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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
USO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS DA MEDULA ÓSSEA PARA O TRATAMENTO
DE LESÕES ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris).
Helia Christine Dórea de Macedo Zamprogno
Orientador: Maria Eugênia Leite Duarte
Livros Grátis
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Junho / 2008
Helia Christine Dórea de Macedo Zamprogno
USO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS
DA MEDULA ÓSSEA PARA O TRATAMENTO DE LESÕES ÓSSEAS EM CÃES (Canis
familiaris).
Orientador: Maria Eugênia Leite Duarte
Tese apresentada ao Programa de
Ciências Morfológicas da Universidade
Federal do Rio de Janeiro como requisito para obtenção do grau de Doutor.
ii
Junho / 2008
BANCA EXAMINADORA MEMBROS TITULARES Prof. Dr. Helio Dutra Universidade São Paulo Profa. Dra. Maria Isabel Doria Rossi Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. José Mauro Granjeiro Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Marcos Farina Suplente Interno Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. Alex Balduíno Revisor e Suplente Externo Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO).
ORIENTADOR Profa. Dra. Maria Eugenia Duarte Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO) Universidade Federal do Rio de Janeiro
COORDENADOR DO PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto
iii
iv
Dedico esta tese à Heron Dórea,
minha avó, que continua guiando meus caminhos.
Agradecimentos
A Professora Dra. Maria Eugênia Leite Duarte, orientadora, que
me mostrou os caminhos, me apoiou nas dificuldades e me ensinou a
lidar com os erros, imperfeições e as variabilidades dos estudos
clínicos, facilitando assim, a execução deste trabalho e a constatação dos benefícios da pesquisa clínica tanto para a medicina veterinária,
como também para a medicina humana.
A Priscila Moreno, amiga e colega, que me ensinou a trabalhar com
células e me mostrou que a complexidade dos protocolos pode ser
quebrada pela prática. Porém mais que isso, me ensinou o verdadeiro sentido de trabalho em equipe e amizade.
Ao Professor Dr. André Lacerda, amigo e colega que abriu as portas da sua instituição, Universidade Estadual do Norte Fluminense, permitindo que eu usasse as instalações do Hospital Veterinário para
a execução de várias etapas deste trabalho.
Aos colegas médicos veterinários que humildemente indicaram seus casos de não-união de fraturas, contribuindo para a casuística
deste estudo. Aos proprietários dos cães que participaram deste estudo, pela
coragem de enfrentar o desconhecido, perseverança e vontade de fazer de tudo pelos seus “amigos de quatro patas”.
A Marcela Fontana que com muita paciência e dedicação me
ensinou RT-PCR.
A Alex Balduíno pela importante ajuda na revisão da tese.
A Professora Dra. Cristina Takyia que me ajudou tantas vezes a
ajustar protocolos, corrigir erros e seguir em frente.
A Renato Zamprogno (Beco), Eliete Dórea e Edilza Dórea,
minha família, pelo apoio incondicional e pela compreensão diante de
tantas horas dedicadas ao trabalho.
A Deus pelas infinitas oportunidades de aprendizado.
v
RESUMO
Introdução: Uma das alternativas para aumentar o número de células
osteoprogenitoras da medula óssea, e consequentemente a taxa de sucesso
da terapia celular, é a expansão in vitro, que tem como principal vantagem
o significante aumento da população celular em um curto espaço de tempo,
devido ao alto potencial de proliferação (Lucarelli and Beccheroni, 2003). O
objetivo deste estudo foi investigar a resposta obtida no tratamento de não
união de fraturas e defeitos ósseos críticos, após a injeção percutânea de
células osteoprogenitoras da medula óssea autólogas expandidas in vitro.
Materiais e Métodos: Os casos clínicos incluíram seis não uniões de
fraturas e quatro fraturas associadas com defeitos ósseos críticos como
resultado de reabsorção óssea. Todos os animais foram tratados com
injeção percutânea de células osteoprogenitoras da medula óssea autóloga,
expandidas in vitro e os implantes não foram revisados mesmo na presença
de instabilidade no foco de fratura. A caracterização fenotípica e mofológica
das células osteoprogenitoras da medula óssea foi baseada nos ensaios de
PCR-RT, imunocitoquímica e quantificação das unidades formadoras de
colônia (CFU-F). Avaliação radiográfica foi feita no momento da injeção das
células e oito semanas depois, para analisar a consolidação óssea.
Resultados: Após 60 dias, a avaliação radiográfica revelou uma completa
união óssea em sete cães, redução do tamanho do espaço interfragmentar
em um cão e ausência de reparo ósseo em dois pacientes. O número de
CFU-F variou de 18.8 to 24.8 (média 22.42±1.54) por milhão de células
nucleadas. A expressão de α-actina de músculo liso, vimentina, decorina,
osteopontina, colágeno I, sialoproteína óssea, biglicana, and fibronectina
demonstrou o comprometimento osteogênico das CTEs. PCR-RT detectou a
expressão gênica de Cbfa1, fosfatase alcalina, colágeno I e osteonectina,
confirmando o comprometimento osteogênico das CTEs expandidas.
Conclusão: A consolidação óssea foi alcançada em 7/10 casos,
demonstrando que as CTEs, aplicadas de forma minimamente invasivas,
podem ter um papel no reparo de não união de fraturas e defeitos ósseos
extensos.
Palavras chave: Células osteoprogenitoras, medula óssea, cão, não-união
de fraturas, e defeito ósseo crítico.
vi
ABSTRACT
Introduction: The use of in vitro expanded bone marrow stem cells
(BMSC) increases success rate of the stem cell therapy. One advantage of
this technique is the ability to give a significant increase in cells numbers in
a few days due to their high proliferative rate (Lucarelli and Beccheroni,
2003). The aim of the present study was to investigate the response to
treatment of canine nonunion fractures and critical sized bone defects with
the percutaneous injection of autologous in vitro expanded BMSC.
Materials and Methods: The clinical cases were six nonunion fractures
and four fractures associated with critical-sized bone defects as a result of
bone resorption. All animals were treated with percutaneous in vitro
expanded autologous BMSCs grafting. The implants were not revised, even
when instability was detected. BMSCs morphologic and phenotypic
characterization was based on PCR-RT, immunocytochemistry and Colony
Forming Units–Fibroblasts (CFU-F) quantification. Radiographic evaluation of
the fracture site was performed at the date of the injection and 8 weeks
later to assess bone healing.
Results: After 60 days, radiographic evaluation revealed complete union in
seven dogs, reduction of the fracture gap in one dog (which was insufficient
to stabilize the fragments) and lack of boney healing in two dogs. The
number of CFU-F per million of nucleated cells ranged from 18.8 to 24.8
(mean 22.42±1.54). The expression of α-smooth muscle actin, vimentin,
decorin, osteopontin, type I collagen, bone sialoprotein, biglycan, and
fibronectin in expanded SSCs displayed osteogenic commitment of the cells.
PCR-RT detected the expression of Cbfa1, alkaline phosphate, type I
collagen and osteonectin genes, confirming the osteogenic commitment of
the expanded BMSCs.
Conclusion: Complete bone healing was achieved in 7/10 cases,
demonstrating that BMSCs may aid healing of non-union fractures and large
bone defects. Furthermore, this treatment could be advantageous to
decrease the morbidity associated with more invasive surgical procedures.
Key words: Bone marrow, stem cells, canine, nonunion fractures, and
critical bone defects.
vii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11
1.1 O tecido ósseo 11
1.2 Remodelação óssea em humanos 13
1.3 Consolidação das fraturas 15
1.4 Medula óssea 20
1.5 Células tronco mesenquimais 20
1.6 Não-união de fraturas 22
1.7 Tratamento da não-união óssea 27
1.8 Uso terapêutico de células osteoprogenitoras 30
1.9 Justificativa 33
2. OBJETIVOS 35
2.1 Objetivo geral 35
2.2 Objetivos específicos 35
3. METODOLOGIA 36
3.1. Animais 36
3.2. Coleta de medula óssea 37
3.3. Isolamento e expansão das células estromais 38
3.4. Caracterização morfofuncional e molecular das células
estromais da medula óssea 40
3.4.1. Identificação das unidades formadoras de colônias (CFU-
Fs) 40
3.4.2. Imunocitoquímica 41
3.4.3. PCR-RT (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction) 42
3.5. Injeção da suspensão celular 45
3.6. Avaliação radiográfica 46
3.7. Avaliação clínica 46
3.8 Análise estatística 47
4. RESULTADOS 49
4.1 Caracterização dos pacientes 49
4.2 Coleta da medula óssea 51
4.3 Isolamento e expansão das células estromais 52
4.4 Caracterização das células estromais da medula óssea 55
4.4.1 Unidades formadoras de colônia (CFU-Fs) 55
4.4.2 Caracterização fenotípica por imunocitoquímica 56
4.4.3 Caracterização fenotípica por PCR-RT 57
4.5 Injeção da suspensão celular 58
4.6 Avaliação radiográfica 60
4.6.1 Caso 1 60
4.6.2 Caso 2 61
4.6.3 Caso 3 62
4.6.4 Caso 4 63
4.6.5 Caso 5 64
4.6.6 Caso 6 65
4.6.7 Caso 7 66
viii
4.6.8 Caso 8 67
4.6.9 Caso 9 68
4.6.10 Caso 10 69
4.7 Avaliação clínica 70
5. DISCUSSÃO 72
5.1 Celularidade do aspirado medular 74
5.2 Eficácia da expansão in vitro 74
5.3 Potencial osteogênico da suspensão celular injetada nas
lesões 77
5.4 Comprometimento com a linhagem osteogênica 78
5.5 Manutenção do tecido fibroso inviolado no foco de não-união 81
6. CONCLUSÕES 85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87
ANEXOS 98
11
Introdução
1.1 Tecido Ósseo
Os ossos são constituídos por uma forma de tecido conjuntivo
rígido cuja matriz extracelular encontra-se impregnada por cristais de
fosfato de cálcio depositado através do processo de mineralização.
Com sua estrutura altamente vascularizada e metabolicamente ativa,
os ossos exercem funções de suporte e proteção e representam o
principal reservatório de íons de cálcio e fosfato (WHITEFIELD e
ROSEMBERG, 2005).
Os ossos podem ser constituídos por tecido ósseo compacto (ou
cortical) ou tecido ósseo esponjoso (ou medular). A superfície externa
dos ossos é recoberta pelo periósteo, enquanto que o endósteo
recobre a superfície interna (KIERSZENBAUM, 2002).
Do ponto de vista microscópico, o tecido ósseo é composto por
matriz óssea, osteoblastos (formas ativas e inativas), osteócitos e
osteoclastos (HOLMBECK et al., 2005).
A matriz óssea consiste de 35% de componentes orgânicos,
incluindo prioritariamente colágeno tipo I (90%), proteoglicanos
como o sulfato de condroitina e ácido hialurônico e proteínas não
colágenas (osteocalcina, osteopontina e osteonectina) e 65% de
componentes inorgânicos. Os componentes inorgânicos são
representados predominantemente pela hidroxiapatita
(KIERSZENBAUM, 2002).
12
Os osteoblastos são células de formato cuboidal ou colunar
que recobrem todas as áreas de formação óssea ativa, sob a forma
de monocamada (HOLMBECK et al., 2005). Os osteoblastos
depositam na interface com a trave mineralizada uma matriz orgânica
denominada de matriz osteóide, onde posteriormente terá inicio o
processo de mineralização (HOLMBECK et al., 2005). Durante o
processo de deposição da matriz osteóide alguns osteoblastos ficam
aprisionados na matriz e se diferenciam em osteócitos. Estas células
maduras, localizadas no interior de lacunas e completamente
envolvidas por matriz óssea mineralizada, estão conectadas por
canalículos pelos quais atravessam prolongamentos celulares que
integram os osteócitos através de junções comunicantes (WANG et
al., 2000). Por esta rede de canais circula um fluido que é
impulsionado para dentro das lacunas e de volta para os canalículos
de acordo com os movimentos dos ossos. A intensidade com que esse
fluido alcança os osteócitos determina a oscilação de íons de cálcio.
Ademais, este fluido participa do transporte de nutrientes, de
oxigênio e metabólitos dos/para os osteócitos controlando o processo
de ativação ou não destas células (KNOTHE-TATE et al., 2003).
O osteoclasto é uma célula multinucleada que tem sua origem
a partir da fusão de monócitos, provenientes da circulação sanguínea
(BLAIR, 1998) ou a partir da fusão de pré-osteoclastos existentes na
medula óssea (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). Essas células são
responsáveis pela reabsorção óssea, através da secreção de enzimas
13
na superfície óssea que promovem a dissolução da matriz
mineralizada e degradação enzimática da matriz orgânica. A
formação dos osteoclastos é controlada pelo paratormônio (PTH),
produzido nas glândulas paratireóides. Essa glândula possui
receptores de membrana que respondem aos níveis séricos de Ca++.
Quando a concentração sérica declina, o PTH é secretado e os
osteoclastos são formados a fim de promover a reabsorção óssea,
restaurando os níveis de cálcio (BLAIR, 1998).
