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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

USO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS DA MEDULA ÓSSEA PARA O TRATAMENTO

DE LESÕES ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris).

Helia Christine Dórea de Macedo Zamprogno

Orientador: Maria Eugênia Leite Duarte

Livros Grátis

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Junho / 2008

Helia Christine Dórea de Macedo Zamprogno

USO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS

DA MEDULA ÓSSEA PARA O TRATAMENTO DE LESÕES ÓSSEAS EM CÃES (Canis

familiaris).

Orientador: Maria Eugênia Leite Duarte

Tese apresentada ao Programa de

Ciências Morfológicas da Universidade

Federal do Rio de Janeiro como requisito para obtenção do grau de Doutor.

ii

Junho / 2008

BANCA EXAMINADORA MEMBROS TITULARES Prof. Dr. Helio Dutra Universidade São Paulo Profa. Dra. Maria Isabel Doria Rossi Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. José Mauro Granjeiro Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Marcos Farina Suplente Interno Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof. Dr. Alex Balduíno Revisor e Suplente Externo Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO).

ORIENTADOR Profa. Dra. Maria Eugenia Duarte Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO) Universidade Federal do Rio de Janeiro

COORDENADOR DO PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto

iv

Dedico esta tese à Heron Dórea,

minha avó, que continua guiando meus caminhos.

Agradecimentos

A Professora Dra. Maria Eugênia Leite Duarte, orientadora, que

me mostrou os caminhos, me apoiou nas dificuldades e me ensinou a

lidar com os erros, imperfeições e as variabilidades dos estudos

clínicos, facilitando assim, a execução deste trabalho e a constatação dos benefícios da pesquisa clínica tanto para a medicina veterinária,

como também para a medicina humana.

A Priscila Moreno, amiga e colega, que me ensinou a trabalhar com

células e me mostrou que a complexidade dos protocolos pode ser

quebrada pela prática. Porém mais que isso, me ensinou o verdadeiro sentido de trabalho em equipe e amizade.

Ao Professor Dr. André Lacerda, amigo e colega que abriu as portas da sua instituição, Universidade Estadual do Norte Fluminense, permitindo que eu usasse as instalações do Hospital Veterinário para

a execução de várias etapas deste trabalho.

Aos colegas médicos veterinários que humildemente indicaram seus casos de não-união de fraturas, contribuindo para a casuística

deste estudo. Aos proprietários dos cães que participaram deste estudo, pela

coragem de enfrentar o desconhecido, perseverança e vontade de fazer de tudo pelos seus “amigos de quatro patas”.

A Marcela Fontana que com muita paciência e dedicação me

ensinou RT-PCR.

A Alex Balduíno pela importante ajuda na revisão da tese.

A Professora Dra. Cristina Takyia que me ajudou tantas vezes a

ajustar protocolos, corrigir erros e seguir em frente.

A Renato Zamprogno (Beco), Eliete Dórea e Edilza Dórea,

minha família, pelo apoio incondicional e pela compreensão diante de

tantas horas dedicadas ao trabalho.

A Deus pelas infinitas oportunidades de aprendizado.

v

RESUMO

Introdução: Uma das alternativas para aumentar o número de células

osteoprogenitoras da medula óssea, e consequentemente a taxa de sucesso

da terapia celular, é a expansão in vitro, que tem como principal vantagem

o significante aumento da população celular em um curto espaço de tempo,

devido ao alto potencial de proliferação (Lucarelli and Beccheroni, 2003). O

objetivo deste estudo foi investigar a resposta obtida no tratamento de não

união de fraturas e defeitos ósseos críticos, após a injeção percutânea de

células osteoprogenitoras da medula óssea autólogas expandidas in vitro.

Materiais e Métodos: Os casos clínicos incluíram seis não uniões de

fraturas e quatro fraturas associadas com defeitos ósseos críticos como

resultado de reabsorção óssea. Todos os animais foram tratados com

injeção percutânea de células osteoprogenitoras da medula óssea autóloga,

expandidas in vitro e os implantes não foram revisados mesmo na presença

de instabilidade no foco de fratura. A caracterização fenotípica e mofológica

das células osteoprogenitoras da medula óssea foi baseada nos ensaios de

PCR-RT, imunocitoquímica e quantificação das unidades formadoras de

colônia (CFU-F). Avaliação radiográfica foi feita no momento da injeção das

células e oito semanas depois, para analisar a consolidação óssea.

Resultados: Após 60 dias, a avaliação radiográfica revelou uma completa

união óssea em sete cães, redução do tamanho do espaço interfragmentar

em um cão e ausência de reparo ósseo em dois pacientes. O número de

CFU-F variou de 18.8 to 24.8 (média 22.42±1.54) por milhão de células

nucleadas. A expressão de α-actina de músculo liso, vimentina, decorina,

osteopontina, colágeno I, sialoproteína óssea, biglicana, and fibronectina

demonstrou o comprometimento osteogênico das CTEs. PCR-RT detectou a

expressão gênica de Cbfa1, fosfatase alcalina, colágeno I e osteonectina,

confirmando o comprometimento osteogênico das CTEs expandidas.

Conclusão: A consolidação óssea foi alcançada em 7/10 casos,

demonstrando que as CTEs, aplicadas de forma minimamente invasivas,

podem ter um papel no reparo de não união de fraturas e defeitos ósseos

extensos.

Palavras chave: Células osteoprogenitoras, medula óssea, cão, não-união

de fraturas, e defeito ósseo crítico.

vi

ABSTRACT

Introduction: The use of in vitro expanded bone marrow stem cells

(BMSC) increases success rate of the stem cell therapy. One advantage of

this technique is the ability to give a significant increase in cells numbers in

a few days due to their high proliferative rate (Lucarelli and Beccheroni,

2003). The aim of the present study was to investigate the response to

treatment of canine nonunion fractures and critical sized bone defects with

the percutaneous injection of autologous in vitro expanded BMSC.

Materials and Methods: The clinical cases were six nonunion fractures

and four fractures associated with critical-sized bone defects as a result of

bone resorption. All animals were treated with percutaneous in vitro

expanded autologous BMSCs grafting. The implants were not revised, even

when instability was detected. BMSCs morphologic and phenotypic

characterization was based on PCR-RT, immunocytochemistry and Colony

Forming Units–Fibroblasts (CFU-F) quantification. Radiographic evaluation of

the fracture site was performed at the date of the injection and 8 weeks

later to assess bone healing.

Results: After 60 days, radiographic evaluation revealed complete union in

seven dogs, reduction of the fracture gap in one dog (which was insufficient

to stabilize the fragments) and lack of boney healing in two dogs. The

number of CFU-F per million of nucleated cells ranged from 18.8 to 24.8

(mean 22.42±1.54). The expression of α-smooth muscle actin, vimentin,

decorin, osteopontin, type I collagen, bone sialoprotein, biglycan, and

fibronectin in expanded SSCs displayed osteogenic commitment of the cells.

PCR-RT detected the expression of Cbfa1, alkaline phosphate, type I

collagen and osteonectin genes, confirming the osteogenic commitment of

the expanded BMSCs.

Conclusion: Complete bone healing was achieved in 7/10 cases,

demonstrating that BMSCs may aid healing of non-union fractures and large

bone defects. Furthermore, this treatment could be advantageous to

decrease the morbidity associated with more invasive surgical procedures.

Key words: Bone marrow, stem cells, canine, nonunion fractures, and

critical bone defects.

vii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 11

1.1 O tecido ósseo 11

1.2 Remodelação óssea em humanos 13

1.3 Consolidação das fraturas 15

1.4 Medula óssea 20

1.5 Células tronco mesenquimais 20

1.6 Não-união de fraturas 22

1.7 Tratamento da não-união óssea 27

1.8 Uso terapêutico de células osteoprogenitoras 30

1.9 Justificativa 33

2. OBJETIVOS 35

2.1 Objetivo geral 35

2.2 Objetivos específicos 35

3. METODOLOGIA 36

3.1. Animais 36

3.2. Coleta de medula óssea 37

3.3. Isolamento e expansão das células estromais 38

3.4. Caracterização morfofuncional e molecular das células

estromais da medula óssea 40

3.4.1. Identificação das unidades formadoras de colônias (CFU-

Fs) 40

3.4.2. Imunocitoquímica 41

3.4.3. PCR-RT (Reverse Transcriptase Polymerase Chain

Reaction) 42

3.5. Injeção da suspensão celular 45

3.6. Avaliação radiográfica 46

3.7. Avaliação clínica 46

3.8 Análise estatística 47

4. RESULTADOS 49

4.1 Caracterização dos pacientes 49

4.2 Coleta da medula óssea 51

4.3 Isolamento e expansão das células estromais 52

4.4 Caracterização das células estromais da medula óssea 55

4.4.1 Unidades formadoras de colônia (CFU-Fs) 55

4.4.2 Caracterização fenotípica por imunocitoquímica 56

4.4.3 Caracterização fenotípica por PCR-RT 57

4.5 Injeção da suspensão celular 58

4.6 Avaliação radiográfica 60

4.6.1 Caso 1 60

4.6.2 Caso 2 61

4.6.3 Caso 3 62

4.6.4 Caso 4 63

4.6.5 Caso 5 64

4.6.6 Caso 6 65

4.6.7 Caso 7 66

viii

4.6.8 Caso 8 67

4.6.9 Caso 9 68

4.6.10 Caso 10 69

4.7 Avaliação clínica 70

5. DISCUSSÃO 72

5.1 Celularidade do aspirado medular 74

5.2 Eficácia da expansão in vitro 74

5.3 Potencial osteogênico da suspensão celular injetada nas

lesões 77

5.4 Comprometimento com a linhagem osteogênica 78

5.5 Manutenção do tecido fibroso inviolado no foco de não-união 81

6. CONCLUSÕES 85

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87

ANEXOS 98

11

Introdução

1.1 Tecido Ósseo

Os ossos são constituídos por uma forma de tecido conjuntivo

rígido cuja matriz extracelular encontra-se impregnada por cristais de

fosfato de cálcio depositado através do processo de mineralização.

Com sua estrutura altamente vascularizada e metabolicamente ativa,

os ossos exercem funções de suporte e proteção e representam o

principal reservatório de íons de cálcio e fosfato (WHITEFIELD e

ROSEMBERG, 2005).

Os ossos podem ser constituídos por tecido ósseo compacto (ou

cortical) ou tecido ósseo esponjoso (ou medular). A superfície externa

dos ossos é recoberta pelo periósteo, enquanto que o endósteo

recobre a superfície interna (KIERSZENBAUM, 2002).

Do ponto de vista microscópico, o tecido ósseo é composto por

matriz óssea, osteoblastos (formas ativas e inativas), osteócitos e

osteoclastos (HOLMBECK et al., 2005).

A matriz óssea consiste de 35% de componentes orgânicos,

incluindo prioritariamente colágeno tipo I (90%), proteoglicanos

como o sulfato de condroitina e ácido hialurônico e proteínas não

colágenas (osteocalcina, osteopontina e osteonectina) e 65% de

componentes inorgânicos. Os componentes inorgânicos são

representados predominantemente pela hidroxiapatita

(KIERSZENBAUM, 2002).

12

Os osteoblastos são células de formato cuboidal ou colunar

que recobrem todas as áreas de formação óssea ativa, sob a forma

de monocamada (HOLMBECK et al., 2005). Os osteoblastos

depositam na interface com a trave mineralizada uma matriz orgânica

denominada de matriz osteóide, onde posteriormente terá inicio o

processo de mineralização (HOLMBECK et al., 2005). Durante o

processo de deposição da matriz osteóide alguns osteoblastos ficam

aprisionados na matriz e se diferenciam em osteócitos. Estas células

maduras, localizadas no interior de lacunas e completamente

envolvidas por matriz óssea mineralizada, estão conectadas por

canalículos pelos quais atravessam prolongamentos celulares que

integram os osteócitos através de junções comunicantes (WANG et

al., 2000). Por esta rede de canais circula um fluido que é

impulsionado para dentro das lacunas e de volta para os canalículos

de acordo com os movimentos dos ossos. A intensidade com que esse

fluido alcança os osteócitos determina a oscilação de íons de cálcio.

Ademais, este fluido participa do transporte de nutrientes, de

oxigênio e metabólitos dos/para os osteócitos controlando o processo

de ativação ou não destas células (KNOTHE-TATE et al., 2003).

O osteoclasto é uma célula multinucleada que tem sua origem

a partir da fusão de monócitos, provenientes da circulação sanguínea

(BLAIR, 1998) ou a partir da fusão de pré-osteoclastos existentes na

medula óssea (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). Essas células são

responsáveis pela reabsorção óssea, através da secreção de enzimas

13

na superfície óssea que promovem a dissolução da matriz

mineralizada e degradação enzimática da matriz orgânica. A

formação dos osteoclastos é controlada pelo paratormônio (PTH),

produzido nas glândulas paratireóides. Essa glândula possui

receptores de membrana que respondem aos níveis séricos de Ca++.

Quando a concentração sérica declina, o PTH é secretado e os

osteoclastos são formados a fim de promover a reabsorção óssea,

restaurando os níveis de cálcio (BLAIR, 1998).

1.2 Remodelação Óssea em Humanos

Os osteócitos são responsáveis pelo monitoramento das forças

exercidas sobre o osso e programados para responder às alterações

biomecânicas (KLEIN-NULENT et al., 2003), iniciando o processo de

remodelação (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). Em reposta a

micro danos e subseqüente ativação dos osteócitos os osteoclastos

migram para o sítio onde o processo de remodelação está se

iniciando. Através da ação da catepsina K os osteoclastos iniciam a

degradação da matriz óssea (BLAIR, 1998). Com a degradação da

matriz e morte dos osteócitos, é provável que os osteoclastos sejam

recrutados pelos percussores estromais osteoblásticos por

quimiotaxia, através da liberação de M-CSF (macrophage colony-

stimulating factor) e RANKL (receptor activator of NF-κB Ligand).

Uma vez aderidos à zona de reabsorção os osteoclastos promovem a

escavação da matriz óssea durante 2 a 3 semanas. Durante esse

14

período de tempo o fluxo do fluido extracelular cessa por completo

naquela região (KLEIN-NULENT et al., 2003) e o local fica preparado

para que ocorra a deposição de matriz protéica pelos osteoblastos e

sua subseqüente mineralização (KIERSZENBAUM, 2002).

Durante o processo de escavação, BMP-2 (proteína morfogênica

óssea 2), FGF-2 (fator de crescimento fibroblástico 2), IGFs-I e II

(fatores de crescimento insulínico I e II), IGFBP-5 (proteína de

ligação do fator de crescimento insulínico 5) e TGF-β (fator de

crescimento transformante β), são liberados da matriz óssea

estimulando a diferenciação das células osteoprogenitoras em

osteoblastos (WHITEFIELD e ROSEMBERG, 2005). O TGF-β estimula

particularmente a diferenciação das células do estroma da medula

óssea em osteoblastos, através da via de ativação Cbfa1/Runx-2 e

concomitantemente a diminuição da formação de osteoclastos

através da redução da expressão de RANKL (TROEN, 2003). Cessada

a escavação, os osteoclastos sofrem apoptose. Estas células deixam

um rastro de Mim-1 (myb-induced myeloid protein 1), uma citocina

que atrai progenitores de osteoblastos (TROEN, 2003) e facilita a

ação do Cbfa1/Runx-2, estimulando a expressão de osteocalcina e

mineralização da matriz orgânica (PONOMAVERA et al., 2002). O

preenchimento completo das lacunas de reabsorção com o osso

depositado pelos osteoblastos e a completa restituição da área recém

remodelada ocorre num período de 3 a 9 meses. Ao final deste

processo, os osteoblastos que não foram aprisionados nas lacunas

15

sofrem apoptose e liberam fosfatase alcalina sobre a nova matriz

óssea concluindo o processo de reparação do tecido ósseo

(WHITEFIELDB e ROSEMBERG, 2005).

