias
alternados com finalidade de estabelecer o perfil hormonal e comportamental dentro da
família de origem.
Fases experimentais- Posteriormente, durante 13 semanas, as coletas de dados foram
realizadas diariamente na primeira semana de cada mês (F2, F3, F4, F5), para ambos os
grupos.
Registro comportamental
Os animais foram observados, sempre no mesmo horário (6:30 da manhã) para evitar a
variação circadiana do comportamento (Erkert 1989), através do visor unidirecional na parede
frontal da gaiola, que se encontra voltada para a sala de observação. O método utilizado nas
observações comportamentais foi o focal contínuo, contabilizando a frequência e/ou a duração
dos comportamentos, listados a seguir na tabela 1, durante o intervalo de 30 minutos para
cada animal (Altmann 1974). Foram registrados os comportamentos individuais de marcação
de cheiro (frequência), piloereção individual (frequência), autocatação (duração),
deslocamento (frequência), coçar (duração) e ingestão de alimentos (duração e frequência),
segundo o etograma de Stevenson & Poole (1976). O tempo e a frequência da ingestão de
uma solução aquosa de sacarose foi mensurado a fim de verificar a capacidade de sentir
prazer do animal, e avaliar um possível estado de anedonia (adaptado de Paul et al. 2000).
27
Tabela 1. Descrição dos comportamentos
COMPORTAMENTO DESCRIÇÃO
Marcação de Cheiro Ato de esfregar a região anogenital ou
suprapúbica em um substrato.
Piloereção Individual Ato de eriçar o pelo e andar com o dorso
arqueado.
Autocatação Ato de catar o próprio pelo.
Deslocamento Ato de se locomover entre os diferentes
quadrantes delimitados em uma gaiola.
Coçar Ato de utilizar as mãos para esfregar alguma
região do corpo.
Ingestão de alimentos Ato de levar um pedaço de alimento à boca e
ingeri-lo.
Ingestão da solução aquosa de sacarose Ato de ingerir substâncias palatáveis (solução de
sacarose).
Coleta de fezes
As coletas de fezes foram realizadas sempre em um mesmo intervalo de horários
(entre 6:30 – 8:30) para evitar influência circadiana sobre as análises (Raminelli et al. 2001).
Antes da coleta de fezes, as gaiolas foram limpas para facilitar a identificação de amostras.
Quando o animal defecava, o observador entrava na gaiola e recolhia a amostra utilizando
uma espátula de madeira. Em seguida, as amostras foram identificadas e armazenadas em
tubos de plástico a cerca de -4 °C. Posteriormente, estas amostras foram processadas para
dosagem do cortisol.
Dosagem hormonal
A dosagem do cortisol fecal foi realizada no Laboratório de Medidas Hormonais, do
Departamento de Fisiologia da UFRN, de acordo com o protocolo de Sousa & Ziegler (1998).
Em resumo, o protocolo é composto por uma etapa inicial de extração, onde os esteróides na
28
forma livre são separados a partir de substâncias que são solúveis em água, etapa chamada de
hidrólise. Isto é seguido pela etapa da solvólise, que se destina a realizar a separação de
conjugados esteróides utilizando o etanol. O extrato de cortisol, ressuspenso no álcool é
utilizado para dosagem do hormônio pelo método de ELISA competitivo. Os coeficientes de
variação foram 1,78 e 15,47% para intra e interplacas respectivamente.
Análise estatística
Foi utilizado o teste ANOVA para medidas repetidas e o post hoc de Fisher para
investigar as variações do cortisol e peso entre os grupos (GI e GF; variável independente) e
ao longo das fases (FB, F2, F3, F4, F5; variável dependente repetida). Os dados hormonais
foram normalizados por transformação logarítmica e um outlier 4 desvios padrão acima da
média foi excluído em um animal na F3.
Para os comportamentos, foi utilizado teste GLM e o post hoc de Fisher para
investigar a variação dos comportamentos entre os grupos (GI e GF; variável independente) e
ao longo das fases (FB, F2, F3, F4, F5; variável dependente repetida). Para isto, aplicou-se a
técnica de reamostragem estatística do bootstrap, pois os dados não apresentavam distribuição
normal. Aplicou-se ainda o teste não-paramétrico Mann-Whitney para analisar se houve
diferença para os comportamentos entre os grupos (GF e GI) quando as fases experimentais
foram agrupadas (F2, F3, F4 e F5).
As possíveis correlações entre hormônio e comportamentos foram investigadas
durante as fases experimentais, analisadas conjuntamente, através do teste de correlação de
Spearman.
O nível de significância considerado foi de p < 0.05 em todos os testes.
RESULTADOS
29
Perfil hormonal
Os animais do grupo familiar (μ = 4,3 ± 0,46 ng/g) apresentou níveis gerais de cortisol
mais elevados do que os do grupo de isolamento social (μ = 3,02 ± 0,3 ng/g) (ANOVA para
medidas repetidas; Grupo*: F = 4,9 p = 0,03). Os grupos apresentaram variação do cortisol
diferente ao longo das fases (ANOVA para medidas repetidas; Fases*Grupo: F = 3,9; p =
0,004). O GF não apresentou variações significativas nos níveis de cortisol ao longo das fases
(Fisher post hoc- FB*F2, p = 0,77; FB*F3, p = 0,12; FB*F4, p = 0,74; FB*F5, p = 0,98;
F2*F3, p = 0,2; F2*F4, p = 0,96; F2*F5, p = 0,76; F3*F4, p = 0,22; F3*F5, p = 0,12; F4*F5,
p = 0,73). Para os animais que foram separados de seu grupo familiar, um aumento no cortisol
foi observado em F2, com maiores níveis de hormônio nesta fase quando comparado com
todas as outras fases do estudo (Fisher post hoc- F2*FB, p = 0,0003; F2*F3, p = 0,0003;
F2*F4, p = 0,001; F2*F5, p = 0,001). Após F2 observou-se um redução gradual do cortisol
através das fases para o GI, com concentrações em F5 menores que os níveis basais (Fisher
post hoc- F3*FB, p = 0,49; F3*F4, p = 0,18; F3*F5, p = 0,001; F4*FB, p = 0,51; F4*F5, p =
0,003; F5*FB, p = 0,001) (figura 1).
30
GF
GIFB F2 F3 F4 F5
0
2
4
6
8
10
Co
rtis
ol
feca
l (n
g/g
)
*FB, F3, F4, F5
*FB, F3, F4
Figura 1: Níveis de cortisol fecal nos grupos familiar (GF) e isolamento social (GI) de machos
juvenis de C. jacchus ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo * = diferença
estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a(s) fase (s) apontada (s) ao
lado do símbolo. ANOVA para medida repetida e post hoc de Fisher, p < 0,05.
Perfil comportamental
- Marcação de cheiro
Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre GI e GF para as
frequências gerais do comportamento de marcação de cheiro (GLM; Grupo: F = 1,37 p =
0,242). Entretanto, observaram-se maiores frequências de marcação de cheiro para o GI que o
GF, considerando-se as fases experimentais conjuntamente (F2, F3, F4, F5) (Mann-Whitney:
U = 395,5 p = 0,02) (figura 2a). Os grupos, GF e GI, apresentaram variações similares do
comportamento ao longo das fases (GLM; Fases*Grupo: F = 0,75 p = 0,55), e foi observado
um aumento nas frequências deste comportamento na F4 com relação a FB, F3 e F5 (GLM;
31
Fases: F = 3,02 p = 0,01, Fisher post hoc- F4*FB, p = 0,006; F4*F3, p = 0,001; F4*F5, p =
0,03) (figura 2b).
Figura 2: Frequências do comportamento de marcação de cheiro em machos juvenis de C.
jacchus. (a) Durante as fases experimentais (F2, F3, F4, F5) para o grupo familiar (GF) e
isolamento social (GI). (b) Ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo * =
diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a (s) fase (s)
apontada (s) ao lado do símbolo. ** = diferença estatística significativa entre os grupos, GLM
e post hoc de Fisher, p < 0,05.
- Piloereção individual
O GI (μ = 0,23 ± 0,06) apresentou frequências gerais de piloereção individual maiores
que o GF (μ = 0,1 ± 0,02) (GLM; Grupos: F = 4,8 p = 0,02), assim como também apresentou
maiores frequências piloereção que o GF considerando-se as fases experimentais
conjuntamente (F2, F3, F4, F5) (Mann-Whitney: U = 420 p = 0,02) (figura 3a). Não foram
observadas diferenças na frequência da piloereção entre as fases para o GF (GLM;
Grupos*fases: F = 2,36 p = 0,03, Fisher post hoc-FB*F2, p = 0,74; FB*F3, p = 0,87; FB*F4,
p = 0,62; FB*F5, p = 0,87; F2*F3, p = 0,87; F2*F4, p = 0,41; F2*F5, p = 0,87; F3*F4, p =
0,51; F3*F5, p = 1; F4*F5, p = 0,5), porém para o GI observou-se um aumento na F2 com
32
relação as demais fases (GLM; Grupos*fases: F = 2,36 p = 0,03, Fisher post hoc- FB*F2, p =
0,07; FB*F3, p = 0,41; FB*F4, p = 0,41; FB*F5, p = 0,19; F2*F3, p = 0,009; F2*F4, p =
0,009; F2*F5, p = 0,002; F3*F4, p = 1; F3*F5, p = 0,62; F4*F5, p = 0,62) (figura 3b).
Figura 3: Frequência do comportamento de piloereção individual em machos juvenis de C.
jacchus. (a) Durante as fases experimentais (F2, F3, F4, F5) nos grupo familiar (GF) e
isolamento social (GI). (b) Nos grupos ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5),
sendo * = diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a (s) fase
(s) apontada (s) ao lado do símbolo. ** = diferença estatística significativa entre os grupos,
GLM e post hoc de Fisher, p < 0,05.
- Autocatação
Os grupos não apresentaram diferenças estatisticamente significativas nas durações
gerais do comportamento de autocatação (GLM; Grupos: F = 2,12 p = 0,14) (figura 4a). Nas
fases experimentais analisadas em conjunto, os grupos não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas nas durações deste comportamento (Mann-Whitney: U = 9029
p = 0,89).
No entanto, os grupos apresentaram variações distintas do comportamento ao longo
das fases (GLM; Fases*Grupo: F = 7,52 p = 0,001). Enquanto o GF não apresentou variações
33
deste comportamento ao longo das fases (Fisher post hoc – FB*F2, p = 0,5; FB*F3, p = 0,3;
FB*F4, p = 0,9; FB*F5, p = 0,8; F2*F3, p = 0,7; F2*F4, p = 0,4; F2*F5, p = 0,3; F3*F4, p =
0,2; F3*F5, p = 0,2; F4*F5, p = 0,8), o GI, na F4 e F5, apresentaram maiores durações de
autocatação do que a FB, F2 e F3 (Fisher post hoc – F4*FB, p = 0,001; F4*F2, p = 0,001;
F4*F3, p = 0,001; F5a*FB, p = 0,001; F5*F2, p = 0,001; F5*F3, p = 0,001) (figura 4b).
Foram observados maiores períodos de autocatação para o GI, que o GF, na F4 e F5 (Fisher
post hoc – FB, p = 0,054; F2, p = 0,11; F3, p = 0,93; F4, p = 0,003; F5, p = 0,02) (Figura 4b).
Figura 4: Duração (segundos) do comportamento de autocatação em machos juvenis de C.
jacchus. (a) Níveis gerais nos grupo familiar (GF) e isolamento social (GI). (b) Para os grupos
ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo * = diferença estatística
significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a (s) fase (s) apontada (s) ao lado do
símbolo. # = diferença estatística entre os grupos na respectiva fase. GLM e post hoc de
Fisher, p<0,05
- Deslocamento
O grupo isolamento social (μ = 35,86 ± 2,10) apresentou frequências gerais de
deslocamento maiores que o grupo de familiar (μ = 29,87 ± 1,35) (GLM; Grupo: F = 4,18 p =
0,04) (figura 5a). Não foram observadas variações significativas deste comportamento nas
fases experimentais analisadas em conjunto (Mann-Whitney: U = 9207 p = 0,63). Não foram
34
observadas variações significativas deste comportamento ao longo das fases para ambos os
grupos (GLM; Fases: F = 0,978 p = 0,41; Fases*Grupo: F = 1,71 p = 0,14) (figura 5b).