1.2 Remodelação Óssea em Humanos
Os osteócitos são responsáveis pelo monitoramento das forças
exercidas sobre o osso e programados para responder às alterações
biomecânicas (KLEIN-NULENT et al., 2003), iniciando o processo de
remodelação (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). Em reposta a
micro danos e subseqüente ativação dos osteócitos os osteoclastos
migram para o sítio onde o processo de remodelação está se
iniciando. Através da ação da catepsina K os osteoclastos iniciam a
degradação da matriz óssea (BLAIR, 1998). Com a degradação da
matriz e morte dos osteócitos, é provável que os osteoclastos sejam
recrutados pelos percussores estromais osteoblásticos por
quimiotaxia, através da liberação de M-CSF (macrophage colony-
stimulating factor) e RANKL (receptor activator of NF-κB Ligand).
Uma vez aderidos à zona de reabsorção os osteoclastos promovem a
escavação da matriz óssea durante 2 a 3 semanas. Durante esse
14
período de tempo o fluxo do fluido extracelular cessa por completo
naquela região (KLEIN-NULENT et al., 2003) e o local fica preparado
para que ocorra a deposição de matriz protéica pelos osteoblastos e
sua subseqüente mineralização (KIERSZENBAUM, 2002).
Durante o processo de escavação, BMP-2 (proteína morfogênica
óssea 2), FGF-2 (fator de crescimento fibroblástico 2), IGFs-I e II
(fatores de crescimento insulínico I e II), IGFBP-5 (proteína de
ligação do fator de crescimento insulínico 5) e TGF-β (fator de
crescimento transformante β), são liberados da matriz óssea
estimulando a diferenciação das células osteoprogenitoras em
osteoblastos (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). O TGF-β estimula
particularmente a diferenciação das células do estroma da medula
óssea em osteoblastos, através da via de ativação Cbfa1/Runx-2 e
concomitantemente a diminuição da formação de osteoclastos
através da redução da expressão de RANKL (TROEN, 2003). Cessada
a escavação, os osteoclastos sofrem apoptose. Estas células deixam
um rastro de Mim-1 (myb-induced myeloid protein 1), uma citocina
que atrai progenitores de osteoblastos (TROEN, 2003) e facilita a
ação do Cbfa1/Runx-2, estimulando a expressão de osteocalcina e
mineralização da matriz orgânica (PONOMAVERA et al., 2002). O
preenchimento completo das lacunas de reabsorção com o osso
depositado pelos osteoblastos e a completa restituição da área recém
remodelada ocorre num período de 3 a 9 meses. Ao final deste
processo, os osteoblastos que não foram aprisionados nas lacunas
15
sofrem apoptose e liberam fosfatase alcalina sobre a nova matriz
óssea concluindo o processo de reparação do tecido ósseo
(WHITEFIELDB e ROSEMBERG, 2005).
1.3 Consolidação das Fraturas
Em certas condições de instabilidade a consolidação das
fraturas é caracterizada pela formação de um calo intermediário à
formação óssea. Esse reparo ósseo é chamado de consolidação
secundária e pode ser dividido em três fases que ocorrem
simultaneamente: inflamação, reparo e remodelamento (GRIFFON,
2005). Cabe ressaltar que a formação óssea ocorre somente em
condições mínimas de mobilidade entre os fragmentos ósseos, que
não deve ultrapassar 2% (SCHILLER, 1988).
A fase inflamatória começa imediatamente após a fratura e o
estabelecimento da ausência de continuidade óssea e de tecidos
adjacentes, e persiste até o início da formação de cartilagem ou osso.
Essa fase dura em torno de 3 a 4 dias e o final desta fase, pode ser
caracterizado clinicamente, pela diminuição do edema e dor local
(GRIFFON, 2005).
Inevitavelmente as fraturas causam dilaceração dos vasos
sanguíneos medulares, com subseqüente extravasamento de sangue.
Trombose e contração destes vasos sanguíneos minimizam a perda
sanguínea, mas ao mesmo tempo promovem isquemia e conseqüente
necrose óssea, observada pela presença de lacunas vazias na
16
histopatologia. Forma-se então, no espaço interfragmentar, um
hematoma rico em fibrina que apesar de não oferecer nenhum
suporte mecânico à fratura, marca o início da consolidação óssea,
através da liberação de fatores de crescimento que estimulam a
angiogênese e osteogênese. Formação óssea endocondral ectópica foi
observada após o transplante de coágulo interfragmentar,
demonstrando assim o potencial osteoindutor dos componentes deste
hematoma (STREET et al., 2000). Possivelmente, as plaquetas seriam
o primeiro tipo celular a alcançar o foco de fratura e além de fatores
de coagulação, elas contribuiriam também com fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e TGF-β1, estimulando a
formação óssea (LIEBERMAN et al., 2002).
As propriedades angiogênicas presentes no hematoma
interfragmentar são mediadas pelo fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF) e fatores como acidez local e citoquininas contidas
no exudato da região traumatizada (STREET et al., 2000).
Mediadores inflamatórios como as prostaglandinas E1 e E2 também
estimulam a angiogênese e ainda são responsáveis pela sinalização e
ativação de osteoclastos e o início da reabsorção óssea (MILLIS,
1999). Finalmente, mastócitos contendo substâncias vasoativas
contribuem para a formação de novos capilares (MCLAUGHLIN,
1991). Em questão de horas, a área necrótica é invadida por novos
vasos sanguíneos oriundos dos tecidos moles adjacentes (GRIFFON,
2005).
17
Células mononucleares, com potencial fagocitário auxiliam na
remoção de osso necrótico, e macrófagos, através da liberação de
fatores de crescimento como o fator de crescimento fibroblástico
(FGF), estimulam a produção de tecido fibroso, assim como a
formação óssea (LIEBERMAN et al., 2002). Com o restabelecimento
da vascularização intra-medular, a vascularização extra óssea
regride. Em condições normais, o hematoma é reabsorvido no final da
primeira semana pós-trauma (SCHILLER, 1988).
O restabelecimento da vascularização permite a disseminação
de fibroblastos e células mononucleares que transformam o
hematoma em tecido de granulação. Isso promove um leve grau de
estabilidade ao foco de fratura, em torno de 0.1 Mn/mm2. Com a
maturação do tecido de granulação, fibras de colágeno se tornam
mais abundantes, principalmente colágeno tipo I, permitindo uma
resistência ainda maior no foco de fratura, de até 60 Nm/mm2. Baixa
tensão de oxigênio, vascularização precária, fatores de crescimento e
forças mecânicas atuando na região interfragmentar influenciam na
formação do calo cartilaginoso (REMEDIOS, 1999).
As células mesenquimais que se encontram no periósteo,
endósteo, medula óssea e tecidos moles adjacentes, começam a se
proliferar durante a fase inflamatória e se diferenciar durante a fase
de reparo. Fatores de crescimento como TGF-β e proteínas ósseas
morfogenéticas (BMPs) coordenam a quimiotaxia, proliferação e
diferenciação das células progenitoras em condroblastos e
18
osteoblastos (HEPPENSTALL, 1980). O periósteo que circunda a
região fraturada aumenta de diâmetro, produzindo assim, um calo
ósseo externo, inteiramente irrigado por vasos extra-ósseos. Um calo
interno, confinado à cavidade medular, se desenvolve a partir do
endósteo e é vascularizado a partir das arteríolas medulares
(HEPPENSTALL, 1980). Esse calo cartilaginoso, que é formado
durante as primeiras 3 semanas após o trauma, apresenta uma
resistência a forcas mecânicas similar à do tecido fibroso (MANN e
PAYNE, 1989).
Um achado comum em fraturas instáveis e bem vascularizadas
é um calo exuberante. Esse aumento de diâmetro do osso promove
um ganho na resistência contra as forças de torção permitindo assim
a formação de osso compacto. A mineralização do calo
fibrocartilaginoso progride das extremidades dos fragmentos ósseos,
para o centro do espaço interfragmentar, através da formação de
focos de mineralização controlados por condrócitos (GRIFFON, 2005).
O exato mecanismo de mineralização é ainda incerto, entretanto,
estudos apontam para uma atividade mitocondrial muito similar à que
ocorre nas placas de crescimento (KETENJIAN e ARSENIS, 1975). A
mitocôndria acumularia grânulos de cálcio e fosfato de cálcio que
seriam liberados na matrix extracelular e em uma condição de
hipóxia, estimulariam o depósito de micro-cristais de apatita. A
invasão vascular ocorre no tecido fibrocartilaginoso a partir da
degradação de compartimentos de matrix não mineralizada por
19
macrófagos, seguidos do estabelecimento das trabéculas por células
osteoprogenitoras. Com suporte mecânico adequado e vascularização
restabelecida, o tecido fibroso interfragmentar sofre ossificação
intramembranosa e gradativamente vai sendo substituído por osso
compacto, que apresenta uma resistência mecânica de 160 Nm/mm2
(RAHN, 2002).
No fim da fase de reparo, a união óssea é alcançada, mas a
estrutura da região previamente fraturada difere da morfologia óssea
original e por isso, a fase de remodelamento se inicia.
Essa fase final da consolidação óssea é caracterizada pela
adaptação morfológica até alcançar estrutura, resistência e função
originais. A fase de reparo ósseo é um processo lento que em
humanos leva entre 6 e 9 meses e representa 70% do total de tempo
de consolidação de uma fratura (REMEDIOS, 1999).
O equilíbrio das ações osteoclástica e osteoblástica é regido
pela lei de Wolff. A carga axial exercida sobre o osso cria uma
superfície convexa eletropositiva, onde reabsorção óssea predomina e
uma superfície côcava, eletronegativa onde deposição óssea ocorre.
O calo ósseo vai gradativamente desaparecendo e o espaço medular
na diáfise do osso se restabelece (REMEDIOS, 1999).
Insuficiente vascularização e excessiva mobilidade no foco de
fratura contribuem para o estabelecimento da não-união (GRIFFON,
2005).
20
1.4 Medula Óssea
A medula óssea é um órgão que se estabelece na fase final do
desenvolvimento embrionário, como resultado do processo de
ossificação endocondral. Com o envelhecimento do indivíduo, a
medula óssea, que inicialmente é predominantemente vermelha,
composta por elementos hematopoéticos, se torna amarela devido a
substituição por células adiposas, perdendo gradativamente sua
função hematopoética (KUZNETSOV et al., 2004).
Na vida adulta, a medula óssea hematopoética está restrita à
cavidade medular da clavícula, vértebras, esterno, pélvis, e
extremidades dos ossos longos, entre as trabéculas ósseas. Por muito
tempo, a hematopoese foi considerada a única função da medula
óssea pós-natal. A partir da descrição da presença de células
estromais, com potencial de pluripotencialidade na medula óssea pós-
natal, esta passou a ter um papel mais amplo alem do local de
formação e diferenciação de células hematopoéticas (ROBEY, 2000).
1.5 Célula-Tronco Mesenquimal
Poucos anos após a descoberta das células-tronco
hematopoéticas, os estudos de FRIEDESTEIN et al. (1966) e mais
tarde de OWEN e FRIEDESTEIN (1988), revelaram a existência de
progenitores mesenquimais multipotentes na medula óssea pós-natal,
com potencial para dar origem a distintos tecidos mesodermais. A
partir dessas descobertas, reconheceu-se a existência de dois
21
sistemas tronco distintos na medula óssea – o sistema hematopético
e o sistema estromal, este último precursor das linhagens
osteogênica, condrogênica, adipogênica, e reticulares, a partir de um
progenitor comum (BIANCO e ROBEY, 2004).
Muitos termos têm sido utilizados para designar essas células
de origem não hematopoética, tais com precursor de mecanócitos,
empregado por FRIEDESTEIN (1976) ou células tronco estromais da
medula óssea (OWEN & FRIEDESTEIN, 1988). Outro termo muito
utilizado é célula-tronco mesenquimal, que permite a interpretação
errada de que essas células teriam a capacidade de originar múltiplos
tecidos mesodermais, propriedade exclusiva de células embrionárias
(BIANCO et al, 2006). Hoje sabe-se que progenitores oriundos do
estroma da medula óssea, somente dão origem a tecidos do
esqueleto pós-natal ou do esqueleto em desenvolvimento, como
osso, cartilagem, tecido adiposo, músculo liso e tecido estromal de
suporte da medula óssea, excluindo músculo esquelético e endotélio.
Por esse motivo, foi sugerido por BIANCO et al. (2006) e BIANCO e
ROBEY (2004) a denominação mais atual e coerente como células-
tronco esqueléticas (CTE).
As CTEs se caracterizam pela capacidade de aderência após o
plaqueamento da medula óssea. Essas células aderentes apresentam
potencial clonogênico, investigado através de ensaios denominados
CFU-F (colony forming unit–fibroblasts). Após a expansão in vitro,
elas são capazes de originar osteoblastos, células reticulares
22
(friedestein, 1968; krebsbach, 1997) condrócitos e células
acumuladoras de gordura (friedestein, 1970; ashton, 1980). Até o
presente momento, o fenótipo descrito das células-tronco
esqueléticas humanas é CD34-, CD45-, CD14-, CD13+, CD29+, CD44+,
CD49a+, CD63+, CD90+, CD105+, CD106+, CD146+, CD166+
(ZANNETTINO et al, 2003; BIANCO e ROBEY, 2004).