1.3 Consolidação das Fraturas

Em certas condições de instabilidade a consolidação das

fraturas é caracterizada pela formação de um calo intermediário à

formação óssea. Esse reparo ósseo é chamado de consolidação

secundária e pode ser dividido em três fases que ocorrem

simultaneamente: inflamação, reparo e remodelamento (GRIFFON,

2005). Cabe ressaltar que a formação óssea ocorre somente em

condições mínimas de mobilidade entre os fragmentos ósseos, que

não deve ultrapassar 2% (SCHILLER, 1988).

A fase inflamatória começa imediatamente após a fratura e o

estabelecimento da ausência de continuidade óssea e de tecidos

adjacentes, e persiste até o início da formação de cartilagem ou osso.

Essa fase dura em torno de 3 a 4 dias e o final desta fase, pode ser

caracterizado clinicamente, pela diminuição do edema e dor local

(GRIFFON, 2005).

Inevitavelmente as fraturas causam dilaceração dos vasos

sanguíneos medulares, com subseqüente extravasamento de sangue.

Trombose e contração destes vasos sanguíneos minimizam a perda

sanguínea, mas ao mesmo tempo promovem isquemia e conseqüente

necrose óssea, observada pela presença de lacunas vazias na

16

histopatologia. Forma-se então, no espaço interfragmentar, um

hematoma rico em fibrina que apesar de não oferecer nenhum

suporte mecânico à fratura, marca o início da consolidação óssea,

através da liberação de fatores de crescimento que estimulam a

angiogênese e osteogênese. Formação óssea endocondral ectópica foi

observada após o transplante de coágulo interfragmentar,

demonstrando assim o potencial osteoindutor dos componentes deste

hematoma (STREET et al., 2000). Possivelmente, as plaquetas seriam

o primeiro tipo celular a alcançar o foco de fratura e além de fatores

de coagulação, elas contribuiriam também com fatores de

crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e TGF-β1, estimulando a

formação óssea (LIEBERMAN et al., 2002).

As propriedades angiogênicas presentes no hematoma

interfragmentar são mediadas pelo fator de crescimento vascular

endotelial (VEGF) e fatores como acidez local e citoquininas contidas

no exudato da região traumatizada (STREET et al., 2000).

Mediadores inflamatórios como as prostaglandinas E1 e E2 também

estimulam a angiogênese e ainda são responsáveis pela sinalização e

ativação de osteoclastos e o início da reabsorção óssea (MILLIS,

1999). Finalmente, mastócitos contendo substâncias vasoativas

contribuem para a formação de novos capilares (MCLAUGHLIN,

1991). Em questão de horas, a área necrótica é invadida por novos

vasos sanguíneos oriundos dos tecidos moles adjacentes (GRIFFON,

2005).

17

Células mononucleares, com potencial fagocitário auxiliam na

remoção de osso necrótico, e macrófagos, através da liberação de

fatores de crescimento como o fator de crescimento fibroblástico

(FGF), estimulam a produção de tecido fibroso, assim como a

formação óssea (LIEBERMAN et al., 2002). Com o restabelecimento

da vascularização intra-medular, a vascularização extra óssea

regride. Em condições normais, o hematoma é reabsorvido no final da

primeira semana pós-trauma (SCHILLER, 1988).

O restabelecimento da vascularização permite a disseminação

de fibroblastos e células mononucleares que transformam o

hematoma em tecido de granulação. Isso promove um leve grau de

estabilidade ao foco de fratura, em torno de 0.1 Mn/mm2. Com a

maturação do tecido de granulação, fibras de colágeno se tornam

mais abundantes, principalmente colágeno tipo I, permitindo uma

resistência ainda maior no foco de fratura, de até 60 Nm/mm2. Baixa

tensão de oxigênio, vascularização precária, fatores de crescimento e

forças mecânicas atuando na região interfragmentar influenciam na

formação do calo cartilaginoso (REMEDIOS, 1999).

As células mesenquimais que se encontram no periósteo,

endósteo, medula óssea e tecidos moles adjacentes, começam a se

proliferar durante a fase inflamatória e se diferenciar durante a fase

de reparo. Fatores de crescimento como TGF-β e proteínas ósseas

morfogenéticas (BMPs) coordenam a quimiotaxia, proliferação e

diferenciação das células progenitoras em condroblastos e

18

osteoblastos (HEPPENSTALL, 1980). O periósteo que circunda a

região fraturada aumenta de diâmetro, produzindo assim, um calo

ósseo externo, inteiramente irrigado por vasos extra-ósseos. Um calo

interno, confinado à cavidade medular, se desenvolve a partir do

endósteo e é vascularizado a partir das arteríolas medulares

(HEPPENSTALL, 1980). Esse calo cartilaginoso, que é formado

durante as primeiras 3 semanas após o trauma, apresenta uma

resistência a forcas mecânicas similar à do tecido fibroso (MANN e

PAYNE, 1989).

Um achado comum em fraturas instáveis e bem vascularizadas

é um calo exuberante. Esse aumento de diâmetro do osso promove

um ganho na resistência contra as forças de torção permitindo assim

a formação de osso compacto. A mineralização do calo

fibrocartilaginoso progride das extremidades dos fragmentos ósseos,

para o centro do espaço interfragmentar, através da formação de

focos de mineralização controlados por condrócitos (GRIFFON, 2005).

O exato mecanismo de mineralização é ainda incerto, entretanto,

estudos apontam para uma atividade mitocondrial muito similar à que

ocorre nas placas de crescimento (KETENJIAN e ARSENIS, 1975). A

mitocôndria acumularia grânulos de cálcio e fosfato de cálcio que

seriam liberados na matrix extracelular e em uma condição de

hipóxia, estimulariam o depósito de micro-cristais de apatita. A

invasão vascular ocorre no tecido fibrocartilaginoso a partir da

degradação de compartimentos de matrix não mineralizada por

19

macrófagos, seguidos do estabelecimento das trabéculas por células

osteoprogenitoras. Com suporte mecânico adequado e vascularização

restabelecida, o tecido fibroso interfragmentar sofre ossificação

intramembranosa e gradativamente vai sendo substituído por osso

compacto, que apresenta uma resistência mecânica de 160 Nm/mm2

(RAHN, 2002).

No fim da fase de reparo, a união óssea é alcançada, mas a

estrutura da região previamente fraturada difere da morfologia óssea

original e por isso, a fase de remodelamento se inicia.

Essa fase final da consolidação óssea é caracterizada pela

adaptação morfológica até alcançar estrutura, resistência e função

originais. A fase de reparo ósseo é um processo lento que em

humanos leva entre 6 e 9 meses e representa 70% do total de tempo

de consolidação de uma fratura (REMEDIOS, 1999).

O equilíbrio das ações osteoclástica e osteoblástica é regido

pela lei de Wolff. A carga axial exercida sobre o osso cria uma

superfície convexa eletropositiva, onde reabsorção óssea predomina e

uma superfície côcava, eletronegativa onde deposição óssea ocorre.

O calo ósseo vai gradativamente desaparecendo e o espaço medular

na diáfise do osso se restabelece (REMEDIOS, 1999).

Insuficiente vascularização e excessiva mobilidade no foco de

fratura contribuem para o estabelecimento da não-união (GRIFFON,

2005).

20

1.4 Medula Óssea

A medula óssea é um órgão que se estabelece na fase final do

desenvolvimento embrionário, como resultado do processo de

ossificação endocondral. Com o envelhecimento do indivíduo, a

medula óssea, que inicialmente é predominantemente vermelha,

composta por elementos hematopoéticos, se torna amarela devido a

substituição por células adiposas, perdendo gradativamente sua

função hematopoética (KUZNETSOV et al., 2004).

Na vida adulta, a medula óssea hematopoética está restrita à

cavidade medular da clavícula, vértebras, esterno, pélvis, e

extremidades dos ossos longos, entre as trabéculas ósseas. Por muito

tempo, a hematopoese foi considerada a única função da medula

óssea pós-natal. A partir da descrição da presença de células

estromais, com potencial de pluripotencialidade na medula óssea pós-

natal, esta passou a ter um papel mais amplo alem do local de

formação e diferenciação de células hematopoéticas (ROBEY, 2000).

1.5 Célula-Tronco Mesenquimal

Poucos anos após a descoberta das células-tronco

hematopoéticas, os estudos de FRIEDESTEIN et al. (1966) e mais

tarde de OWEN e FRIEDESTEIN (1988), revelaram a existência de

progenitores mesenquimais multipotentes na medula óssea pós-natal,

com potencial para dar origem a distintos tecidos mesodermais. A

partir dessas descobertas, reconheceu-se a existência de dois

21

sistemas tronco distintos na medula óssea – o sistema hematopético

e o sistema estromal, este último precursor das linhagens

osteogênica, condrogênica, adipogênica, e reticulares, a partir de um

progenitor comum (BIANCO e ROBEY, 2004).

Muitos termos têm sido utilizados para designar essas células

de origem não hematopoética, tais com precursor de mecanócitos,

empregado por FRIEDESTEIN (1976) ou células tronco estromais da

medula óssea (OWEN & FRIEDESTEIN, 1988). Outro termo muito

utilizado é célula-tronco mesenquimal, que permite a interpretação

errada de que essas células teriam a capacidade de originar múltiplos

tecidos mesodermais, propriedade exclusiva de células embrionárias

(BIANCO et al, 2006). Hoje sabe-se que progenitores oriundos do

estroma da medula óssea, somente dão origem a tecidos do

esqueleto pós-natal ou do esqueleto em desenvolvimento, como

osso, cartilagem, tecido adiposo, músculo liso e tecido estromal de

suporte da medula óssea, excluindo músculo esquelético e endotélio.

Por esse motivo, foi sugerido por BIANCO et al. (2006) e BIANCO e

ROBEY (2004) a denominação mais atual e coerente como células-

tronco esqueléticas (CTE).

As CTEs se caracterizam pela capacidade de aderência após o

plaqueamento da medula óssea. Essas células aderentes apresentam

potencial clonogênico, investigado através de ensaios denominados

CFU-F (colony forming unit–fibroblasts). Após a expansão in vitro,

elas são capazes de originar osteoblastos, células reticulares

22

(friedestein, 1968; krebsbach, 1997) condrócitos e células

acumuladoras de gordura (friedestein, 1970; ashton, 1980). Até o

presente momento, o fenótipo descrito das células-tronco

esqueléticas humanas é CD34-, CD45-, CD14-, CD13+, CD29+, CD44+,

CD49a+, CD63+, CD90+, CD105+, CD106+, CD146+, CD166+

(ZANNETTINO et al, 2003; BIANCO e ROBEY, 2004).

As CTEs apresentam três propriedades: clonogenicidade,

multipotencialidade e capacidade de auto-renovação, (BIANCO et al.,

2006; SACCHETTI et al., 2007). As células de medula óssea em

cultura expressam fator de transcrição Runx2/CBFA1, que é o gene

para o comprometimento osteogênico (DUNCY et al., 1997; KOMORI

et al., 1997). Entretanto, ainda há pouca evidência dessa expressão

in vivo (BIANCO et al, 2006). Outros fatores de transcrição como

Osterix, que caracteriza diferenciação osteogênica (NAKASHIMA et al,

2002) e Sox9, que determina diferenciação condrogênica (AKIYAMA

et al., 2002) são levemente detectados em amostras de estroma de

medula óssea (BIANCO et al., 2006). Fatores de transcrição que

controlam a adipogênese C/EBP e PPAR são expressos, em baixos

níveis, mesmo sem a adição de indutores adipogênicos na cultura

(GUIMBLE et al., 1996; KUZNETSOV et al., 2001).

1.6 Não-União de Fraturas

A não-união de fraturas ocorre quando o processo de reparo

biológico num foco de fratura é interrompido por motivo ainda não

23

esclarecido, acarretando em não consolidação do tecido ósseo. Nestas

situações, a consolidação só ocorrerá se for instituído um tratamento

direcionado para este objetivo, em sua maioria associando

tratamento cirúrgico. Sob o ponto de vista temporal, a não união é

diagnosticada quando uma fratura, não apresenta sinais radiográficos

de consolidação três meses após sua ocorrência (LA VELLE, 1988).

Diversos fatores podem contribuir para a interrupção ou retardo

da consolidação óssea. Dentre estes fatores, os que estão mais

diretamente relacionados com uma das duas condições é o grau

inicial de desvio da fratura, perda óssea, traumas de alta energia

(HARRIS et al., 2006) associados à lesão extensa de partes moles,

cominuição e infecção (LERNER et al., 2006). Em pequenos animais,

assim como na medicina humana, situações como redução e fixação

inadequadas, instabilidade entre os fragmentos ósseos e local da

fratura representam também importantes fatores para o

estabelecimento desta patologia (AUDIGE et al., 2005; PIERMATEI et.

al., 2006).

A não-união pode acarretar problemas relacionados com a

função do membro afetado, como atrofia muscular por desuso,

redução da amplitude do movimento articular e rigidez relacionada à

contração de tecido cicatricial, disfunção neuromuscular e angulação

e/ou encurtamento do membro (MILLIS e JACKSON, 2003).

24

A fisiopatologia da não-união de fraturas é caracterizada

inicialmente pelo surgimento do tecido de granulação no espaço

interfragmentar que confere alguma estabilidade, sem impedir a sua

mobilidade. Gradativamente, cartilagem e osso preenchem o foco de

fratura conferindo estabilidade ao mesmo. Porém, se houver

mobilidade além da tolerada por esses tecidos, haverá

comprometimento da angiogênese e consequente retardo do reparo

ósseo, com possibilidade de estabelecimento de uma não-união

(NUNAMAKER et al., 1985). BOYAN et al. (1999) identificaram a

presença de poucas células mesenquimais comprometidas ou

diferenciadas na linhagem osteoblástica no foco de fratura de um

modelo experimental canino de não-união, sugerindo que a

diferenciação dessas células seja inibida na não-união crônica.

O tecido interfragmentar persistente nas não-uniões consiste

prioritariamente de uma zona uniforme de fibrocartilagem. Estruturas

vasculares e evidência de reciclagem ativa do tecido ósseo estão

presentes nas extremidades dos fragmentos, mas os canais

vasculares não são capazes de penetrar na fibrocartilagem não-

mineralizada. No estágio crônico da não-união, pode haver o

desenvolvimento de pseudoartrose no defeito ósseo, caracterizada

pela formação de membrana e líquido sinovial em torno de um falso

espaço articular na extremidade de cada fragmento que constitui o

foco da fratura (WOODARD e RISER, 1991).

25

Baseado nas suas características biológicas e tradução

radiográfica as não-uniões são classificadas em viáveis ou inviáveis

(WEBER & CECH, 1974).

As não-uniões viáveis ou hipertróficas ou “em pata de

elefante” possuem calo ósseo abundante hipervascularizado e,

frequentemente, estão relacionadas com fraturas que foram

desestabilizadas pela remoção prematura ou afrouxamento do

aparelho de fixação esquelética. As não-uniões viáveis levemente

hipertróficas ou “em casco de cavalo” possuem quantidade

inadequada de calo e se caracterizam por leve esclerose das

extremidades dos fragmentos. Estas não-uniões ocorrem em casos de

instabilidade rotacional moderada. As não-uniões viáveis

oligotróficas não possuem calo visível, mas ainda são capazes de

resposta biológica. Caracterizam-se pela presença de tecido fibroso

vascularizado entre os fragmentos, que têm extremidades

arredondadas e sofrem reabsorção progressiva. Estas não-uniões

ocorrem diante de grande deslocamento ou distração dos fragmentos

fraturados.

As não-uniões inviáveis distróficas possuem fragmentos

intermediários que consolidaram em relação a apenas um fragmento

principal. O fragmento intermediário, com deficiência de

vascularização, é incapaz de estimular resposta osteogênica

suficiente para que ocorra união com o segundo fragmento. As não-

26

uniões inviáveis necrosadas estão associadas a fraturas

cominutivas, nas quais grandes fragmentos estão avascularizados ou

deficientemente vascularizados, progredindo para necrose tecidual.

Os fragmentos necrosados não são incorporados aos calos de fratura.

