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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JULIANA CARVALHÃES LAGO
ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA DE BIOMARCADORES DO
PROCESSO DE ENVELHECIMENTO DA PELE
CAMPINAS
2016
JULIANA CARVALHÃES LAGO
ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA DE BIOMARCADORES DO
PROCESSO DE ENVELHECIMENTO DA PELE
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Doutora em Ciências na Área de Concentração
em Clínica Médica.
ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Beatriz Puzzi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA
CARVALHÃES LAGO E ORIENTADA PELA PROFA.
DRA. MARIA BEATRIZ PUZZI
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências MédicasMaristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Lago, Juliana Carvalhães, 1982- L137a LagAnálise do perfil de expressão gênica de biomarcadores do processo de
envelhecimento da pele / Juliana Carvalhães Lago. – Campinas, SP : [s.n.],2016.
LagOrientador: Maria Beatriz Puzzi. LagTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Ciências Médicas.
Lag1. Envelhecimento da pele. 2. Biomarcadores. 3. Envelhecimento. 4.
Técnicas in vitro. 5. Fenômenos fisiológicos celulares - Efeitos da radiação. I.Puzzi, Maria Beatriz,1950-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdadede Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Gene expression profile analysis from biomarkers of skin agingprocessPalavras-chave em inglês:Skin agingBiomarkersAgingIn vitro techniquesCell physiological phenomena, Radiation effectsÁrea de concentração: Clínica MédicaTitulação: Doutora em CiênciasBanca examinadora:Maria Beatriz Puzzi [Orientador]Carmen Silvia BertuzzoCarolina Caliari OliveiraThiago Antônio Moretti de AndradeMaria José Vieria FonsecaData de defesa: 26-02-2016Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
JULIANA CARVALHÃES LAGO
ORIENTADOR: PROFA. DRA. MARIA BEATRIZ PUZZI
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MARIA BEATRIZ PUZZI
2. PROF. DR. THIAGO ANTÔNIO MORETTI DE ANDRADE
3. PROFA. DRA. MARIA JOSE VIEIRA FONSECA
4. PROFA. DRA. CARMEN SILVIA BERTUZZO
5. PROFA. DRA. CAROLINA CALIARI OLIVEIRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 26/02/2016
Insanidade é continuar fazendo sempre a mesma coisa e esperar
resultados diferentes.
Albert Einstein
Dedico esta tese aos meus pais
Edna e Donizeti,
que sempre foram condizentes com as minhas loucuras.
“Sim, sou muito louco, não vou me curar Já não sou o único que encontrou a paz
Mas louco é quem me diz E não é feliz, eu sou feliz”
Arnaldo Baptista - Rita Lee
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos:
À Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, por permitir e dar
suporte ao meu trabalho de doutorado, permitindo o uso de seus laboratórios;
À Professora e amiga Dra. Maria Beatriz Puzzi, por ter acreditado em mim, no meu trabalho
e no meu sonho. Por todo o suporte técnico, toda a orientação necessária e todo apoio que
eu precisei nestes anos;
Aos colegas Jussara e Paulo, por toda a ajuda nos momentos de crise laboratoriais;
À Natura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda, em especial à gestora Ana Paula de
Oliveira, por também acreditar no meu sonho e permitir que ele fosse possível;
Às amis Fabi, Carla, Lu e Dani por me acompanharem em todos esses anos de Natura e
sempre me incentivarem a continuar o doutorado, porque elas sabem que não é fácil, mas
no fim tudo dá certo;
Às malokinhas que, mesmo sem entender muito bem o que eu faço, sempre acreditaram e
admiraram meu trabalho;
Ao Tobias, o melhor parceiro que a vida poderia ter me dado para estar comigo neste
momento;
Ao meu irmão Daniel, por ser sempre um excelente exemplo a ser seguido e a Daniele, que
fez com que o que já era bom ficasse ainda melhor;
E aos meus pais Donizeti e Edna, que sempre foram exemplos de pessoas lutadoras e me
incentivaram a seguir meus sonhos.