As CTEs apresentam três propriedades: clonogenicidade,
multipotencialidade e capacidade de auto-renovação, (BIANCO et al.,
2006; SACCHETTI et al., 2007). As células de medula óssea em
cultura expressam fator de transcrição Runx2/CBFA1, que é o gene
para o comprometimento osteogênico (DUNCY et al., 1997; KOMORI
et al., 1997). Entretanto, ainda há pouca evidência dessa expressão
in vivo (BIANCO et al, 2006). Outros fatores de transcrição como
Osterix, que caracteriza diferenciação osteogênica (NAKASHIMA et al,
2002) e Sox9, que determina diferenciação condrogênica (AKIYAMA
et al., 2002) são levemente detectados em amostras de estroma de
medula óssea (BIANCO et al., 2006). Fatores de transcrição que
controlam a adipogênese C/EBP e PPAR são expressos, em baixos
níveis, mesmo sem a adição de indutores adipogênicos na cultura
(GUIMBLE et al., 1996; KUZNETSOV et al., 2001).
1.6 Não-União de Fraturas
A não-união de fraturas ocorre quando o processo de reparo
biológico num foco de fratura é interrompido por motivo ainda não
23
esclarecido, acarretando em não consolidação do tecido ósseo. Nestas
situações, a consolidação só ocorrerá se for instituído um tratamento
direcionado para este objetivo, em sua maioria associando
tratamento cirúrgico. Sob o ponto de vista temporal, a não união é
diagnosticada quando uma fratura, não apresenta sinais radiográficos
de consolidação três meses após sua ocorrência (LA VELLE, 1988).
Diversos fatores podem contribuir para a interrupção ou retardo
da consolidação óssea. Dentre estes fatores, os que estão mais
diretamente relacionados com uma das duas condições é o grau
inicial de desvio da fratura, perda óssea, traumas de alta energia
(HARRIS et al., 2006) associados à lesão extensa de partes moles,
cominuição e infecção (LERNER et al., 2006). Em pequenos animais,
assim como na medicina humana, situações como redução e fixação
inadequadas, instabilidade entre os fragmentos ósseos e local da
fratura representam também importantes fatores para o
estabelecimento desta patologia (AUDIGE et al., 2005; PIERMATEI et.
al., 2006).
A não-união pode acarretar problemas relacionados com a
função do membro afetado, como atrofia muscular por desuso,
redução da amplitude do movimento articular e rigidez relacionada à
contração de tecido cicatricial, disfunção neuromuscular e angulação
e/ou encurtamento do membro (MILLIS e JACKSON, 2003).
24
A fisiopatologia da não-união de fraturas é caracterizada
inicialmente pelo surgimento do tecido de granulação no espaço
interfragmentar que confere alguma estabilidade, sem impedir a sua
mobilidade. Gradativamente, cartilagem e osso preenchem o foco de
fratura conferindo estabilidade ao mesmo. Porém, se houver
mobilidade além da tolerada por esses tecidos, haverá
comprometimento da angiogênese e consequente retardo do reparo
ósseo, com possibilidade de estabelecimento de uma não-união
(NUNAMAKER et al., 1985). BOYAN et al. (1999) identificaram a
presença de poucas células mesenquimais comprometidas ou
diferenciadas na linhagem osteoblástica no foco de fratura de um
modelo experimental canino de não-união, sugerindo que a
diferenciação dessas células seja inibida na não-união crônica.
O tecido interfragmentar persistente nas não-uniões consiste
prioritariamente de uma zona uniforme de fibrocartilagem. Estruturas
vasculares e evidência de reciclagem ativa do tecido ósseo estão
presentes nas extremidades dos fragmentos, mas os canais
vasculares não são capazes de penetrar na fibrocartilagem não-
mineralizada. No estágio crônico da não-união, pode haver o
desenvolvimento de pseudoartrose no defeito ósseo, caracterizada
pela formação de membrana e líquido sinovial em torno de um falso
espaço articular na extremidade de cada fragmento que constitui o
foco da fratura (WOODARD e RISER, 1991).
25
Baseado nas suas características biológicas e tradução
radiográfica as não-uniões são classificadas em viáveis ou inviáveis
(WEBER & CECH, 1974).
As não-uniões viáveis ou hipertróficas ou “em pata de
elefante” possuem calo ósseo abundante hipervascularizado e,
frequentemente, estão relacionadas com fraturas que foram
desestabilizadas pela remoção prematura ou afrouxamento do
aparelho de fixação esquelética. As não-uniões viáveis levemente
hipertróficas ou “em casco de cavalo” possuem quantidade
inadequada de calo e se caracterizam por leve esclerose das
extremidades dos fragmentos. Estas não-uniões ocorrem em casos de
instabilidade rotacional moderada. As não-uniões viáveis
oligotróficas não possuem calo visível, mas ainda são capazes de
resposta biológica. Caracterizam-se pela presença de tecido fibroso
vascularizado entre os fragmentos, que têm extremidades
arredondadas e sofrem reabsorção progressiva. Estas não-uniões
ocorrem diante de grande deslocamento ou distração dos fragmentos
fraturados.
As não-uniões inviáveis distróficas possuem fragmentos
intermediários que consolidaram em relação a apenas um fragmento
principal. O fragmento intermediário, com deficiência de
vascularização, é incapaz de estimular resposta osteogênica
suficiente para que ocorra união com o segundo fragmento. As não-
26
uniões inviáveis necrosadas estão associadas a fraturas
cominutivas, nas quais grandes fragmentos estão avascularizados ou
deficientemente vascularizados, progredindo para necrose tecidual.
Os fragmentos necrosados não são incorporados aos calos de fratura.
As não-uniões inviáveis de defeito resultam da perda de
segmento significativo do osso no local fraturado. Por ocasião da
lesão, grandes fragmentos podem ter sido perdidos através das
feridas abertas. Os defeitos também podem resultar da reabsorção de
fragmentos necrosados ou da remoção ou excisão de fragmentos
durante a cirurgia. As não-uniões inviáveis atróficas são seqüelas
dos outros três tipos de não-união inviável. Há reabsorção óssea
significativa nas extremidades dos fragmentos, perda da
vascularização, ausência de atividade osteogênica e osteoporose
caracterizam estas não-uniões.
Em um estudo retrospectivo, ATIOLA e SUMNER (1984)
observaram que 3,4% de 2.825 fraturas em cães evoluíram para
não-união, sendo o rádio e a ulna os ossos mais afetados (40,6%),
seguidos pelo fêmur (38,5%), úmero (12,5%) e tíbia (4,2%). A
prevalência de não-união foi maior em cães entre 2-7 anos de idade
(49%) e cães que pesavam entre 7-14kg.
Cães das raças toy e miniatura podem apresentar variantes
anatômicas da vascularização óssea constituída por pequena
densidade vascular na junção diafisisária-metafisária distal do rádio,
27
(WELCH et al., 1997). Adicionalmente, a cobertura tecidual nesta
região, por ser muito pequena, fica susceptível a lesões mais
extensas após traumas (NUNAMAKER, 1985).
No exame clínico das não-uniões evidencia-se ampla mobilidade
no local fraturado sem dor à palpação ou apenas leve desconforto
(MILLIS & JACKSON, 2003). A atrofia muscular e a rigidez articular
são provavelmente seqüelas de desuso do membro, pois na maioria
dos casos, o membro afetado não sustenta o peso do animal (MILLIS
e JACKSON, 2003).
O diagnóstico da não-união deve ser baseado nos achados
radiográficos, característicos de cada tipo de não-união e na não
progressão da consolidação óssea durante pelo menos três meses,
com persistência da linha de fratura entre os fragmentos ósseos (La
VELLE, 1998). As características radiográficas mais freqüentes são
formação variável de calo periostal e endosteal, linha de
radiotransparência interfragmentar, esclerose e arredondamento das
extremidades dos fragmentos fraturados, tecido mineralizado
ocluindo a cavidade medular e pseudoartrose. Estes achados podem
ser confirmados por exames complementares tais como cintigrafia e
DEXA (dual energy x-ray absorptiometry) (MILLIS e JACKSON, 2003).
1.7 Tratamento da não-união óssea
Durante os últimos 20 anos foram desenvolvidas diversas
técnicas para o tratamento das não-uniões, incluindo procedimentos
28
invasivos (fixação interna e enxertia com osso ou com substitutos
ósseos) e procedimentos não invasivos (ultra-som e aplicação de
pulsos eletromagnéticos) (HERNIGOU et al., 2005). Entretanto, o
passo inicial no tratamento das não-uniões é a avaliação das
condições biológicas e mecânicas envolvidas na instalação da lesão.
Em seres humanos a definição da estratégia terapêutica deve levar
em consideração a localização, configuração e tipo (quando exposta)
da fratura, infecção ou manipulação cirúrgica prévias, alinhamento,
condição neuro-vascular do membro afetado e eventual perda óssea
(HERNIGOU et al., 2005).
A remoção do tecido fibroso através de curetagem, remoção de
tecido ósseo esclerótico das bordas dos fragmentos ósseos, abertura
do canal medular obstruído, estimulação da osteogênese e fixação
estável da fratura constitui o tratamento cirúrgico de escolha para as
não-uniões inviáveis (RODRIGUEZ-MERCHAN e FORRIOL, 2004;
PIERMATEI et. al., 2006).
Diversos tipos de enxertos ósseos podem ser utilizados no
tratamento das pseudoartroses em humanos a fim de estimular a
osteogênese. O enxerto de osso esponjoso autógeno é considerado o
padrão-ouro neste tipo de abordagem e, por isso, é comumente
utilizado em medicina humana e veterinária (GOULET et al., 1997;
MCLAUGHLIN, 1998; JOHNSON, 2002; BRAWLEY e SIMPSON, 2006).
Mesmo sendo clinicamente eficaz, o tempo cirúrgico e anestésico
adicional à coleta do enxerto, o aumento da morbidade pós-
29
operatória e escassez de osso esponjoso, principalmente observada
em pacientes pequenos, têm encorajado a pesquisa em busca de
substitutos para enxertos ósseos (GRIFFON, 1996; OONISH, 1997). A
dificuldade da coleta de enxerto ósseo autógeno em quantidades
satisfatórias é freqüente em cães de raças miniatura e toy e felinos,
muitas vezes requerem a exposição cirúrgica de múltiplas áreas de
coleta (DOREA et al. 2005).
O uso de enxerto alógeno elimina a morbidade associada com a
coleta do enxerto autógeno e reduz o tempo cirúrgico e anestésico.
Em cães, o enxerto de osso esponjoso alógeno congelado é
efetivamente incorporado quando usado no reparo de fraturas e em
artrodeses, aumentando a taxa de consolidação óssea por meio das
propriedades de osteoindução e osteocondução (KERWIN et al.,
1996). Entretanto, reação imunológica e transferência de doenças do
doador para o paciente recipiente são algumas das desvantagens que
podem ser observadas com o uso deste material (KERWIN et al.,
1996; MCLAUGHLIN e ROUSH, 1998).
Diversos enxertos ósseos sintéticos surgiram com a proposta de
eliminar a coleta de enxerto autógeno e evitar complicações
associadas com o uso de enxerto ósseo alógeno. Muitos materiais
têm sido investigados tanto em homens como em animais, mas até o
presente momento não há nenhuma evidência de que enxertos
ósseos sintéticos contribuam com fatores osteoindutores ou
osteogênicos. Ademais, o fato destes materiais apresentarem
30
somente osteocondução, torna-os menos eficientes na promoção da
consolidação óssea, quando comparados com enxertos alógenos e
principalmente com os enxertos autógenos (OONISHI, 1988;
WILSON, 1999; WHELLER, 2000; DOREA et al., 2005;).
Ainda com o intuito de evitar a morbidade associada à coleta do
enxerto de osso autógeno e de superar as limitações observadas com
o emprego dos enxertos de osso alógeno e sintético, procedimentos
minimamente invasivos como aplicação de concentrado de plaquetas
no foco de fratura (SLATER et al., 1995), uso de proteínas
morfogenéticas do osso (JONHSON et al., 1990; ZIMMERMANN et al.,
2006) e injeção percutânea de medula óssea total (CONNOLY et al.,
1989; GOEL et al. 2005), começam a ser considerados.
Atualmente, a comunidade científica tem mostrado um grande
interesse sobre a utilização terapia celular em ortopedia, dando
grande ênfase para o uso de células provenientes da medula óssea
com o objetivo de acelerar ou promover o reparo ósseo (HERNIGOU e
BEAUJEAN, 2002).
1.8 Uso terapêutico de células osteoprogenitoras
Há alguns anos a medula óssea total vem sendo usada como
coadjuvante no reparo ósseo a fim de acelerar este processo.
Adicionada a enxertos sintéticos (COLNOT et al., 2006), enxertos
ósseos alógenos (ASPENBERG et al., 1987) ou ainda injetada por via
percutânea no foco de fratura (JEAN et al., 1997; COLNOT et
31
al.,2006) a medula óssea introduz principalmente os componentes
osteogênicos e osteoindutores que promoverão a formação óssea.
Mais recentemente, pesquisas têm ressaltado a importância da
concentração de células da medula óssea para a eficácia da terapia.