As não-uniões inviáveis de defeito resultam da perda de

segmento significativo do osso no local fraturado. Por ocasião da

lesão, grandes fragmentos podem ter sido perdidos através das

feridas abertas. Os defeitos também podem resultar da reabsorção de

fragmentos necrosados ou da remoção ou excisão de fragmentos

durante a cirurgia. As não-uniões inviáveis atróficas são seqüelas

dos outros três tipos de não-união inviável. Há reabsorção óssea

significativa nas extremidades dos fragmentos, perda da

vascularização, ausência de atividade osteogênica e osteoporose

caracterizam estas não-uniões.

Em um estudo retrospectivo, ATIOLA e SUMNER (1984)

observaram que 3,4% de 2.825 fraturas em cães evoluíram para

não-união, sendo o rádio e a ulna os ossos mais afetados (40,6%),

seguidos pelo fêmur (38,5%), úmero (12,5%) e tíbia (4,2%). A

prevalência de não-união foi maior em cães entre 2-7 anos de idade

(49%) e cães que pesavam entre 7-14kg.

Cães das raças toy e miniatura podem apresentar variantes

anatômicas da vascularização óssea constituída por pequena

densidade vascular na junção diafisisária-metafisária distal do rádio,

27

(WELCH et al., 1997). Adicionalmente, a cobertura tecidual nesta

região, por ser muito pequena, fica susceptível a lesões mais

extensas após traumas (NUNAMAKER, 1985).

No exame clínico das não-uniões evidencia-se ampla mobilidade

no local fraturado sem dor à palpação ou apenas leve desconforto

(MILLIS & JACKSON, 2003). A atrofia muscular e a rigidez articular

são provavelmente seqüelas de desuso do membro, pois na maioria

dos casos, o membro afetado não sustenta o peso do animal (MILLIS

e JACKSON, 2003).

O diagnóstico da não-união deve ser baseado nos achados

radiográficos, característicos de cada tipo de não-união e na não

progressão da consolidação óssea durante pelo menos três meses,

com persistência da linha de fratura entre os fragmentos ósseos (La

VELLE, 1998). As características radiográficas mais freqüentes são

formação variável de calo periostal e endosteal, linha de

radiotransparência interfragmentar, esclerose e arredondamento das

extremidades dos fragmentos fraturados, tecido mineralizado

ocluindo a cavidade medular e pseudoartrose. Estes achados podem

ser confirmados por exames complementares tais como cintigrafia e

DEXA (dual energy x-ray absorptiometry) (MILLIS e JACKSON, 2003).

1.7 Tratamento da não-união óssea

Durante os últimos 20 anos foram desenvolvidas diversas

técnicas para o tratamento das não-uniões, incluindo procedimentos

28

invasivos (fixação interna e enxertia com osso ou com substitutos

ósseos) e procedimentos não invasivos (ultra-som e aplicação de

pulsos eletromagnéticos) (HERNIGOU et al., 2005). Entretanto, o

passo inicial no tratamento das não-uniões é a avaliação das

condições biológicas e mecânicas envolvidas na instalação da lesão.

Em seres humanos a definição da estratégia terapêutica deve levar

em consideração a localização, configuração e tipo (quando exposta)

da fratura, infecção ou manipulação cirúrgica prévias, alinhamento,

condição neuro-vascular do membro afetado e eventual perda óssea

(HERNIGOU et al., 2005).

A remoção do tecido fibroso através de curetagem, remoção de

tecido ósseo esclerótico das bordas dos fragmentos ósseos, abertura

do canal medular obstruído, estimulação da osteogênese e fixação

estável da fratura constitui o tratamento cirúrgico de escolha para as

não-uniões inviáveis (RODRIGUEZ-MERCHAN e FORRIOL, 2004;

PIERMATEI et. al., 2006).

Diversos tipos de enxertos ósseos podem ser utilizados no

tratamento das pseudoartroses em humanos a fim de estimular a

osteogênese. O enxerto de osso esponjoso autógeno é considerado o

padrão-ouro neste tipo de abordagem e, por isso, é comumente

utilizado em medicina humana e veterinária (GOULET et al., 1997;

MCLAUGHLIN, 1998; JOHNSON, 2002; BRAWLEY e SIMPSON, 2006).

Mesmo sendo clinicamente eficaz, o tempo cirúrgico e anestésico

adicional à coleta do enxerto, o aumento da morbidade pós-

29

operatória e escassez de osso esponjoso, principalmente observada

em pacientes pequenos, têm encorajado a pesquisa em busca de

substitutos para enxertos ósseos (GRIFFON, 1996; OONISH, 1997). A

dificuldade da coleta de enxerto ósseo autógeno em quantidades

satisfatórias é freqüente em cães de raças miniatura e toy e felinos,

muitas vezes requerem a exposição cirúrgica de múltiplas áreas de

coleta (DOREA et al. 2005).

O uso de enxerto alógeno elimina a morbidade associada com a

coleta do enxerto autógeno e reduz o tempo cirúrgico e anestésico.

Em cães, o enxerto de osso esponjoso alógeno congelado é

efetivamente incorporado quando usado no reparo de fraturas e em

artrodeses, aumentando a taxa de consolidação óssea por meio das

propriedades de osteoindução e osteocondução (KERWIN et al.,

1996). Entretanto, reação imunológica e transferência de doenças do

doador para o paciente recipiente são algumas das desvantagens que

podem ser observadas com o uso deste material (KERWIN et al.,

1996; MCLAUGHLIN e ROUSH, 1998).

Diversos enxertos ósseos sintéticos surgiram com a proposta de

eliminar a coleta de enxerto autógeno e evitar complicações

associadas com o uso de enxerto ósseo alógeno. Muitos materiais

têm sido investigados tanto em homens como em animais, mas até o

presente momento não há nenhuma evidência de que enxertos

ósseos sintéticos contribuam com fatores osteoindutores ou

osteogênicos. Ademais, o fato destes materiais apresentarem

30

somente osteocondução, torna-os menos eficientes na promoção da

consolidação óssea, quando comparados com enxertos alógenos e

principalmente com os enxertos autógenos (OONISHI, 1988;

WILSON, 1999; WHELLER, 2000; DOREA et al., 2005;).

Ainda com o intuito de evitar a morbidade associada à coleta do

enxerto de osso autógeno e de superar as limitações observadas com

o emprego dos enxertos de osso alógeno e sintético, procedimentos

minimamente invasivos como aplicação de concentrado de plaquetas

no foco de fratura (SLATER et al., 1995), uso de proteínas

morfogenéticas do osso (JONHSON et al., 1990; ZIMMERMANN et al.,

2006) e injeção percutânea de medula óssea total (CONNOLY et al.,

1989; GOEL et al. 2005), começam a ser considerados.

Atualmente, a comunidade científica tem mostrado um grande

interesse sobre a utilização terapia celular em ortopedia, dando

grande ênfase para o uso de células provenientes da medula óssea

com o objetivo de acelerar ou promover o reparo ósseo (HERNIGOU e

BEAUJEAN, 2002).

1.8 Uso terapêutico de células osteoprogenitoras

Há alguns anos a medula óssea total vem sendo usada como

coadjuvante no reparo ósseo a fim de acelerar este processo.

Adicionada a enxertos sintéticos (COLNOT et al., 2006), enxertos

ósseos alógenos (ASPENBERG et al., 1987) ou ainda injetada por via

percutânea no foco de fratura (JEAN et al., 1997; COLNOT et

31

al.,2006) a medula óssea introduz principalmente os componentes

osteogênicos e osteoindutores que promoverão a formação óssea.

Mais recentemente, pesquisas têm ressaltado a importância da

concentração de células da medula óssea para a eficácia da terapia.

HERNIGOU et al. (2005), tratou 60 pacientes que apresentavam não-

união na diáfise da tíbia com células mononucleares autólogas da

medula óssea, injetando-as por via percutânea no tecido fibroso

interfragmentar, no foco de não-união. O número de progenitores foi

avaliado através do ensaio de CFU-Fs. Os autores observaram

reversão da não-união e consolidação óssea em 53 casos, onde foi

injetado mais de 54.000 células progenitoras. Nos sete pacientes que

não responderam ao tratamento foram injetados em média 634

progenitores/cm3 e 19 CFU-Fs. Os autores atribuem a falta de

resposta destes pacientes ao baixo número de progenitores presentes

na medula óssea.

HERNIGOU e BEAUJEAN (2002) utilizaram a mesma abordagem

terapêutica para tratar osteonecrose de cabeça femoral e observaram

redução significativa da necessidade de artroplastia total de quadril

dez anos após o tratamento.

O conjunto das características das células mesenquimais

pluripotentes, em especial a facilidade com que podem ser isoladas

da medula óssea (PITTENGER et al., 1999), a possibilidade de se

obter, por expansão in vitro, um número elevado de células a partir

de volumes relativamente pequenos de medula óssea (JIANG et al.,

32

2002), a sua capacidade de diferenciação em tecidos músculo-

esqueléticos (SESHI et al., 2000), fazem com que o uso destas

células seja promissor para aplicações em bioengenharia ortopédica.

A utilização terapêutica das CTEs expandidas in vitro está sendo

explorada no reparo ou na regeneração de tecidos mesenquimais

lesionados e na consolidação de fraturas ósseas (MOUTSATSOS et al.,

2001), lesões tendinosas (AWAD et al., 1999) e cartilaginosas

(KADIYALA et al., 1997; QUINTAVALLA et al., 2002). Outra forma de

explorar o potencial biológico destas células é através da associação

com biomateriais reabsorvíveis de origem sintética. Utilizando-se esta

estratégia, que constitui a base da bioengenharia, lesões

consideradas intratáveis passam a ser passíveis de abordagem

terapêutica (BIANCO & ROBEY, 2001; CANCEDDA et al., 2003;

ROBEY & BIANCO, 2004).

33

1.9 Justificativa

Neste estudo clínico, células estromais provenientes da medula

óssea autóloga e expandidas in vitro foram injetadas por via

percutânea para tratar defeitos ósseos críticos e não-união de

fraturas em dez cães. A nossa hipótese foi avaliar se, ao prover o

foco de fratura com elementos celulares adicionais, estes seriam

capazes de promover ou acelerar a formação óssea.

Os cães foram selecionados a partir da constatação radiográfica

de não consolidação óssea, três meses após o tratamento cirúrgico ou

conservador primário de fraturas ocasionadas por traumas diversos.

Considerando-se que as propostas de tratamento para defeitos

ósseos críticos e não-união de fraturas em cães são em geral muito

invasivas (acesso cirúrgico do foco de fratura, remoção do tecido

fibroso interfragmentar e a adição de material osteogênico e/ou

osteoindutor) tem sido observado um significativo aumento da

morbidade pós-operatória, especialmente em cães de raças

pequenas. A injeção percutânea de células osteoprogenitoras em

focos fratura, com a finalidade de estimular a consolidação óssea,

reduz a morbidade associada aos procedimentos cirúrgicos

convencionais e para o proprietário acarreta em substancial redução

de custos e cuidados.

A análise dos resultados deste estudo permitirá avaliar os

benefícios, vantagens e desvantagens da aplicação da terapia com

34

células estromais da medula óssea autóloga na prática clínica

veterinária.

35

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Este estudo tem como objetivo avaliar o reparo de não-união

e de defeitos ósseos segmentares em cães utilizando células

estromais de medula óssea autóloga expandidas in-vitro e

injetadas na lesão por via percutânea.

2.2 Objetivos específicos

Estabelecer protocolo de expansão in vitro de células

estromais da medula óssea canina.

Avaliar o número de CFU-Fs na medula óssea canina.

Avaliar o fenótipo das células estromais da medula óssea

canina por imunohistoquímica e PCR-RT das células

estromais expandidas in vitro.

Avaliar por exames radiográficos (formação de calo ósseo nas

não-uniões e reconstrução óssea das lesões críticas),

sessenta dias apos ao tratamento.

36

3. METODOLOGIA

3.1 Animais

Foram utilizados neste estudo cinco cães machos e cinco

fêmeas das raças Poodle (n=2), Pinscher (n=4), Bichon Frisé

(n=1) e sem raça definida (n=3), pesando entre dois e 18kg,

procedentes de clínicas veterinárias particulares do estado do Rio

de Janeiro. Os animais apresentavam não-união óssea (n=6) ou

defeito ósseo segmentar (n=4) comprovado clínica e

radiograficamente. O consentimento do proprietário e a

aprovação pelo Comitê de Ética da Universidade Estadual do

Norte Fluminense (protocolo número 25) foram obtidos antes do

tratamento dos animais.

O diagnóstico de não-união foi feito baseado na ausência de

sinais radiográficos de progressão de consolidação óssea e

persistência do espaço interfragmentar três meses após a

realização de osteossíntese para o tratamento da fratura. As não

uniões foram classificadas em viáveis, quando havia formação

de calo, mas sem formação de ponte óssea entre os fragmentos

e não viáveis caracterizadas por esclerose e reabsorção óssea

sem formação de calo. Foram considerados defeitos

segmentares ou defeitos de tamanho crítico quando o

37

afastamento entre os fragmentos ósseos era maior do que

200mm.

Seis animais eram portadores de não-união óssea em rádio e

ulna (n=5) ou em tíbia (n=1) e quatro animais apresentavam

defeito ósseo segmentar no fêmur (n=1), metatarso (n=1) ou no

rádio e ulna (n=2). Todos os animais do estudo realizaram perfil

hematológico, que incluiu hemograma completo, contagem de

plaquetas, pesquisa de hematozoários e proteínas totais,

bioquímica sérica (uréia, creatinina e enzimas hepáticas). Todos

os animais apresentavam vacinação e vermifugação nos prazos

de validade.

3.2 Coleta de medula óssea

As regiões do trocanter maior do fêmur e do tubérculo maior

do úmero, contralaterais à lesão óssea, foram preparadas para

um procedimento cirúrgico asséptico. Com os animais sob efeito

de anestesia geral (Propofol 6mg/kg) foi feita uma incisão da

pele para introdução da trefina (Jamishidi gauge 13), através da

cortical, até atingir o osso esponjoso da metáfise (Figuras 1A e

B). A aspiração da medula foi feita lentamente em seringas de

5mL rinsadas com solução de heparina na concentração de 1000

UI/mL, em alíquotas individuais de 4mL. A cada troca de seringa,

a agulha era reposicionada na metáfise para reduzir a diluição do

aspirado com sangue. Foram coletados 2mL/Kg de medula

38

óssea, de cada paciente, baseados nos valores de referência

para humanos (HERNIGOU et al., 2005). As amostras foram

armazenadas em 4oC por no máximo 16 horas antes do

processamento laboratorial. Após a retirada da trefina com

movimentos circulares foi feita a síntese da incisão de pele com

material de sutura não absorvível em padrão interrompido

simples. Os animais receberam medicação antiinflamatória

(Cetoprofeno 1mg/kg/dia) e antibiótico (Cefalexina 10mg/kg,

12/12h) durante 5 e 7 dias respectivamente.

3.3 Isolamento e expansão das células estromais autólogas

Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados no

Centro de Terapia Celular e Bioengenharia Ortopédica (CTCel) do

Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia (INTO), Rio de

Janeiro, RJ. O protocolo de isolamento e expansão foi baseado

Figura 1 – (A) - Trefina Jamishid gauge 13. (B) – Animal posicionado

em decúbito lateral para obtenção do aspirado de medula em alíquotas individuais de 4ml.

39

no estudo previamente descrito em ovelhas (FERNANDES et al.,

2007).

O aspirado de medula foi transferido para um tubo tipo

Falcon de 50mL, em meio de cultura Dulbelco’s Modified Eagle

Medium (DMEM - Sigma), no mesmo volume do aspirado de

medula e centrifugado a 600g, em temperatura ambiente por 5

minutos. As células autólogas foram ressuspendidas em DMEM e

homogenizadas sucessivamente, seguido de centrifugação a

800g, em temperatura ambiente por 5 minutos. Este processo

foi repetido 3 vezes. No final da terceira lavagem, as células

autólogas eram ressuspendidas em 10 mL de DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), penicilina

(100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/mL). Uma alíquota desta

suspensão foi utilizada para quantificação em câmara de

Neubauer, pelo método de lise de hemácias, através da adição

da solução hemolítica de ácido acético 2% e cristal violeta 0,1%,

na proporção de 1:100. As células foram plaqueadas na

densidade de 4-6x105/cm2 em DMEM suplementado com 10%

SFB, penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml). O

meio foi substituído após 24 horas e a cada dois dias (Figura 2).