Figura 5: Frequências do comportamento de deslocamento em machos juvenis de C. jacchus.
(a) Níveis gerais no grupo familiar (GF) e isolamento social (GI). (b) Para os grupos ao longo
das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo ** = diferença estatística significativa entre
os grupos. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Coçar
O grupo de isolamento social (μ = 17,2 ± 0,77) apresentou níveis gerais de coçar mais
elevados do que o grupo familiar (μ = 11,16 ± 0,51) (GLM; Grupo: F = 43,17 p = 0,001)
(figura 6a). Também foi encontrado maiores durações deste comportamento no GI com
relação ao GF quando as fases experimentais foram analisadas conjuntamente (Mann-
Whitney: U = 5343 p = 0,001).
Além disto, os grupos apresentaram variações na duração do comportamento de coçar
diferentes ao longo das fases (GLM; Fases*Grupo: F = 11,07; p = 0,001). O GF não
apresentou diferença para este comportamento entre as fases (Fisher post hoc- FB*F2, p =
0,97; FB*F3, p = 0,2; FB*F4, p = 1; FB*F5, p = 0,2; F2*F3, p = 0,22; F2*F4, p = 0,97;
F2*F5, p = 0,28; F3*F4, p = 0,2; F3*F5, p = 0,88; F4*F5, p = 0,26). O GI apresentou um
aumento consecutivo deste comportamento em F3, F4 e F5 com relação a FB e F2 (Fisher
35
post hoc- F3*FB, p = 0,001; F3*F2, p = 0,001; F4*FB, p = 0,001; F4*F2, p = 0,001; F5*FB,
p = 0,001; F5*F2, p = 0,001). E um aumento na F5 com relação a F3 (Fisher post hoc- F5*F3,
p = 0,02) (figura 6b). Foram observadas também maiores frequências deste comportamento
em F3, F4 e F5 para o GI, com relação ao GF (Fisher post hoc – FB, p = 0,56; F2, p = 0,52;
F3, p = 0,001; F4, p = 0,001; F5, p = 0,001) (figura 6b).
Figura 6: Duração do comportamento de coçar em machos juvenis de C. jacchus. (a) Níveis
gerais no grupo familiar (GF) e isolamento social (GI). (b) Para os grupos ao longo das fases
do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo ** = diferença estatística significativa entre os grupos.
* = diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a(s) fase (s)
apontada (s) ao lado do símbolo. # = diferença estatística entre os grupos na respectiva fase.
GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Ingestão de solução aquosa de sacarose
Os grupos não apresentaram diferenças significativas nos níveis gerais de ingestão da
solução aquosa de sacarose (GLM; Grupo: F = 0,08 p = 0,76). Porém, analisando apenas as
fases experimentais conjuntamente, observou-se maiores ingestões nos animais do GF com
relação ao GI (Mann-Whitney: U = 7486 p = 0,005) (figura 7a).
36
Ao longo do estudo foi observado uma redução da ingestão da solução aquosa de sacarose
para ambos os grupos (GLM; Fases*Grupos: F = 15,4 p = 0,001/ Fisher post hoc – GF: FB*F2, p
= 0,05; FB*F3, p = 0,85; FB*F4, p = 0,1; FB*F5, p = 0,002; F2*F3, p = 0,08; F2*F4, p = 0,73;
F2*F5, p = 0,24; F3*F4, p = 0,15; F3*F5, p = 0,003; F4*F5, p = 0,13; GI: FB*F2, p = 0,001;
FB*F3, p = 0,001; FB*F4, p = 0,001; FB*F5, p = 0,001; F2*F3, p = 0,61; F2*F4, p = 0,26;
F2*F5, p = 0,03; F3*F4, p = 0,53, F3*F5, p = 0,1; F4*F5, p = 0,31 (figura 7b) / Fases*: F = 9,3 p
= 0.001, Fisher post hoc- FB*F2, p = 0.001; FB*F3, p = 0.001; FB*F4, p = 0.001; FB*F5, p =
0.001; F2*F3, p = 0.11; F2*F4, p = 0.3; F2*F5, p = 0.5; F3*F4, p = 0.58; F3*F5, p = 0.35; F4*F5,
p = 0.7).
Figura 7: Duração do comportamento de ingestão da solução aquosa de sacarose em machos
juvenis de C. jacchus. (a) Para os grupos ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5).
(b) Percentual de variação da relação da ingestão da solução aquosa de sacarose sobre
ingestão total de alimentos, entre FB e F5, em machos juvenis de C. jacchus, para os grupos
GF (grupo familiar) e GI (grupo isolado), sendo * = diferença estatística significativa entre a
fase que se encontra o símbolo e a(s) fase (s) apontada (s) ao lado do símbolo; ** = diferença
estatística significativa entre os grupos. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
37
Além disso, o percentual de variação da ingestão da solução de sacarose sobre a
ingestão geral de alimentos, entre FB e a F5, foi diferente. O GI apresentou um percentual de
redução quase três vezes maior que o GF (Mann-Whitney: U = 2 p = 0,02) (figura 8).
{Fórmula = [(μfrequência ingestão de sacarose_ FB) - (μfrequência ingestão de sacarose_ F5a) *100/
[(μfrequência ingestão total de alimentos_ FB) - (μfrequência ingestão total de alimentos _ F5a)]}.
Figura 8: Duração do comportamento de ingestão da solução aquosa de sacarose em machos
juvenis de C. jacchus. # = diferença estatística entre os grupos na respectiva fase. Mann-
Whitney, p<0,05.
- Ingestão de alimentos
O grupo de isolamento social (μ = 5,68 ± 0,24) apresentou durações gerais de ingestão
de alimentos mais elevados do que o grupo familiar (μ = 4,74 ± 0,20) (GLM; Grupo: F = 6 p
= 0,01) (figura 8a). Não foram observadas variações significativas deste comportamento ao
38
longo das fases (GLM; Fases: F = 0,95 p = 0,43; Fases*Grupo: F = 0,48; p = 0,74) (figura
8b).
Figura 8: Duração do comportamento de ingestão de alimentos em machos juvenis de C.
jacchus. (a) Níveis gerais no grupo familiar (GF) e isolamento social (GI). (b) Para os grupos
ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo ** = diferença estatística
significativa entre os grupos. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Peso
A variação de peso corporal ao longo do estudo foi diferente entre os grupos (GLM;
Fases*Grupo: F = 3,59; p = 0,02). Analisando apenas as fases experimentais conjuntamente,
não observou-se diferenças estatística significativamente entre os grupos (Mann-Whitney: U
= 239 p = 0,22).
O GF aumentou significativamente o peso na F5 com relação a FB e F2 (Fisher post
hoc: F2*FB, p = 0,32; F3*FB, p = 0,053; F4*FB, p = 0,007; F5*FB, p = 0,001; F2*F3, p =
0,31; F2*F4, p = 0,38; F2*F5, p = 0,01; F3*F4, p = 0,88; F3*F5, p = 0,09; F4*F5, p = 0,07).
Por outro lado, o GI apresentou perda de peso na F4, com relação a todas as fases do estudo
(Fisher post hoc: F4*FB, p = 0,02; F4*F2, p = 0,009; F4*F3, p = 0,001; F4*F5, p = 0,0001).
E uma recuperação em F5 apresentando pesos maiores que as fases iniciais e semelhantes ao
39
grupo familiar (Fisher post hoc: F5*FB, p = 0,002; F5a*F2, p = 0,006; F5*F3, p = 0,03)
(figura 9). Foi observado também maiores médias do peso em F4 para o GF, que para o GI
(Fisher post hoc – FB, p = 0,68; F2, p = 0,52; F3, p = 0,46; F4, p = 0,01; F5, p = 0,78).
GF
GIFB F2 F3 F4 F5
100
200
300
400
Pes
o (
g)
*FB, F2, F3, F5
*FB, F2, F3
*FB, F2
#
Figura 9: Peso corporal nos grupos familiar (GF) e isolamento social (GI) de machos juvenis
de C. jacchus ao longo das fases do estudo (FB, F2, F3, F4 e F5), sendo * = diferença
estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a(s) fase (s) apontada (s) ao
lado do símbolo. # diferença entre os grupos (GF e GI) na respectiva fase do estudo. ANOVA
para medida repetida e post hoc de Fisher, p <0,05.
Correlações
Algumas correlações estatisticamente significativas foram observadas para o GI
durante as fases experimentais (F2, F3, F4, F5): correlação negativa entre cortisol e
autocatação (correlação de Spearman, p < 0,05; rs = - 0,28) e correlações positivas entre os
comportamentos de deslocamento e marcação de cheiro (correlação de Spearman, p < 0,05; rs
= 0,57; GF: rs = 0,32), deslocamento e piloereção individual (correlação de Spearman, p <
40
0,05; rs = 0,26; GF: rs = - 0,09) e deslocamento e coçar (correlação de Spearman, p < 0,05; rs
= 0,31; GF: rs = - 0,06) (Tabela 2).
Não foram encontradas correlações para o GF durante as fases experimentais (F2, F3,
F4. F5): cortisol e autocatação (correlação de Spearman, p < 0,05; rs = 0,03), deslocamento e
marcação de cheiro (correlação de Spearman, p < 0,05; rs = 0,32), deslocamento e piloereção
individual (correlação de Spearman, p < 0,05; rs = - 0,09) e deslocamento e coçar (correlação
de Spearman, p < 0,05; rs = - 0,06).
Tabela 2 – Correlação entre os comportamentos e cortisol nas fases experimentais (F2, F3, F4,
F5) para os grupos GF e GI
CORRELAÇÕES (rs) NAS FASES EXPERIMENTAIS
GI Cortisol*AutoC (p< 0,05, rs = - 0,28)
Desl*MarcaçãoC (p< 0,05, rs = 0,57)
Desl*PiloI (p< 0,05, rs = 0,26)
Desl*Coçar (p< 0,05, rs = 0,31)
GF Cortisol*AutoC (p> 0,05, rs = 0,03)
Deslo*MarcaçãoC (p> 0,05, rs = 0,32)
Desl*PiloI (p> 0,05, rs = - 0,09)
Desl*Coçar (p> 0,05, rs = - 0,06)
AutoC: autocatação; PiloI: piloereção individual; MarcaçãoC: marcação de cheiro; Desl:
deslocamento
DISCUSSÃO
Espécies sociais formam interações comportamentais que se estendem para além do
indivíduo e que são reflexos de mecanismos neurais, hormonais, celulares e genéticos, e
41
auxiliam na sobrevivência, reprodução e cuidado da prole (Cacioppo et al. 2011). Dessa
forma, o isolamento social causa rupturas no funcionamento adequado de tais
comportamentos e mecanismos reduzindo assim a aptidão e induzindo o surgimento de
patologias físicas e mentais (Cacioppo et al. 2011; Steptoe et al. 2013). Por outro lado, a
indução do isolamento social em protocolos de estudos experimentais representa uma lente
através da qual se pode investigar de maneira apropriada as alterações comportamentais
hormonais, neurais, celulares e genéticas, corroborando no entendimento das patologias
(Cacioppo et al. 2011).
Sendo assim, alguns estudos com primatas não-humanos vêm utilizando protocolos de
isolamento social crônico para induzir estados depressivos (Cacioppo et al. 2011; Li et al.
2013). Neste estudo os machos juvenis de C. jacchus foram submetidos 13 semanas de
isolamento social, a fim de investigar as alterações em parâmetros fisiológicos (cortisol fecal
e peso) e comportamentais, com objetivo de caracterizar biomarcadores e um protocolo
indutor de depressão em animais juvenis, considerando-se a crescente incidência desta
patologia na adolescência, assim como os graves prejuízos cognitivos, comportamentais e
fisiológicos que podem ser induzidos de maneira permanente em função da incidência da
patologia neste período ontogenético de janela biológica (Thapar et al. 2012).