HERNIGOU et al. (2005), tratou 60 pacientes que apresentavam não-
união na diáfise da tíbia com células mononucleares autólogas da
medula óssea, injetando-as por via percutânea no tecido fibroso
interfragmentar, no foco de não-união. O número de progenitores foi
avaliado através do ensaio de CFU-Fs. Os autores observaram
reversão da não-união e consolidação óssea em 53 casos, onde foi
injetado mais de 54.000 células progenitoras. Nos sete pacientes que
não responderam ao tratamento foram injetados em média 634
progenitores/cm3 e 19 CFU-Fs. Os autores atribuem a falta de
resposta destes pacientes ao baixo número de progenitores presentes
na medula óssea.
HERNIGOU e BEAUJEAN (2002) utilizaram a mesma abordagem
terapêutica para tratar osteonecrose de cabeça femoral e observaram
redução significativa da necessidade de artroplastia total de quadril
dez anos após o tratamento.
O conjunto das características das células mesenquimais
pluripotentes, em especial a facilidade com que podem ser isoladas
da medula óssea (PITTENGER et al., 1999), a possibilidade de se
obter, por expansão in vitro, um número elevado de células a partir
de volumes relativamente pequenos de medula óssea (JIANG et al.,
32
2002), a sua capacidade de diferenciação em tecidos músculo-
esqueléticos (SESHI et al., 2000), fazem com que o uso destas
células seja promissor para aplicações em bioengenharia ortopédica.
A utilização terapêutica das CTEs expandidas in vitro está sendo
explorada no reparo ou na regeneração de tecidos mesenquimais
lesionados e na consolidação de fraturas ósseas (MOUTSATSOS et al.,
2001), lesões tendinosas (AWAD et al., 1999) e cartilaginosas
(KADIYALA et al., 1997; QUINTAVALLA et al., 2002). Outra forma de
explorar o potencial biológico destas células é através da associação
com biomateriais reabsorvíveis de origem sintética. Utilizando-se esta
estratégia, que constitui a base da bioengenharia, lesões
consideradas intratáveis passam a ser passíveis de abordagem
terapêutica (BIANCO & ROBEY, 2001; CANCEDDA et al., 2003;
ROBEY & BIANCO, 2004).
33
1.9 Justificativa
Neste estudo clínico, células estromais provenientes da medula
óssea autóloga e expandidas in vitro foram injetadas por via
percutânea para tratar defeitos ósseos críticos e não-união de
fraturas em dez cães. A nossa hipótese foi avaliar se, ao prover o
foco de fratura com elementos celulares adicionais, estes seriam
capazes de promover ou acelerar a formação óssea.
Os cães foram selecionados a partir da constatação radiográfica
de não consolidação óssea, três meses após o tratamento cirúrgico ou
conservador primário de fraturas ocasionadas por traumas diversos.
Considerando-se que as propostas de tratamento para defeitos
ósseos críticos e não-união de fraturas em cães são em geral muito
invasivas (acesso cirúrgico do foco de fratura, remoção do tecido
fibroso interfragmentar e a adição de material osteogênico e/ou
osteoindutor) tem sido observado um significativo aumento da
morbidade pós-operatória, especialmente em cães de raças
pequenas. A injeção percutânea de células osteoprogenitoras em
focos fratura, com a finalidade de estimular a consolidação óssea,
reduz a morbidade associada aos procedimentos cirúrgicos
convencionais e para o proprietário acarreta em substancial redução
de custos e cuidados.
A análise dos resultados deste estudo permitirá avaliar os
benefícios, vantagens e desvantagens da aplicação da terapia com
34
células estromais da medula óssea autóloga na prática clínica
veterinária.
35
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este estudo tem como objetivo avaliar o reparo de não-união
e de defeitos ósseos segmentares em cães utilizando células
estromais de medula óssea autóloga expandidas in-vitro e
injetadas na lesão por via percutânea.
2.2 Objetivos específicos
Estabelecer protocolo de expansão in vitro de células
estromais da medula óssea canina.
Avaliar o número de CFU-Fs na medula óssea canina.
Avaliar o fenótipo das células estromais da medula óssea
canina por imunohistoquímica e PCR-RT das células
estromais expandidas in vitro.
Avaliar por exames radiográficos (formação de calo ósseo nas
não-uniões e reconstrução óssea das lesões críticas),
sessenta dias apos ao tratamento.
36
3. METODOLOGIA
3.1 Animais
Foram utilizados neste estudo cinco cães machos e cinco
fêmeas das raças Poodle (n=2), Pinscher (n=4), Bichon Frisé
(n=1) e sem raça definida (n=3), pesando entre dois e 18kg,
procedentes de clínicas veterinárias particulares do estado do Rio
de Janeiro. Os animais apresentavam não-união óssea (n=6) ou
defeito ósseo segmentar (n=4) comprovado clínica e
radiograficamente. O consentimento do proprietário e a
aprovação pelo Comitê de Ética da Universidade Estadual do
Norte Fluminense (protocolo número 25) foram obtidos antes do
tratamento dos animais.
O diagnóstico de não-união foi feito baseado na ausência de
sinais radiográficos de progressão de consolidação óssea e
persistência do espaço interfragmentar três meses após a
realização de osteossíntese para o tratamento da fratura. As não
uniões foram classificadas em viáveis, quando havia formação
de calo, mas sem formação de ponte óssea entre os fragmentos
e não viáveis caracterizadas por esclerose e reabsorção óssea
sem formação de calo. Foram considerados defeitos
segmentares ou defeitos de tamanho crítico quando o
37
afastamento entre os fragmentos ósseos era maior do que
200mm.
Seis animais eram portadores de não-união óssea em rádio e
ulna (n=5) ou em tíbia (n=1) e quatro animais apresentavam
defeito ósseo segmentar no fêmur (n=1), metatarso (n=1) ou no
rádio e ulna (n=2). Todos os animais do estudo realizaram perfil
hematológico, que incluiu hemograma completo, contagem de
plaquetas, pesquisa de hematozoários e proteínas totais,
bioquímica sérica (uréia, creatinina e enzimas hepáticas). Todos
os animais apresentavam vacinação e vermifugação nos prazos
de validade.
3.2 Coleta de medula óssea
As regiões do trocanter maior do fêmur e do tubérculo maior
do úmero, contralaterais à lesão óssea, foram preparadas para
um procedimento cirúrgico asséptico. Com os animais sob efeito
de anestesia geral (Propofol 6mg/kg) foi feita uma incisão da
pele para introdução da trefina (Jamishidi gauge 13), através da
cortical, até atingir o osso esponjoso da metáfise (Figuras 1A e
B). A aspiração da medula foi feita lentamente em seringas de
5mL rinsadas com solução de heparina na concentração de 1000
UI/mL, em alíquotas individuais de 4mL. A cada troca de seringa,
a agulha era reposicionada na metáfise para reduzir a diluição do
aspirado com sangue. Foram coletados 2mL/Kg de medula
38
óssea, de cada paciente, baseados nos valores de referência
para humanos (HERNIGOU et al., 2005). As amostras foram
armazenadas em 4oC por no máximo 16 horas antes do
processamento laboratorial. Após a retirada da trefina com
movimentos circulares foi feita a síntese da incisão de pele com
material de sutura não absorvível em padrão interrompido
simples. Os animais receberam medicação antiinflamatória
(Cetoprofeno 1mg/kg/dia) e antibiótico (Cefalexina 10mg/kg,
12/12h) durante 5 e 7 dias respectivamente.
3.3 Isolamento e expansão das células estromais autólogas
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados no
Centro de Terapia Celular e Bioengenharia Ortopédica (CTCel) do
Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO), Rio de
Janeiro, RJ. O protocolo de isolamento e expansão foi baseado
Figura 1 – (A) - Trefina Jamishid gauge 13. (B) – Animal posicionado
em decúbito lateral para obtenção do aspirado de medula em alíquotas individuais de 4ml.
39
no estudo previamente descrito em ovelhas (FERNANDES et al.,
2007).
O aspirado de medula foi transferido para um tubo tipo
Falcon de 50mL, em meio de cultura Dulbelco’s Modified Eagle
Medium (DMEM - Sigma), no mesmo volume do aspirado de
medula e centrifugado a 600g, em temperatura ambiente por 5
minutos. As células autólogas foram ressuspendidas em DMEM e
homogenizadas sucessivamente, seguido de centrifugação a
800g, em temperatura ambiente por 5 minutos. Este processo
foi repetido 3 vezes. No final da terceira lavagem, as células
autólogas eram ressuspendidas em 10 mL de DMEM
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), penicilina
(100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/mL). Uma alíquota desta
suspensão foi utilizada para quantificação em câmara de
Neubauer, pelo método de lise de hemácias, através da adição
da solução hemolítica de ácido acético 2% e cristal violeta 0,1%,
na proporção de 1:100. As células foram plaqueadas na
densidade de 4-6x105/cm2 em DMEM suplementado com 10%
SFB, penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml). O
meio foi substituído após 24 horas e a cada dois dias (Figura 2).
A cada troca de meio, as células não aderentes, presentes no
sobrenadante, eram removidas através da lavagem sucessiva
das culturas com solução tampão (Balanced Salt Solution.
Calcium and Magnesium Free - BSS.CMF).
40
Figura 2 - Esquema ilustrando as etapas do processo de isolamento
celular.
Após atingir confluência (cerca de duas semanas), as células
autólogas foram tripsinizadas e ressuspensas em DMEM não
suplementado e quantificadas. Após centrifugação as células
foram ressuspendidas em 0.5-4ml de DMEM 10% SFB. A
suspensão celular foi acondicionada em criotubo e preservada a
4º C até o momento do uso, que ocorreu em no máximo três
horas. As células obtidas na passagem 0 foram replaqueadas e
as obtidas na passagem 1 foram utilizadas na terapia celular.
3.4 Caracterização morfo-funcional e molecular das células
estromais da medula óssea
A. Identificação de Unidades Formadoras de Colônias (CFU-Fs).
Para a quantificação de progenitores mesenquimais presente
na suspensão celular foi realizado o ensaio para identificação de
CFU-Fs, onde as células, provenientes da medula óssea total, no
41
dia da coleta, foram plaqueadas na densidade de 1 x 106 células
por 25 cm2 em DMEM 10% SFB, penicilina (100 UI/ml) e
estreptomicina (0,1 mg/ml). O meio foi trocado após 3 dias e as
células foram mantidas por mais 7 dias sem trocas adicionais.
Após esse período, as culturas foram fixadas com metanol 100%
e coradas com Cristal Violeta 1% overnight para contagem de
colônias ao microscópio óptico de campo claro. Foram incluídas
na contagem apenas as colônias com 50 ou mais células.
B. Imunocitoquímica
A caracterização fenotípica foi feita através do plaqueamento de
1x104 células provenientes da passagem 0 em lamínulas de vidro
de 3cm2 mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de soro
fetal bovino e penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml)
até atingir semi-confluência. As células foram fixadas com
paraformaldeído a 4% por 30 minutos e permeabilizadas com
Triton-X 100 0,5% por 20 minutos. Após cada um destes
processos, fixação e permeabilização, as culturas eram lavadas
abundantemente com PBS e PBS-tween20 0,1%, respectivamente.
O bloqueio das ligações inespecíficas foi feito com PBS–BSA 5%
(Bovine Serum Albumin, Sigma) por 1 hora. Os anticorpos
primários foram diluídos em PBS nas concentrações descritas na
tabela 1 e incubados overnight em câmara úmida. Em seguida, as
células receberam o anticorpo secundário biotinilado, diluído em
42
PBS, anti-camundongo IgG FITC (1:30, Sigma F-2266), por 30
minutos, seguido de incubação com Streptavidina Cy3 (Sigma
S6402) diluída 1:800 em PBS, por 30 minutos. As células autólogas
foram coradas para marcação dos núcleos com DAPI diluído 1:1000
em água destilada por 5 minutos e as lamínulas montadas com
vectashield para observação através de microscopia de
fluorescência.
Os ensaios imunocitoquímicos foram feitos para detectar a
expressão de -actina de músculo liso, colágeno tipo I, biglicana,
vimentina, fibronectina, sialoproteína óssea (BSP), decorina e
osteopontina.
Tabela 1: Anticorpos, fabricantes e diluições
1. Colágeno I (Novotec 20151) 1:300 5. Osteopontina 1:400 *
2. Fibronectina (Novotec 24951) 1:100 6. Sialo Proteína Óssea – BSP 1:400 *
3. Vimentina (Dako M0725) 1:100 7. Biglicana 1:500 *
4. α Actina Músculo Liso (Dako M0851) 1:50
8. Decorina 1:450 *
* Anticorpos cedidos por L. W. Fisher (Craniofacial and Skeletal Diseases
Branch, NIDCR, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados
Unidos)
C. PCR-RT (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
Foram coletadas amostras das células na passagem 1 do
cultivo expansivo de cada animal. Como controle positivo foi
utilizado o RNA de osteoblastos (MOREIRA e cols., 2004). O RNA
foi isolado de acordo com o protocolo do Trizol (Invitrogen). As
43
amostras de RNA foram resuspendidas em 10 μL de água com
dietil-pirocarbonato (DEPC - Sigma), e diluídas 1:300 em
água/DEPC para a quantificação por espectrofotometria em
valores de absorbância (A) a 260 nm (DNA e RNA) e 280 nm
(proteínas). A concentração de RNA foi calculada através do
valor de leitura a A260 x 40 x fator de diluição (300) = mg/mL de
RNA. A qualidade foi avaliada pela razão A260/A280. Considerou-se
aceitável um valor de DO A260/280 entre 1,6 a 1,8 do RNA
(SAMBROOK e GETHING, 1989).
