universidade federal do rio grande do sul faculdade de veterinÁria programa de pÓs-graduaÇÃo em...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Torque teno

vírus

(TTV)Thais Fumaco Teixeira

(Exame de qualificação)

Histórico

•1997: Torque teno vírus (TTV)

▫Paciente com hepatite pós-transfusional de etiologia desconhecida

Iniciais do nome do paciente (T.T.)

“transfusion transmitted virus”

Histórico

•2000: “TTV-like mini virus” (TLMV)

•2005: Novo significado para TTV e TLMV▫Torque teno vírus (TTV)▫Torque teno mini vírus (TTMV)

“Torque” = colar “teno” = pequeno

Histórico

•2007: Torque teno midi-vírus (TTMDV)

▫Vírus relacionado ao TTV

▫Tamanho intermediário

Histórico

•Infecção por TTV não é restrita a humanos

▫Chimpanzés ▫Tupaias▫Suínos▫Bovinos▫Cães▫Gatos▫Leões marinhos

Taxonomia

• Família Anelloviridae

• Gênero Anellovirus

▫ Sub-classificados em genogrupos

Taxonomia

Características moleculares

• DNA circular

• Fita simples

• Polaridade negativa

• Variabilidade no tamanho

▫ TTV humano (3,4 kb – 3,9 kb)

▫ TTMDV (3,2 kb)▫ TTMV (2,8 kb – 2,9 kb)▫ TTSuV (2,9 kb)▫ TTV felino (2,1 kb)

Epidemiologia

•Amplamente difundidos▫Distribuição não está associada com a sua

origem geográfica

•Prevalência TTSuV1 varia de 24% a 100%

•Prevalência de TTSuV2 na Espanha (77%)

Epidemiologia

•TTV estaria associado a diferentes patologias

auto-imunes:▫Doenças reumáticas▫Patologias hepáticas ▫Disturbios respiratórios

•Não existem dados definitivos indicando que TTV é responsável por qualquer doença em humanos▫Vírus órfão

Epidemiologia

•Em suínos: TTSuV infecta uma elevada proporção de animais aparentemente saudáveis

•Co-infecção com outros patógenos

•Prevalência de TTSuV2 em suínos com SMDS (91%) e em suínos saudáveis (72%) (Kekarainen et al., 2006)

•TTSuV1 facilita indução da SMDS pelo PCV2 (Ellis et al., 2008)

Patogenia

•DNA de TTV tem sido identificado em:

▫Células mononucleares de sangue periférico;▫Células hematopoiéticas da medula óssea;▫Plasma;▫Fezes;▫Saliva;▫Suabes nasais e de garganta.

•Aparentemente necessita de células em multiplicação ativa para se replicar

Transmissão

• Principal transmissão TTSuV: oral-fecal (soro, plasma, fezes)

• Transmissão vertical: colostro, útero, soro de porcas e seus natimortos

• Sêmen

• Trato respiratório: pulmões, secreções nasais e saliva

Detecção de Torque teno vírus suíno 1 (TTSuV1)

em diferentes tecidos de suínos

Introdução

• Aparentemente TTSuV não tem associação com qualquer patologia

• Estudo mostrou uma aparente associação negativa entre a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS (Teixeira et al., 2008)

• Estudo de distribuição de TTSuV em tecidos detectou uma maior prevalência de TTSuV no pulmão (Bigarré et al., 2005)

Introdução

• Replicação do TTSuV não parece estar restrita a este órgão

• Formas replicativas intermediárias de fita dupla de TTV foram encontradas:

▫ Fígado ▫ Células da medula óssea▫ Pulmão▫ Pâncreas▫ Baço▫ Outros tecidos linfóides

Objetivos

• Detecção de TTSuV em órgãos de suínos com

e sem a Síndrome Multissistêmica do

Definhamento dos Suínos;

Material e Métodos

• Amostras

▫ Órgãos de suínos (pulmão, fígado, rim, baço e linfonodo)

11 suínos saudáveis 76 suínos com SMDS

• Extração de DNA• Quantificação (100 ng)• PCR

Material e Métodos

• Sensibilidade da PCR

▫ Produto da PCR de TTSuV1 (349 pb) e TTSuV2 (572 pb)

clonado no vetor pCR2.1;

▫ Sequenciamento;

▫ Plasmídeo: C+1 e C+2;

▫ DNA plasmidial foi quantificado;

▫ Diluição seriada na base 10.