Os machos juvenis de C. jacchus isolados cronicamente neste estudo apresentaram
alterações fisiológicas e comportamentais condizentes com um quadro depressivo, que não
foram observadas em animais de mesmo sexo e idade mantidos em ambiente familiar. Os
animais que permaneceram na família não apresentaram alterações significativas nos níveis de
cortisol ao longo do estudo. A ausência de variações significativas no cortisol dos animais do
GF provavelmente deve-se a presença do suporte social que, segundo a teoria do efeito
principal, funciona como um tamponador diante de desafios da rotina diária dos animais,
reduzindo a resposta ao estresse e patologias associadas (Cohen & Wills 1985). Em
42
calitriquídeos comportamentos sociais ou afiliativos, como catação, entre co-especifico
induzem a redução dos níveis de cortisol (Taylor et al 2015). Entretanto, os benefícios do
suporte social não é um fenômeno sempre constate e depende de vários fatores, como:
espécie, sexo e idade, temperamento, relação de parentesco entre o grupo e tempo de
agrupamento (Gerber et al 2002; Galvão-Coelho et al 2012). Em sagui adultos, díades de
machos aparentados se beneficiam do suporte social durante os períodos de estresse,
tamponando as alterações do cortisol induzidas pelos estressores. Entretanto, díades de
machos não-parentes e fêmeas (parentes e não parentes) não se beneficiam da mesma forma
do suporte social, e reagem elevando o cortisol às situações de estresse (Galvão-Coelho et al.
2012).
Por outro lado, os animais que permaneceram no isolamento social crônico (GI)
apresentaram uma elevação nos níveis de cortisol fecal durante a primeira semana do
protocolo de estresse, e em seguida uma queda crescente ao longo dos meses subsequentes,
chegando ao final do experimento com níveis menores que os observados na fase basal,
quando estes animais se encontravam no grupo familiar. A literatura, normalmente, aponta
ativação do HPA e, consequentemente, elevação do cortisol nos estudos que utilizam modelos
animais de depressão (Cacioppo et al. 2011; Matthews et al. 2006; Checkley 1996).
Entretanto, os estudos com modelos animais de depressão frequentemente são desenvolvidos
com roedores, e utilizam protocolos de natureza e duração distintos do utilizado neste estudo
(Willner et al. 1992; Shively & Willard 2012). Ou seja, protocolos agudos e de natureza física
(exposição ao frio intenso ou choque elétrico) (Frazer & Morilak 2005) ou sociais (separação
materna, exposição à intruso) com baixa validade etológica (Pryce et al. 2002; Lupien et al.
2009), já que em sua grande maioria, os roedores são animais de hábitos solitários e reduzido
cuidado parental. Por outro lado, estudos recentes que expõe primatas não-humanos à
estressores sociais crônico vêm apontando um padrão de hipocortisolemia nos animais
43
expostos a estes protocolos, que são os mesmos utilizados para induzir depressão em
primatas. Por exemplo, observou-se uma associação entre baixos níveis de cortisol e perfil
comportamental depressivo em fêmeas adultas de Macaca fascicularis expostas a protocolos
crônicos de alterações no posto social (22-26 meses) (Willard & Shively 2012). Saimeri
juvenis, que foram separados da mãe repetidamente quando infantes, apresentaram uma
hiporresponsividade do cortisol após um protocolo de isolamento social, quando comparado
com animais juvenis que não passaram por este estressor na infância (Levine & Moby 2003).
Da mesma forma, C. jacchus juvenis que sofreram separação social diária quando infantes
apresentam menores níveis de cortisol basal que animais juvenis que não foram expostos a
este agente estressor (Dettling et al. 2002).
Além disto, alguns estudos com pacientes com depressão apontam resultados
conflitantes no que se refere aos níveis de cortisol. Enquanto a Depressão Maior é
caracterizada pela hipercortisolemia (Ehlert et al. 2001), a Depressão Atípica (Fries et al.
2005) e a Bipolar, estão associadas com hipocortisolismo (Maripuu et al. 2014). Sugere-se
que a hipocortisolemia pode ser uma adaptação de proteção após eventos de respostas bruscas
de elevações do cortisol (Fries et al. 2005). Por outro lado, discute-se que a manutenção da
atividade do eixo HPA tamponada, com ausência de responsividade, pode promover
vulnerabilidade ao indivíduo, principalmente em janelas biológicas, como é o caso da
juventude, facilitando o surgimento posterior de desordens psiquiátricas, inclusive a própria
depressão (Badanes et al. 2011). Alguns estudos mostram que é nessa faixa etária onde
normalmente surgem os primeiros sinais característicos dos principais distúrbios psiquiátricos
(Walker et al. 2001), adolescentes que apresentaram sintomas depressivos frequentemente
manifestam a doença já no início da fase adulta (Aalto-Setälä et al. 2002).
A fim de auxiliar na interpretação adequada dos dados fisiológicos, os estudos com
modelo animais vêm buscando avaliar também parâmetros comportamentais que auxiliam na
44
caracterização dos estados mentais. Padrões etológicos anormais levam a expressão de alguns
comportamentos estereotipados e/ou de automutilação, que permitem medir a baixa qualidade
de vida dos animais e detectar a presença de distúrbios comportamentais (Young 2003;
Yamamoto 2006). A piloereção individual vem sendo apontado há algum tempo como um
indicador da ativação do sistema nervoso autônomo simpático em primatas (Dettling et al.
2002) e, no presente estudo, foi observado no GI uma elevação deste comportamento
concomitante aos níveis de cortisol na primeira semana de isolamento social (F2), uma
resposta aguda padrão dos sistemas neurovegetativo e neuroendócrino de resposta ao estresse.
Após este período inicial de isolamento os animais GI reduziram o cortisol juntamente com as
frequências da piloereção individual e aumentaram as durações dos comportamentos de
autocatação. Comportamento este redutor de tensão e que induz a liberação de ocitocina, que
por sua vez é um inibidor da ativação do eixo HPA (DeVries et al. 2003; Detillion et al. 2004;
DeVries et al. 2007; Wittig et al. 2008). Em Callithrix geoffroyi observou-se uma associação
inversa entre a frequência de catação social e o cortisol urinário, os animais que iniciaram este
comportamento mais frequentemente apresentaram menores níveis de cortisol (Taylor et al
2015). Sendo assim, provavelmente a redução do cortisol que se segue após a F3, em nosso
estudo, deva-se ao aumento concomitante da autocatação no GI. O GI ainda apresentou
maiores frequências de marcação de cheiro e piloereção individual quando as fases
experimentais foram analisadas conjuntamente. A marcação de cheiro é um comportamento
que sinalizador de dominância e também do estado reprodutivo do animal, porém dentro do
contexto da resposta ao estresse é visto como um comportamento deslocado e que indica
ansiedade (Cubicciotti et al. 1986; Barros & Tomaz 2002; Dettling et al. 2002), pois estudo
mostra que os calitriquídeos aumentam a taxa de marcação de cheiro quando em dificuldade
(Morgan & Tromborg 2007)
45
Neste estudo os animais GI apresentaram níveis gerais de deslocamento e coçar,
maiores que o GF, ainda observaram-se aumentos na frequência do coçar para o grupo GI a
partir da F3 e maiores frequências para o GI quando as fases experimentais foram analisadas
conjuntamente. A literatura já aponta estes comportamentos como sendo típicos de depressão
em primatas (Shively et al. 2005; Shively & Willard 2012). O deslocamento aleatório, se
diferencia da aproximação e afastamento direcionado a um outro animal ou objeto, e é
considerado um comportamento estereotipado (Shively et al. 2005). O comportamento de
coçar o pêlo, diferente da catação, é um comportamento deslocado e não tem função de
limpeza, portanto, também é tido como um comportamento estereotipado (Dufour et al.
2011). Outra medida muito utilizada para medir depressão é a anedonia, que é a perda da
capacidade de sentir prazer, que vem sendo investigada em primatas não-humanos através da
mensuração da ingestão de uma solução aquosa de sacarose (Shively et al. 2005;
Vasconcellos et al. 2010; Shively & Willard 2012). Neste estudo, ambos os grupos reduziram
o consumo da solução aquosa de sacarose ao longo das 17 semanas, uma adaptação o que é
esperada, pois o alimento deixa de ser uma novidade. Entretanto, analisando as fases
experimentais conjuntamente, os GF apresentaram maiores medias de consumo da solução
aquosa de sacarose que o GI. Além disto, a proporção de redução do consumo da solução de
sacarose do GI foi maior que o GF, quando foi analisado a relação entre a ingestão da solução
de sacarose sobre a ingestão total de alimento após 13 semanas de estudo (entre a FB e F5).
Enquanto os GF reduziram em aproximadamente 20%, os animais GI apresentaram quase
60% de redução. Deve-se ainda atentar que apesar desta maior redução na ingestão da solução
de sacarose, o GI não reduziu a ingestão alimentar de maneira geral, o que indica, ainda mais,
a presença da anedonia e a perda da capacidade de sentir prazer. Além disso, o GI
apresentaram correlações positivas estatisticamente significativas que confirmam os achados
descritos, foram estas entre: deslocamento e a marcação de cheiro, deslocamento e piloereção
46
individual e deslocamento e coçar. Sendo assim, os achados etológicos, em conjunto,
corroboram na construção de um perfil depressivo nos animais GI oriundo de um estresse
crônico de origem social.
Também foi observado uma redução severa no peso corporal dos animais isolados,
que não foi observado para os animais vivendo em família. Vale ressaltar que esta redução de
peso não ocorreu em função de uma redução na ingestão alimentar, pois os animais isolados
apresentaram períodos gerais de ingestão alimentar maiores que os GF. Além disto, no final
da última fase (F5), os animais da GI apresentam um aumento de peso que chega a ser maior
que a fase basal. Apesar da perda de peso ser uma característica típica observada em primatas
não-humanos adultos submetidos a protocolos indutores de depressão (Shively et al. 2005;
Shively & Willard 2012), a avaliação deste parâmetro durante fases ontogenéticas de
crescimento acentuado, como na juventude, pode mascarar resultados e gerar conclusões
equivocadas (Maxwell & Cole 2009). A relação entre o estresse crônico e a ingestão alimentar
mostra-se bastante individualizada, estudos em modelos animais apontam que situações
estressantes podem levar em alguns casos a aumentos, e em outros à diminuição na ingestão
de alimentos (Adam & Epel 2007). Nos seres humanos, de forma semelhante, as situações
estressantes também atuam de forma bidirecional sobre o apetite (Adam & Epel 2007).
Ademais, já se compreende bem que os eixos HPA e o hipotálamo-hipófise-gonal (HPG)
interagem mutualmente e que o estresse crônico altera negativamente o funcionamento do
eixo HPG (Handa & Weiser, 2014), podendo inclusive alterar o início da puberdade
(Solorzano & McCartney 2010). Além disso, a testosterona induz o aumento da síntese de
proteínas e a deposição de glicogênio nos músculos esqueléticos, consequentemente, auxilia
no ganho de massa muscular e peso (Solorzano & McCartney 2010). Assim, uma hipótese é
que a perca acentuada de peso deva-se a alterações no início da puberdade, em função do
estresse crônico, nos animais GI.
47
Sendo assim, de maneira geral, as alterações fisiológicas e comportamentais
encontradas para os animais GI caracterizam um quadro depressivo em primatas não-humanos
e validam o protocolo de isolamento social crônico (13 semanas) como indutor de depressão
em machos juvenis de C. jacchus. Ademais, estas alterações fornecem parâmetros que podem
ser utilizados como biomarcadores de depressão para esta espécie e faixa etária e que podem,
por exemplo, serem utilizados em estudos farmacológicos. Os dados em conjunto, corroboram
no processo de validação do C. jacchus como modelo translacional de depressão juvenil.
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ARTIGO 2
ESTRESSE, COGNIÇÃO E PLASTICIDADE NEURONAL EM SAGUIS (CALLITHRIX
JACCHUS).
Ana Cecília de Menezes Galvão, Antônio Pereira Junior, Nicole Leite Galvão Coelho.