Na síntese do DNA complementar (cDNA) foram utilizados
2 μg do RNA total de cada amostra acrescidos de 25 mM de
desoxirribonucleotideos (dNTPs), com quantidades equivalentes
de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Invitrogen); 0.1 M de ditiotreitol
(DTT- Invitrogen); 100 pM de random primer (Invitrogen)); 200
g/ L da enzima transcriptase reversa Monoley Murine Leukemia
Virus Reverse Transcriptase (M-MLV - Invitrogen). As misturas
foram mantidas à temperatura ambiente por 10 minutos,
seguidas de incubação a 42°C por 40 minutos. As reações foram
aquecidas a 65°C por 5 minutos e armazenadas à -200C.
A presença dos transcritos de -actina, Cbfa-1, colágeno tipo
I, osteonectina e fosfatase alcalina foram testadas por RT-PCR
(Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction). A
amplificação do transcrito de -actina foi utilizado como controle
interno da síntese de cDNA devido sua expressão constitutiva
44
nas CTEs (RICKARD et al, 1996). O controle positivo foi
previamente padronizado para todos os genes estudados.
Foram feitas reações para amostras de cDNA da passagem 1
de cada animal. Em cada reação foi adicionado 2 L de cDNA,
100pM/µL de cada oligonucleotídio (Gene Link), 50 mM de
cloreto de magnésio (MgCl2-Invitrogen), 25 mM de cada dNTPs;
500 mM de cloreto de potássio (KCl- Invitrogen), 1,5 unidades
da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen) e 2,5 L do iniciador
1 (sense) e do iniciador 2 (antisense) (Tabela 2). Também
foram feitas reações para o controle negativo de cada uma das
etapas de análise molecular (extração de RNA, confecção de
cDNA e RT-PCR).
Os tubos contendo as reações foram pré-aquecidos no
termociclador PTC DNA EngineTM Systems a 98 C por 60 segundos,
seguido por um ciclo de 30 segundos a 96 C, 30 ciclos a 96 C por 30
segundos, outro ciclo com a temperatura de anelamento para cada
primer por 45 segundos (tabela 2), 1 ciclo de 72 C por 60 segundos,
outro na mesma temperatura de 72 C por 5 minutos e por fim 4 C
até o momento da análise do gel por eletroforese. As condições
experimentais para amplificação de cada produto por PCR-RT estão
descritos na tabela 2. Os produtos da amplificação foram
visualizados em géis de agarose (1,4%) corados com brometo de
etídio (0,2 g/mL- Sigma), após eletroforese em tampão TAE
45
(Tampão Tris Acetato EDTA) a 8,0 V/cm, por aproximadamente 90
minutos.
Tabela 2: Condições Experimentais para a Amplificação por RT-PCR
GENE Iniciadores Seqüência 5’/3’ TM Fragmento (pb)
Actina sense
antisense gtcttcacaaatcctccc caatcaaagtcctcggc
53ºC 629(C)*/573(H)**
Cbfa-1 sense
antisense
gtcttcacaaatcctccc
tggattaaaaggacttggtg 52ºC 231(C)*
Colágeno 1 sense
antisense
ggcttaaagggacacaatgg
tctggtggctgagtctc 55ºC 455(C)*
Fosfatase
Alcalina
sense
antisense
aggcttcttcttgctggt
cctggtagttgttgtgagc 53ºC 353(C)*
Osteonectina sense
antisense
gcctggatcttctttctc
gtcagaaggttgttgtcc 52ºC 560(C)*
* amostra canina, **amostra humana utilizada como controle da reação.
3.5 Injeção da suspensão celular
Com os animais sob efeito de anestesia geral, o membro
acometido pela lesão óssea foi preparado para procedimento
asséptico. O protocolo anestésico foi o mesmo utilizado para a
coleta do aspirado de medula óssea. Após o preparo do campo
cirúrgico, foi inserida uma agulha hipodérmica (18x24) entre os
fragmentos da fratura. A confirmação do posicionamento da
agulha na lesão foi obtida através de exame radiográfico simples
ou por fluoroscopia. Antes da injeção, a suspensão de células foi
homogenizada através de agitação manual, o conteúdo do tubo
foi transferido para uma seringa de 10 ml e injetado na fibrose
contida no espaço interfragmentar da fratura, em diversos
ângulos para tentar preencher todo o perímetro do defeito ósseo.
Os animais receberam antiinflamatório (Cetoprofeno 1mg/kg,dia)
46
e antibiótico (Cefalexina 10mg/kg, 12/12h) durante 5 e 15 dias
respectivamente. A avaliação radiográfica ocorreu após 60 dias
da injeção.
3.6 Avaliação radiográfica
O reparo do tecido ósseo foi avaliado e quantificado, de
acordo com os seguintes parâmetros, no dia da aplicação das
células e após oito semanas:
Tamanho do defeito ósseo
Medido com um cáliper nas radiografias realizadas nos dois
momentos (no dia da injeção e após oito semanas) e expresso
em milímetros (mm).
Reação de tecidos adjacentes
Investigação de alterações radiográficas tais como aumento
de densidade tecidual e presença de ar nos tecidos adjacentes
ao defeito ósseo onde as células estromais da medula óssea
foram injetadas. As alterações, quando presentes, foram
graduadas em função da sua intensidade, em ausente (0),
moderada (1) e intensa (2).
3.7 Avaliação clínica
O exame clínico do membro afetado foi feito no dia da
injeção das células estromais da medula óssea, diariamente
durante os cinco primeiros dias após a injeção e na quarta e na
47
oitava semana, após a terapia celular. Foram avaliados
parâmetros como dor à palpação, presença de edema da região
tratada e grau de atividade e retorno das funções do membro.
Para a avaliação da claudicação, foi utilizado o sistema de
HAZEWINKEL E MEUTSTEGE (1990) onde: ausência de
claudicação = zero; locomoção discretamente alterada = 1;
locomoção alterada, mas ainda mantendo apoio no membro = 2;
claudicação com apoio intermitente do membro = 3; ausência de
apoio no membro = 4.
3.3.8 Análise estatística
Os resultados foram apresentados sob a forma de média ±
desvio padrão, e o nível de significância foi estabelecido em
p<0,05. As variáveis relacionadas aos resultados da terapia
foram: o sucesso do tratamento, observado clinicamente através
do retorno das funções do membro acometido e volume do calo
ósseo no período de 2 meses, avaliado radiograficamente
através da mensuração com caliper, do tamanho do espaço
interfragmentar no dia da terapia celular e dois meses depois. A
correlação entre as variáveis relacionadas aos resultados da
terapia celular e os fatores terapêuticos como número de células
da medula total, número de CFU-Fs, número de células
plaqueadas e número de células injetadas foi feito através do
teste T. Como variáveis do paciente e da fratura foram incluídos
48
fatores como idade e sexo do animal, tempo de lesão, número
de cirurgias prévias e tamanho do defeito.
49
4. Resultados
4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS PACIENTES
Dez cães, apresentando não-união de fratura ou defeito ósseo
segmentar, foram tratados com células estromais autólogas de
medula óssea expandidas in vitro. Todos os animais apresentavam
maturidade esquelética, sendo classificadas como adultos jovens
(n=9) com até seis anos de idade, ou idoso (n=1) com idade superior
a seis anos.
Os ossos mais acometidos pela não-união e reabsorção óssea
foram o rádio e ulna, seguido da tíbia, fêmur e metatarso. Seis
animais apresentavam lesão óssea há pelo menos 12 meses e os
demais apresentavam evolução superior a um ano. Os pacientes
foram tratados antes da terapia celular com fixador externo (n=3),
placas e parafusos (n=3), pinos intramedular (n=1) ou coaptação
externa (n=3). No momento da injeção da suspensão celular, todos
os animais apresentavam algum grau de instabilidade no foco de
fratura.
O tamanho dos defeitos variou entre 1-20mm nos animais com
não-união e entre 22-100mm nos animais com defeito segmentar. Na
Tabela 3 estão resumidas as principais características clínicas dos
pacientes.
50
Tabela 3 - Caracterização individual dos pacientes, das lesões ósseas e do
tratamento instituído antes da injeção celular. Animal Raça Sexo/Idade
/Peso
Tipo de Lesão / Tamanho Evolução
(meses)
Método de
Estabilização
1
Pinscher
M /5 anos /3kg
Não união radio/ulna
distal / 1mm
12
2.0 mini placa
2
Pinscher
M /5 anos /3kg
Não união radio/ulna
distal / 1mm
12
2.0 mini placa
3
Pinscher
M /1 ano /2kg
Não união radio/ulna
distal / 3mm
8
Pino
intramedular
4
SRD
M/3 anos/18kg
Não união radio/ulna
distal / 20mm
18
Coaptação
externa
(tala spoon)
5
Bichon Frise
F /5 anos /5kg
Defeito segmentar
radio/ulna terço médio /
100mm
48
Fixador externo
6
SRD
F/3 anos /17kg
Defeito segmentar
metatarso terço médio /
22mm
10
Fixador externo
7
Poodle
F/4 anos /12kg
Defeito segmentar fêmur
terço médio / 70mm
6
Fixador externo
8
Poodle
F /2 anos /5kg
Não união tíbia terço
médio / 20mm
6
Coaptação
externa (muleta
Thomas)
9
Pinscher
F /9 anos /4kg
Defeito segmentar radio /
ulna distal / 24 mm
24
Coaptação
externa
(tala spoon)
10
Poodle
M /4 anos /6kg
Não união radio/ulna
terço médio / 2mm
48
2.0 mini placa
SRD=Sem Raça Definida; M=macho; F=fêmea
O resultado dos exames complementares (hemograma
completo, função renal e hepática) realizados antes do ingresso dos
animais no estudo estão discriminados na Tabela 4. A faixa de
valores normais de referência para cães consta do Anexo 2.
51
Tabela 4 – Valores médios dos parâmetros hematológicos e bioquímicos
obtidos antes do inicio dos experimentos.
HEMOGRAMA
BIOQUIMICA
Hematócrito
(%)
44,1±6,43
Leucócitos
(x103/µl)
8±3,12
Uréia
(UI/L)
34,3±9,6
Hemácias
(x106/ L)
6,44±0,90
Basófilos
(x103/µl)
0.7±1,05
Creatinina
(UI/L)
0,73±1,18
Hemoglobina
(g/dL)
15,4±3,16
Eosinófilos
(x103/µl)
4±2,58
AST
(mg/dL)
8,4±2,4
VCM
(fL)
67,9±5,58
Bastoes,
Mielócitos,
Metamielócitos
(x103/µl)
0
ALT
(mg/dL)
9,8±4,8
HCM
(g/dL)
22,22±1,51
Segmentados
(x103/µl)
67,5±5,4
CHCM
(g/dL)
33,3±2,26
Linfócitos
(x103/µl)
17,1±5,17
Plaquetas
(x103/µl)
337,8±64,41
Monócitos
(x103/µl)
5,5±2,36
Todos os valores estão expressos sob a forma de média DP. VCM=Volume
corpuscular médio; HCM= Hemoglobina corpuscular média; CHCM= Concentração de hemoglobina corpuscular média; AST= Aspartato
aminotransferase; ALT= Alanina aminotransferase.
4.2 COLETA DA MEDULA ÓSSEA
Nenhuma complicação anestésica ou clínica foi observada
durante ou após a coleta de medula óssea, com recuperação
satisfatória de todos os animais no pós-operatório imediato. A
sutura no local da punção foi removida sete dias após o procedimento
e nenhum dos cães apresentou infecção ou dor locais. Todos se
mantiveram ativos, e sem limitações aparentes das atividades
habituais.
52
4.3 ISOLAMENTO E EXPANSÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS
Os valores individuais do volume total de aspirado de medula
óssea, quantidade de células nucleadas isoladas da medula óssea
total, número de CFU-F, número de células obtidas nas passagens 0 e
1, número total de células injetadas e volume da suspensão injetada
estão descriminados nas Tabelas 5 e 6. Em todos os animais a
viabilidade celular da suspensão injetada na lesão foi maior do que
95%.
Tabela 5 – Valores individuais do volume total de aspirado medular,
da quantidade de células isoladas da medula total e o número de
CFU-Fs.
Animal Volume total
de aspirado
(mL)
Número células
(/mL medula
total)
Número de CFU-
Fs (/milhão
células
nucleadas)
1 8,0 3,1x107 21,2±0,89
2 8,0 3,1x107 21,2±0,89
3 4,0 3,02x107 18,8±0.97
4 10,0 7x107 22±4,77
5 7,0 6,4x107 23±1,6
6 40,0 2,7x107 24±1,41
7 10,0 1,3x107 24,8±3,16
8 10,0 1,1x107 23,2±2,05
9 8,0 4,5x107 21,4±1,78
10 10,0 2,8x107 23,6±1,30
53
Tabela 6 – Valores individuais do número de células obtidas nas
passagens 0 e 1, do número total de células e volume da suspensão injetada nas lesões.