A cada troca de meio, as células não aderentes, presentes no

sobrenadante, eram removidas através da lavagem sucessiva

das culturas com solução tampão (Balanced Salt Solution.

Calcium and Magnesium Free - BSS.CMF).

40

Figura 2 - Esquema ilustrando as etapas do processo de isolamento

celular.

Após atingir confluência (cerca de duas semanas), as células

autólogas foram tripsinizadas e ressuspensas em DMEM não

suplementado e quantificadas. Após centrifugação as células

foram ressuspendidas em 0.5-4ml de DMEM 10% SFB. A

suspensão celular foi acondicionada em criotubo e preservada a

4º C até o momento do uso, que ocorreu em no máximo três

horas. As células obtidas na passagem 0 foram replaqueadas e

as obtidas na passagem 1 foram utilizadas na terapia celular.

3.4 Caracterização morfo-funcional e molecular das células

estromais da medula óssea

A. Identificação de Unidades Formadoras de Colônias (CFU-Fs).

Para a quantificação de progenitores mesenquimais presente

na suspensão celular foi realizado o ensaio para identificação de

CFU-Fs, onde as células, provenientes da medula óssea total, no

41

dia da coleta, foram plaqueadas na densidade de 1 x 106 células

por 25 cm2 em DMEM 10% SFB, penicilina (100 UI/ml) e

estreptomicina (0,1 mg/ml). O meio foi trocado após 3 dias e as

células foram mantidas por mais 7 dias sem trocas adicionais.

Após esse período, as culturas foram fixadas com metanol 100%

e coradas com Cristal Violeta 1% overnight para contagem de

colônias ao microscópio óptico de campo claro. Foram incluídas

na contagem apenas as colônias com 50 ou mais células.

B. Imunocitoquímica

A caracterização fenotípica foi feita através do plaqueamento de

1x104 células provenientes da passagem 0 em lamínulas de vidro

de 3cm2 mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de soro

fetal bovino e penicilina (100 UI/ml) e estreptomicina (0,1 mg/ml)

até atingir semi-confluência. As células foram fixadas com

paraformaldeído a 4% por 30 minutos e permeabilizadas com

Triton-X 100 0,5% por 20 minutos. Após cada um destes

processos, fixação e permeabilização, as culturas eram lavadas

abundantemente com PBS e PBS-tween20 0,1%, respectivamente.

O bloqueio das ligações inespecíficas foi feito com PBS–BSA 5%

(Bovine Serum Albumin, Sigma) por 1 hora. Os anticorpos

primários foram diluídos em PBS nas concentrações descritas na

tabela 1 e incubados overnight em câmara úmida. Em seguida, as

células receberam o anticorpo secundário biotinilado, diluído em

42

PBS, anti-camundongo IgG FITC (1:30, Sigma F-2266), por 30

minutos, seguido de incubação com Streptavidina Cy3 (Sigma

S6402) diluída 1:800 em PBS, por 30 minutos. As células autólogas

foram coradas para marcação dos núcleos com DAPI diluído 1:1000

em água destilada por 5 minutos e as lamínulas montadas com

vectashield para observação através de microscopia de

fluorescência.

Os ensaios imunocitoquímicos foram feitos para detectar a

expressão de -actina de músculo liso, colágeno tipo I, biglicana,

vimentina, fibronectina, sialoproteína óssea (BSP), decorina e

osteopontina.

Tabela 1: Anticorpos, fabricantes e diluições

1. Colágeno I (Novotec 20151) 1:300 5. Osteopontina 1:400 *

2. Fibronectina (Novotec 24951) 1:100 6. Sialo Proteína Óssea – BSP 1:400 *

3. Vimentina (Dako M0725) 1:100 7. Biglicana 1:500 *

4. α Actina Músculo Liso (Dako M0851) 1:50

8. Decorina 1:450 *

* Anticorpos cedidos por L. W. Fisher (Craniofacial and Skeletal Diseases

Branch, NIDCR, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados

Unidos)

C. PCR-RT (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

Foram coletadas amostras das células na passagem 1 do

cultivo expansivo de cada animal. Como controle positivo foi

utilizado o RNA de osteoblastos (MOREIRA e cols., 2004). O RNA

foi isolado de acordo com o protocolo do Trizol (Invitrogen). As

43

amostras de RNA foram resuspendidas em 10 μL de água com

dietil-pirocarbonato (DEPC - Sigma), e diluídas 1:300 em

água/DEPC para a quantificação por espectrofotometria em

valores de absorbância (A) a 260 nm (DNA e RNA) e 280 nm

(proteínas). A concentração de RNA foi calculada através do

valor de leitura a A260 x 40 x fator de diluição (300) = mg/mL de

RNA. A qualidade foi avaliada pela razão A260/A280. Considerou-se

aceitável um valor de DO A260/280 entre 1,6 a 1,8 do RNA

(SAMBROOK e GETHING, 1989).

Na síntese do DNA complementar (cDNA) foram utilizados

2 μg do RNA total de cada amostra acrescidos de 25 mM de

desoxirribonucleotideos (dNTPs), com quantidades equivalentes

de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Invitrogen); 0.1 M de ditiotreitol

(DTT- Invitrogen); 100 pM de random primer (Invitrogen)); 200

g/ L da enzima transcriptase reversa Monoley Murine Leukemia

Virus Reverse Transcriptase (M-MLV - Invitrogen). As misturas

foram mantidas à temperatura ambiente por 10 minutos,

seguidas de incubação a 42°C por 40 minutos. As reações foram

aquecidas a 65°C por 5 minutos e armazenadas à -200C.

A presença dos transcritos de -actina, Cbfa-1, colágeno tipo

I, osteonectina e fosfatase alcalina foram testadas por RT-PCR

(Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction). A

amplificação do transcrito de -actina foi utilizado como controle

interno da síntese de cDNA devido sua expressão constitutiva

44

nas CTEs (RICKARD et al, 1996). O controle positivo foi

previamente padronizado para todos os genes estudados.

Foram feitas reações para amostras de cDNA da passagem 1

de cada animal. Em cada reação foi adicionado 2 L de cDNA,

100pM/µL de cada oligonucleotídio (Gene Link), 50 mM de

cloreto de magnésio (MgCl2-Invitrogen), 25 mM de cada dNTPs;

500 mM de cloreto de potássio (KCl- Invitrogen), 1,5 unidades

da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen) e 2,5 L do iniciador

1 (sense) e do iniciador 2 (antisense) (Tabela 2). Também

foram feitas reações para o controle negativo de cada uma das

etapas de análise molecular (extração de RNA, confecção de

cDNA e RT-PCR).

Os tubos contendo as reações foram pré-aquecidos no

termociclador PTC DNA EngineTM Systems a 98 C por 60 segundos,

seguido por um ciclo de 30 segundos a 96 C, 30 ciclos a 96 C por 30

segundos, outro ciclo com a temperatura de anelamento para cada

primer por 45 segundos (tabela 2), 1 ciclo de 72 C por 60 segundos,

outro na mesma temperatura de 72 C por 5 minutos e por fim 4 C

até o momento da análise do gel por eletroforese. As condições

experimentais para amplificação de cada produto por PCR-RT estão

descritos na tabela 2. Os produtos da amplificação foram

visualizados em géis de agarose (1,4%) corados com brometo de

etídio (0,2 g/mL- Sigma), após eletroforese em tampão TAE

45

(Tampão Tris Acetato EDTA) a 8,0 V/cm, por aproximadamente 90

minutos.

Tabela 2: Condições Experimentais para a Amplificação por RT-PCR

GENE Iniciadores Seqüência 5’/3’ TM Fragmento (pb)

Actina sense

antisense gtcttcacaaatcctccc caatcaaagtcctcggc

53ºC 629(C)*/573(H)**

Cbfa-1 sense

antisense

gtcttcacaaatcctccc

tggattaaaaggacttggtg 52ºC 231(C)*

Colágeno 1 sense

antisense

ggcttaaagggacacaatgg

tctggtggctgagtctc 55ºC 455(C)*

Fosfatase

Alcalina

sense

antisense

aggcttcttcttgctggt

cctggtagttgttgtgagc 53ºC 353(C)*

Osteonectina sense

antisense

gcctggatcttctttctc

gtcagaaggttgttgtcc 52ºC 560(C)*

* amostra canina, **amostra humana utilizada como controle da reação.

3.5 Injeção da suspensão celular

Com os animais sob efeito de anestesia geral, o membro

acometido pela lesão óssea foi preparado para procedimento

asséptico. O protocolo anestésico foi o mesmo utilizado para a

coleta do aspirado de medula óssea. Após o preparo do campo

cirúrgico, foi inserida uma agulha hipodérmica (18x24) entre os

fragmentos da fratura. A confirmação do posicionamento da

agulha na lesão foi obtida através de exame radiográfico simples

ou por fluoroscopia. Antes da injeção, a suspensão de células foi

homogenizada através de agitação manual, o conteúdo do tubo

foi transferido para uma seringa de 10 ml e injetado na fibrose

contida no espaço interfragmentar da fratura, em diversos

ângulos para tentar preencher todo o perímetro do defeito ósseo.

Os animais receberam antiinflamatório (Cetoprofeno 1mg/kg,dia)

46

e antibiótico (Cefalexina 10mg/kg, 12/12h) durante 5 e 15 dias

respectivamente. A avaliação radiográfica ocorreu após 60 dias

da injeção.

3.6 Avaliação radiográfica

O reparo do tecido ósseo foi avaliado e quantificado, de

acordo com os seguintes parâmetros, no dia da aplicação das

células e após oito semanas:

Tamanho do defeito ósseo

Medido com um cáliper nas radiografias realizadas nos dois

momentos (no dia da injeção e após oito semanas) e expresso

em milímetros (mm).

Reação de tecidos adjacentes

Investigação de alterações radiográficas tais como aumento

de densidade tecidual e presença de ar nos tecidos adjacentes

ao defeito ósseo onde as células estromais da medula óssea

foram injetadas. As alterações, quando presentes, foram

graduadas em função da sua intensidade, em ausente (0),

moderada (1) e intensa (2).

3.7 Avaliação clínica

O exame clínico do membro afetado foi feito no dia da

injeção das células estromais da medula óssea, diariamente

durante os cinco primeiros dias após a injeção e na quarta e na

47

oitava semana, após a terapia celular. Foram avaliados

parâmetros como dor à palpação, presença de edema da região

tratada e grau de atividade e retorno das funções do membro.

Para a avaliação da claudicação, foi utilizado o sistema de

HAZEWINKEL E MEUTSTEGE (1990) onde: ausência de

claudicação = zero; locomoção discretamente alterada = 1;

locomoção alterada, mas ainda mantendo apoio no membro = 2;

claudicação com apoio intermitente do membro = 3; ausência de

apoio no membro = 4.

3.3.8 Análise estatística

Os resultados foram apresentados sob a forma de média ±

desvio padrão, e o nível de significância foi estabelecido em

p<0,05. As variáveis relacionadas aos resultados da terapia

foram: o sucesso do tratamento, observado clinicamente através

do retorno das funções do membro acometido e volume do calo

ósseo no período de 2 meses, avaliado radiograficamente

através da mensuração com caliper, do tamanho do espaço

interfragmentar no dia da terapia celular e dois meses depois. A

correlação entre as variáveis relacionadas aos resultados da

terapia celular e os fatores terapêuticos como número de células

da medula total, número de CFU-Fs, número de células

plaqueadas e número de células injetadas foi feito através do

teste T. Como variáveis do paciente e da fratura foram incluídos

48

fatores como idade e sexo do animal, tempo de lesão, número

de cirurgias prévias e tamanho do defeito.

49

4. Resultados

4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS PACIENTES

Dez cães, apresentando não-união de fratura ou defeito ósseo

segmentar, foram tratados com células estromais autólogas de

medula óssea expandidas in vitro. Todos os animais apresentavam

maturidade esquelética, sendo classificadas como adultos jovens

(n=9) com até seis anos de idade, ou idoso (n=1) com idade superior

a seis anos.

Os ossos mais acometidos pela não-união e reabsorção óssea

foram o rádio e ulna, seguido da tíbia, fêmur e metatarso. Seis

animais apresentavam lesão óssea há pelo menos 12 meses e os

demais apresentavam evolução superior a um ano. Os pacientes

foram tratados antes da terapia celular com fixador externo (n=3),

placas e parafusos (n=3), pinos intramedular (n=1) ou coaptação

externa (n=3). No momento da injeção da suspensão celular, todos

os animais apresentavam algum grau de instabilidade no foco de

fratura.

O tamanho dos defeitos variou entre 1-20mm nos animais com

não-união e entre 22-100mm nos animais com defeito segmentar. Na

Tabela 3 estão resumidas as principais características clínicas dos

pacientes.

50

Tabela 3 - Caracterização individual dos pacientes, das lesões ósseas e do

tratamento instituído antes da injeção celular. Animal Raça Sexo/Idade

/Peso

Tipo de Lesão / Tamanho Evolução

(meses)

Método de

Estabilização

1

Pinscher

M /5 anos /3kg

Não união radio/ulna

distal / 1mm

12

2.0 mini placa

2

Pinscher

M /5 anos /3kg


distal / 1mm

12

2.0 mini placa

3

Pinscher

M /1 ano /2kg


distal / 3mm

8

Pino

intramedular

4

SRD

M/3 anos/18kg


distal / 20mm

18

Coaptação

externa

(tala spoon)

5

Bichon Frise

F /5 anos /5kg

Defeito segmentar

radio/ulna terço médio /

100mm

48

Fixador externo

6

SRD

F/3 anos /17kg

Defeito segmentar

metatarso terço médio /

22mm

10

Fixador externo

7

Poodle

F/4 anos /12kg

Defeito segmentar fêmur

terço médio / 70mm

6

Fixador externo

8

Poodle

F /2 anos /5kg

Não união tíbia terço

médio / 20mm

6

Coaptação

externa (muleta

Thomas)

9

Pinscher

F /9 anos /4kg

Defeito segmentar radio /

ulna distal / 24 mm

24

Coaptação

externa

(tala spoon)

10

Poodle

M /4 anos /6kg


terço médio / 2mm

48

2.0 mini placa

SRD=Sem Raça Definida; M=macho; F=fêmea

O resultado dos exames complementares (hemograma

completo, função renal e hepática) realizados antes do ingresso dos

animais no estudo estão discriminados na Tabela 4. A faixa de

valores normais de referência para cães consta do Anexo 2.

51

Tabela 4 – Valores médios dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

obtidos antes do inicio dos experimentos.

HEMOGRAMA

BIOQUIMICA

Hematócrito

(%)

44,1±6,43

Leucócitos

(x103/µl)

8±3,12

Uréia

(UI/L)

34,3±9,6

Hemácias

(x106/ L)

6,44±0,90

Basófilos

(x103/µl)

0.7±1,05

Creatinina

(UI/L)

0,73±1,18

Hemoglobina

(g/dL)

15,4±3,16

Eosinófilos

(x103/µl)

4±2,58

AST

(mg/dL)

8,4±2,4

VCM

(fL)

67,9±5,58

Bastoes,

Mielócitos,

Metamielócitos

(x103/µl)

0

ALT

(mg/dL)

9,8±4,8

HCM

(g/dL)

22,22±1,51

Segmentados

(x103/µl)

67,5±5,4

CHCM

(g/dL)

33,3±2,26

Linfócitos

(x103/µl)

17,1±5,17

Plaquetas

(x103/µl)

337,8±64,41

Monócitos

(x103/µl)

5,5±2,36

Todos os valores estão expressos sob a forma de média DP. VCM=Volume

corpuscular médio; HCM= Hemoglobina corpuscular média; CHCM= Concentração de hemoglobina corpuscular média; AST= Aspartato

aminotransferase; ALT= Alanina aminotransferase.

4.2 COLETA DA MEDULA ÓSSEA

Nenhuma complicação anestésica ou clínica foi observada

durante ou após a coleta de medula óssea, com recuperação

satisfatória de todos os animais no pós-operatório imediato. A

sutura no local da punção foi removida sete dias após o procedimento

e nenhum dos cães apresentou infecção ou dor locais. Todos se

mantiveram ativos, e sem limitações aparentes das atividades

habituais.