Departamento de Fisiologia, Programa de Pós-graduação em Psicobiologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
Título curto: Estresse e cognição em saguis
Endereço de correspondência:
Nicole L. Galvão-Coelho
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Departamento de Fisiologia
Caixa Postal, 1511
59078-970 NATAL, RN, BRASIL
Tel 55 84 3215-3410
Fax 55 84 3211-9206
E-mail: [email protected]
54
RESUMO
A diferenciação e o desenvolvimento do sistema nervoso é constituído por um
conjunto de eventos celulares complexos, dinâmicos e sequenciais determinados por fatores
genéticos e ambientais. Os períodos críticos são etapas do desenvolvimento caracterizadas por
uma maior permissividade do sistema nervoso ao ambiente, que tem como ponto importante
estruturar o sistema imaturo ou reestruturar o sistema nervoso em amadurecimento. Um dos
campos de estudo que tem obtido importante atenção nos últimos anos é a modulação do
estresse sobre o sistema nervoso, principalmente em áreas responsáveis por funções
cognitivas complexas. Neste cenário, a utilização de novos modelos experimentais tem sido
imprescindível para elucidar tais modulações. Sendo assim, este trabalho investigou os efeitos
do estresse social crônico sobre memória de trabalho (MT) e plasticidade neuronal no córtex
pré-frontal (CPF) em machos de Callithrix jacchus, durante a fase juvenil, que é um período
crítico de plasticidade neural. Foram aplicados dois testes cognitivos de aprendizagem
reversa, sendo um teste de discriminação de objetos e outro de memória espacial, a fim de
aferir o funcionamento da MT em animais que viviam em grupos familiares e em animais
isolados cronicamente por 16 semanas. Ao final, 3 animais de cada grupo foram sacrificados e
análises de imunofluorescência para o BDNF (Brain derived neurotrophic fator) no CPF
orbitofrontal e lateral foram realizadas a fim de mensurar a plasticidade neuronal nestas
regiões. O cortisol fecal foi mensurado e o repertório comportamental foi registrado a fim de
correlacionar o estresse, o desempenho cognitivo e a plasticidade neural no CPF. De maneira
geral tanto o GI quanto o GF apresentaram desinteresse em executar os testes e baixos
desempenhos foram observados, nenhum dos grupos aprendeu a tarefa reversa. Entretanto, o
GI apresentou melhores desempenhos que os GF. A presença de BDNF nas duas regiões do
CPF foi independente do grupo social (GI e GF), e do desempenho nos testes cognitivos.
Entretanto, os animais que não apresentaram BDNF no CPF orbitofrontal e lateral possuíram
55
maiores níveis de cortisol na última semana do estudo. Pela primeira vez investigou-se
simultaneamente a relação entre estresse, cognição e BDNF nesta espécie. Os resultados dos
testes cognitivos induziram uma reflexão sobre os protocolos que avaliam a MT em machos
de saguis juvenis sem experiência prévia na realização de testes cognitivos e os resultados do
BDNF corroboram estudos que apontam uma modulação em U invertido do cortisol sobre a
neurogênese.
Palavras-chave: BDNF, cortisol, memória de trabalho, modelo animal.
56
INTRODUÇÃO
Muitos estudos têm pesquisado a relação entre o estresse e a cognição (Schwabe et al.
2010; Schwabe et al. 2012), principalmente através da modulação dos níveis de cortisol sobre
o hipocampo (Lupien et al. 2007; Schwabe et al. 2012), devido à importância desta região
sobre a formação de memórias de longo prazo e sobre a aprendizagem (Tottenham &
Sheridan 2010; Bremner 1999). O hipocampo possui receptores para o fator liberador de
corticotropina (rCRF1 e rCRF2) e para o cortisol (MR- mineralocorticoid receptor e GR-
glucocorticoid receptor) (Joëls & Baram 2009), sendo assim, é importante alvo de modulação
do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), sistema alostático fundamental para o
desenvolvimento da resposta ao estresse (Czéh et al. 2008). Atualmente, aponta-se uma
relação de U invertido entre o estresse e a memória de longo prazo, ou seja, tanto baixos
níveis, quanto altos níveis de cortisol, levam a um prejuízo nos processos mnemônicos, sendo
os níveis intermediários, ótima para a expressão da mesma (Em humanos: Lupien & Lepage
2001; em primatas não-humanos: Pryce et al. 2011; em roedores: Salehi et al. 2010)
Outra região importante para a cognição é o córtex pré-frontal (CPF), que
desempenha papel fundamental na coordenação de comportamentos, de tomada de decisões e
julgamentos (Ramos & Arnsten 2007; Yuen et al. 2009). Para isto, utiliza a memória de
trabalho (MT), que é a capacidade de manter informações e eventos mnemônicos ativos,
“concientes”, por determinado período de tempo (segundos ou minutos), inibindo distrações
inadequadas (Baddeley 1992; Okon-Singer et al. 2015). As MT podem ser originadas a partir
do resgate de memórias de longo prazo, anteriormente consolidadas, ou a partir de fatos e
informações recentes, ainda não consolidados (Lupien & Lepage 2001; Ramos & Arnsten
2007; Czéh et al. 2008).
57
Basicamente a MT é mantida por circuitos de neurotransmissores GABAérgicos e
glutamatérgicos no CPF que podem ser modulados por alguns mensageiros químicos
liberados durante a resposta ao estresse, como a noradrenalina, o cortisol e o CRF (Fator
liberador de corticotropina), pois no CPF observa-se receptores adrenérgicos, receptores
rCRF1, rCRF2, MR e GR (Joëls & Baram 2009). Alguns estudos também apontam uma
relação em curva de U invertido entre os níveis de estresse e o desempenho da MT (Humanos:
Lupien & Hauger 1999; Roedores: Yuen et al. 2009 e Barsegyan et al. 2010). Observa-se
ainda que o CPF atua modulando o funcionamento do eixo HPA, em uma via de mão dupla.
O CPF medial dorsal atua inibindo a ativação do eixo HPA, enquanto o CPF medial ventral
estimula seu funcionamento (Radley et al 2006).
Existem períodos do desenvolvimento ontogenéticos, chamados de janelas biológicas,
em que o indivíduo, e seu sistema nervoso, são mais susceptíveis a influência do ambiente,
que modula processos de organização ou reorganizações estruturais e funcionais, por
exemplo, para os seres humanos durante o período pré-natal, pós-natal precoce ou neonatal e
durante a adolescência (Pryce et al. 2002; Lupien et al. 2009). A regulação do início e da
duração dos períodos críticos, cujos fechamentos culminam nos amadurecimentos dos
circuitos, não se relacionam apenas com a idade, mas, também, depende da experiência
individual e da influência ambiental. Se o sistema não é estimulado adequadamente os
circuitos neurais passam a apresentar amadurecimentos alterados, facilitando o surgimento de
disfunções físicas e psicológicas (Hensch 2003; Fuchs et al. 2006).
Para uma melhor compreensão da ação do estresse sobre a plasticidade neural faz-se
necessário o desenvolvimento de estudos com de modelos animais. A maior parte dos estudos
que se dedicam a este tipo de investigação usam em sua grande maioria roedores adultos
como modelo animal (Silva-Gómez 2003; Duman & Monteggia 2006). A maior utilização
dos roedores como modelo, deve-se ao fácil manuseio, a existência de protocolos bem
58
estabelecidos (Willner et al. 1992). Apesar disso, esses animais possuem algumas limitações,
por exemplo, possuem cérebros bem menos diferenciados e segregados que os humanos, uma
considerável distancia filogenética e organização social diferentes dos humanos, fatores que
dificultam o desenvolvimento de algumas tarefas cognitivas (Uylings et al. 2003; Wise 2008;
Lupien et al. 2009). Por este motivo, alguns estudos passaram a utilizar primatas não-
humanos como modelo experimental translacional (Eichler & Dejong 2002), pois apresentam
maior proximidade filogenética com humanos, maior similaridade anatômica e funcional do
sistema nervoso central e organizações sociais mais próximas as observadas nos humanos (´t
Hart et al. 2012; McEwen & Morrison 2013; Mansouri et al. 2014).
Uma das espécies de primatas não-humanos muito utilizada atualmente em estudos de
neurociências (´t Hart et al. 2012; Burman & Rosa 2009) e disfunções mentais (Prasad et al.
2007; Sasaki et al. 2005; Harder & Ridley 2000) é Callithrix jacchus, pois são primatas
sociais de pequeno porte, com boa adaptação ao cativeiro, alta taxa de fecundidade e
facilidade no manuseio, quando comparados aos primatas do Velho Mundo (Abbott & Hearn
1978; Dixson & Lunn 1987). Ademais, esta espécie apresentam uma gama de alterações de
estados fisiológicos e comportamentais que se assemelham ao observado em humanos, de
forma que podem contribuem para investigações de patologias associadas ao estresse
(Galvão-Coelho et al. 2008; Galvão-Coelho et al. 2012; Li et al. 2013; Sousa et al. 2015).
Também possui um etograma bem definido (Stevenson & Poole 1976), e técnicas não
invasivas para a medição de hormônios esteróides (cortisol, progesterona e andrógenos) em
fezes (Sousa & Ziegler 1998), o que facilita ainda mais a sua utilização como modelo
experimental em desordens associadas ao eixo Hipotálamo-Hipofise-Adrenal (HPA) (Galvão-
Coelho et al. 2008). Recentemente, estudos sobre cognição e memória com esta espécie
também vem aumentando (Roberts & Wallis 2000; Tsujimoto & Sawaguchi 2002; Spinelli et
al. 2004; Valentinuzzi et al. 2008; Murai et al. 2013). Entretanto, não há na literatura estudos
59
que investiguem, nesta espécie, a modulação do de estresse crônico sobre o desempenho de
funções cognitivas e a plasticidade neuronal. Diante disto, este estudo investigou os efeitos do
isolamento social crônico sobre o desempenho da memória de trabalho e a plasticidade
neuronal no córtex pré-frontal (através do BDNF) durante um período crítico de plasticidade,
a fase juvenil, em machos de Callithrix jacchus.
METODOLOGIA
Manutenção dos animais
Este estudo utilizou dez machos juvenis de C. jacchus com a faixa etária inicial de 7
meses, classificados como juvenis I de acordo com Leão et al. 2009. Os animais viviam em
cativeiro, no Laboratório de Estudos Avançados em Primatas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (LEAP), e inicialmente estavam alojados em gaiolas familiares, localizadas
na área externa da colônia, em condições naturais de iluminação, umidade e temperatura. As
gaiolas mediam 2,0 x 2,0 x 1,0 m, construídas em alvenaria, possuindo na sua parede anterior
um visor unidirecional e na parede posterior uma porta em tela de arame, na qual estavam
encaixados o bebedouro e o prato de alimentação. No interior da gaiola havia uma caixa
ninho, para descanso, pranchas de madeira e poleiros de galhos de plantas que são usadas para
o deslocamento dos animais. A alimentação de rotina dos animais foi à base de frutas
tropicais e uma papa nutritiva constituída de leite, aveia, ovo e pão. Foi ainda administrado,
duas vezes na semana, o suplemento multivitamínico glicocan. Os animais foram tratados de
acordo com as normas estabelecidas pela Instrução Normativa 169 do IBAMA de 20 de
fevereiro de 2008 e as normas de cuidados estabelecidos pelo CONCEA – Conselho Nacional
de Controle de Experimentação Animal, da Lei N 11.794, de 08 de outubro de 2008 (Lei
Arouca). O criadouro segue as normas internacionais de manutenção de animais ex situ
propostas pela Animal Behavior Society e International Primatological Society. Os
60
procedimentos realizados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de
Animal (CEUA – UFRN), segundo o protocolo 019/2013. E os animais foram acompanhados
durante todo o procedimento por um médico veterinário do LEAP e por tratadores aos quais
os animais já estavam habituados.
Desenho experimental
O experimento incluiu as seguintes fases experimentais:
Fase basal (FB): Os dez machos juvenis I, foram acompanhadas por 4 semanas no
ambiente familiar. Neste período, as coletas de fezes para dosagem hormonal e as observações
comportamentais foram realizadas em dias alternados, com finalidade de estabelecer o perfil
hormonal e comportamental individual dos animais.
Fase experimental (FE): após este período basal, cinco animais foram isolados
socialmente em uma nova gaiola, por 16 semanas (GI- grupo isolamento social) e cinco
animais permaneceram na família (GF- grupo familiar). Os animais GI nunca haviam sido
separados da família. Durante o isolamento social, o animal não teve contato visual com
outros co-especificos, porém tiveram contato auditivo e olfatório com outros animais da
colônia, mas não com seus familiares. Não houve restrição alimentar ou de ingestão de água.
A duração do isolamento social foi determinada de acordo com outros estudos relacionados
com estresse crônico em primatas não-humanos (Cacioppo et al. 2011; Li et al. 2013; Cinini
et al. 2014).