Anima
l
Número
células P0
Número
células P1
Número de
células
injetadas
Volume
injetado
(mL)
1 2,36x107 2x107 2x107 0,5
2 2,36x107 2x107 2x107 0,5
3 1,7x107 2,7x108 2x107 0,5
4 3x107 1,8x107 1,8x107 1,0
5 5x107 8,3x107 2,5x107 4,0
6 1,49x107 3x107 2x107 2,0
7 3x107 4,5x107 2,5x107 2,0
8 6,4 x107 7,2x107 2x107 2,0
9 3x107 4,8x107 2x107 0,5
10 3,2x107 4x107 2x107 0,5
54
A quantificação das células totais da medula óssea, feita em
câmara de Neubauer pelo método de lise de hemácias através da
adição de ácido acético 2%, evidenciou 1,1x107-6,4x107 células
nucleadas por mL de medula total. Após a primeira expansão (P0), ao
atingir a confluência, o número de células variou entre 1,7x107-
6,4x107 células e na segunda expansão (P1), também ao atingir a
confluência o número de células variou entre 1,8x107- 2,7x108
células. Em todas as culturas, as células apresentavam morfologia
fibroblastóide (Figura 3).
Figura 3: Fotomicrografias das culturas celulares. (A) - Após 24 horas de cultivo, as
células encontram-se aderidas, em torno de clusters hematopoéticos. (B) - Após 72 horas em cultura as células tem morfologia fibroblastóide. (C) – CFU-Fs formadas 7 dias após
plaqueamento em baixa densidade. (D) - Confluência das colônias. Barra: 100µm.
A quantidade das células injetadas nas lesões foi padronizada
para um total de 2x107-2.5x107 e injetadas em 0,5-4ml de DMEM não
suplementado. Apenas o animal 4 não alcançou o número mínimo de
2x107. Neste animal foram utilizadas todas as células obtidas após a
segunda expansão (1,8x107 células).
55
4.1.4 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS DA MEDULA
ÓSSEA
4.1.4.1. Unidades Formadoras de Colônias (CFU-Fs)
O número de CFU-Fs com mais de 50 células variou entre
18,8±0,97-24,8±3,16 (média 22.42±1.54) (Figura 4).
Não houve diferença estatisticamente significativa no número
de CFU-Fs em relação ao sexo, idade, localização e tamanho da lesão,
tempo de evolução e método de fixação (p>0.05 em todas as
comparações). Quanto a raça dos animais, observou-se que os
animais da raça Pinscher apresentaram um menor número de CFU-Fs
(20.9±0.73) tanto em relação aos animais da raça Poodle
(23.23±0.30, p<0,005) quanto em relação aos animais SRD
(23.6±1.44, p<0.005).
4.4.2. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica
Não houve diferença estatisticamente significativa no número
de CFU-Fs entre os animais do sexo feminino e masculino (p>0,05).
A correlação entre número de CFU-Fs e a idade dos animais também
não mostrou significância estatística (p>0,05). Quanto a raça,
Figura 4: Observação das unidades
formadoras de colônia – fibroblásticas (CFU-Fs) no animal 3.
56
observou-se que os animais da raça Pinscher apresentaram um
menor número de CFU-Fs (20.9±0.73) tanto em relação aos animais
da raça Poodle (23.23±0.30, p<0,005) quanto em relação aos
animais SRD (23.6±1.44, p<0.005).
4.1.4.2. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica
As células estromais de todos os animais expressaram
moléculas características do comprometimento celular com as
linhagens miofibroblástica ( -actina de músculo liso, colágeno tipo I,
biglicana, vimentina, fibronectina) ou osteoprogenitora (colágeno I,
osteopontina, sialoproteína óssea, biglicana e decorina). Quanto ao
padrão de marcação (Figura 5), observamos que as moléculas
apresentavam certas peculiaridades, comum a todos os animais, tais
como: expressão sob a forma de fibras de estresse da -actina de
músculo liso (Fig. 5A), expressão intra e extra-celular da fibronectina
(Fig. 5C), distribuição prioritária da biglicana na região perinuclear e
em células em divisão mitótica (Fig. 5D), expressão de osteopontina
exclusiva na região perinuclear possivelmente indicando glicosilação
no aparelho de Golgi (Fig. 5E), expressão de colágeno tipo I na
região perinuclear (Fig. 5F) e expressão de decorina e vimentina
sob a forma de fibras dispostas homogeneamente no citoplasma
(Figs. 5G e 5H).
57
Figura 5. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica das células estromais caninas após a primeira expansão in vitro. (A) - α-actina
de músculo liso. (B) - Sialoproteína óssea. (C) - Fibronectina. (D) -
Biglicana. (E) Osteopontina. (F) Colágeno tipo I. (G) - Decorina. (H)
- Vimentina Barra: 15μm.
4.1.4.3. Caracterização fenotípica por RT-PCR
As análises por RT-PCR foram realizadas nas células após a
segunda expansão in vitro (P1). O padrão de expressão dos genes ß-
actina, Cbfa-1, colágeno I e osteonectina não diferiu entre os
animais. A expressão da fosfatase alcalina encontrava-se reduzida
nas amostras 1, 5 e 7 e foi semelhante nas demais amostras (2, 3, 4,
6, 8, 9, 10) (Figura 6).
58
Cabe ressaltar que o pequeno desnível na localização da banda
referente à expressão da ß-actina entre o controle positivo e as
amostras foi devido ao tamanho diferente do produto amplificado. O
controle positivo, de origem humana, apresentava 573 pares de base
enquanto que as amostras de origem canina apresentam 629 pares
de base.
4.5 Injeção da suspensão celular
Nenhum tipo de complicação sistêmica (anestésica ou
hemodinâmica) ou local foi observada em decorrência da injeção da
suspensão celular.
Figura 6. Detecção da expressão por RT-PCR dos genes ß-
actina, Cbfa-1, colágeno I, osteonectina e fosfatase alcalina pelas células estromais caninas após a segunda expansão in vitro (P1). PM = peso molecular 100 pb e C+ = controle positivo.
59
A comprovação do posicionamento da agulha hipodérmica na
fibrose interfragmentar foi obtida através de radiografias simples em
nove pacientes e por fluoroscopia em um animal (Figura 7).
A injeção da suspensão celular foi feita lentamente,
procurando-se vencer gradualmente a resistência à entrada do líquido
no local da lesão. Entretanto, observamos em todos os animais que
sempre ocorria um pequeno retorno e extravasamento da suspensão
celular no trajeto da agulha.
Os animais foram totalmente liberados para suas atividades
habituais após 60 dias.
Figura 7 – Posicionamento da agulha para injeção da suspensão celular no espaço interfragmentar (animal 1) – (seta).
60
4.6 Avaliação radiográfica
4.6.1 – Animal 1 (Figura 10)
Fratura de rádio e ulna distal após um ano de evolução e
tratamento prévio com três procedimentos cirúrgicos para
estabilização do foco de fratura (fixação com placa). O diagnóstico de
não-união oligotrófica no rádio foi feito 12 meses após a fratura,
baseado na persistência de linha radiotransparente medindo 1mm
(Fig.10A). Sessenta dias após a injeção da suspensão celular,
observou-se consolidação radiográfica da fratura do rádio,
diagnosticada pelo desaparecimento da linha de radiotransparência
(Fig.10B). Não houve alteração no aspecto da ulna nos dois exames
radiográficos realizados respectivamente antes e depois do
tratamento com as células.
Figura 10. Animal 1. (A) - Não-
união de fratura distal de rádio e ulna, com evolução de 1 ano.
Espessamento cortico-endosteal do rádio e extensa reabsorção da ulna
– seta preta. (B) - Sessenta dias após o tratamento com a suspensão
celular observa-se consolidação da fratura do rádio – seta branca. A
perda óssea ulnar manteve-se inalterada.
61
4.6.2 – Animal 2 (Figura 11)
Fratura de rádio e ulna distal após um ano de evolução e
tratamento prévio com dois procedimentos cirúrgicos para
estabilização do foco de fratura (fixação com placa). No exame
radiográfico realizado antes da injeção da suspensão celular observa-
se no foco de não-união oligotrófica do rádio arredondamento das
bordas dos fragmentos ósseos. Na ulna o traço de fratura permanece
evidente (Fig. 11C). Sessenta dias após a injeção da solução celular
podemos observar formação de ponte óssea entre os fragmentos
proximais e distais do rádio e da ulna. A formação de calo ósseo em
fase de remodelação, confirma a consolidação óssea nos dois sítios de
não-união (Fig. 11D).
Figura 11. Animal 2. (A) - Não-união de fratura distal de
rádio e ulna, com evolução de 1 ano associada a falência dos
implantes metálicos e instabilidade do foco de fratura
(seta). (B) - Sessenta dias após
o tratamento com a suspensão celular observa-se consolidação
das fraturas do rádio e da ulna (seta).
62
4.6.3 – Animal 3 (Figura 12)
Fratura de rádio e ulna distal após oito meses de evolução e
tratamento prévio com quatro procedimentos cirúrgicos para
estabilização do foco de fratura, optando-se pela fixação com pino
intramedular. O diagnóstico de não-união oligotrófica foi feito com
base na ausência de formação de calo ósseo e persistência de espaço
interfragmentar de 3mm, arredondamento das bordas dos
fragmentos ósseos e evidente instabilidade rotacional no foco de
fratura (Fig. 12A). Dois meses após a terapia celular observa-se
consolidação óssea nos dois sítios de não-união (Figura 12B).
Figura 12. Animal 3. (A) -
Não-união de fratura distal de rádio e ulna, com
evolução de 8 meses, sem sinais de formação de calo
ósseo. O pino intramedular encontra-se alojado na
articulação do carpo e é evidente a instabilidade
rotacional no foco de
fratura (seta preta). (B) – Dois meses após o
tratamento com a suspensão celular observa-
se consolidação das fraturas do rádio e da ulna
(seta branca).
63
4.6.4 – Animal 4 (Figura 13)
Fratura de rádio e ulna distal, inicialmente exposta, com 18
meses de evolução, tratamento prévio com dois procedimentos
cirúrgicos e atualmente em tratamento conservador para
estabilização do foco de fratura (tala). O diagnóstico de não-união
viável atrófica foi feito baseado na ausência de calo ósseo com
manutenção de um espaço interfragmentar de 20mm (Fig. 13A).
Dois meses após a terapia celular, os fragmentos ósseos
encontravam-se sobrepostos, possivelmente em decorrência da
mobilidade no foco de fratura, não se observando qualquer evidência
de consolidação e reparo ósseo no foco de não-união (Fig. 13B).
Figura 13. Animal 4. (A) - Não-união viável
atrófica de fratura distal de rádio e ulna, com
evolução de 18 meses, estabilizada com tala e
sem sinais de infecção
(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento
com a suspensão celular não se evidencia sinais
radiográficos de consolidação óssea, com
permanência da não-união (seta).
64
4.6.5 – Animal 5 (Figura 14)
Fratura do terço médio do rádio e da ulna, com 48 meses de
evolução e tratamento prévio com diversos procedimentos cirúrgicos
(pino intramedular, placa e parafusos e enxerto ósseo autólogo) e
atualmente estabilizada com fixador externo. O diagnóstico de não
união de defeito foi feito baseado no tamanho da falha óssea
(100mm) decorrente da extensa reabsorção óssea (Fig. 14A). Dois
meses após a terapia celular, houve redução de 3mm do espaço
interfragmentar, alterando pouco o aspecto radiográfico inicial do
defeito (Fig. 14B).
A B
Figura 14. Animal 5. (A) – Defeito crítico do
terço médio do rádio e ulna com 100mm e
evolução de 48 meses,
estabilizado com fixador externo (seta). (B) –
Sessenta dias após o tratamento com a
suspensão celular houve uma redução mínima
(3mm) no tamanho da falha óssea e
permanência de um
defeito de grande dimensão (seta).
65
4.6.6 – Animal 6 (Figura 15)
Fratura transversa do terço médio do metatarso, com 10 meses
de evolução, tratada desde a sua instalação com fixador externo. O
diagnóstico de defeito ósseo foi feito baseado na presença de
reabsorção óssea que gerou um afastamento de 22mm entre os
fragmentos ósseos (Fig. 15A). Dois meses após a terapia celular,
observamos consolidação total do segundo metatarso e parcial do
primeiro osso metatarsiano, e sindesmose entre o quarto e quinto
metatarsos (Fig. 15B).
Figura 15. Animal 6. (A) –
Defeito crítico do terço médio do metatarso, com 22mm e
evolução de 10 meses, estabilizado com fixador
externo. As bordas dos fragmentos ósseos são
arredondadas e a instabilidade
no foco de fratura pode ser confirmada pela presença de
zona de radiotransparência em torno dos pinos (seta). (B) –
Sessenta dias após o tratamento com a suspensão
celular observa-se consolidação completa do segundo
metatarso e reparo parcial do
primeiro metatarso, além de sindesmose entre o quarto e
quinto metatarsos (seta).