52

4.3 ISOLAMENTO E EXPANSÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS

Os valores individuais do volume total de aspirado de medula

óssea, quantidade de células nucleadas isoladas da medula óssea

total, número de CFU-F, número de células obtidas nas passagens 0 e

1, número total de células injetadas e volume da suspensão injetada

estão descriminados nas Tabelas 5 e 6. Em todos os animais a

viabilidade celular da suspensão injetada na lesão foi maior do que

95%.

Tabela 5 – Valores individuais do volume total de aspirado medular,

da quantidade de células isoladas da medula total e o número de

CFU-Fs.

Animal Volume total

de aspirado

(mL)

Número células

(/mL medula

total)

Número de CFU-

Fs (/milhão

células

nucleadas)

1 8,0 3,1x107 21,2±0,89

2 8,0 3,1x107 21,2±0,89

3 4,0 3,02x107 18,8±0.97

4 10,0 7x107 22±4,77

5 7,0 6,4x107 23±1,6

6 40,0 2,7x107 24±1,41

7 10,0 1,3x107 24,8±3,16

8 10,0 1,1x107 23,2±2,05

9 8,0 4,5x107 21,4±1,78

10 10,0 2,8x107 23,6±1,30

53

Tabela 6 – Valores individuais do número de células obtidas nas

passagens 0 e 1, do número total de células e volume da suspensão injetada nas lesões.

Anima

l

Número

células P0

Número

células P1

Número de

células

injetadas

Volume

injetado

(mL)

1 2,36x107 2x107 2x107 0,5

2 2,36x107 2x107 2x107 0,5

3 1,7x107 2,7x108 2x107 0,5

4 3x107 1,8x107 1,8x107 1,0

5 5x107 8,3x107 2,5x107 4,0

6 1,49x107 3x107 2x107 2,0

7 3x107 4,5x107 2,5x107 2,0

8 6,4 x107 7,2x107 2x107 2,0

9 3x107 4,8x107 2x107 0,5

10 3,2x107 4x107 2x107 0,5

54

A quantificação das células totais da medula óssea, feita em

câmara de Neubauer pelo método de lise de hemácias através da

adição de ácido acético 2%, evidenciou 1,1x107-6,4x107 células

nucleadas por mL de medula total. Após a primeira expansão (P0), ao

atingir a confluência, o número de células variou entre 1,7x107-

6,4x107 células e na segunda expansão (P1), também ao atingir a

confluência o número de células variou entre 1,8x107- 2,7x108

células. Em todas as culturas, as células apresentavam morfologia

fibroblastóide (Figura 3).

Figura 3: Fotomicrografias das culturas celulares. (A) - Após 24 horas de cultivo, as

células encontram-se aderidas, em torno de clusters hematopoéticos. (B) - Após 72 horas em cultura as células tem morfologia fibroblastóide. (C) – CFU-Fs formadas 7 dias após

plaqueamento em baixa densidade. (D) - Confluência das colônias. Barra: 100µm.

A quantidade das células injetadas nas lesões foi padronizada

para um total de 2x107-2.5x107 e injetadas em 0,5-4ml de DMEM não

suplementado. Apenas o animal 4 não alcançou o número mínimo de

2x107. Neste animal foram utilizadas todas as células obtidas após a

segunda expansão (1,8x107 células).

55

4.1.4 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS DA MEDULA

ÓSSEA

4.1.4.1. Unidades Formadoras de Colônias (CFU-Fs)

O número de CFU-Fs com mais de 50 células variou entre

18,8±0,97-24,8±3,16 (média 22.42±1.54) (Figura 4).

Não houve diferença estatisticamente significativa no número

de CFU-Fs em relação ao sexo, idade, localização e tamanho da lesão,

tempo de evolução e método de fixação (p>0.05 em todas as

comparações). Quanto a raça dos animais, observou-se que os

animais da raça Pinscher apresentaram um menor número de CFU-Fs

(20.9±0.73) tanto em relação aos animais da raça Poodle

(23.23±0.30, p<0,005) quanto em relação aos animais SRD

(23.6±1.44, p<0.005).

4.4.2. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica

Não houve diferença estatisticamente significativa no número

de CFU-Fs entre os animais do sexo feminino e masculino (p>0,05).

A correlação entre número de CFU-Fs e a idade dos animais também

não mostrou significância estatística (p>0,05). Quanto a raça,

Figura 4: Observação das unidades

formadoras de colônia – fibroblásticas (CFU-Fs) no animal 3.

56

observou-se que os animais da raça Pinscher apresentaram um

menor número de CFU-Fs (20.9±0.73) tanto em relação aos animais

da raça Poodle (23.23±0.30, p<0,005) quanto em relação aos

animais SRD (23.6±1.44, p<0.005).

4.1.4.2. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica

As células estromais de todos os animais expressaram

moléculas características do comprometimento celular com as

linhagens miofibroblástica ( -actina de músculo liso, colágeno tipo I,

biglicana, vimentina, fibronectina) ou osteoprogenitora (colágeno I,

osteopontina, sialoproteína óssea, biglicana e decorina). Quanto ao

padrão de marcação (Figura 5), observamos que as moléculas

apresentavam certas peculiaridades, comum a todos os animais, tais

como: expressão sob a forma de fibras de estresse da -actina de

músculo liso (Fig. 5A), expressão intra e extra-celular da fibronectina

(Fig. 5C), distribuição prioritária da biglicana na região perinuclear e

em células em divisão mitótica (Fig. 5D), expressão de osteopontina

exclusiva na região perinuclear possivelmente indicando glicosilação

no aparelho de Golgi (Fig. 5E), expressão de colágeno tipo I na

região perinuclear (Fig. 5F) e expressão de decorina e vimentina

sob a forma de fibras dispostas homogeneamente no citoplasma

(Figs. 5G e 5H).

57

Figura 5. Caracterização fenotípica por imunocitoquímica das células estromais caninas após a primeira expansão in vitro. (A) - α-actina

de músculo liso. (B) - Sialoproteína óssea. (C) - Fibronectina. (D) -

Biglicana. (E) Osteopontina. (F) Colágeno tipo I. (G) - Decorina. (H)

- Vimentina Barra: 15μm.

4.1.4.3. Caracterização fenotípica por RT-PCR

As análises por RT-PCR foram realizadas nas células após a

segunda expansão in vitro (P1). O padrão de expressão dos genes ß-

actina, Cbfa-1, colágeno I e osteonectina não diferiu entre os

animais. A expressão da fosfatase alcalina encontrava-se reduzida

nas amostras 1, 5 e 7 e foi semelhante nas demais amostras (2, 3, 4,

6, 8, 9, 10) (Figura 6).

58

Cabe ressaltar que o pequeno desnível na localização da banda

referente à expressão da ß-actina entre o controle positivo e as

amostras foi devido ao tamanho diferente do produto amplificado. O

controle positivo, de origem humana, apresentava 573 pares de base

enquanto que as amostras de origem canina apresentam 629 pares

de base.

4.5 Injeção da suspensão celular

Nenhum tipo de complicação sistêmica (anestésica ou

hemodinâmica) ou local foi observada em decorrência da injeção da

suspensão celular.

Figura 6. Detecção da expressão por RT-PCR dos genes ß-

actina, Cbfa-1, colágeno I, osteonectina e fosfatase alcalina pelas células estromais caninas após a segunda expansão in vitro (P1). PM = peso molecular 100 pb e C+ = controle positivo.

59

A comprovação do posicionamento da agulha hipodérmica na

fibrose interfragmentar foi obtida através de radiografias simples em

nove pacientes e por fluoroscopia em um animal (Figura 7).

A injeção da suspensão celular foi feita lentamente,

procurando-se vencer gradualmente a resistência à entrada do líquido

no local da lesão. Entretanto, observamos em todos os animais que

sempre ocorria um pequeno retorno e extravasamento da suspensão

celular no trajeto da agulha.

Os animais foram totalmente liberados para suas atividades

habituais após 60 dias.

Figura 7 – Posicionamento da agulha para injeção da suspensão celular no espaço interfragmentar (animal 1) – (seta).

60

4.6 Avaliação radiográfica

4.6.1 – Animal 1 (Figura 10)

Fratura de rádio e ulna distal após um ano de evolução e

tratamento prévio com três procedimentos cirúrgicos para

estabilização do foco de fratura (fixação com placa). O diagnóstico de

não-união oligotrófica no rádio foi feito 12 meses após a fratura,

baseado na persistência de linha radiotransparente medindo 1mm

(Fig.10A). Sessenta dias após a injeção da suspensão celular,

observou-se consolidação radiográfica da fratura do rádio,

diagnosticada pelo desaparecimento da linha de radiotransparência

(Fig.10B). Não houve alteração no aspecto da ulna nos dois exames

radiográficos realizados respectivamente antes e depois do

tratamento com as células.

Figura 10. Animal 1. (A) - Não-

união de fratura distal de rádio e ulna, com evolução de 1 ano.

Espessamento cortico-endosteal do rádio e extensa reabsorção da ulna

– seta preta. (B) - Sessenta dias após o tratamento com a suspensão

celular observa-se consolidação da fratura do rádio – seta branca. A

perda óssea ulnar manteve-se inalterada.

61


Fratura de rádio e ulna distal após um ano de evolução e

tratamento prévio com dois procedimentos cirúrgicos para

estabilização do foco de fratura (fixação com placa). No exame

radiográfico realizado antes da injeção da suspensão celular observa-

se no foco de não-união oligotrófica do rádio arredondamento das

bordas dos fragmentos ósseos. Na ulna o traço de fratura permanece

evidente (Fig. 11C). Sessenta dias após a injeção da solução celular

podemos observar formação de ponte óssea entre os fragmentos

proximais e distais do rádio e da ulna. A formação de calo ósseo em

fase de remodelação, confirma a consolidação óssea nos dois sítios de

não-união (Fig. 11D).

Figura 11. Animal 2. (A) - Não-união de fratura distal de

rádio e ulna, com evolução de 1 ano associada a falência dos

implantes metálicos e instabilidade do foco de fratura

(seta). (B) - Sessenta dias após

o tratamento com a suspensão celular observa-se consolidação

das fraturas do rádio e da ulna (seta).

62


Fratura de rádio e ulna distal após oito meses de evolução e

tratamento prévio com quatro procedimentos cirúrgicos para

estabilização do foco de fratura, optando-se pela fixação com pino

intramedular. O diagnóstico de não-união oligotrófica foi feito com

base na ausência de formação de calo ósseo e persistência de espaço

interfragmentar de 3mm, arredondamento das bordas dos

fragmentos ósseos e evidente instabilidade rotacional no foco de

fratura (Fig. 12A). Dois meses após a terapia celular observa-se

consolidação óssea nos dois sítios de não-união (Figura 12B).

Figura 12. Animal 3. (A) -

Não-união de fratura distal de rádio e ulna, com

evolução de 8 meses, sem sinais de formação de calo

ósseo. O pino intramedular encontra-se alojado na

articulação do carpo e é evidente a instabilidade

rotacional no foco de

fratura (seta preta). (B) – Dois meses após o

tratamento com a suspensão celular observa-

se consolidação das fraturas do rádio e da ulna

(seta branca).

63


Fratura de rádio e ulna distal, inicialmente exposta, com 18

meses de evolução, tratamento prévio com dois procedimentos

cirúrgicos e atualmente em tratamento conservador para

estabilização do foco de fratura (tala). O diagnóstico de não-união

viável atrófica foi feito baseado na ausência de calo ósseo com

manutenção de um espaço interfragmentar de 20mm (Fig. 13A).

Dois meses após a terapia celular, os fragmentos ósseos

encontravam-se sobrepostos, possivelmente em decorrência da

mobilidade no foco de fratura, não se observando qualquer evidência

de consolidação e reparo ósseo no foco de não-união (Fig. 13B).

Figura 13. Animal 4. (A) - Não-união viável

atrófica de fratura distal de rádio e ulna, com

evolução de 18 meses, estabilizada com tala e

sem sinais de infecção

(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento

com a suspensão celular não se evidencia sinais

radiográficos de consolidação óssea, com

permanência da não-união (seta).

64


Fratura do terço médio do rádio e da ulna, com 48 meses de

evolução e tratamento prévio com diversos procedimentos cirúrgicos

(pino intramedular, placa e parafusos e enxerto ósseo autólogo) e

atualmente estabilizada com fixador externo. O diagnóstico de não

união de defeito foi feito baseado no tamanho da falha óssea

(100mm) decorrente da extensa reabsorção óssea (Fig. 14A). Dois

meses após a terapia celular, houve redução de 3mm do espaço

interfragmentar, alterando pouco o aspecto radiográfico inicial do

defeito (Fig. 14B).

A B

Figura 14. Animal 5. (A) – Defeito crítico do

terço médio do rádio e ulna com 100mm e

evolução de 48 meses,

estabilizado com fixador externo (seta). (B) –

Sessenta dias após o tratamento com a

suspensão celular houve uma redução mínima

(3mm) no tamanho da falha óssea e

permanência de um

defeito de grande dimensão (seta).

65


Fratura transversa do terço médio do metatarso, com 10 meses

de evolução, tratada desde a sua instalação com fixador externo. O

diagnóstico de defeito ósseo foi feito baseado na presença de

reabsorção óssea que gerou um afastamento de 22mm entre os

fragmentos ósseos (Fig. 15A). Dois meses após a terapia celular,

observamos consolidação total do segundo metatarso e parcial do

primeiro osso metatarsiano, e sindesmose entre o quarto e quinto

metatarsos (Fig. 15B).

Figura 15. Animal 6. (A) –

Defeito crítico do terço médio do metatarso, com 22mm e

evolução de 10 meses, estabilizado com fixador

externo. As bordas dos fragmentos ósseos são

arredondadas e a instabilidade

no foco de fratura pode ser confirmada pela presença de

zona de radiotransparência em torno dos pinos (seta). (B) –

Sessenta dias após o tratamento com a suspensão

celular observa-se consolidação completa do segundo

metatarso e reparo parcial do

primeiro metatarso, além de sindesmose entre o quarto e

quinto metatarsos (seta).

66


Fratura transversa do terço médio do fêmur, com 6 meses de

evolução, tratamento prévio com dois procedimentos cirúrgicos e

atualmente tratado com fixador externo para estabilização do foco de

fratura. O diagnóstico da não-união óssea foi feito com base na falta

de formação de calo ósseo e na extensa reabsorção óssea que gerou

um afastamento de 70mm entre os fragmentos no foco de fratura

(Fig. 16A). Dois meses após a terapia celular observa-se

consolidação óssea no sítio do defeito (Figura 16B)

Figura 16. Animal 7. (A) – Defeito crítico do terço médio do fêmur com 70mm e

evolução de 6 meses, estabilizado com fixador externo. Além da extensa perda óssea que deu origem ao defeito, observa-se seqüestro ósseo no foco de fratura

(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se consolidação completa do defeito femoral (seta).

67


Fratura oblíqua do terço distal da tíbia, com 8 meses de

evolução, tratamento prévio sem sucesso com fixador externo e

atualmente sem qualquer estabilização do foco de fratura. O

diagnóstico de não-união foi feito baseado na ausência de formação

de calo ósseo, arrendondamento e esclerose das bordas dos

fragmentos ósseos no foco de fratura e manutenção de um espaço

interfragmentar de 20mm (Fig. 17A). No momento da injeção da

suspensão celular foi feita estabilização da fratura com uma muleta

de Thomas e, dois meses após a terapia celular, observou-se a

formação de calo ósseo e consolidação parcial em cerca de 50% do

foco de não-união (Fig. 17B).

Figura 17. Animal 8. (A) – Não-união do terço distal da

tíbia, com 20mm e evolução de 8 meses. As bordas dos

fragmentos ósseos são

arredondadas e escleróticas e a instabilidade no foco de

fratura pode ser confirmada pela ausência de qualquer

tipo de estabilização cirúrgica ou conservadora

(seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a

suspensão celular observa-

se reparo parcial da não-união, comprometendo

cerca de 50% do diâmetro da tíbia (seta).