No início da 17º semana do estudo (FE17), 13º de isolamento, foram realizados 7 dias
consecutivos de coletas de fezes e observações comportamentais para ambos os grupos, GI e
GF. Esse procedimento foi repetido na 20º semana do estudo (FE20), 16° de isolamento. Ao
da FE20 foram realizados três dias consecutivos de testes cognitivos (FEte = fase
experimental de testes cognitivos), todos os animais eram inexperientes na realização de testes
61
cognitivos. Em seguida, foram sacrificados 3 animais do GI e 3 animais do GF por perfusão
para análise do BDNF, por imunofluorescência, no córtex pré-frontal (orbitofrontal e lateral)
(figura 1).
Figura 1: Desenho experimental. FE: Fase experimental; FE17: Início da 17° semana de FE;
FE20°: 20° semana; FEte: fase experimental de testes cognitivos.
Registro comportamental
Os animais foram observados, sempre no mesmo horário (6:30 da manhã) para evitar a
variação circadiana do comportamento (Erkert 1989), através do visor unidirecional na parede
frontal da gaiola, que se encontra voltada para a sala de observação. O método utilizado nas
observações comportamentais foi o focal contínuo, contabilizando a frequência ou a duração
dos comportamentos, listados a seguir (tabela 1), durante o intervalo de 30 minutos para cada
animal (Altmann 1974). Foram registrados os comportamentos individuais de piloereção
individual (frequência), autocatação (duração) e coçar (duração), segundo o etograma de
Stevenson & Poole (1976). Também foi registrada a duração e frequência da ingestão de uma
solução aquosa de sacarose a fim de diagnosticar a capacidade de sentir prazer do animal, e
avaliar um possível estado de anedonia (adaptado de Paul et al. 2000).
62
Tabela 1. Descrição dos comportamentos
COMPORTAMENTOS DESCRIÇÃO
PILOEREÇÃO INDIVIDUAL Ato de eriçar o pelo e andar com o dorso arqueado.
AUTOCATAÇÃO Ato de catar o próprio pelo.
COÇAR Ato de utilizar as mãos para esfregar alguma região do
corpo.
Coleta de fezes
As coletas foram realizadas sempre no mesmo intervalo de horários (entre 6:30 – 8:30)
para evitar influência circadiana sobre as análises (Raminelli et al. 2001). Antes da coleta de
fezes, as gaiolas foram limpas para facilitar a identificação de amostras. Quando o animal
defecava o observador entrava na gaiola e recolhia a amostra utilizando uma espátula de
madeira. Em seguida, as amostras eram identificadas e armazenadas em tubos de plástico a
cerca de -4 ° C. Posteriormente, estas amostras foram processadas para dosagem do cortisol.
Dosagem hormonal
A dosagem do cortisol fecal foi realizada no Laboratório de Medidas Hormonais, do
Departamento de Fisiologia da UFRN, de acordo com o protocolo de Sousa e Ziegler (1998).
Em resumo, o protocolo é composto por uma etapa inicial de extração, onde os esteróides na
forma livre são separados a partir de substâncias que são solúveis em água, etapa chamada de
Hidrolise. Isto é seguido pela etapa da solvólise, que se destina a realizar a separação de
conjugados esteróides utilizando o etanol. O extrato de cortisol, ressuspenso no álcool é
utilizado para dosagem do hormônio pelo método de ELISA competitivo. Os coeficientes de
variação foram 1,75 e 16,53% para intra e interplacas respectivamente.
63
Testes de memória
Dois testes de memória de aprendizagem reversa, o teste do objeto e o teste da caixa,
foram utilizados para avaliar o funcionamento da memória de trabalho nos animais do GI e
GF. Os animais de ambos os grupos não apresentavam conhecimento prévio com relação a
execução de testes cognitivos. Estes testes foram realizados na própria gaiola que o animal
habitava evitando assim a modulação da “novidade” sobre o desempenho cognitivo. Para
fazer os testes, os animais do GF, foram separados momentaneamente da família, por no
máximo 90 minutos, em uma área restrita da própria gaiola familiar. Durante 3 dias,
anteriores ao início dos testes, na FE20, os animais do GF foram habituados, em ambos os
turnos: manhã e tarde, ao local de realização dos testes, ocorrendo assim breves separações do
grupo familiar, por no máximo 10 minutos/cada.
O teste do objeto foi realizado no período da manhã (entre às 7:30 – 9:00h) e o teste da
caixa no período da tarde (entre às 14:00h – 16:00h), sempre duas horas após os animais
terem se alimentado. Foram realizadas 15 sessões, com durações de 3 minutos/cada, em cada
fase de ambos os teste (direta / reversa dos testes do objeto e caixa). Tanto na fase direta
quanto reversa, dos dois testes, o animal deveria obter a recompensa alimentar (banana,
passas, manga, mamão). Quando o animal apresentava 6 acertos consecutivos, considerava-se
que o animal havia aprendido a tarefa. O animal só passava para a fase reversa se aprendesse
a tarefa da fase direta. Para a realização adequada da tarefa da fase reversa, o animal deveria
necessariamente inibir o aprendizado da fase direta.
Teste de memória do objeto: este é um teste de discriminação de objetos e foi
adaptado de Roberts & Wallis (2000) e Domeney et al. (1990). Foram utilizados objetos de
plástico, tridimensionais, de diferentes formas e cores e de fácil manipulação pelos animais
(figura 2a). Dois objetos eram colocados em dois recipientes de alimentação do animal e
foram apresentados aos animais através de gavetas de alimentação localizadas abaixo do visor
64
unidirecional, sem a interação do animal com o experimentador (figura 2b). Na fase direta,
um dos objetos escondia a recompensa alimentar, e este foi repetido ao longo de todas as
sessões desta fase sempre na mesma posição, enquanto o outro objeto era alterado a cada
sessão. O intervalo entre sessões era de no máximo 5 segundos. Quando o animal aprendia a
tarefa, ou seja, apresentava 6 acertos consecutivos, a próxima fase (reversa) começava. Na
fase reversa, o objeto que variava era o que escondia a recompensa alimentar. Apesar do
objeto variar, sua posição era constante.
Figura 2: Teste de discriminação do objeto: (a) os objetos utilizados e (b) o local onde foi
realizado o teste.
Teste de memória da caixa: este teste envolve a memória espacial e foi adaptado
segundo a metodologia proposta por Murai et al. (2013) e Roberts & Wallis (2000). Uma
caixa de acrílico no formato cúbico com dimensões de 30 x 30 x 30 cm e com abertura
circular de 17 cm em uma das faces, foi utilizado neste protocolo (figura 3). O aparato
experimental foi colocado no interior da gaiola e o experimentador observava por um visor
unidirecional. Na fase direta, o animal tinha que encontrar a entrada da caixa, que nesta
situação sempre esteve voltada para cima, e obter a recompensa alimentar. Quando o animal
aprendia a tarefa, ou seja, apresentava 6 acertos consecutivos, a próxima fase (reversa)
65
começava. Nesta fase, o animal deveria encontrar a nova localização da abertura da caixa e
adquirir a recompensa alimentar.
Figura 3: Teste de memória espacial
Perfusão
Os animais receberam uma dose letal de uma mistura de 75% de cloridrato de
cetamina (Ketalar, PARKER) e 25% de cloridrato de tiazina (Rompun, BAYER) pela via
intraperitoneal (IP) e foram posicionados em decúbito dorsal, com imobilização dos membros.
Foi feita uma incisão longitudinal ao longo da linha média abdominal. Em seguida, foram
realizadas duas incisões oblíquas através das costelas, na direção da cabeça do úmero, para
expor completamente o coração. Posteriormente, os animais foram perfundidos através do
ventrículo esquerdo com tampão fosfato salina (PBS) heparinizado e em seguida, por
paraformaldeído 4% (PFA, Sigma Company, USA) em tampão fosfato (PB) 0,1 M (Nuclear)
(pH 7,2-7,4). Após a perfusão, os encéfalos foram cuidadosamente removidos da caixa
craniana e pós-fixados por 24 horas em solução de PFA 4%. Após a pós-fixação, os encéfalos
foram crioprotegidos utilizando a seguinte sequência: a) solução crioprotetora a 10%; b)
solução crioprotetora a 20% e; c) solução crioprotetora a 30%. Após a crioproteção, o tecido
foi congelado em líquido de imersão para criostato (Tissue Tek) a -55 oC e foram cortados no
plano coronal ou tangencial em seções de 30µm (Carl Zeiss, Mícron, Alemanha).
66
Procedimentos de imunofluorescência
Após microtomia, os cortes da área 47 (12L) e A11 do CPF lateral e orbitofrontal,
respectivamente, foram processados para investigar a presença do BDNF (brain-derived
neurotrophic fator – fator neurotrófico derivado de encéfalo), por imunofluorescência, no
córtex pré-frontal orbitofrontal e lateral.
As secções de um compartimento de cada animal foram separadas retirando a região
do hipocampo para facilitar a montagem das lâminas. Essas foram lavadas 5 vezes durante 5
minutos em tampão fosfato (PB) 0,1M, pH 7,4, sob agitação automática, e pré-tratadas com
peróxido de hidrogênio a 0,3% em PB por 20 minutos para inibir a peroxidase endógena. Os
cortes foram colocados em contato com os anticorpos primários de coelho anti–BDNF (1:500;
Santa Cruz), para marcação de BDNF. Estes foram diluídos em PB contendo Triton-X 100 a
(ICN Biomedicals) 0,4% e de soro normal por 48 horas com agitação e na geladeira. Em
seguida, após a lavagem 5 vezes por 5 minutos com PB, os cortes foram colocados em contato
com o anticorpo secundário (1:200), diluído em Triton-X 100 a 0,4% por 4 horas. Após este
tempo, os tecidos foram lavados 2 vezes de 5 minutos e incubadas com DAPI (Sigma) durante
5 minutos com tecido já montado na lâmina. E seguida foram colocados na geladeira.
As células marcadas foram fotografadas com o auxílio do programa de análise
morfométrica Stereo Investigator (MicroBrigthField Bioscience - USA).
Análise estatística
Para o cortisol e comportamentos foi aplicado GLM e o post hoc de Fisher, para
investigar as variações do cortisol entre os grupos (GI e GF) ao longo das fases (FB, FE17 e
FE20). Os dados de cortisol foram normalizados por transformação logarítmica. E para os
comportamentos aplicou-se a técnica de reamostragem estatística do bootstrap.
Nos testes de memória os dados analisados foram: (1) Índice de acertos (A): relação
entre o total de acertos e o total de sessões realizadas durante FEte; (2) Índice de erros (E):
67
relação entre o total de erros e o total de sessões realizadas durante FEte; (c) Índice de
motivação (M): relação entre o total de sessões realizadas pelo animal e o total de sessões
previsto no protocolo durante FEte (adaptado de Domeney et al. 1990). O teste de Mann-
Whitney foi utilizado para investigar a diferença entre GF e GI nos índices de acerto, erro e
motivação, em cada fase dos testes de memória (direta e reversa) separadamente. Para saber
se houve variação no total de acertos, erros e sessões de teste realizadas em cada dia, ao longo
dos dias de realização dos testes de memória (FEte), foi utilizado ANOVA de Friedman e o
teste de Wilcoxon. O nível de significância considerado foi de p < 0,05 em todos os testes.
RESULTADOS
Perfil hormonal
O GI e GF apresentaram distintas variações do cortisol ao longo das fases (GLM;
Fases*Grupo: F = 3,10; p = 0,04). O GF não apresentou variações significativas deste
hormônio ao longo das 3 fases (post hoc Fisher: FB*FE17, p = 0,7; FB*FE20, p = 0,4;
FE17*FE20, p = 0,64), enquanto que o GI apresentou maiores níveis de cortisol na FB que na
FE17 (post hoc Fisher: FE17*FB, p = 0,003) e a FE20 (post hoc Fisher: FE20*FB, p = 0,02).
Não houve diferenças significativas entre FE17 e FE20 (post hoc Fisher: FE17*FE20, p =
0,46) para GI. O GF (FB: μ = 3,9 ± 0,65 ng/g; F17: μ = 4,3 ± 0,71 ng/g; F20: μ = 4,8 ± 0,67
ng/g) apresentou níveis de cortisol maiores que o GI (FB: μ = 2,4 ± 0,36 ng/g; FE17: μ = 1,6
± 0,36 ng/g; FE20: μ = 1,5 ± 0,36 ng/g) na FB (post hoc Fisher: FB, p = 0,04), FE17 (post hoc
Fisher: FE17, p = 0,001) e FE20 (post hoc Fisher: F5b, p = 0,001) (figura 4).