Material e Métodos

• Construção do controle interno

▫ Mesmos primers usados na PCR para TTSuV1 e 2;

▫ PCR com temperatura de anelamento de 40 °C;

▫ TTSuV1: célula de linhagem de rim de suíno (SK6); Produto de 293 pb foi clonado e sequenciado;

Plasmídeo: CI1;

▫ TTSuV2: célula de linhagem de rim de suíno livre de PCV1 (PKsC3); Produto de 441 pb foi clonado e sequenciado;

Plasmídeo: CI2;

▫ DNA plasmidial foi quantificado;

▫ Diluição seriada na base 10.

Resultados

2 3 4 5 6 71

200 bp

400 bp 349 bp

293 bp

1 2 3 4 5 6 7

500 bp572 bp

441 bp

A)

B)

Figura1.A) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV1B) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV2

Resultados

Tabela 1. Prevalência de TTSuV1 e 2 em tecidos de suínos saudáveis e com Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Com um tecido positivo o animal foi considerado positivo para TTSuV.

Suínos saudáveis (n=11)

Suínos com SMDS (n=76)

Total (n=87)

100 (11/11)

48.7 (37 /76)

55.17 (48/87)

100 (11/11)

94.7 (72 /76)

93.1 (81/87)

% de suínos positivos para

sTTV1

% de suínos positivos para

sTTV2

Resultados

Tabela 2. Prevalência de TTSuV1 e 2 em 5 diferentes amostras de tecidos de suínos saudáveis e com a Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS).

Suínos

saudáveis

Grupos Órgãos

Pulmão Fígado Rim Baço Linfonodo

100% (11/11) 100%

(11/11)

90.9%

(10/11)

100% (11/11) 100%

(11/11)

TTSuV

1

TTSuV

2

TTSuV

1

TTSuV

2Suínos com

SMDS

37.7%

(26/69)

41.9%

(31/74)

37.8%

(28/74)

38.5%

(27/70)

30.4% (21/69)

76.8% (53/69) 81.1%

(60/74)

59.4%

(44/74)

77.1%

(54/70)

68.1% (47/69)

81.8%

(9/11)

81.8%

(9/11)

100%

(11/11)

81.8%

(9/11)

90.9%

(10/11)

Resultados

Figura 2. árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos da região não traduzida do genoma do TTSuV.Número de acesso do GenBank das sequências de referência para TTSuV1 (AB076001 e AY823990) e TTSuV2 (AY823991).

Discussão

• Bigarré et al. (2005) relatou que o TTSuV foi encontrado mais frequentemente no pulmão.

(11,2% pulmão; 8,1% linfonodo inguinal; 5,6% linfonodo mesentérico; 4,4% tonsila; 3,1% ileo)

• Difere dos resultados encontrados por Ellis et al. (2008) e Kekarainen et al.(2006).

Conclusão

• Trabalho mostra que a distribuição de TTSuV1 em tecidos aparentemente não apresenta em particular um órgão alvo.

• Resultados reforçam uma aparente correlação inversa entre a presença de TTSuV1 e o desenvolvimento da SMDS.

• Corrobora com trabalho prévio realizado por nossa equipe.