68


Fratura transversa distal de rádio e ulna associada com defeito

metafisário secundário ao uso prolongado (cinco anos) de placa para

estabilização. A placa foi retirada, a lesão foi curetada e enxertada

com osso esponjoso e, 24 meses após este último procedimento, a

formação óssea no local permanecia inexpressiva, persistindo no local

da fratura uma falha óssea segmentar com 24mm. Após a injeção da

suspensão celular o animal foi tratado conservadoramente (tala) para

a estabilização da lesão (Fig. 18A). Dois meses após a terapia celular

observamos formação óssea expressiva e reparo do defeito, que

encontra-se preenchido por osso neoformado (Figura 18B).

Figura 18. Animal 9. (A) – Defeito crítico de rádio com 24mm e evolução de 24 meses,

decorrente do contato prolongado com placa (seta). (B) – Sessenta dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se preenchimento completo do defeito do rádio por osso neoformado (seta).

69


Fratura transversa de rádio e ulna distal, com 48 meses de

evolução e tratamento prévio com cinco procedimentos cirúrgicos. O

foco da fratura permanece instável apesar da tentativa de

estabilização com a placa. O diagnóstico de não-união atrófica foi

feito baseado na ausência de formação de calo ósseo,

arrendondamento e esclerose das bordas dos fragmentos ósseos no

foco de fratura e manutenção de um espaço interfragmentar de 2mm

(Fig. 19A). Após sessenta dias decorridos da terapia celular, houve

redução de 1mm do espaço interfragmentar, caracterizando uma

consolidação parcial da não-união (Figura 19B).

Figura 19. Animal 10. (A) –

Não-união do terço distal do radio, com 2mm e evolução de

48 meses. As bordas dos fragmentos ósseos estão

arredondadas e escleróticas,

com instabilidade do foco de fratura (seta). (B) – Sessenta

dias após o tratamento com a suspensão celular observa-se

reparo parcial da não-união, com redução em 1mm do

afastamento entre os fragmentos ósseos (seta).

70

4.7 Avaliação Clínica

Nenhum dos animais apresentou dor à palpação, edema,

eritema ou nenhum outro sinal associado à presença de inflamação

ou infecção nos cinco dias seguintes após à injeção da suspensão

celular.

Levando em consideração o sistema de HAZEWINKEL e

MEUTSTEGE (1990) para a avaliação de claudicação, todos os

pacientes no dia da terapia celular, apresentaram ausência de apoio

ou claudicação com apoio intermitente do membro acometido pela

lesão óssea. Excetuando os animais 4 e 5, após um mês, todos os

demais cães apresentaram melhora na avaliação clínica caracterizada

pelo retorno total ou parcial das funções do membro afetado. Na

segunda avaliação clínica, 60 dias após a injeção da suspensão

celular, excetuando os pacientes 3, 4 e 10, os demais animais

apresentaram melhor desempenho das funções do membro afetado,

quando comparado com a primeira avaliação clínica, 30 dias depois

da terapia celular. Quatro pacientes (1, 3, 7, 9) apresentaram

recuperação funcional total e ausência de claudicação e três cães (2,

6 e 8) apresentaram a locomoção discretamente alterada na última

avaliação clínica (60 dias após a terapia celular). Os pacientes 4 e 5

não apresentaram qualquer melhora no retorno das funções do

membro, finalizando o estudo com a mesma condição que iniciaram,

sem apoiar o membro afetado e claudicando com apoio intermitente

do membro lesionado, respectivamente. O paciente 10 apresentou

71

melhora clínica moderada e ao final do estudo apresentava

locomoção alterada, mas apoiando o membro lesionado. A avaliação

clínica no dia da terapia celular e nas duas outras subseqüentes, após

30 e 60 dias respectivamente, estão resumidas na Tabela 7.

Tabela 7 - Avaliação clínica mensal e classificação da claudicação

segundo HAZEWINKEL e MEUTSTEGE (1990)

Tempo/Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Terapia celular 3 4 4 4 3 4 4 4 3 3

30 dias 2 2 0 4 3 2 2 2 1 2

60 dias 1 1 0 4 3 0 0 1 0 2

72

5. DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, diversos procedimentos foram

desenvolvidos para tratar não-união de fraturas e defeitos ósseos

críticos. Esses procedimentos incluem técnicas invasivas, como

fixação interna com enxertia de osso ou de material sintético e

técnicas minimamente invasivas, como injeção percutânea de fatores

de crescimento derivados de plaquetas (MARICONDA et al., 2008) ou

de medula óssea total (GARG et al., 1993), ultrassom (KRISTIANSEN

et al., 1997) e pulso eletromagnético (HERNIGOU et al., 2005). A

opção por utilizar neste estudo a injeção percutânea de células

osteoprogenitoras, isoladas de aspirados de medula óssea autóloga e

expandidas in vitro, deve-se ao fato de ser uma alternativa com

potencial osteogênico e, ao mesmo tempo, minimamente invasiva.

Todos os animais utilizados no estudo são adultos, com idade

superior a um ano. Os relatos de não-união, se excluídas causas

metabólicas ou nutricionais, ocorrem preferencialmente em animais

adultos (ATILOLA e SUMNER, 1984; KUMAR et al., 2007). Ao excluir

animais jovens em crescimento, limitando nossa observação a

animais adultos, eliminamos a possibilidade da resposta osteogênica

global mais exacerbada que ocorre em fraturas em organismos em

desenvolvimento. Essa resposta exacerbada poderia influenciar na

resposta ao tratamento.

73

Um estudo realizado por ATILOLA e SUMNER (1984) em 2.825

cães com fraturas, mostrou uma incidência de 3.4% de não-união. Os

ossos mais acometidos foram o rádio e ulna (40,6%), seguidos pelo

fêmur (38,5%), úmero (12,5%) e tíbia (4,2%). O presente estudo,

apesar do pequeno tamanho da amostra, confirma a alta incidência

de não-união do rádio e ulna (70%). Os animais das raças pequenas,

com peso inferior a 2kg, foram as mais acometidas (60%) ao

contrário de ATILOLA e SUMNER (1984) que observaram uma maior

incidência de não-união em animais com peso entre 7 e 14kg. As

diferenças entre os resultados deste estudo e a literatura podem ser

atribuídas ao pequeno tamanho da nossa amostra.

Além da localização anatômica, o tipo de estabilização

influencia no estabelecimento da não-união, cuja base do tratamento

é a fixação dos fragmentos ósseos, com o objetivo de reduzir a

mobilidade no foco de fratura (RODRIGUEZ-MERCHAN e FORRIOL,

2004). Neste estudo, todos os pacientes apresentaram algum grau de

mobilidade no foco de fratura por falência da fixação interna ou da

coaptação externa. Entretanto, apesar dos graus variáveis de

instabilidade mecânica, sete dos dez animais apresentaram

consolidação da não-união. Como as variáveis biomecânicas não

constituíram objeto deste estudo, apesar do seu papel bem definido

na instalação e manutenção da não-união, procuraremos interpretar

a resposta ao tratamento sob o ponto de vista celular. Para tal

utilizaremos alguns pontos de referência que consideramos ter

74

influenciado a qualidade do reparo das lesões e o resultado clínico

final.

5.1 Celularidade do aspirado medular

Em humanos e em outras espécies animais, incluindo cães,

aspirados de medula óssea são obtidos classicamente da crista ilíaca.

Neste estudo, entretanto, seguimos o protocolo desenvolvido por

MANKIANI et al. (2006) e MARTIN et al. (2002), utilizando as

metáfises proximais do úmero ou do fêmur como fonte de obtenção

dos aspirados de medula óssea. A técnica preconizada por estes dois

grupos foi de simples execução pela facilidade em reposicionar a

agulha em toda a extensão do osso metafisário. A extensa área

disponível para punção aliada à possibilidade de sucessivas alterações

na angulação da agulha permitiu reduzir consideravelmente a diluição

do aspirado com sangue periférico. A alta concentração celular obtida

nas amostras de medula óssea total (de até 1x1010 células nucleadas)

confirma a qualidade do aspirado sob o ponto de vista celular.

Nenhum dos animais apresentou complicações durante o

procedimento ou na recuperação anestésica, demonstrando também

ser um procedimento de baixa morbidade para cães.

5.2 Eficácia da expansão in vitro

O protocolo de isolamento e expansão utilizado no presente

estudo foi o mesmo estabelecido previamente em ovelhas por

75

FERNANDES et al. (2004), baseado nas descrições iniciais de

FRIEDESTEIN et al. (1968 e 1970) sobre o comportamento das

células estromais in vitro.

A expansão celular em nosso estudo foi feita a partir do

plaqueamento de 1,5 a 3x107 células por 25 cm2. Como utilizamos

uma alta densidade celular inicial, as culturas alcançavam a

confluência mais rapidamente em relação aos achados descritos na

literatura (DIGIRALAMO et al., 1999). Uma das justificativas para

utilizarmos este número elevado de células no plaqueamento inicial

foi baseada nos resultados de DIGIRALAMO et al. (1999). Com maior

densidade de plaqueamento inicial, as células passam por menos

ciclos de divisão celular até atingirem confluência, preservando seu

potencial expansivo. Além disso, SEKIYA et al. (2002) demonstraram

que a velocidade de expansão e a capacidade multipotencial são

inversamente proporcionais à densidade celular e ao tempo de

incubação por passagem, respectivamente. Dessa forma, quanto

maior a densidade celular, menor será a quantidade de divisões

celulares de cada progenitor, e quanto menor o tempo de incubação

para atingir a confluência a cada passagem, maior será a capacidade

multipotencial das células obtidas. Tomando por base estes relatos e

por considerarmos que a obtenção de um produto celular final com

alto potencial de ação biológica no microambiente ósseo, poderia ser

um diferencial na resposta ao tratamento, optamos pelo isolamento

76

inicial dos osteoprogenitores a partir de uma suspensão com alta

densidade celular.

Uma outra característica das células estromais caninas foi o

padrão organizacional das culturas, observado até três semanas após

o isolamento inicial. Esta organização das células estromais descrita

por OWEN et al. (1988) em sistemas in vitro se caracteriza pelo

arranjo das células em pequenos grupamentos circundados por

células hematopoéticas. Esta disposição mimetiza a interação

funcional entre o estroma e a hematopoese in vivo, através do qual

as células hematopoéticas se beneficiam e se diferenciam. Essa

interação é amplamente observada em culturas de progenitores

mesenquimais de roedores, mas raramente é observada em humanos

(SHORT et al., 2003).

As células isoladas da medula óssea canina apresentaram

padrão morfológico fusiforme desde os primeiros dias da expansão

até a fase de confluência, quando a proliferação é mais lenta (SEKIYA

et al., 2002). Apesar da grande heterogeneidade morfológica e

fenotípica observada em praticamente todas as espécies, as células

estromais são células fibroblastóides tipicamente mesenquimais

(PITTENGER et al., 1999; WOODBURRY et al., 2000; MARTIN et al.,

2002), mas que apresentam diferenças quanto à expressão de

moléculas e quanto aos índices de crescimento e diferenciação

(BIANCO e ROBEY, 2001).

77

5.3 Potencial osteogênico da suspensão celular injetada nas lesões

MUSCHELER et al. (2001) mostraram em humanos, que a

medula óssea normal possui cerca de 32 milhões/mL de células

nucleadas e apenas uma dentre 18.000 células nucleadas tem

características fenotípicas de célula tronco mesenquimal. Esta

quantidade pode ser facilmente ampliada através da expansão in

vitro. Neste estudo foram injetadas nas lesões em média 20 milhões

de células osteoprogenitoras (2,08x107±0,22) em volumes que

variaram entre 0,5-4,0 mL. Consideramos como uma vantagem

adicional do nosso protocolo a possibilidade de obter este elevado

número de células a partir de volumes iniciais de medula óssea

relativamente pequenos (11,5±10,18 mL). A utilização de

concentrado de células mononucleares, com o mesmo objetivo

terapêutico em humanos, requer a aspiração de volumes

consideravelmente maiores (300mL) para a obtenção de um número

mínimo de osteoprogenitores com potencial suficiente para estimular

resposta osteogênica (HERNIGOU et al., 2005).

Para quantificar o número de progenitores osteogênicos

presentes na medula óssea total foi utilizado o ensaio de CFU-F.

Inicialmente o padrão de expansão foi sob a forma de grupamentos

contendo 2-7 células. Ao final do 3º dia, as células em franco estado

proliferativo, iniciaram o delineamento das CFU-Fs. Ao final da

primeira semana as CFU-Fs com 50 ou mais células eram facilmente

identificadas para quantificação. Este padrão de crescimento coincide

78

com as descrições da literatura, onde se utiliza em média 5x104 -

1x106 células por 25 cm2 (SHORT et al., 2003).

HERNIGOU et al. (2005) mostraram que em mulheres o número

de CFU-Fs declina com a idade. CAPLAN (1994) e GALOTTO et al.

(1997) demonstraram que a quantidade de progenitores

mesenquimais declina com a idade. Em recém natos existe 1 CFU-F

para cada 10.000 células mononucleadas, proporção esta que em

indivíduos com mais de 80 anos diminui para um progenitor para

cada 2.000.000 células nucleadas. Em relação à idade dos animais

não observamos diferença no número de CFU-Fs. Entretanto, animais

da raça Pinscher possuíam um menor número de CFU-Fs por milhão

de células nucleadas (20.9±0.73) tanto em relação aos animais da

raça Poodle (23.23±0.30, p<0.005) quanto em relação aos animais

SRD (23.6±1.44, p<0.005). Hernigou e colaboradores, observaram

em seu estudo com 60 pacientes humanos, portadores de não união,

que a média de CFU-F por milhão de células nucleadas era de 33±8

(HERNIGOU et al., 2005).

5.4 Comprometimento com a linhagem osteogênica

A análise fenotípica qualitativa das células por imunocitoquímica

revelou em todas as amostras expressão significativa de moléculas

características de comprometimento com as linhagens

miofibroblástica ( -actina de músculo liso, colágeno tipo I, biglicana,

vimentina, fibronectina) ou osteoprogenitora (colágeno I,

79

osteopontina, sialoproteína óssea, biglicana e decorina). A verificação

por RT-PCR da expressão quantitativa de genes diretamente

relacionados com o comprometimento osteogênico confirmou os

resultados da imunocitoquímica.

O padrão uniforme de expressão de Cbfa-1, durante todo o

período de cultivo, foi a principal comprovação de que os

progenitores estavam comprometidos com a linhagem osteogênica.

DUCY et al. (1997), demonstraram que in vitro o gene Cbfa-1 é

responsável pela diferenciação osteoblástica durante os processos de

remodelamento ósseo e durante o desenvolvimento do esqueleto na

embriogênese. In vivo, KOMORI et al. (1997) mostraram em animais

knock-out para Cbfa-1, a formação de esqueleto totalmente

cartilaginoso, sem formação óssea pela ausência de osteoblastos.

DUCY et al. (1999) também demonstraram que o Cbfa-1 é

responsável pelo controle da formação óssea através da regulação da

função de osteoblastos diferenciados, que por sua vez regulam a

expressão de genes necessários para a formação da matriz óssea.

Para SATOMURA et al. (2000), o Cbfa-1 é expresso constitutivamente

por células estromais em cultura.

O colágeno tipo I é um dos primeiros marcadores moleculares a

ser regulado em osteoprogenitores comprometidos, de tal forma que

a sua produção e deposição precedem e são essenciais para a

regulação da expressão de outros marcadores osteoblásticos precoces

e tardios (XIAO et al., 1998). O comprometimento das células

80

estromais caninas com a linhagem osteogênica foi confirmado através

do padrão de expressão do colágeno tipo I similar ao controle

realizado com osteoblastos humanos.

O padrão de expressão de fosfatase alcalina pelas células

caninas não foi uniforme. Em cinco amostras a expressão foi

bastante reduzida, o que pode ser explicado pela cinética de

expressão da fosfatase alcalina. Tanto durante o processo de

diferenciação in vitro, como durante sua expressão in vivo, existe

uma variação de acordo com a localização e com a função da célula.