66
4.6.7 – Animal 7 (Figura 16)
Fratura transversa do terço médio do fêmur, com 6 meses de
evolução, tratamento prévio com dois procedimentos cirúrgicos e
atualmente tratado com fixador externo para estabilização do foco de
fratura. O diagnóstico da não-união óssea foi feito com base na falta
de formação de calo ósseo e na extensa reabsorção óssea que gerou
um afastamento de 70mm entre os fragmentos no foco de fratura
(Fig. 16A). Dois meses após a terapia celular observa-se
consolidação óssea no sítio do defeito (Figura 16B)
Figura 16. Animal 7. (A) – Defeito crítico do terço médio do fêmur com 70mm e
evolução de 6 meses, estabilizado com fixador externo. Além da extensa perda óssea que deu origem ao defeito, observa-se seqüestro ósseo no foco de fratura
(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se consolidação completa do defeito femoral (seta).
67
4.6.8 – Animal 8 (Figura 17)
Fratura oblíqua do terço distal da tíbia, com 8 meses de
evolução, tratamento prévio sem sucesso com fixador externo e
atualmente sem qualquer estabilização do foco de fratura. O
diagnóstico de não-união foi feito baseado na ausência de formação
de calo ósseo, arrendondamento e esclerose das bordas dos
fragmentos ósseos no foco de fratura e manutenção de um espaço
interfragmentar de 20mm (Fig. 17A). No momento da injeção da
suspensão celular foi feita estabilização da fratura com uma muleta
de Thomas e, dois meses após a terapia celular, observou-se a
formação de calo ósseo e consolidação parcial em cerca de 50% do
foco de não-união (Fig. 17B).
Figura 17. Animal 8. (A) – Não-união do terço distal da
tíbia, com 20mm e evolução de 8 meses. As bordas dos
fragmentos ósseos são
arredondadas e escleróticas e a instabilidade no foco de
fratura pode ser confirmada pela ausência de qualquer
tipo de estabilização cirúrgica ou conservadora
(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a
suspensão celular observa-
se reparo parcial da não-união, comprometendo
cerca de 50% do diâmetro da tíbia (seta).
68
4.6.9 – Animal 9 (Figura 18)
Fratura transversa distal de rádio e ulna associada com defeito
metafisário secundário ao uso prolongado (cinco anos) de placa para
estabilização. A placa foi retirada, a lesão foi curetada e enxertada
com osso esponjoso e, 24 meses após este último procedimento, a
formação óssea no local permanecia inexpressiva, persistindo no local
da fratura uma falha óssea segmentar com 24mm. Após a injeção da
suspensão celular o animal foi tratado conservadoramente (tala) para
a estabilização da lesão (Fig. 18A). Dois meses após a terapia celular
observamos formação óssea expressiva e reparo do defeito, que
encontra-se preenchido por osso neoformado (Figura 18B).
Figura 18. Animal 9. (A) – Defeito crítico de rádio com 24mm e evolução de 24 meses,
decorrente do contato prolongado com placa (seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se preenchimento completo do defeito do rádio por osso neoformado (seta).
69
4.6.10 – Animal 10 (Figura 19)
Fratura transversa de rádio e ulna distal, com 48 meses de
evolução e tratamento prévio com cinco procedimentos cirúrgicos. O
foco da fratura permanece instável apesar da tentativa de
estabilização com a placa. O diagnóstico de não-união atrófica foi
feito baseado na ausência de formação de calo ósseo,
arrendondamento e esclerose das bordas dos fragmentos ósseos no
foco de fratura e manutenção de um espaço interfragmentar de 2mm
(Fig. 19A). Após sessenta dias decorridos da terapia celular, houve
redução de 1mm do espaço interfragmentar, caracterizando uma
consolidação parcial da não-união (Figura 19B).
Figura 19. Animal 10. (A) –
Não-união do terço distal do radio, com 2mm e evolução de
48 meses. As bordas dos fragmentos ósseos estão
arredondadas e escleróticas,
com instabilidade do foco de fratura (seta). (B) – Sessenta
dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se
reparo parcial da não-união, com redução em 1mm do
afastamento entre os fragmentos ósseos (seta).
70
4.7 Avaliação Clínica
Nenhum dos animais apresentou dor à palpação, edema,
eritema ou nenhum outro sinal associado à presença de inflamação
ou infecção nos cinco dias seguintes após à injeção da suspensão
celular.
Levando em consideração o sistema de HAZEWINKEL e
MEUTSTEGE (1990) para a avaliação de claudicação, todos os
pacientes no dia da terapia celular, apresentaram ausência de apoio
ou claudicação com apoio intermitente do membro acometido pela
lesão óssea. Excetuando os animais 4 e 5, após um mês, todos os
demais cães apresentaram melhora na avaliação clínica caracterizada
pelo retorno total ou parcial das funções do membro afetado. Na
segunda avaliação clínica, 60 dias após a injeção da suspensão
celular, excetuando os pacientes 3, 4 e 10, os demais animais
apresentaram melhor desempenho das funções do membro afetado,
quando comparado com a primeira avaliação clínica, 30 dias depois
da terapia celular. Quatro pacientes (1, 3, 7, 9) apresentaram
recuperação funcional total e ausência de claudicação e três cães (2,
6 e 8) apresentaram a locomoção discretamente alterada na última
avaliação clínica (60 dias após a terapia celular). Os pacientes 4 e 5
não apresentaram qualquer melhora no retorno das funções do
membro, finalizando o estudo com a mesma condição que iniciaram,
sem apoiar o membro afetado e claudicando com apoio intermitente
do membro lesionado, respectivamente. O paciente 10 apresentou
71
melhora clínica moderada e ao final do estudo apresentava
locomoção alterada, mas apoiando o membro lesionado. A avaliação
clínica no dia da terapia celular e nas duas outras subseqüentes, após
30 e 60 dias respectivamente, estão resumidas na Tabela 7.
Tabela 7 - Avaliação clínica mensal e classificação da claudicação
segundo HAZEWINKEL e MEUTSTEGE (1990)
Tempo/Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Terapia celular 3 4 4 4 3 4 4 4 3 3
30 dias 2 2 0 4 3 2 2 2 1 2
60 dias 1 1 0 4 3 0 0 1 0 2
72
5. DISCUSSÃO
Nas últimas décadas, diversos procedimentos foram
desenvolvidos para tratar não-união de fraturas e defeitos ósseos
críticos. Esses procedimentos incluem técnicas invasivas, como
fixação interna com enxertia de osso ou de material sintético e
técnicas minimamente invasivas, como injeção percutânea de fatores
de crescimento derivados de plaquetas (MARICONDA et al., 2008) ou
de medula óssea total (GARG et al., 1993), ultrassom (KRISTIANSEN
et al., 1997) e pulso eletromagnético (HERNIGOU et al., 2005). A
opção por utilizar neste estudo a injeção percutânea de células
osteoprogenitoras, isoladas de aspirados de medula óssea autóloga e
expandidas in vitro, deve-se ao fato de ser uma alternativa com
potencial osteogênico e, ao mesmo tempo, minimamente invasiva.
Todos os animais utilizados no estudo são adultos, com idade
superior a um ano. Os relatos de não-união, se excluídas causas
metabólicas ou nutricionais, ocorrem preferencialmente em animais
adultos (ATILOLA e SUMNER, 1984; KUMAR et al., 2007). Ao excluir
animais jovens em crescimento, limitando nossa observação a
animais adultos, eliminamos a possibilidade da resposta osteogênica
global mais exacerbada que ocorre em fraturas em organismos em
desenvolvimento. Essa resposta exacerbada poderia influenciar na
resposta ao tratamento.
73
Um estudo realizado por ATILOLA e SUMNER (1984) em 2.825
cães com fraturas, mostrou uma incidência de 3.4% de não-união. Os
ossos mais acometidos foram o rádio e ulna (40,6%), seguidos pelo
fêmur (38,5%), úmero (12,5%) e tíbia (4,2%). O presente estudo,
apesar do pequeno tamanho da amostra, confirma a alta incidência
de não-união do rádio e ulna (70%). Os animais das raças pequenas,
com peso inferior a 2kg, foram as mais acometidas (60%) ao
contrário de ATILOLA e SUMNER (1984) que observaram uma maior
incidência de não-união em animais com peso entre 7 e 14kg. As
diferenças entre os resultados deste estudo e a literatura podem ser
atribuídas ao pequeno tamanho da nossa amostra.
Além da localização anatômica, o tipo de estabilização
influencia no estabelecimento da não-união, cuja base do tratamento
é a fixação dos fragmentos ósseos, com o objetivo de reduzir a
mobilidade no foco de fratura (RODRIGUEZ-MERCHAN e FORRIOL,
2004). Neste estudo, todos os pacientes apresentaram algum grau de
mobilidade no foco de fratura por falência da fixação interna ou da
coaptação externa. Entretanto, apesar dos graus variáveis de
instabilidade mecânica, sete dos dez animais apresentaram
consolidação da não-união. Como as variáveis biomecânicas não
constituíram objeto deste estudo, apesar do seu papel bem definido
na instalação e manutenção da não-união, procuraremos interpretar
a resposta ao tratamento sob o ponto de vista celular. Para tal
utilizaremos alguns pontos de referência que consideramos ter
74
influenciado a qualidade do reparo das lesões e o resultado clínico
final.
5.1 Celularidade do aspirado medular
Em humanos e em outras espécies animais, incluindo cães,
aspirados de medula óssea são obtidos classicamente da crista ilíaca.
Neste estudo, entretanto, seguimos o protocolo desenvolvido por
MANKIANI et al. (2006) e MARTIN et al. (2002), utilizando as
metáfises proximais do úmero ou do fêmur como fonte de obtenção
dos aspirados de medula óssea. A técnica preconizada por estes dois
grupos foi de simples execução pela facilidade em reposicionar a
agulha em toda a extensão do osso metafisário. A extensa área
disponível para punção aliada à possibilidade de sucessivas alterações
na angulação da agulha permitiu reduzir consideravelmente a diluição
do aspirado com sangue periférico. A alta concentração celular obtida
nas amostras de medula óssea total (de até 1x1010 células nucleadas)
confirma a qualidade do aspirado sob o ponto de vista celular.
Nenhum dos animais apresentou complicações durante o
procedimento ou na recuperação anestésica, demonstrando também
ser um procedimento de baixa morbidade para cães.
5.2 Eficácia da expansão in vitro
O protocolo de isolamento e expansão utilizado no presente
estudo foi o mesmo estabelecido previamente em ovelhas por
75
FERNANDES et al. (2004), baseado nas descrições iniciais de
FRIEDESTEIN et al. (1968 e 1970) sobre o comportamento das
células estromais in vitro.
A expansão celular em nosso estudo foi feita a partir do
plaqueamento de 1,5 a 3x107 células por 25 cm2. Como utilizamos
uma alta densidade celular inicial, as culturas alcançavam a
confluência mais rapidamente em relação aos achados descritos na
literatura (DIGIRALAMO et al., 1999). Uma das justificativas para
utilizarmos este número elevado de células no plaqueamento inicial
foi baseada nos resultados de DIGIRALAMO et al. (1999). Com maior
densidade de plaqueamento inicial, as células passam por menos
ciclos de divisão celular até atingirem confluência, preservando seu
potencial expansivo. Além disso, SEKIYA et al. (2002) demonstraram
que a velocidade de expansão e a capacidade multipotencial são
inversamente proporcionais à densidade celular e ao tempo de
incubação por passagem, respectivamente. Dessa forma, quanto
maior a densidade celular, menor será a quantidade de divisões
celulares de cada progenitor, e quanto menor o tempo de incubação
para atingir a confluência a cada passagem, maior será a capacidade
multipotencial das células obtidas. Tomando por base estes relatos e
por considerarmos que a obtenção de um produto celular final com
alto potencial de ação biológica no microambiente ósseo, poderia ser
um diferencial na resposta ao tratamento, optamos pelo isolamento
76
inicial dos osteoprogenitores a partir de uma suspensão com alta
densidade celular.
Uma outra característica das células estromais caninas foi o
padrão organizacional das culturas, observado até três semanas após
o isolamento inicial. Esta organização das células estromais descrita
por OWEN et al. (1988) em sistemas in vitro se caracteriza pelo
arranjo das células em pequenos grupamentos circundados por
células hematopoéticas. Esta disposição mimetiza a interação
funcional entre o estroma e a hematopoese in vivo, através do qual
as células hematopoéticas se beneficiam e se diferenciam. Essa
interação é amplamente observada em culturas de progenitores
mesenquimais de roedores, mas raramente é observada em humanos
(SHORT et al., 2003).
As células isoladas da medula óssea canina apresentaram
padrão morfológico fusiforme desde os primeiros dias da expansão
até a fase de confluência, quando a proliferação é mais lenta (SEKIYA
et al., 2002). Apesar da grande heterogeneidade morfológica e
fenotípica observada em praticamente todas as espécies, as células
estromais são células fibroblastóides tipicamente mesenquimais
(PITTENGER et al., 1999; WOODBURRY et al., 2000; MARTIN et al.,
2002), mas que apresentam diferenças quanto à expressão de
moléculas e quanto aos índices de crescimento e diferenciação
(BIANCO e ROBEY, 2001).