RESUMO
Lago, J. C. ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA DE BIOMARCADORES DO
PROCESSO DE ENVELHECIMENTO DA PELE, 2016. Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, São Paulo, SP, Brasil.
Introdução: Nos últimos anos, tem-se observado o aumento no número de estudos
relacionados ao processo de envelhecimento da pele, devido principalmente ao interesse da
população em prevenir ou retardar o aparecimento dos sinais do tempo. O envelhecimento
da pele é decorrente de um processo natural do corpo humano e sofre influência direta do
background genético do indivíduo. Também pode sofrer com ação do ambiente externo,
intensificando as dermatoses comuns do envelhecimento.
Objetivo: Neste presente trabalho analisamos a expressão gênica de fibroblastos
humanos originários de indivíduos jovens e idosos, mantidos em cultura celular de
monocamada, a fim de se determinar um padrão gênico de envelhecimento da pele.
Metodologias e métodos: Utilizando fibroblastos humanos primários, comparamos
três modelos in vitro de envelhecimento, através da técnica de proliferação celular
acelerada, radiação UVB e células provenientes de doadores idosos, com relação ao seu
comportamento celular e gênico considerando 29 genes: CASP3, SIRT1, LMNA, COL1A1,
COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL7A1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10,
MMP12, MMP13, MMP14, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, IL1B, IL1A, IL6, IL8, IL10, TP53,
PTGS2 relacionados ao processo de envelhecimento da pele.
Resultados e discussão: Foi possível observar redução na velocidade de proliferação
celular nos modelos de envelhecimento quando comparados ao controle jovem sem
tratamento. Os resultados de expressão gênica foram analisados através da plataforma
Ingenuity Pathway Analysis e 12 genes foram identificados como potenciais biomarcadores
para o processo de envelhecimento da pele. Os genes COL1A1 e COL1A2, relacionados à
síntese de colágeno tipo I, demonstraram inibição de expressão enquanto os genes MMP1 e
MMP3, relacionados à degradação de matriz extracelular, apresentaram aumento,
corroborando sua importância no processo de envelhecimento da pele. Os genes
responsáveis pela síntese de citocinas pró-inflamatórias IL6, IL1A, IL1B e PTGS2
apresentaram inibição da expressão ao mesmo tempo em que o IL10, gene que codifica uma
citocina anti-inflamatória, apresentou aumento, sugerindo que estas citocinas atuam no
dano e recuperação da pele envelhecida. Além disso, os genes CXCL8, TP53 e LMNA também
foram positivamente modulados, sugerindo possuir papel importante no processo de
envelhecimento celular.
Conclusão: Os modelos in vitro de envelhecimento de pele, quando analisados
isoladamente, não apresentaram marcadores gênicos exclusivos porém, quando analisados
conjuntamente, foi possível identificar 12 genes como biomarcadores comuns entre os
modelos de envelhecimento, sendo eles COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B,
LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53. Deste modo, podemos concluir que é possível definir
um padrão gênico de envelhecimento da pele em modelos de cultura celular in vitro, nas
condições testadas.
Palavras chaves: envelhecimento da pele, envelhecimento celular, senescência, técnicas in
vitro, fenômenos fisiológicos celulares/ efeitos de radiação, marcadores biológicos.
ABSTRACT
Lago, J. C. GENE EXPRESSION PROFILE ANALYSIS FROM BIOMARKERS OF SKIN
AGING PROCESS, 2016. Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, São Paulo, SP, Brasil.
Introduction: In recent years, it has been observed an increase in the number of
works related to skin aging, due mainly to the interest of the population on prevent or delay
the signs of elderly on skin. Skin aging is the result of a natural process of human body and it
is influenced by genetic background. It also can be influenced by external environment,
intensifying regular dermatoses of elderly.