Em condições habituais de cultivo in vitro, a expressão da fosfatase

alcalina se inicia no 7º dia de cultivo, apresenta um pico de expressão

no 14º dia e decai progressivamente até o 21º dia em cultura

(SCHECROUN e DELLOYE, 2003). A baixa expressão de fosfatase

alcalina nos animais 1, 4, 6, 7 e 10 pode ser explicada, ao menos em

parte, pelo maior tempo de expansão (19, 19, 17, 19 e 16, dias

respectivamente) que as culturas destes animais requereram para

atingir confluência, já que classicamente o pico de expressão ocorre

em torno do 14º dia.

O padrão de expressão da osteonectina é descrito na literatura

como presente tanto nos progenitores mesenquimais como nas

células ósseas maduras. Neste estudo, o padrão de expressão da

osteonectina pelas células caninas em muito se assemelhou ao

padrão de expressão dos osteoblastos maduros. Esses resultados

estão de acordo com relatos da literatura que mostram que in vitro, a

81

osteonectina é amplamente expressa por células estromais

(MOTAMED e SAGE, 1998), em especial nas que estão em divisão

(YAN et al., 1998). Um outro dado da literatura sugere a co-

expressão de osteonectina e colágeno tipo I. RINGUETTE et al.

(1992) mostraram que a osteonectina se concentra prioritariamente

nos sítios ricos em fibras colágenas. Os resultados de BRADSHAW e

SAGE (2001) complementam esta observação ao demonstrar que a

ausência de colágeno leva a redução maciça da expressão de

osteonectina. Mais recentemente (FRAMSON et al., 2004) foi descrito

que a ausência de osteonectina por interferir na fibrilogênese,

promove uma drástica redução na expressão do colágeno tipo I.

5.5 Manutenção do tecido fibroso inviolado no foco de não-união

Até o presente momento, o tratamento de escolha para não-

união de fraturas e defeitos segmentares em cães é baseado na

remoção do tecido fibroso, estabilização mecânica e adição de um

componente osteogênico, o que acarreta em grande morbidade para

o paciente (JOHNSON, 1987). No protocolo descrito neste estudo, o

tecido fibroso não somente não foi removido como foi um

componente importante do tratamento ao exercer a função de

suporte, mantendo as células no local da lesão.

Embora a sua ocorrência não tenha sido descrita em humanos,

HERNINGOU et al. (2005) mencionam que uma das preocupações

com a aplicação de concentrado de medula óssea por via percutânea

82

em focos de não-união é o potencial risco de embolia. Esta

complicação pode ser evitada ou eliminada, através da filtração tanto

da medula óssea total como do concentrado de células

mononucleares antes da sua injeção. No protocolo utilizado neste

estudo, o risco de embolia gordurosa ou de medula óssea pode ser

praticamente descartado uma vez que utilizamos apenas as células

estromais expandidas in vitro ressuspendidas em um pequeno

volume de meio líquido.

A ausência de resposta clínica ao tratamento com a injeção da

suspensão celular em três (4, 5 e 10) dos dez animais pode ser

explicada por algumas particularidades das lesões e/ou da biologia

dos animais.

No animal 4 identificamos como possíveis causas para a falta de

resposta ao tratamento a intensa mobilidade no foco de fratura, as

sucessivas cirurgias que podem ter acarretado na redução da

vascularização local pelo processo de reparo e, consequentemente,

comprometendo a sobrevivência celular e menos provavelmente ao

menor número de células (1.8x107) injetadas na lesão em relação aos

demais animais (2x107). Apesar do número de células ser menor, o

número de CFU-Fs neste animal (22 / milhão de células nucleadas)

estava dentro da média dos animais que responderam ao tratamento.

Em relação ao animal 5, a causa da falta de resposta ao

tratamento certamente está relacionada com o grande tamanho

(100mm) e longo tempo de evolução da lesão (4 anos). Mesmo tendo

83

recebido a suspensão com o maior número de células (2.5x107), os

determinantes tamanho e tempo de evolução devem ter prevalecido

na definição da resposta final ao tratamento. Segundo HERNIGOU et

al. (2005), o volume de calo ósseo obtido com a injeção de células

mononucleares provenientes da medula óssea no foco de não-união,

é limitado e por isso, o espaço interfragmentar, assim como o

deslocamento entre os fragmentos ósseos devem também ser

limitados. Esses achados podem ter sido determinantes no nosso

estudo, onde pacientes com amplo espaço fragmentar e extrema

mobilidade no foco de não-união, não demonstraram consolidação

óssea.

No animal 10, além da instabilidade no foco de fratura e longo

tempo de evolução, aparentemente nenhuma outra causa pode ser

atribuída a falta de resposta ao tratamento. Possivelmente pela

pequena dimensão da lesão (2mm) este animal foi o único dos

refratários ao tratamento que apresentou melhora clínica,

caracterizada pela diminuição da instabilidade no foco de fratura, na

avaliação através do sistema de HAZEWINKEL e MEUTSTEGE (1990).

Até o presente momento, o uso de células osteoprogenitoras

provenientes da medula óssea, expandidas in vitro e aplicadas em

foco de não união de fraturas, nunca foi feito. Essa técnica permite

que somente células progenitoras, em altas concentrações, sejam

injetadas, em pequenos volumes, no foco da doença óssea. Devido a

alta concentração celular, a resposta osteogênica foi prontamente

84

visível mesmo em condições desfavoráveis para a consolidação óssea,

permitindo a recuperação funcional do membro acometido, na

maioria dos pacientes.

85

6. CONCLUSÕES

1. O tratamento de não-união de fraturas ou defeitos

segmentares de cães, com suspensão de células

osteoprogenitoras expandidas in vitro mostrou ser um

procedimento clinicamente seguro e pouco invasivo, capaz

de induzir a consolidação num percentual elevado de animais

provavelmente pelo seu alto potencial biológico;

2. Em cães, por razões anatômicas e técnicas, a punção da

região metafisária parece favorecer a obtenção de aspirados

de medula óssea mais concentrados, com menos diluição por

sangue periférico;

3. A partir de pequenos volumes de aspirados de medula óssea

canina é possível se obter um número substancial de células

osteoprogenitoras num intervalo de tempo relativamente

curto;

4. As células estromais caninas quando cultivadas in vitro

adquirem um aspecto organizacional em clusters associados

às células hematopoéticas, pouco observado na expansão de

medula óssea de animais superiores, incluindo medula óssea

humana.

5. A expressão de diversas moléculas características da

linhagem osteogênica confirmam o comprometimento

86

fenotípico das células estromais caninas, expandidas in vitro,

com a linhagem osteogênica;

6. Grande mobilidade do foco de fratura, diversos

procedimentos cirúrgicos, lesões extensas ou com longo

tempo de evolução parecem favorecer a não resposta ao

tratamento de não-união / defeito ósseo em cães com

injeção percutânea de células osteoprogenitoras.

87

Referências Bibliográficas

AKIYAMA H, CHABOISSIER MC, MARTIN JF, SCHEDL A, DE

CROMBRUGGHE B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation

pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes

Dev. 16: 2813–2828, 2002.

ASHTON BA, ALLEN TD, HOWLETT CR, EAGLESOM CC, HATTORI A,

OWEN M. Formation of bone and cartilage by marrow stromal

cells in diffusion chambers in vivo. Clin. Orthop. 151: 294–307, 1980.

ASPENBERG P, WITTBJER J, THORNGREN KG. Bone matrix and

marrow versus cancellous bone in rabbit radial defects. Arch Orthop Trauma Surg. 106(6):335-40, 197.

ATILOLA MAO, SUMNER SG. Nonunion fractures in dogs. J Vet

Orthop 3:21-26, 1984.

AUDIGE L, GRIFFIN D, BHANDARI M, KELLAM J, RUEDI TP. Path

analysis of factors for delayed healing and union in 416 aperatively treated tibial shaft fractures. Clin Orthop Relat Res 438: 221-232, 2005.

AWAD HA, BUTLER DL, BOIVIN GP, SMITH FN, MALAVIYA P,

HUIBREGTSE B, CAPLAN AI. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng. 5(3): 267-77, 1999.

BIANCO P, KUZNETSOV SA, RIMINUCCI M, ROBEY PG. Postnatal

skeletal stem cells. Methods of Enzimology 419: 117-148, 2006.

BIANCO P, ROBEY PG. Stem cells in tissue engineering. Nature 414:

118–121, 2001.

BIANCO P, ROBEY PG. Skeletal stem cells. In: Lanza RP (ed.): Handbook of Adult and Fetal Stem Cells. Academic Press, San

Diego, CA, 2004, pp. 415–424.

BLAIR HC. How the osteoclast degrades bone. BioEssays 20: 837-846, 1998.

BOYAN BD, CAPLAN AI, HECKMAN JD, LENNON DP, EHLER W,

SCHWARTZ Z. Osteochondralprogenitor cells in acute and chronic canine nonunions. J Orthop Res 17: 246-255, 1999.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=3324990&query_hl=21&itool=pubmed_docsum

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10434073?ordinalpos=732&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Boyan%20BD%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Caplan%20AI%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Heckman%20JD%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lennon%20DP%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ehler%20W%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schwartz%20Z%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

88

BRADSHAW AD, SAGE EH. SPARC, a matricellular protein that

functions in cellular differentiation and tissue response to injury. J Clin Invest. 107(9): 1049-54, 2001.

BRAWLEY SC, SIMPSON RB. Results of an alternative autogenous iliac crest bone graft harvest method. Orthopedics, 29: 342-346,

2006.

CANCEDDA R, DOZIN B, GIANNONI P, QUARTO R. Tissue engineering

and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biol. 22(1): 81-

91, 2003.

CAPLAN AI. The mesengenic process. Clin Plast Surg 21:429–35,

1994.

COLNOT C, HUANG S, HELMS J. Analyzing the cellular contribution of bone marrow to fracture healing using bone marrow

transplantation in mice. Biochem Biophys Res Commun. 24; 350(3): 557-61, 2006.

CONNOLLY, J.F., GUSE, R., TIEDEMAN, J., DEHNE, R. Autologous marrow injection for delayed unions of the tibia: a preliminary

report. Journal of Orthopaedic Trauma 3: 276-282, 1989. DIGIROLAMO CM, STOKES D, COLTER D, PHINNEY DG, CLASS R,

PROCKOP DJ. Propagation and senescence of human marrow

stromal cells in culture: a simple colony-forming assay identifies

samples with the greatest potencial to propagate and differentiate. British Journal of Hematology 107: 275-281,

1999.

DOREA, HC, MCLAUGHLIN RM, CANTWELL HD, READ R., ARMBRUST L, POOL R, ROUSH JK, BOYLE C. Evaluation of healing in feline

femoral defects filled with cancellous autograft, cancellous

allograft and bioglass. Veterinary Comparative Orthopadic

Traumatology 18(3): 157-68, 2005.

DUCY P, STARBUCK M, PRIEMEL M, SHEN J, PINERO G, GEOFFROY V, AMLING M, KARSENTY G. A Cbfa-1-dependent genetic pathway

controls bone formation beyond development. Genes

Development 13(8): 1025-1036, 1999.

DUCY P, ZHANG R, GEOFFROY V, RIDALL A, KARSENTY G. Osf2 Cbfa-

1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell

89: 747-754, 1997.

FERNANDES MCB, REIS JSN, MARTINS HSH, LOPEZ PCM, BALDUÍNO

A, ACETO ML, AMBRÓSIO CE, PINTO ACF, RODRIGUES FN,



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=17022937&query_hl=1&itool=pubmed_DocSum



89

MIGLINO A, BOROJEVIC R, DUARTE MEL. Repair of large bone

defects in sheep with allografts augmented with loading of bone marrow stromal cells. Journal of bone and mineral research

19: 353, 2004.

FRAMSON PE, SAGE EH. SPARC and tumor growth: where the seed

meets the soil? J Cell Biochem. 1;92(4): 679-90, 2004.

FRIEDENSTEIN AJ. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol.

47: 327–359, 1976.

FRIEDENSTEIN AJ, PETRAKOVA KV, KUROLESOVA AI, FROLOVA GP. Heterotropic Transplant os Bone Marrow Cells. Analysis of

Precursor Cells for Osteogenic and Hematogenic Tissues.

Transplantetion 6:230-247, 1968.

FRIEDENSTEIN AJ, CHAILAKHJAN R.K, LALYKINA KS. The

development of fibroblast colonies in monolayer cultures of

guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell tissue Knetics

3: 393-403, 1970.

FRIEDENSTEIN AJ, PIATETZKY-SHAPIRO II, PETRAKOVA KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J. Embryol.

Exp. Morphol. 16: 381–390, 1966.

GALOTTO M, BERISSO G, DELFINO L, PODESTA M, OTTAGGIO L, DALLORSO S, DUFOUR C, FERRARA GB, ABBONDANDOLO A,

DINI G, BACIGALUPO A, CANCEDDA R, QUARTO R. . Stromal damage as consequence of high-dose chemo/radiotherapy in bone marrow transplant recipients. Exp Hematol 27: 1460–

1466, 1997.

GARG NK, GAUR S, SHARMA S. Percutaneous autogenous bone

marrow grafting in 29 cases of ununited fracture. Acta Orthop

Scand. 64: 671–672, 1993.

GRIFFON DJ. Fracture Healing. In: Jonhson AL, Houlton JEF, Vannini

R. (eds): AO Principles of Fracture Management in the Dog and

the Cat, ed. AO Publishing, Switzerland, 2005, pp 73-98.

GRIFFON D, MCLAUGHLIN RM, HOSKINOSON JJ. Effects of a bone-

inducing agent derived from a cultured human osteosarcoma cell line after orthotopic and heterotopic implantation in the dog.

Vet Comp Ortho Trauma 9: 22-28, 1996.

GIMBLE JM, ROBINSON CE, WU X, KELLY KA. The function of

adipocytes in the bone marrow stroma: An update. Bone 19:

421–428, 1996.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Galotto%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Berisso%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Delfino%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Podesta%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ottaggio%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Dallorso%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Dufour%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ferrara%20GB%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Abbondandolo%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Dini%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bacigalupo%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Cancedda%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Quarto%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

90

GOEL A, SANGWAN SS, SIWACH RC, ALI AM. Percutaneous bone marrow grafting for the treatment of tibial non-union. Injury 36,

203-206, 2005.

GOULET JA, SENUNAS LE, De SILVA GL, GREENFIELD ML.

Autogenous iliac crest bone graft. Complications and functional

assessment. Clin Orthop Relat Res 339: 76-81, 1997.

HARRIS AM, PATTERSON BM, SONTICH JK, VALLIER HA. Results and

outcomes after operative treatment of high-energy tibial plafond

fractures. Foot Ankle Int. 27(4): 256-65, 2006.

HAZEWINKEL HAW, MEUTSTEGE FJ. Locomotor system. In: Rijnberk

A and de Vries HW. (eds). Medical history and physical

examination in companion animals. Dordrecht, Kluwer Academic Publisher, 1990, pp. 175–201.

HEPPENSTALL RB. Fracture Healing. In: Heppenstall RB (ed). Fracture

Treatment and healing. WB Saunders, Philadelphia, 1980, pp 35-

64.

HERNIGOU P, BEAUJEAN F. Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting. Clin Orthop Relat Res. 405: 14-23, 2002.

HERNIGOU PH, POIGNARD A, BEAUJEAN F, ROUARD H. Percutaneous

autologous bone marrow grafting for nonunions – Influence of number and concentration of progenitor cells. The Journal of

Bone and Joint Surgery 87: 1430-1437, 2005.

HOLMBECK K, BIANCO P, PIDOUX I, INOUE S, BILLINGHURST RC, WU W, CHRYSOVERGIS K, YAMADA S, BIRKEDAL-HANSEN H,

POOLE AR. The metalloproteinase MT1-MMP is required for

normal development and maintenance of osteocyte processes in

bone. Journal of Cell Science 118(1): 147-156, 2005.

JEAN JL, WANG SJ, AU MK. Treatment of a large segmental bone defect with allograft and autogenous bone marrow graft. J

Formos Med Assoc. 96(7): 553-7, 1997.