Torque teno vírus suíno (TTSuV) em cultivos celulares e tripsina

Introdução

• Interação entre TTSuV e PCV2

• Sistema eficaz de replicação para o TTSuV

• Nenhum cultivo que permita a propagação de TTSuV foi identificado

• Nenhum cultivo foi avaliado em busca de TTSuV como contaminante

Objetivos

• Detectar a presença de genomas de TTSuV

em células de linhagem, soro e tripsina

Material e Métodos

• Amostras

▫ 25 células de linhagem 10 células em cultivo 15 ampoladas e estocadas em nitrogênio líquido

▫ 9 lotes de soros (diferentes fornecedores) Soro fetal bovino Soro de equíno Soro de ovino Soro de terneiro

▫ 5 lotes de tripsina

Material e Métodos

• Extração de DNA

• Quantificação (100 ng)

• PCR ▫ forward-1: 5’ GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG 3’▫ forward-2: 5’ GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG 3’▫ reverso: 5’ GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC 3’

(Rijsewijk,2008)

• TTSuV1: 106 pb• TTSuV2: 103 pb

Material e Métodos

• Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados

• Sequências obtidas foram depositadas no GenBank n° de acesso (GU574709 A GU574729)

• Análise filogenética

Resultados

Células de linhagemPresença deDNA viral de

TTSuV1

Presença deDNA viral de

TTSuV2

Baby hamster kidney (BHK-21) - +

Chicken embryo related (CER) - +

Crandell feline kidney (CRFK) - +

Human embryonic intestine (H407) + -

Human leukemic cell (K562) (28/05/04)* + -

African green monkey kidney embryonic (MA-104) (28/04/93)* + -

Madin-darby bovine kidney (MDBK) (17/08/01)* + -

Madin-darby canine kidney (MDCK) (25/10/05)* + -

Porcine kidney PK(15) + +

Porcine kidney (PK-2a) - +

Porcine kidney sub-clone 3 PCV1 free (PKsC3) + +

Swine kidney (SK6) - +

Swine testicle (ST) + +

Bovine thyroid cell (TB) (27/02/85)* + -

African green monkey kidney (Vero) - +

Resultados

Células de linhagemPresença deDNA viral de

TTSuV1

Presença deDNA viral de

TTSuV2

Canine Carcinoma (A-72) (2/07/08)* - -

Mutant MDBK Resistant to BVDV Infection (CRIB) (16/01/06)*

- -

Embryonic Bovine Trachea (EBTr) (29/12/04)* - -

Equine Dermis (ED) (9/07/08)* - -

Foetal Lamb Kidney (FLK) (6/12/90)* - -

Murine Fibrosarcoma (L929) (3/06/08)* - -

Monkey Kidney (LLC-MK2) (15/07/86)* - -

Murine Neuroblastoma (N2A) (18/10/04)* - -

Rabbit Kidney (RK13) (13/01/93)* - -

Murine myeloma (SP2/O-Ag14) - -

Resultados

Soro e tripsinaPresença de

DNA viral de sTTV1Presença de

DNA viral de sTTV2

Fetal Bovine Serum (supplier A) - -

Fetal Bovine Serum (supplier B) - -

Fetal Bovine Serum (supplier C) - -

Calf Serum (treated in house with polyethylene glycol) - -

Horse serum (inactivated) - -

Horse serum (1 donor) - -

Horse serum (pool) - -

Ovine serum - -

Calf serum - -

Trypsin (supplier A) + +

Trypsin (supplier B) - -

Trypsin (supplier C) - -

Trypsin (supplier D) - -

Trypsin (supplier E) - -

Resultados

Fig. 1. Árvore filogenética baseada nas sequências de nucleotídeos da região não codificante do genoma dos sTTVs. AB076001 e AY823990 são as sequências de referência para sTTV1 e AY823991 é a sequência referência para sTTV2.

Discussão

• Devido a natureza ubíqua do TTSuV fontes comuns de transmissão devem existir (McKeown et al., 2004)

▫ Vacinas preparadas em células contaminadas

• Kekarainen et al. (2009) relataram presença de TTSuV1 e 2 em enzimas e vacinas.

• Segales et al. (2009) também detectaram TTSuV1 e 2 em soro de suínos desde 1985.

Conclusão

• Primeira evidência de TTSuV como contaminante celular.

• Resultados sugerem que a fonte da contaminação pode ter sido a tripsina.

• Contaminação existente no laboratório desde 1985 (Tireóide bovina-TB).

Obrigada !

Thais Fumaco TeixeiraDoutoranda PPGCV