68
GF
GIFB FE17 FE20
0
2
4
6
8
Cort
isol
feca
l (n
g/g
)
*FE17, FE20
# # #
Figura 4: Níveis de cortisol fecal nos grupos familiar (GF) e isolamento social (GI) de machos
juvenis de C. jacchus ao longo das fases do estudo (FB, FE17, FE20), sendo * = diferença
estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a (s) fase (s) apontada (s) ao
lado do símbolo. # = diferença estatística entre os grupos na respectiva fase. GLM e post hoc
de Fisher, p<0,05.
Perfil Comportamental
- Autocatação
O GF e GI apresentaram variações semelhantes comportamento na duração de
autocatação ao longo das fases (GLM; Fases*Grupo: F = 1,52 p = 0,22). Ambos os grupos
apresentaram maiores durações do comportamento na FE17 e FE20 com relação a FB (GLM;
Fases*: F = 5,3; p = 0,005; post hoc Fisher: FE17*FB, p = 0,01; FE20*FB, p= 0,002;
FE17*FE20, p = 0,64) (figura 5).
69
GF
GIFB FE17 FE20
0
30
60
90A
uto
cata
ção
(s)
*FE17, FE20
Figura 5: Durações (segundos) do comportamento de autocatação em machos juvenis de C.
jacchus ao longo das fases (FB, FE17 e FE20), para os grupos GI e GF analisados em
conjunto, sendo * = diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e
a (s) fase (s) apontada (s) ao lado do símbolo. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Piloereção individual
O GF apresentou aumento da frequência da piloereção individual na F20 com relação
a demais fases (GLM; Fases*: F = 4,54, p = 0,01; post hoc Fisher: F20*FB, p = 0,01;
F20*F17, p = 0,007), não foi encontrado diferenças entre FB e F17 (post hoc Fisher: FB*F17,
p = 0,8). Enquanto que para GI não foi observado diferenças entre as fases (GLM; Fases*: F =
0,41, p = 0.6; post hoc Fisher: FB*F17, p = 0,36; FB*F20, p = 0,67; F17*F20, p = 0,62)
(figura 6).
70
GF
GIFB FE17 FE20
0,0
0,4
0,8
Pil
oer
eção
in
div
idual
(f) *FB, FE17
Figura 6: Frequência do comportamento de piloereção individual em machos juvenis de C.
jacchus no grupo familiar (GF) e isolamento social (GI) ao longo das fases (FB, FE17 e
FE20), sendo * = diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a
(s) fase (s) apontada (s) ao lado do símbolo. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Coçar
Os grupos apresentaram variações na duração do comportamento de coçar diferente ao
longo das fases (GLM; Fases*Grupo: F = 6,78; p = 0,001) (figura 7). O GF não apresentou
variações deste comportamento (post hoc Fisher: FB*FE17, p = 0,35; FB*FE20, p = 0,53;
FE17*FE20, p = 0,12). O GI apresentou um aumento do comportamento nas fases FE17 e
FE20 com relação a FB (post hoc Fisher: FB*FE17, p = 0,02; FB*FE20, p = 0,005) e não
houve diferença entre FE17 com a FE20 (Fisher post hoc: FE17*FE20, p = 0,64). Além disto,
71
o GI apresentou maiores durações do comportamento de coçar que o GF na FE17 e FE20
(post hoc Fisher: FB = 0,8; FE17 = 0,01; FE20 = 0,01).
GF
GIFB FE17 FE20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Co
çar
(s)
*FB
*FB
# #
Figura 7: Duração (segundos) do comportamento de coçar em machos juvenis de C. jacchus
no grupo familiar (GF) e isolamento social (GI) ao longo das fases (FB, FE17 e FE20), sendo
* = diferença estatística significativa entre a fase que se encontra o símbolo e a (s) fase (s)
apontada (s) ao lado do símbolo. # = diferença estatística entre os grupos na respectiva fase.
GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
- Ingestão da solução aquosa de sacarose
Os dois grupos, GI e GF, apresentaram variações semelhantes, reduzindo a frequência da
ingestão da solução aquosa de sacarose ao longo do estudo (GLM; Fases*: F = 11,73 p =
0,001). Entretanto, o percentual de variação da ingestão da solução de sacarose sob a ingestão
geral de alimentos, entre FB e a FE17, foi diferente. O GI apresentou um percentual de
redução aproximadamente três vezes maior que o GF (Mann-Whitney: U = 2 p = 0,02) (figura
8).
72
{Fórmula da Ingestão da solução aquosa de sacarose = [(μfrequência ingestão de sacarose_ FB) - (μfrequência
ingestão de sacarose_ F5a) *100/ [(μfrequência ingestão total de alimentos_ FB) - (μfrequência ingestão total
de alimentos _ F5a)]}.
Figura 8: Percentual de variação da relação da ingestão da solução aquosa de sacarose sobre
ingestão total de alimentos, entre FB e FE17, em machos juvenis de C. jacchus, para os
grupos GF (grupo familiar) e GI (grupo isolado), sendo **= diferença estatística entre os
grupos. GLM e post hoc de Fisher, p<0,05.
Testes de memória
1. Teste de discriminação de objetos
Na fase direta do teste foi observado que o GI apresentou maiores índices de
motivação (Mann-Whitney: U = 26 p = 0,0003) e uma tendência a maiores índices de A
(Mann-Whitney: U = 70 p = 0,07). Não foi encontrado diferenças entre os grupos para os
índices de E (Mann-Whitney: U = 81 p = 0,19) (figura 9).
73
Ao longo dos 3 dias, da realização do teste de memória, não foram encontradas para o
GF diferenças para os totais diários de acerto (Anova de Friedman: x² = 1,4 p = 0,49), erro
(Anova de Friedman: x² = 4 p = 0,13) e sessões de teste realizadas em cada dia da FEte
(Anova de Friedman: x² = 4 p = 0,13). Como também não foram encontradas para os GI
diferenças entre os dias para os totais diários de acerto (Anova de Friedman: x² = 2 p = 0,36),
de erro (Anova de Friedman: x² = 8 p = 0,01; Wilcoxon; D1*D2: z = 2,02 p 0,04; D1*D3: z =
1,6 p = 0,1; D2*D3: z = 1,6 p = 0,1) e sessões de teste realizadas em cada dia da FEte (Anova
de Friedman: x² = 5,15 p = 0,07). O desempenho individual para os animais que foram
sacrificados, para a investigação do BDNF no CPF, encontra-se no quadro 1.
Figura 9: Índices de acertos, erros e motivação no teste de memória dos objetos para os
grupos familiares e isolamento social em machos juvenis de C. jacchus. * = diferença
estatística significativa entre os grupos que se encontra o símbolo. # = tendência estatística
entre os grupos.
74
2. Teste de memória espacial
Na fase direta do teste, foram observadas que o GI apresentou maiores índices de A
(Mann-Whitney: U = 63 p = 0.04) e uma tendência a maiores índices de motivação (Mann-
Whitney: U = 70 p = 0,07) e não foi encontrado diferenças entre os grupos para os índices de
erro (Mann-Whitney: U = 110 p = 0,9) (figura 10).
Ao longo dos 3 dias, da realização do teste de memória (FEte), não foram encontradas
para o GF diferenças no total diário de acerto (Anova de Friedman: x² = 3,4 p = 0,17), erros
(Anova de Friedman: x² = 2 p = 0,36) e sessões de teste realizadas em cada dia da FEte
(Anova de Friedman: x² = 3,8 p = 0,14). Para GI também não foram encontradas diferenças ao
longo dos dias da FEte para o total diário de acertos (Anova de Friedman: x² = 1 p = 0,6),
erros (Anova de Friedman: x² = 1,07 p = 0,58) e sessões de teste realizadas em cada dia da
FEte (Anova Friedman: x² = 0 p = 1). O desempenho individual para os animais que foram
sacrificados, para a investigação do BDNF no CPF, encontra-se no quadro 1.
75
Figura 10: Índices de acertos, erros e motivação no teste de memória da caixa para os grupos
familiares e isolamento social em machos juvenis de C. jacchus. * = diferença estatística
significativa entre os grupos que se encontra o símbolo. # = tendência estatística entre os
grupos.
BDNF imunofluorescência
Córtex pré-frontal Orbitofrontal (A11)
Grupo familiar (GF): Os animais 1279 e 1271 apresentaram células marcadas com
BDNF (verde) / DAPI (vermelho) no CPF orbitofrontal. Enquanto que o animal 1287, não
apresentou marcação dupla nesta região (Anexo I).
Grupo isolamento social (GI): foram encontradas no animal 1273 e 1263 células
marcadas com BDNF (verde)/ DAPI (vermelho) no CPF orbitofrontal Entretanto, o animal
1275 não apresentou marcação dupla nesta região (Anexo I).
Foi observado que o grupo BDNF positivo (BDNF+:μ = 3,7 ± 0,88 ng/g) apresentou
níveis de cortisol mais elevados na F20 do que o grupo BDNF negativo (BDNF-: μ = 2,45 ±
0,36 ng/g) (Teste T independente: T = 2,45 p = 0,008).
Córtex pré-frontal lateral (A47/12L)
Grupo familiar (GF); Apenas o animal 1271 apresentou células marcadas com
BDNF (verde) / DAPI (vermelho) no CPF lateral. Os animais 1279 e 1287, não apresentaram
marcação dupla nesta região (Anexo II).
Grupo isolamento social (GI); Apenas o animal 1273 apresentou células marcadas
com BDNF (verde) / DAPI (vermelho) no CPF lateral. Os animais 1263 e 1275 não
apresentaram marcação dupla na região lateral (Anexo II).
76
Também foi observado que o grupo BDNF positivo (BDNF+: μ = 4,57 ± 1,62 ng/g)
apresentou níveis de cortisol mais elevados na F20 do que o grupo BDNF negativo (BDNF-: μ
= 2,59 ± 0,29 ng/g) (Teste T independente: T = 2,59 p = 0,01)
Quadro 1: Desempenho nos testes cognitivos e presença de BDNF (brain derived neutrophic
fator) no córtex pré-frontal (CPF) para os animais sacrificados no estudo
Animal
Teste do
objeto
Teste da
caixa
CPF
Orbitofrontal
CPF
Lateral
1271
(GF)
A = 5
E =15
M = 20
A = 11
E = 5
M = 16
+
+
1279
(GF)
A = 4
E = 7
M = 11
A = 0
E = 0
M = 0
+ -
1287
(GF)
A = 0
E = 0
M = 0
A = 4
E = 12
M = 16
- -
1273
(GI)
A = 9
E = 28
M = 37
A =12
E = 0
M = 12
+ +
1263
(GI)
A = 29
E = 37
M = 66
A = 22
E = 8
M = 30
+ -
1275
(GI)
A = 14
E = 34
M = 48
A = 2
E = 0
M = 2
- -
A = índices de acerto; E = índices de erro; M = Motivação; GF = Grupo familiar; GI = Grupo
isolado.
DISCUSSÃO
Apesar da fase juvenil ser considerada uma janela biológica, importante para o
desenvolvimento e amadurecimento do sistema nervoso central (SNC), há poucos estudos que
investiguem a ação do estresse sobre o SNC nesta fase ontogenética, mesmo sabendo-se que
77
as alterações estruturais e funcionais induzidas por agentes estressores crônicos podem ser
permanentes e induzir o surgimento de desordens mentais durante a vida adulta (Pryce et al.
2002; Lupien et al. 2009; Badanes et al. 2011; Ganzel & Morris 2011). Diante disto, este
estudo investigou os efeitos do isolamento social crônico sobre o desempenho da memória de
trabalho e a plasticidade neuronal no córtex pré-frontal (através do BDNF) em saguis machos
juvenis, um modelo animal translacional. Algumas pesquisas já vêm investigando a ação de
fármacos sobre o desempenho da memória de trabalho em saguis adultos e apontam essa
espécie como um novo e importante modelo farmacológico para desordens que envolvam
disfunções cognitivas (Fournier et al. 1993; Spinelli et al. 2004; Nakako et al. 2013).