JIANG Y, JAHAGIRDAR BN, REINHARDT RL, SCHWARTZ RE, KEENE CD, ORTIZ-GONZALEZ XR, REYES M, LENVIK T, LUND T,

BLACKSTAD M, DU J, ALDRICH S, LISBERG A, LOW WC,

LARGAESPADA DA, VERFAILLIE CM. Pluripotency of

mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 4;418(6893): 41-9, 2002.








91

JOHNSON KD. Management of malunion and nonunion of the tibia.

Orthop Clin North Am 18: 157-171, 1987.

JOHNSON AL, HULSE DA. Fracture fixation systems in Small Animal

Surgery, 2nd edition Mosby Inc, 2002, pp 893-899.

JOHNSON EE, URIST MR, FINERMAN GA. Distal methaphyseal tibial

nonunion. Deformity and bone loss treated by open reduction, internal fixation, and human bone morphogenetic protein

(hBMP). Clin Orthop Rel Res 250: 234-240, 1990.

KADIYALA S, YOUNG RG, THIEDE MA, BRUDER SP. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic

potential in vivo and in vitro. Cell Transplant. 6(2): 125-34,

1997.

KERWIN SC, LEWIS DD, ELKINS AD, OLIVER J, PECHMAN R,

MCCARTHY RJ, HOSGOOD G. Deep-Frozen allogenic cancellous bone grafts in 10 dogs: a case series. Veterinary Surgery 25:

18-28, 1996.

KETENJIAN AY, ARSENIS C. Morphological and biolomechanical

studies during differenciation and calcification and calcification of fracture callus cartilage. Clin Ortho. (107): 266-273.

KIERSZENBAUM AL. Connective Tissue. In: Kierszenbaum, AL. (ed):

Histology and Cell Biology. Ed, Mosby, Missouri, 2002, pp 118-

145.

KLEIN-NULENT J, NIJWEIDE PJ. Osteocyte and bone structure. Curr Osteoporosis Rep. 1: 5-10, 2003.

KNOTHE-TATE M. Interstitial fluid flow. In: Cowin SC. Bone Mechanics

Handbook. 2nd ed. Boca Raton, CRC Press, 2001, pp22-29.

KOMORI T, YAGI H, NOMURA S, YAMAGUCHI A, SASAKI K, DEGUCHI

K, SHIMIZU Y, BRONSON RT, GAO YH, INADA M, SATO M,

OKAMOTO R, KITAMURA Y, YOSHIKI S, KISHIMOTO T. Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation

owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89: 755–764,

1997.

KREBSBACH PH, KUZNETSOV SA, SATOMURA K, EMMONS RV, ROWE

DW, ROBEY PG. Bone formation in vivo: Comparison of

osteogenesis by transplanted mouse and human marrow stromal

fibroblasts. Transplantation 63: 1059–1069, 1997.


92

KRISTIANSEN TK, RYABY JP, MCCABE J, ET AL. Accelerated healing of

distal radial fractures with the use of specific, low intensity ultrasound. J Bone Joint Surg. 79A: 961–973, 1997.

KUMAR K, MOGHA IV, AITHAL HP, KINJAVDEKAR P; AMARPAL, SINGH

GR, PAWDE AM, KUSHWAHA RB. Occurrence and pattern of long

bone fractures in growing dogs with normal and osteopenic

bones. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 54(9): 484-90,

2007.

KUZNETSOV SA, MANKANI MH, GRONTHOS S, SATOMURA K, BIANCO

P, ROBEY PG. Circulating skeletal stem cells. J. Cell Biol. 153:

1133–1140, 2001.

KUZNETSOV SA, RIMINUCCI M, ZIRAN N, TSUTSUI TW, CORSI A,

CALVI L, KRONENBERG HM, SCHIPANI E, ROBEY PG, BIANCO P.

The interplay of osteogenesis and hematopoiesis: expression of a constitutively active PTH/PTHrP receptor in osteogenic cells

perturbs the establishment of hematopoiesis in bone and of

skeletal stem cells in the bone marrow. The Journal of Cell Biology 167(6): 1113–1122, 2004.

LA VELLE DG. Delayed union and nonunion of fractures. In: Canale

TS, editor. Campbell’s operative orthopaedics. 9th ed. St. Louis:

Mosby;1998. p 2579-2629.

LERNER A, FODOR L, SOUDRY M. Is staged external fixation a

valuable strategy for war injuries to the limbs? Clin Orthop

Relat Res. 448: 217-24, 2006.

LIEBERMAN JR, DALUISKI A, EINHORN TA. The role of growth factors in the repair of bone. J Bone Joint Surg [Am] 84(6): 1032-

1044, 2002.

MANN FA, PAYNE JT. Bone healing. Semin Vet Med Surg (Small Anim). 4(4): 312-321.

MANKANI MH, KUZNETSOV SA, SHANNON B, NALLA RK, RITCHIE RO,

QIN Y, ROBEY PG. Canine cranial reconstruction using autologous

bone marrow stromal cells. Am J Pathol. 168(2): 542-50, 2006.

MARICONDA M, COZZOLINO F, COZZOLINO A, D’AGOSTINO E, BOVE

A, MILANO C. Platelet Gel Supplementation in Long Bone Nonunions Treated by External Fixation. J Orthop Trauma 22:

342–345, 2008.




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mankani%20MH%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kuznetsov%20SA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Shannon%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Nalla%20RK%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ritchie%20RO%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Qin%20Y%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Robey%20PG%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

93

MARTIN DR, COX NR, HATHCOCK TL, NIEMEYER GP, BAKER HJ.

Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Experimental

Hematology 30: 879–886, 2002.

MCLAUGHLIN RM. The evolution of the understanding of bone

healing. Vet Comp Orthop Traumatol 4:16-20, 1991.

MCLAUGHLIN RM, ROUSH JK. Autogenous cancellous and cortico-

cancellous bone grafting. Vet Medicine 93(12): 1071-1074,

1998.

MILLIS DL. Bone and non-bone derived growth factors and effects on

bone healing. Vet Clin North Am Small Anim Pract.

29(5):1221-1246, 1999.

MILLIS DL, JACKSON AM. Delayed Unions, Nonunions, and Malunions.

In: D. Slatter (ed): Textbook of Small Animal Surgery (3rd edition). Sauders, Philadelphia, 2003, pp 1849-1861.

MOREIRA RO, BALDUINO A, MARTINS HS, REIS JS, DUARTE ME, FARIAS ML, BOROJEVIC R. Ribavirin, but not interferon alpha-2b,

is associated with impaired osteoblast proliferation and differentiation in vitro. Calcifie Tissue 75(2): 160-168, 2004.

MOTAMED K, SAGE EH. SPARC inhibits endothelial cell adhesion but

not proliferation through a tyrosine phosphorylation-dependent

pathway. Journal of. Cellular Biochemestry 70: 543-552, 1998.

MOUTSATSOS IK, TURGEMAN G, ZHOU S, KURKALLI BG, PELLED G,

TZUR L, KELLEY P, STUMM N, MI S, MÜLLER R, ZILBERMAN Y, GAZIT D. Exogenously regulated stem cell-mediated gene

therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3(4): 449-61, 2001.

MUSCHLER GF, NITTO H, BOEHM CA, EASLEY KA. Age- and gender-

related changes in the cellularity of human bone marrow and the

prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res 19:117-125, 2001.

NAKASHIMA K, ZHOU X, KUNKEL G, ZHANG Z, DENG JM, BEHRINGER

RR, DE CROMBRUGGHE B. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast

differentiation and bone formation. Cell 108: 17–29, 2002.

NUNAMAKER DM, RHINELANDER FW, HEPPENSTALL. Delayed Union, Nonunion and Malunion. In: CD. Newton, DM. Nunamaker (Eds):




94

Textbook of Small Animal Orthopaedics Ithaca, International

Veterinary Information Service, 1985.

OONISHI H, KUSHITANI S, YASUKAWA E, IWAKI H, HENCH LL,

WILSON J, TSUJI E, SUGIHARA T. Particulate Bioglass compared with Hydroxyapatite as a bone graft substitute. Clinical

Orthopaedics and Related Research 334: 316-325, 1997.

OWEN M, FRIEDENSTEIN AJ. Stromal stem cells: Marrow-derived

osteogenic precursors. Ciba Found. Symp. 136: 42–60, 1988.

PIERMATEI DL, FLO GL, DECAMP CE. Delayed Union and Nonunion. In: Piermtei DL, Flo GL. DeCamp CE. (eds): Handbook of Small

Animal Orthopaedics and Fracture Repair, 4rd ed. Sauders,

Philadelphia, 2006, pp 168-176.

PITTENGER MF, MACKAY AM, BECK SC, JAISWAL RK, DOUGLAS R,

MOSCA JD, MOORMAN MA, SIMONETTI DW, CRAIG S, MARSHAK DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem

cells. Science 284(5411): 143-147, 1999.

PONOMAREVA LV, WANG W, AND KOSZEWSKI NJ. Mim-1, an

osteoclast secreted chemokine, stimulates differentiation, matrix mineralization and increased Vitamin D receptor binding at the VDRE of osteoblastic precursor cells. J Bone Miner Res 17:

S155, 2002.

QUINTAVALLA J, UZIEL-FUSI S, YIN J, BOEHNLEIN E, PASTOR G, BLANCUZZI V, SINGH HN, KRAUS KH, O'BYRNE E, PELLAS TC.

Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation

into articular cartilage defects. Biomaterials. 23(1): 109-19, 2002.

RAHN BA. Bone healing: histologic and physiologic concepts. In:

Sumner-Smith G (ed). Bone in Clinical Orthopaedics. WB

Saunders, Philadelphia, 2002, pp. 335-386.

REMEDIOS A. Bone and bone healing. Vet Clin North Am Small

Anim Pract. 29(5):1029-1044, 1999.

RICKARD DJ, KASSEM M, HEFFERAN TE, SARKAR G, SPELSBERG TC, RIGGS BL. Isolation and characterization of osteoblast precursor

cells from human bone marrow. J Bone Miner Res. 11(3): 312-

24, 1996.










95

RINGUETTE M, DAMJANOVSKI S, WHEELER D. Expression of

SPARC/osteonectin in tissues of bony and cartilaginous vertebrates. Biochem Cell Biol. 69(4): 245-50, 1991.

ROBEY PG. Stem cells near the century mark. J. Clin. Invest., 105(11): 1489-1491, 2000.

RODRIGUEZ-MERCHAN EC, FORRIOL F. Nonunion: general principles and experimental data. Clin Orthop Relat Res. 419: 4-12,

2004.

SACCHETTI B, FUNARI A, MICHIENZI S, DI CESARE S, PIERSANTI S, SAGGIO I, TAGLIAFICO E, FERRARI S, ROBEY PG, RIMINUCCI M,

BIANCO P. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow

sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell 131: 324-336, 2007.

SAMBROOK J, GETHING MJ. Protein structure. Chaperones, peperones. Nature. 342(6247): 224-225, 1989.

SATOMURA K, KREBSBACH P, BIANCO P, GEHRON ROBEY P. Osteogenic imprinting upstream of marrow stromal cell differentiation. J. Cell. Biochem. 78: 391–403, 2000.

SCHECROUN N, DELLOYE C. Bone-like nodules formed by human

bone marrow stromal cells: comparative study and characterization. Bone 32(3): 252-60, 2003.

SCHILLER AL. Bones and Joints. In: Rubin E, Farber JL (eds):

Pathology, ed. Lippincott, Philadelphia, 1988, pp 1304-1393.

SEKYIA I, LARSON BL, SMITH JR, POCHAMPALLY R, CUI JG, PROCKOP

DJ. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: Conditions that maximize the yelds of early progenitors

and evaluate their quality. Stem Cells 20: 530-541, 2002.

SESHI B, KUMAR S, SELLERS D. Human bone marrow stromal cell:

coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell

lineages. Blood Cells Mol Dis. 26(3): 234-46, 2000.

SHORT B, BROUARD N, OCCHIODORO-SCOTT T, RAMARKRISHNAN A,

SIMMONS PJ. Mesenchymal Stem Cells. Archives of Medical Research 34: 567-571, 2003.

SLATER M, PATAVA J, KINGHAM K, MASON RS. Involvement of platelets in stimulating osteogenic activity. J Orthop Res 13:

655-663, 1995.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rodriguez-Merchan%20EC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Forriol%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


96

STREET J, WINTER D, WANG JH, WAKAI A, MCGUINNESS A,

REDMOND HP. Is human fracture hematoma inherently angiogenenic? Clin Orth Rel Res. (378): 224-237, 2000.

TROEN BR. Molecular mechanisms underlying osteoclast formation amd activation. Exp Gerontol 38: 605-614, 2003.

WANG PS, SOLOMON DH, MOGUN H. HMG-CoA reductase inhibitors and the risk of hip fractures in elderly patients. JAMA. 283:

3211-3216, 2000.

WELCH JA, BOUDRIEAU RJ, DEJARDIN LM, SPODNICK GJ. The intraosseous blood supply of canine radius: Implications for

healing of distal fractures in small dogs. Veterinary Surgery

26(1): 57-61, 1997.

WHEELER DL, ESCHBACH EJ, HOELLRICH RG, MONTFORT MJ,

CHAMBERLAND DL. Assessment of resorbable bioactive material for grafting of critical-size cancellous defects. Journal of

Orthopaedic Research 18 (1): 140-48, 2000.

WHITEFIELD J. F., ROSEMBERG L. BMUS – The microcrack fixers. In:

Growing Bone. Austin, TX, Landes Bioscience Company, 2005, pp 4 – 31.

WILSON J, YU LT, BEALE BS. Bone augmentation using Bioglass

particulate in dogs: Pilot study. Bioceramics 5: 139-46, 1999.

WOODBURY D, SCHWARZ EJ, PROCKOP DJ, BLACK IB. Adult rat and

human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 61:364-370, 2000.

WOODARD JC, RISER WH. Morphology of fracture nonunion and

osteomyelitis. Vet Clin North Am Small Anim Practice. 21:

813, 1991.

XIAO G, WANG D, BENSON MD, KARSENTY G, FRANCESCHI RT. Role

of the α2 integrin in osteoblast specific gene expression and activation of the Osf2 trancriptional factor. Journal of

Biological Chemistry 273(49): 32988-32994, 1998.

YAN Q, SAGE EH, HENDRICKSON AE. SPARC is expressed by ganglion cells and astrocytes in bovine retina. J Histochem Cytochem

46: 3–10, 1998.

ZANNETTINO AC, HARRISON K, JOYNER C.J, TRIFFITT JT, SIMMONS PJ. Molecular cloning of the cell surface antigen identified by the

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Welch%20JA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

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97

osteoprogenitor-specific monoclonal antibody, HOP-26. J. Cell.

Biochem. 89: 56–66, 2003.

ZIMMERMANN G, MOGHADDAM A, WAGNER C, VOCK B,

WENTZENSEN A. Clinical experience with bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) in non unions of long bones. Unfallchirurg

109: 528-537, 2006.

98

COMITÊ DE ÉTICA

99

Anexo 2 – Valores de referência para hemograma, leucograma e bioquímica sérica (perfil

hepático e renal) canina.

HEMOGRAMA

LEUCOGRAMA

(x103/µl)

BIOQUIMICA

Hematócrito

(%)

37 - 55

Leucócitos

3 – 11,5

Uréia

(UI/L)

15 - 65

Hemácias

(x106/ L)

5,5 – 8,5

Basófilos

raros

Creatinina

(UI/L)

0.5 – 1.5

Hemoglobina

(g/dL)

12 - 18

Eosinófilos

2 - 10

AST

(mg/dL)

7 - 40

VCM

(fL)

60 - 72

Bastoes,

Mielócitos,

Metamielócitos

raros

ALT

(mg/dL)

9 - 120

HCM

(g/dL)

19 - 24

Segmentados

60 - 77

CHCM

(g/dL)

33 - 38

Linfócitos

12 - 30

Plaquetas

(x103/µl)

200 - 500

Monócitos

3 - 10

* Valores de referência obtidos de Mary Anne Thrall – Hematologia e Bioquímica Veterinária

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