77
5.3 Potencial osteogênico da suspensão celular injetada nas lesões
MUSCHELER et al. (2001) mostraram em humanos, que a
medula óssea normal possui cerca de 32 milhões/mL de células
nucleadas e apenas uma dentre 18.000 células nucleadas tem
características fenotípicas de célula tronco mesenquimal. Esta
quantidade pode ser facilmente ampliada através da expansão in
vitro. Neste estudo foram injetadas nas lesões em média 20 milhões
de células osteoprogenitoras (2,08x107±0,22) em volumes que
variaram entre 0,5-4,0 mL. Consideramos como uma vantagem
adicional do nosso protocolo a possibilidade de obter este elevado
número de células a partir de volumes iniciais de medula óssea
relativamente pequenos (11,5±10,18 mL). A utilização de
concentrado de células mononucleares, com o mesmo objetivo
terapêutico em humanos, requer a aspiração de volumes
consideravelmente maiores (300mL) para a obtenção de um número
mínimo de osteoprogenitores com potencial suficiente para estimular
resposta osteogênica (HERNIGOU et al., 2005).
Para quantificar o número de progenitores osteogênicos
presentes na medula óssea total foi utilizado o ensaio de CFU-F.
Inicialmente o padrão de expansão foi sob a forma de grupamentos
contendo 2-7 células. Ao final do 3º dia, as células em franco estado
proliferativo, iniciaram o delineamento das CFU-Fs. Ao final da
primeira semana as CFU-Fs com 50 ou mais células eram facilmente
identificadas para quantificação. Este padrão de crescimento coincide
78
com as descrições da literatura, onde se utiliza em média 5x104 -
1x106 células por 25 cm2 (SHORT et al., 2003).
HERNIGOU et al. (2005) mostraram que em mulheres o número
de CFU-Fs declina com a idade. CAPLAN (1994) e GALOTTO et al.
(1997) demonstraram que a quantidade de progenitores
mesenquimais declina com a idade. Em recém natos existe 1 CFU-F
para cada 10.000 células mononucleadas, proporção esta que em
indivíduos com mais de 80 anos diminui para um progenitor para
cada 2.000.000 células nucleadas. Em relação à idade dos animais
não observamos diferença no número de CFU-Fs. Entretanto, animais
da raça Pinscher possuíam um menor número de CFU-Fs por milhão
de células nucleadas (20.9±0.73) tanto em relação aos animais da
raça Poodle (23.23±0.30, p<0.005) quanto em relação aos animais
SRD (23.6±1.44, p<0.005). Hernigou e colaboradores, observaram
em seu estudo com 60 pacientes humanos, portadores de não união,
que a média de CFU-F por milhão de células nucleadas era de 33±8
(HERNIGOU et al., 2005).
5.4 Comprometimento com a linhagem osteogênica
A análise fenotípica qualitativa das células por imunocitoquímica
revelou em todas as amostras expressão significativa de moléculas
características de comprometimento com as linhagens
miofibroblástica ( -actina de músculo liso, colágeno tipo I, biglicana,
vimentina, fibronectina) ou osteoprogenitora (colágeno I,
79
osteopontina, sialoproteína óssea, biglicana e decorina). A verificação
por RT-PCR da expressão quantitativa de genes diretamente
relacionados com o comprometimento osteogênico confirmou os
resultados da imunocitoquímica.
O padrão uniforme de expressão de Cbfa-1, durante todo o
período de cultivo, foi a principal comprovação de que os
progenitores estavam comprometidos com a linhagem osteogênica.
DUCY et al. (1997), demonstraram que in vitro o gene Cbfa-1 é
responsável pela diferenciação osteoblástica durante os processos de
remodelamento ósseo e durante o desenvolvimento do esqueleto na
embriogênese. In vivo, KOMORI et al. (1997) mostraram em animais
knock-out para Cbfa-1, a formação de esqueleto totalmente
cartilaginoso, sem formação óssea pela ausência de osteoblastos.
DUCY et al. (1999) também demonstraram que o Cbfa-1 é
responsável pelo controle da formação óssea através da regulação da
função de osteoblastos diferenciados, que por sua vez regulam a
expressão de genes necessários para a formação da matriz óssea.
Para SATOMURA et al. (2000), o Cbfa-1 é expresso constitutivamente
por células estromais em cultura.
O colágeno tipo I é um dos primeiros marcadores moleculares a
ser regulado em osteoprogenitores comprometidos, de tal forma que
a sua produção e deposição precedem e são essenciais para a
regulação da expressão de outros marcadores osteoblásticos precoces
e tardios (XIAO et al., 1998). O comprometimento das células
80
estromais caninas com a linhagem osteogênica foi confirmado através
do padrão de expressão do colágeno tipo I similar ao controle
realizado com osteoblastos humanos.
O padrão de expressão de fosfatase alcalina pelas células
caninas não foi uniforme. Em cinco amostras a expressão foi
bastante reduzida, o que pode ser explicado pela cinética de
expressão da fosfatase alcalina. Tanto durante o processo de
diferenciação in vitro, como durante sua expressão in vivo, existe
uma variação de acordo com a localização e com a função da célula.
Em condições habituais de cultivo in vitro, a expressão da fosfatase
alcalina se inicia no 7º dia de cultivo, apresenta um pico de expressão
no 14º dia e decai progressivamente até o 21º dia em cultura
(SCHECROUN e DELLOYE, 2003). A baixa expressão de fosfatase
alcalina nos animais 1, 4, 6, 7 e 10 pode ser explicada, ao menos em
parte, pelo maior tempo de expansão (19, 19, 17, 19 e 16, dias
respectivamente) que as culturas destes animais requereram para
atingir confluência, já que classicamente o pico de expressão ocorre
em torno do 14º dia.
O padrão de expressão da osteonectina é descrito na literatura
como presente tanto nos progenitores mesenquimais como nas
células ósseas maduras. Neste estudo, o padrão de expressão da
osteonectina pelas células caninas em muito se assemelhou ao
padrão de expressão dos osteoblastos maduros. Esses resultados
estão de acordo com relatos da literatura que mostram que in vitro, a
81
osteonectina é amplamente expressa por células estromais
(MOTAMED e SAGE, 1998), em especial nas que estão em divisão
(YAN et al., 1998). Um outro dado da literatura sugere a co-
expressão de osteonectina e colágeno tipo I. RINGUETTE et al.
(1992) mostraram que a osteonectina se concentra prioritariamente
nos sítios ricos em fibras colágenas. Os resultados de BRADSHAW e
SAGE (2001) complementam esta observação ao demonstrar que a
ausência de colágeno leva a redução maciça da expressão de
osteonectina. Mais recentemente (FRAMSON et al., 2004) foi descrito
que a ausência de osteonectina por interferir na fibrilogênese,
promove uma drástica redução na expressão do colágeno tipo I.
5.5 Manutenção do tecido fibroso inviolado no foco de não-união
Até o presente momento, o tratamento de escolha para não-
união de fraturas e defeitos segmentares em cães é baseado na
remoção do tecido fibroso, estabilização mecânica e adição de um
componente osteogênico, o que acarreta em grande morbidade para
o paciente (JOHNSON, 1987). No protocolo descrito neste estudo, o
tecido fibroso não somente não foi removido como foi um
componente importante do tratamento ao exercer a função de
suporte, mantendo as células no local da lesão.
Embora a sua ocorrência não tenha sido descrita em humanos,
HERNINGOU et al. (2005) mencionam que uma das preocupações
com a aplicação de concentrado de medula óssea por via percutânea
82
em focos de não-união é o potencial risco de embolia. Esta
complicação pode ser evitada ou eliminada, através da filtração tanto
da medula óssea total como do concentrado de células
mononucleares antes da sua injeção. No protocolo utilizado neste
estudo, o risco de embolia gordurosa ou de medula óssea pode ser
praticamente descartado uma vez que utilizamos apenas as células
estromais expandidas in vitro ressuspendidas em um pequeno
volume de meio líquido.
A ausência de resposta clínica ao tratamento com a injeção da
suspensão celular em três (4, 5 e 10) dos dez animais pode ser
explicada por algumas particularidades das lesões e/ou da biologia
dos animais.
No animal 4 identificamos como possíveis causas para a falta de
resposta ao tratamento a intensa mobilidade no foco de fratura, as
sucessivas cirurgias que podem ter acarretado na redução da
vascularização local pelo processo de reparo e, consequentemente,
comprometendo a sobrevivência celular e menos provavelmente ao
menor número de células (1.8x107) injetadas na lesão em relação aos
demais animais (2x107). Apesar do número de células ser menor, o
número de CFU-Fs neste animal (22 / milhão de células nucleadas)
estava dentro da média dos animais que responderam ao tratamento.
Em relação ao animal 5, a causa da falta de resposta ao
tratamento certamente está relacionada com o grande tamanho
(100mm) e longo tempo de evolução da lesão (4 anos). Mesmo tendo
83
recebido a suspensão com o maior número de células (2.5x107), os
determinantes tamanho e tempo de evolução devem ter prevalecido
na definição da resposta final ao tratamento. Segundo HERNIGOU et
al. (2005), o volume de calo ósseo obtido com a injeção de células
mononucleares provenientes da medula óssea no foco de não-união,
é limitado e por isso, o espaço interfragmentar, assim como o
deslocamento entre os fragmentos ósseos devem também ser
limitados. Esses achados podem ter sido determinantes no nosso
estudo, onde pacientes com amplo espaço fragmentar e extrema
mobilidade no foco de não-união, não demonstraram consolidação
óssea.
No animal 10, além da instabilidade no foco de fratura e longo
tempo de evolução, aparentemente nenhuma outra causa pode ser
atribuída a falta de resposta ao tratamento. Possivelmente pela
pequena dimensão da lesão (2mm) este animal foi o único dos
refratários ao tratamento que apresentou melhora clínica,
caracterizada pela diminuição da instabilidade no foco de fratura, na
avaliação através do sistema de HAZEWINKEL e MEUTSTEGE (1990).
Até o presente momento, o uso de células osteoprogenitoras
provenientes da medula óssea, expandidas in vitro e aplicadas em
foco de não união de fraturas, nunca foi feito. Essa técnica permite
que somente células progenitoras, em altas concentrações, sejam
injetadas, em pequenos volumes, no foco da doença óssea. Devido a
alta concentração celular, a resposta osteogênica foi prontamente
84
visível mesmo em condições desfavoráveis para a consolidação óssea,
permitindo a recuperação funcional do membro acometido, na
maioria dos pacientes.
85
6. CONCLUSÕES
1. O tratamento de não-união de fraturas ou defeitos
segmentares de cães, com suspensão de células
osteoprogenitoras expandidas in vitro mostrou ser um
procedimento clinicamente seguro e pouco invasivo, capaz
de induzir a consolidação num percentual elevado de animais
provavelmente pelo seu alto potencial biológico;
2. Em cães, por razões anatômicas e técnicas, a punção da
região metafisária parece favorecer a obtenção de aspirados
de medula óssea mais concentrados, com menos diluição por
sangue periférico;
3. A partir de pequenos volumes de aspirados de medula óssea
canina é possível se obter um número substancial de células
osteoprogenitoras num intervalo de tempo relativamente
curto;
4. As células estromais caninas quando cultivadas in vitro
adquirem um aspecto organizacional em clusters associados
às células hematopoéticas, pouco observado na expansão de
medula óssea de animais superiores, incluindo medula óssea
humana.
5. A expressão de diversas moléculas características da
linhagem osteogênica confirmam o comprometimento
86
fenotípico das células estromais caninas, expandidas in vitro,
com a linhagem osteogênica;
6. Grande mobilidade do foco de fratura, diversos
procedimentos cirúrgicos, lesões extensas ou com longo
tempo de evolução parecem favorecer a não resposta ao
tratamento de não-união / defeito ósseo em cães com
injeção percutânea de células osteoprogenitoras.
87
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COMITÊ DE ÉTICA
99
Anexo 2 – Valores de referência para hemograma, leucograma e bioquímica sérica (perfil
hepático e renal) canina.
HEMOGRAMA
LEUCOGRAMA
(x103/µl)
BIOQUIMICA
Hematócrito
(%)
37 - 55
Leucócitos
3 – 11,5
Uréia
(UI/L)
15 - 65
Hemácias
(x106/ L)
5,5 – 8,5
Basófilos
raros
Creatinina
(UI/L)
0.5 – 1.5
Hemoglobina
(g/dL)
12 - 18
Eosinófilos
2 - 10
AST
(mg/dL)
7 - 40
VCM
(fL)
60 - 72
Bastoes,
Mielócitos,
Metamielócitos
raros
ALT
(mg/dL)
9 - 120
HCM
(g/dL)
19 - 24
Segmentados
60 - 77
CHCM
(g/dL)
33 - 38
Linfócitos
12 - 30
Plaquetas
(x103/µl)
200 - 500
Monócitos
3 - 10
* Valores de referência obtidos de Mary Anne Thrall – Hematologia e Bioquímica Veterinária
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