Objective: In this present work, we analyzed the gene expression of human
fibroblasts from young and elderly donors, maintained in monolayer cell culture, in order to
determine genetic pattern of skin aging.
Materials and Methodology: Using human primary fibroblasts, we compared three in
vitro skin aging models - cell proliferation technique, UVB radiation and cells from elderly
donors - regarding cellular and genetic behavior, using 29 genes: CASP3, SIRT1, LMNA,
COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL7A1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9,
MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, IL1B, IL1A, IL6, IL8, IL10,
TP53, PTGS2 related to skin aging process.
Results and discussion: It was possible to observe a decrease of cellular proliferation
rate on aging models when compared with young cell control, without treatment. The
results of gene expression were analyzed through Ingenuity Pathway Analysis platform and
12 genes were identified as common biomarkers of skin aging. The genes COL1A1 and
COL1A2, related to collagen type 1 synthesis, demonstrated inhibition of expression while
MMP1 and MMP3, related to extracellular matrix degradation, demonstrated increase,
corroborating their importance in the skin aging. The genes responsible for pro
inflammatory cytokines synthesis IL6, IL1A, IL1B and PTGS2 showed inhibition of expression
at the same time that IL10 gene, which encode an anti-inflammatory cytokine, demonstrated
increase suggesting that these cytokines can act on damage and recovery of aged skin.
Furthermore, the genes CXCL8, TP53 and LMNA were also positively modulated, suggesting
an important role on skin aging process.
Conclusion: In vitro skin aging models, when individually analyzed, did not identify
unique biomarkers however, when analyzed together, it was possible to identify 12 genes as
common biomarkers for skin aging, COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B, LMNA,
MMP1, MMP3, PTGS2, TP53. Thus, we can conclude that is possible to determine a genetic
pattern of skin aging in cell culture in vitro models, regarding established conditions.
Key words: biological markers, skin aging, cell aging, aging, in vitro techniques, cell
physiological phenomena
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Vierkötter A, Krutmann J. (2012) Environmental influences on skin aging and ethnic-specific
manifestations. Dermato-Endocrinology 4:3, 227–231 .............................................................. 20
Figura 2. Gordon JR, Brieva JC. (2012) Unilateral dermatoheliosis. N Engl J Med. Apr 19;366(16):e25.
..................................................................................................................................................... 22
Figura 3. Fotos da marcação do processo de senescência precoce induzido por stress nos fibroblastos
de doadores jovens , idosos e envelhecidos em modelos in vitro.. ............................................ 34
Figura 4. Velocidade de proliferação celular considerando o número de células em cultura. ... 36
Figura 5. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens
em tempo real através, obtida no ECIS® ..................................................................................... 37
Figura 6. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores idosos
em tempo real através, obtida no ECIS® ..................................................................................... 37
Figura 7. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens
replicados em tempo real através, obtida no ECIS® ................................................................... 38
Figura 8. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens
irradiados em tempo real através, obtida no ECIS® .................................................................... 38
Figura 9. Gráfico obtido através da análise da velocidade de proliferação celular, avaliada em tempo
real, através da determinação da resistência em relação ao tempo, obtida pela impedância no ECIS®
..................................................................................................................................................... 39
Figura 13. Gráfico do aumento relativo do gene COL1A1 das células envelhecidas, quando
comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ................................... 42
Figura 14. Gráfico do aumento relativo do gene COL1A2 das células envelhecidas, quando
comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ................................... 43
Figura 15. Gráfico do aumento relativo do gene MMP1 das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 44
Figura 16. Gráfico do aumento relativo do gene MMP3 das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 44
Figura 17. Gráfico do aumento relativo do gene LMNA das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 45
Figura 18. Gráfico do aumento relativo do gene TP53 das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 46
Figura 19. Gráfico do aumento relativo do gene PTGS2 das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 46
Figura 20. Gráfico do aumento relativo do gene IL1A das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 47
Figura 21. Gráfico do aumento relativo do gene IL1B das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 47
Figura 22. Gráfico do aumento relativo do gene IL6 das células envelhecidas, quando comparadas ao
controle de fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 48
Figura 23. Gráfico do aumento relativo do gene IL8 das células envelhecidas, quando comparadas ao
controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ............................................................. 48
Figura 24. Gráfico do aumento relativo do gene IL10 das células envelhecidas, quando comparadas
ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. ........................................................ 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Informações sobre os doadores jovens e idosos. .................................................................. 28
Tabela 2. Aumento relativo convertido em fold change....................................................................... 40
Tabela 3. Biomarcadores comuns entre os três modelos de envelhecimento de células da pele in
vitro, quando comparadas com as células dos doadores jovens. ......................................................... 41
LISTA DE SÍMBOLOS
Símbolo Entrez Gene Name
CASP3 caspase 3, apoptosis-related cysteine peptidase
COL1A1 collagen, type I, alpha 1
COL1A2 collagen, type I, alpha 2
COL3A1 collagen, type III, alpha 1
COL4A1 collagen, type IV, alpha 1
COL7A1 collagen, type VII, alpha 1
CXCL8 chemokine (C-X-C motif) ligand 8
IL6 interleukin 6
IL10 interleukin 10
IL1A interleukin 1, alpha
IL1B interleukin 1, beta
LMNA lamin A/C
MMP1 matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
MMP2 matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV
collagenase)
MMP3 matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)
MMP7 matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine)
MMP8 matrix metallopeptidase 8 (neutrophil collagenase)
MMP9 matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV
collagenase)
MMP10 matrix metallopeptidase 10 (stromelysin 2)
MMP12 matrix metallopeptidase 12 (macrophage elastase)
MMP13 matrix metallopeptidase 13 (collagenase 3)
MMP14 matrix metallopeptidase 14 (membrane-inserted)
PTGS2 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and
cyclooxygenase)
SIRT1 sirtuin 1
TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1
TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2
TIMP3 TIMP metallopeptidase inhibitor 3
TIMP4 TIMP metallopeptidase inhibitor 4
TP53 tumor protein p53
SumárioSumárioSumárioSumário 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 18
1.1 A pele e a cultura de fibroblastos ............................................................................... 18
1.2 Envelhecimento ........................................................................................................... 19
1.3 Modelos in vitro .......................................................................................................... 22
1.3.1 Modelos in vitro de envelhecimento celular ....................................................... 23
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 27
2.1 Objetivos específicos ................................................................................................... 27
3 METODOLOGIA .................................................................................................................... 28
3.1 Declaração de ética ..................................................................................................... 28
3.2 Fibroblastos de doadores jovens (Young) e idosos (Old) ............................................ 29
3.3 Fibroblastos de doadores jovens irradiados (Irradiated) ............................................ 29
3.4 Fibroblastos de doadores jovens replicados (Replicated) .......................................... 29
3.5 Determinação do processo de senescência prematura induzida por estresse .......... 30
3.6 Velocidade de proliferação celular.............................................................................. 30
3.6.1 Avaliação pela contagem do número de células ................................................. 30
3.6.2 Avaliação de proliferação celular em tempo real ............................................... 31
3.7 Extração de mRNA ....................................................................................................... 31
3.8 RT-PCR real time .......................................................................................................... 31
3.9 Genes analisados ......................................................................................................... 31
3.10 Aumento relativo ao controle ..................................................................................... 32
3.11 Fold change ................................................................................................................. 32
3.12 Análise estatística ........................................................................................................ 33
4 RESULTADOS ....................................................................................................................... 34
4.1 Determinação do processo de senescência prematura induzida por estresse em
fibroblastos humanos primários envelhecidos em modelo in vitro........................................ 34
4.2 Determinação da velocidade de proliferação celular de fibroblastos humanos primários
envelhecidos em modelo in vitro ............................................................................................ 35
4.2.1 Avaliação com contagem do número de células ................................................. 35
4.2.2 Avaliação de proliferação celular em tempo real. .............................................. 36
4.3 Expressão gênica diferencial dos fibroblastos submetidos aos modelos de envelhecimento
in vitro, comparados aos fibroblastos de doadores jovens .................................................... 39
4.4 Análise do network gênico no processo de envelhecimento ..................................... 40
4.5 Determinação de um padrão gênico de modelos celulares de envelhecimento da pele, in
vitro 41
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 50
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 54
7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................................... 55
7.1 PTGS2 .......................................................................................................................... 55