Foi observado neste estudo que os animais isolados apresentaram melhor desempenho,
índices de acertos, e maior motivação, nos testes de memória de trabalho (MT) do que os
animais em família. Nenhum animal, de ambos os grupos, aprenderam a tarefa da fase reversa
dos testes (2º fase), ou seja, nenhum animal obteve 6 acertos consecutivos nesta fase. Apenas
alguns animais do grupo GI conseguiram passar da fase direta, e executar a fase reversa, no
teste da caixa.
A teoria do efeito principal sugere que a presença de um suporte social induz o
tamponamento do eixo HPA, reduzindo os níveis de cortisol, em resposta aos estressores do
dia-a-dia, mantendo níveis ideais do hormônio (Cohen & Wills 1985). Entretanto, na F20 foi
realizado nos animais do GF breves separações como parte do protocolo de adaptação aos
aparatos dos testes de memória, que foram realizados em seguida na FEte. Provavelmente o
baixo desempenho e motivação observados neste estudo para os animais GF nos testes de
memória pode ser decorrente do aumento dos níveis de estresse em função das breves
separações que foram parte do protocolo de adaptação aos aparatos dos testes de memória.
Embora que para o GF o aumento do cortisol entre a F17 e F20 não tenha sido
estatisticamente significativo, este foi acompanhado do aumento significativo de outros
78
indicadores de estresse, a piloereção individual e a autocatação. A piloereção individual é um
comportamento que indica a ativação do sistema nervoso autônomo simpático em primatas
(Dettling et al. 2002) e a autocatação é um redutor de tensão, já que induz a liberação de
ocitocina que reduz a ativação do eixo HPA (DeVries et al. 2007; Wittig et al. 2008). Neste
estudo, provavelmente, a elevação da autocatação reduziu a atividade do eixo HPA e
consequentemente a liberação do cortisol, fazendo com que houvesse um acréscimo deste
hormônio, mas não estatisticamente significativo. Outros estudos usam protocolos com breves
separações para a execução de testes cognitivos (Crofts et al. 1999; Tsujimoto & Sawaguchi
2002; Spinelli et al. 2004). Porém, no presente estudo, parece que o período de adaptação, 3
dias, não foi suficiente para os machos juvenis de C. jacchus reduzissem a resposta ao
estresse, o que provavelmente desencadeou o baixo desempenho e motivação observados nos
testes de memória. Por exemplo, C. jacchus adultos necessitaram de um período de 1 a 3
semanas de habituação antes de iniciar um protocolo de testes de aprendizado reverso, que
necessitava de breves separações sociais para sua execução (Domeney et al. (1990).
Apesar do melhor desempenho e maior motivação no teste de memória, o GI
apresentava no período de execução dos testes um perfil fisiológico e comportamental típico
de depressão em primatas não-humanos. O GI apresentava uma hipocortisolemia crônica, pois
ao longo das 20 semanas foi observado uma queda progressiva nos níveis de cortisol, e
embora seja menos convencional a hipocortisolemia vem sendo associada a quadros
depressivos tanto em humanos quanto em primatas não-humanos. Por exemplo, observou-se
uma associação entre baixos níveis de cortisol e perfil comportamental depressivo em fêmeas
adultas de Macaca fascicularis expostas a protocolos crônicos de alterações no posto social
(22-26 meses) (Williard & Shively 2012). Saimeri e C. jacchus que foram repetidamente
separados da família quando eram infantes, apresentam hiporcortisolemia quando juvenis
(Dettling et al. 2002; Levine & Moby 2003). Além disto, pacientes com Depressão Atípica
79
(Fries et al. 2005) e a Bipolar apresentam hipocortisolemia (Maripuu et al. 2014). Sugere-se
que a hipocortisolemia pode ser uma adaptação de proteção após eventos de respostas bruscas
de elevações do cortisol (Fries et al. 2005). Por outro lado, discute-se que a manutenção da
atividade do eixo HPA tamponada, com ausência de responsividade, pode promover
vulnerabilidade ao indivíduo, principalmente em janelas biológicas, como é o caso da
juventude, facilitando o surgimento posterior de desordens psiquiátricas, inclusive a própria
depressão, e cognitivas (Badanes et al. 2011). Pois, estudos apontam uma relação de U
invertido entre os níveis de cortisol e o desempenho da memória (Salehi et al. 2010;
Moriarty et al. 2014). Ademais, associado a hipocortisolemia, foi observado no GI elevados
índices de anedonia e frequências de coçar, comportamentos indicativos de depressão em
primatas não-humanos (Paul et al. 2000; Shively & Willard 2012). O comportamento de coçar
o pêlo, diferente da catação, é um comportamento deslocado e não tem função de limpeza,
portanto, também é tido como um comportamento estereotipado (Dufour et al. 2011). Outra
medida muito utilizada para medir depressão é a anedonia, que é a perda da capacidade de
sentir prazer, que vem sendo investigada em primatas não-humanos através da mensuração da
ingestão de uma solução aquosa de sacarose (Shively et al. 2005; Vasconcellos et al. 2010;
Shively & Willard 2012).
Diante disto, podemos supor que os aparatos utilizados para os testes cognitivos
(objetos tridimensionais coloridos e a caixa de acrílico), assim como a recompensa alimentar,
podem ter atuado como um enriquecimento ambiental para os animais do grupo GI,
motivando-os, o que consequentemente levou a um maior índice de acertos. Alguns estudos
vêm demonstrando os benéficos do enriquecimento ambiental cognitivo, em primatas, a partir
da introdução de novos objetos aos animais (Kozorovitskiy et al. 2005; Sambrook &
Buchanan-Smith 1997). Porém, discute-se que os benefícios são dependentes da espécie,
dinâmica de grupo e características individuais (Sambrook & Buchanan-Smith 1997).
80
No entanto, de maneira geral tanto o GI quanto o GF apresentaram baixo desempenho
nos testes, alguns pontos podem ter contribuído para tais resultados, como: (1) A ativação do
sistema de resposta ao estresse, em função dos protocolos usados neste estudo. (2) Diferenças
individuais na motivação, que dentre outros motivos pode estar associada ao estado de
saciedade do animal (Spinelli et al. 2004). O fornecimento da alimentação duas horas antes
dos testes pode ter reduzido a motivação dos animais em obter a recompensa alimentar.
Muitos estudos de cognição incluem privação ou restrição alimentar com intuito de aumentar
a motivação animal em realizar o teste (Crofts et al. 1999; Tsujimoto & Sawaguchi 2002). (3)
O número insuficientes de tentativas, ou sessões experimentais, realizadas nos testes
cognitivos (15 por fase durante três dias, totalizando 45). Estudos relatam diferentes números
de sessões experimentais nos protocolos de testes de aprendizagem reversa, variando entre 20
e 300, tanto manuais quanto automatizados (Yamazaki & Watanabe 2009). Spinelli et al
(2004) relatam que saguis adultos geralmente cometem cerca de 50 erros antes de aprender a
realizar uma tarefa direta e cerca de 100 antes de aprender a realizar uma tarefa inversa.
Em uma revisão de meta-análise Deaner et al. (2006) observaram desempenhos mais
baixos para Callithrix em testes de discriminação de objetos, de aprendizagem reversa e
resposta com retardo, quando comparados tanto com primatas do velho mundo, como Gorilla
e Macaca, quanto com espécies neotropicais filogeneticamente mais próximos, como o
Saimiri. Todos estes testes cognitivos pertencem a domínio cognitivos não-sociais e o animal
realiza um aprendizado individualmente, a partir de sua própria experiência em acertar, ou
errar, e obter ou não, respectivamente, a recompensa. Outra maneira de aprender, e não menos
importante que a experiência individual, é a partir de observações e imitações ou através do
ensinamento. Alguns estudos com C. jacchus apontam que esta é uma das espécies de
primatas que apresenta maior potencial tanto para realizar imitações quanto para ensinar
(Caldwell & Whiten 2004; Moscovice & Snowdon 2006). Discute-se que tais habilidades são
81
oriundas de seu sistema de reprodução cooperativo, que facilitaria o desempenho em tarefas
de domínios sócio-cognitivas, que envolvem aprendizagem social, comunicação, imitação,
ensino e cooperação (Burkart & van Schaik 2010). Uma revisão de meta-análise comparou o
desempenho de várias espécies de primatas do novo mundo, dentre elas o C. jacchus, em
tarefas de domínios sociais e não-sociais, e observaram que C. jacchus apresenta melhor
desempenho nos contextos sociais (Burkart & van Schaik 2010). Entretanto, com treinamento
extenso, a espécie consegue realizar adequadamente tarefas de domínios não sociais, inclusive
manipulações de ferramentas (Yamazaki et al. 2011).
Portanto, em conjunto, estes achados sugerem que novas abordagens de estudo da MT
em sagui juvenis, sem experiência prévia em testes cognitivos, podem ser elaboradas e
testadas. Por exemplo, protocolos que envolvam a participação de um animal adulto,
experiente no teste, que: (1) evitaria o estresse provocado pelas separações sociais, que
normalmente fazem parte dos protocolos de testes de MT, (2) aumentaria a motivação do
juvenil para realizar as tarefas e (3) caso o co-especifico fosse experiente na realização da
tarefa, ensinaria a tarefa para o juvenil, vez que esta espécie possui uma capacidade inata de
imitar, reduzindo consequentemente o número de sessões necessárias para o aprendizado da
tarefa. Além disto, a motivação social levaria a redução da utilização de restrições alimentares
para aumentar a motivação, incrementando assim o bem- estar animal. Alguns estudos com
protocolo similar ao sugerido foram desenvolvidos com Saguinus oedipus, Saguinus
fuscicollis e C. jacchus, mas todos envolvendo memória de longo prazo, não havendo estudos
com MT (Borgens 1982; Moscovice & Snowdon 2006).
Além disto, pode-se considerar em desenvolver protocolos de testes de MT que
utilizem estímulos sociais não vivos, como o uso de vídeos com imagens de um co-especifico
realizando os testes. Pois estudos indicam que os primatas não-humanos podem perceber e
responder às imagens estáticas e em movimento (Anderson 1998). Inclusive, um estudo com
82
C. jacchus aponta que as fêmeas desta espécie são capazes de perceber movimentos
biológicos, que gera a compreensão se um determinado organismo ou objeto é ou não vivo,
(Brown et il. 2010). Outros estímulos de relevância etológica, como: imagens de co-especifico
e/ou predadores, alimentos e pequenos brinquedos de pelúcia também poderiam ser utilizados
para substituir as figuras ou objetos geométricos geralmente utilizados nos testes de MT
automatizados e manuais, respectivamente, e que não apresentam qualquer significado
etológico ao animal, o que provavelmente reduz ainda mais a motivação em realizar os testes
(Anderson 1998). Além disto, as recompensas alimentares, geralmente frutas e doces, também
podem ser substituídas por outros alimentos de maior relevância etológica e que não façam
parte da rotina diária de alimentação, no caso dos saguis, o uso de insetos do gênero Tenebrio.
Com relação à modulação do estresse sobre a plasticidade neural no CPF foi inferida
através da investigação do BDNF nas regiões orbitofrontal e lateral do CPF. Observou-se
maior presença de BDNF (BDNF+) na região orbitofrontal (animais n = 4) que na região
lateral do CPF (animais n = 2). Esses achados aparentemente apontam que o estresse, através
do cortisol, induz maiores prejuízos sobre a área do CPF lateral, que sobre o CPF
orbitofrontal. Provavelmente, isto ocorre em função do CPF lateral, em primatas não-
humanos, e o CPF dorsolateral, em humanos, desempenhar um papel fundamental no controle
de cima para baixo (Top-down) das emoções e dos comportamentos motivados (Okon-Singer
et al. 2015). Apesar disto, sabe-se que tanto o CPF orbitofrontal, quanto o CPF lateral, tem
funções importantes, porém ligeiramente distintas, junto aos processos que regem a memória
de trabalho. Estudos com humanos mostram o CPF dorsolateral atua no processo de atenção
seletiva, inibindo distratores, inclusive, de natureza emocional (Smith & Jonides 1999; Peers
et al. 2013). Em saguis, o CPF lateral possui função semelhante ao CPF dorsolateral humano,
observando-se prejuízos na atenção quando a área é lesionada (Dias et al. 1997; Roberts et al.
2000). Estudos com primatas não humanos, saguis e rhesus, apontam que o CPF orbitofrontal
83
está relacionado com o processo de tomada de decisão e aprendizagens reversas (Roberts et
al. 2000; Mansouri et al. 2014). Wallis et al. (2001) lesionaram, em um grupo de saguis
machos adultos, o CPF lateral e observaram que os animais não conseguiam realizar uma
tarefa já aprendida em um novo contexto com características iguais ao contexto do
aprendizado. Os autores ainda lesionaram, em outro grupo de sagui machos adultos, o CPF
orbitofrontal e observaram que as lesões dificultavam o desenvolvimento de tarefas
dependentes de aprendizado reverso.
Neste estudo, a presença de BDNF no CPF (orbitofrontal ou lateral) não foi associada
ao grupo (GI ou GF), e nem ao desempenho nos testes cognitivos, como demonstra o quadro
1. Entretanto, os animais que apresentaram BDNF+, tanto no CPF orbitofrontal quanto lateral,
possuíram maiores níveis de cortisol que os BDNF- na última semana do estudo (F20).
Estudos moleculares apontam que o cortisol modula a liberação do BDNF à nível de RNAm
nas regiões cerebrais que contém os receptores de cortisol, como por exemplo, o CPF (Tapia-
Aranciba et al. 2004; Gray et al. 2012). Níveis elevados de cortisol reduzem os níveis de
BDNF (Dell´Osso et al. 2009; Gourley et al. 2009) e a neurogênese hipocampal (Lupien et al.
2007; Schwabe et al. 2012). Assim como, a escassez deste hormônio também é prejudicial
para a liberação do BDNF, existindo uma relação em curva de U invertido entre os níveis de
cortisol e BDNF, onde níveis intermediários são os mais adequados para a expressão deste
fator (Tapia-Aranciba et al. 2004). Sendo assim, neste estudo, provavelmente os animais que
apresentaram baixos níveis de cortisol (CPF orbitofrontal BDNF-: n=2, μ = 2,45 ± 0,36 ng/g;
CPF lateral BDNF-: n= 4, μ = 2,59 ± 0,29 ng/g) não apresentaram condições para a expressão
do BDNF, enquanto que um maior número de animais expressaram BDNF quando
apresentaram níveis medianos de cortisol (BDNF+ CPF orbitofrontal n= 4, μ = 3,7 ± 0,88
ng/g). O número de animais que expressaram BDNF reduz ligeiramente (n=2) no grupo de
animais em que os níveis de cortisol (CPF lateral; μ = 4,57 ± 1,62 ng/g) são próximos aqueles
84
observados durante uma resposta aguda ao estresse, por exemplo nos animais GF na F20 (μ =
4,8 ± 0,67). Na literatura são escassos os estudos que investiguem plasticidade neuronal ou
neurogênese em saguis, não havendo ainda um estudo que relacione os níveis de cortisol e a
presença de BDNF no sistema nervoso central. Todavia, um estudo com saguis juvenis,
realizado em colaboração com nosso grupo de pesquisa, apontou que altos níveis de cortisol
liberados durante a resposta ao estresse, em um protocolo de isolamento social por 3 semanas,
estão relacionados a uma redução na neurogênese hipocampal, inferida através do marcador
BrdU (Cinini et al. 2014).
Apesar das limitações encontradas neste estudo, pela primeira vez investigou-se nesta
espécie simultaneamente a relação entre estresse, cognição e plasticidade neuronal, inferida a
partir da presença de BDNF no CPF. Os dados dos testes de memória de trabalho levam a
reflexões sobre os tipos de protocolos utilizados para investigar esta função em animais
juvenis nesta espécie, sem experiência em testes cognitivos, e como eles podem ser
repensados a fim de facilitar a aprendizagem das tarefas, já que esta espécie parece apresentar
um desempenho mais limitado neste tipo de memória e, por outro lado, apresentar alta
propensão ao aprendizado social (Burkart & van Schaik 2010). Apesar de não ter sido
encontrado correlação entre a presença do BDNF no CPF, com o desempenho nos testes
cognitivos ou o tipo de agrupamento social (familiar ou isolado socialmente), foi observado
uma associação, coerente com a literatura, entre a presença de BDNF no CPF e os níveis de
cortisol. Estes resultados corroboram na validação do C. jacchus como modelo translacional
em estudos de estresse e cognição.
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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS E DISCUSSÃO GERAL
Os fatores ambientais que modulam o desenvolvimento de um indivíduo,
principalmente durante as janelas biológicas de neuroplasticidade, podem influenciar na sua
resiliência ou susceptibilidade a doenças futuras (Tamashiro 2015). Estressores, incluindo o
estresse psicossocial, podem ter consequências positivas ou negativas sobre o indivíduo,
dependendo de sua intensidade e duração. Os efeitos do estresse em longo prazo normalmente
induzem, nos seres humanos, a intercorrência de doenças psiquiátricas, como depressão e
ansiedade, e condições metabólicas adversas, incluindo obesidade, diabetes e doenças
cardiovasculares (McEwen 2000).
Sendo a Depressão Maior o transtorno de humor mais prevalente na população,
inclusive entre adolescentes (Lewinsohn et al. 1998; Heim et al. 2004), e considerando que as
doenças psiquiátricas, de maneira geral, reduzem o desempenho cognitivo e reduzem os
índices de aprendizagem (Hindmarch et al. 2013), este estudo avaliou os efeitos do estresse
social crônico sobre parâmetros fisiológicos (cortisol fecal e peso), comportamentais,
cognitivos e a plasticidade neuronal no córtex pré-frontal durante um período crítico do
desenvolvimento cerebral, a fase juvenil, em machos de Callithrix jacchus, a fim de
corroborar na validação desta espécie como modelo animal translacional para desordens de
humor e cognição.
No artigo 1, intitulado “Alterações fisiológicas e comportamentais em modelo animal
juvenil de depressão: Callithrix jacchus, um primata não-humano” cinco machos juvenis
isolados cronicamente por 13 semanas apresentaram modificações fisiológicas e
comportamentais características de um quadro depressivo em primatas não-humanos e que
não foram observadas em animais de mesmo sexo e idade mantidos em ambiente familiar.
93
Estes animais apresentaram um quadro crônico de hipocortisolemia, após uma fase transiente
de elevação de cortisol e de ativação do sistema nervoso autônomo simpático, que ocorreu na
primeira semana de isolamento. Diversos estudos apontam a hipocortisolemia como um
mecanismo que promove vulnerabilidade ao indivíduo, principalmente em janelas biológicas
como é o caso da juventude, facilitando o surgimento de desordens psiquiátricas, inclusive a
própria depressão, durante a vida adulta (Badanes et al. 2011). Além da hipocortisolemia, um
perfil etológico alterado, típico de depressão em primatas não-humanos (Shively & Willard
2012) também foi observado nestes animais, que apresentaram elevadas frequências de
comportamentos estereotipados, como: coçar e deslocamento, associados a uma brusca
redução de um comportamento prazeroso, ingestão de uma solução aquosa de sacarose,
indicando um quadro de anedonia. Apesar da perda de peso ser característica de quadro de
depressão em primatas não-humanos adultos, este parece não ser um bom indicador para
animais juvenis, vez que esta é uma fase ontogenética de crescimento acentuado, o que pode
mascarar resultados (Maxwell & Cole 2009). Em nosso estudo, observamos uma redução
transitória de peso, porém bastante acentuada, que foi recuperada ao final do estudo.
Sendo assim, de maneira geral, as alterações fisiológicas e comportamentais
encontradas para os animais juvenis isolados cronicamente caracterizam um quadro
depressivo em primatas não-humanos e corroboram no processo de validação do C. jacchus
como modelo translacional de depressão juvenil. Marcadores fisiológicos e comportamentais
específicos para esta fase ontogenética e sexo foram apontados, e outros estudos já podem
utiliza-los, assim como o protocolo de isolamento crônico, para realizar nesta espécie
investigações farmacológicas, neurocognitivas, entre outras, associadas à Depressão Maior.
No artigo 2, intitulado: “Estresse, cognição e plasticidade neural em saguis (Callithrix
jacchus)”, investigou-se os efeitos do estresse social crônico sobre memória de trabalho (MT)
e plasticidade neuronal no córtex pré-frontal (CPF) durante um período crítico do
94
desenvolvimento e amadurecimento cerebral, a fase juvenil, em machos de Callithrix jacchus.
Para isto, foram aplicados dois testes cognitivos de memória de trabalho, de aprendizagem
reversa, um teste de discriminação de objetos e outro de memória espacial, em animais que
viviam em grupos familiares e animais isolados cronicamente por 16 semanas. Observou-se
que os animais isolados apresentaram melhores desempenhos e maiores motivações nas
tarefas da fase direta, muito provavelmente porque o aparato experimental para
desenvolvimento dos testes de memória passou a funcionar como um enriquecimento
ambiental cognitivo (Sambrook & Buchanan-Smith 1997; Kozorovitskiy et al. 2005). E por
outro lado, as breves separações da família para a realização dos testes de MT, além do
protocolo de adaptação realizado para os testes, parecem ter provocado um estresse agudo nos
animais do grupo familiar, gerando assim uma redução na motivação e no desempenho das
tarefas. Porém, de maneira geral, tanto os animais isolados quanto os que viviam em família
apresentaram baixos desempenhos nos testes, pois nenhum dos grupos aprendeu a tarefa
reversa. Estes resultados induziram um redirecionamento do estudo e levaram a uma reflexão
a respeito dos protocolos que avaliam a memória de trabalho em saguis juvenis, inexperiente
em testes cognitivos. Diante disto, foi realizado sugestões de protocolos de testes de MT que
associem tarefas de memórias de trabalho às de aprendizagem social, o que provavelmente
facilitaria a aprendizagem do animal, principalmente em situações de estresse.
Ainda no artigo 2, apesar das limitações encontradas neste estudo, pela primeira vez
investigou-se nesta espécie simultaneamente a relação entre estresse, cognição e plasticidade
neuronal, inferida a partir da presença de BDNF no CPF. Apesar de não ter sido encontrado
correlação entre a presença do BDNF no CPF , com: o desempenho nos testes cognitivos ou o
tipo de agrupamento social (familiar ou isolado socialmente), foi observado uma associação
entre a presença de BDNF no CPF e os níveis de cortisol. Os resultados do BDNF corroboram
estudos, com outras espécies, que apontam uma modulação em U invertido do cortisol sobre a
95
neurogênese tanto baixos níveis de cortisol, quanto altos níveis inibem a liberação do BDNF,
sendo os níveis intermediários ótimos para a atuação do mesmo (Tapia-Aranciba et al. 2004;
Dell´Osso et al. 2009).
Sendo assim, ambos os estudos corroboraram na validação desta espécie como modelo
animal translacional para desordens de humor e cognição, vez que: a) houve validação do
protocolo de isolamento crônico como indutor de depressão em saguis juvenis, b) foram
apontados marcadores fisiológicos e comportamentais de depressão em saguis juvenis, c)
discutiu-se a aplicabilidade dos testes de memória de trabalho, que vem sendo utilizado na
literatura, para machos de saguis juvenis sem experiência previa em testes cognitivos e foram
apontados sugestões de novos protocolos que facilitem a aprendizagem, d) apontou pela
primeira vez a relação entre cortisol e BDNF no CPF nesta espécie.
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101
ANEXO I – ARTIGO II: Estresse, cognição e neurogênese em saguis (Callithrix jacchus)
RESULTADOS
BDNF imunofluorescência
1. Córtex pré-frontal Orbitofrontal (A11)
GF- grupo familiar
1279 BDNF +
102
1271 BDNF +
103
1287 BDNF-
104
1. Córtex pré-frontal Orbitofrontal (A11)
GI- grupo isolado
1273 BDNF +
105
1263 BDNF +
106
1275 BDNF-
107
ANEXO II – ARTIGO II: Estresse, cognição e neurogênese em saguis (Callithrix
jacchus)
RESULTADOS
BDNF imunofluorescência
2. Córtex pré-frontal lateral (A47/12L)
GF- grupo familiar
12 71 BDNF +
108
1279 BDNF-
109
1287 BDNF-
110
2. Córtex pré-frontal lateral (A47/12L)
GI- grupo isolado
1273 BDNF+
111
1263 BDNF-
112
1275 BDNF-