7.2 TP53 ............................................................................................................................. 56
7.3 IL10 .............................................................................................................................. 57
7.4 IL8 ................................................................................................................................ 58
7.5 IL6 ................................................................................................................................ 59
7.6 IL1A .............................................................................................................................. 60
7.7 IL1B .............................................................................................................................. 61
7.8 TIMP4 .......................................................................................................................... 62
7.9 TIMP3 .......................................................................................................................... 63
7.10 TIMP2 .......................................................................................................................... 64
7.11 TIMP1 .......................................................................................................................... 65
7.12 MMP14 ........................................................................................................................ 66
7.13 MMP13 ........................................................................................................................ 67
7.14 MMP12 ........................................................................................................................ 68
7.15 MMP10 ........................................................................................................................ 69
7.16 MMP9 .......................................................................................................................... 70
7.17 MMP8 .......................................................................................................................... 71
7.18 MMP7 .......................................................................................................................... 72
7.19 MMP3 .......................................................................................................................... 73
7.20 MMP2 .......................................................................................................................... 74
7.21 MMP1 .......................................................................................................................... 75
7.22 COL7A1 ........................................................................................................................ 76
7.23 COL4A1 ........................................................................................................................ 77
7.24 COL3A1 ........................................................................................................................ 78
7.25 COL1A2 ........................................................................................................................ 79
7.26 COL1A1 ........................................................................................................................ 80
7.27 LMNA ........................................................................................................................... 81
7.28 SIRT1 ............................................................................................................................ 82
7.29 CASP3 .......................................................................................................................... 83
7.30 Teste z ......................................................................................................................... 84
8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 86
9 APÊNDICES .......................................................................................................................... 90
10 ANEXOS ........................................................................................................................... 92
18
1111 INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
Os modelos celulares constituem uma rica ferramenta de exploração do perfil biológico
humano, permitindo estudos livres da influência do ambiente ou de situações não
controladas (1). A vantagem de estudos celulares para avaliação de processos fisológicos da
pele em ambientes controlados é favorecer a avaliação dos danos causados pelos
interferentes externos, que acentuam as variações cutâneas decorrentes do
envelhecimento.
1.11.11.11.1 A pele e a cultura de fibroblastosA pele e a cultura de fibroblastosA pele e a cultura de fibroblastosA pele e a cultura de fibroblastos
A pele é um órgão complexo, com muitas estruturas e mecanismos que conectam todo
o corpo, sendo o maior órgão do corpo humano. Tem como principal função agir como uma
interface entre o corpo e o ambiente externo (2). Localiza-se na parte do corpo mais exposta
à influência do ambiente, funcionando como uma barreira entre as agressões externas e o
restante do corpo, sofrendo frequentemente a ação direta relacionada à exposição
ambiental, incluindo à radiação UV e poluição do ar (3).
A pele é composta de duas camadas, a epiderme e a derme. A epiderme é a camada
mais externa, sendo a região que mais sofre agressões diretas do sol, vento e poluição.
Consiste de um tecido epitelial composto de queratinócitos em cinco camadas de
diferenciação celular, além de outros tipos celulares como melanócitos e as células de
Langerhans e Merkel (4).
Na epiderme, a camada basal, também chamada de germinativa, possui as células
mais indiferenciadas. Calcula-se que essa camada possa se renovar a cada 20 – 30 dias. Na
camada espinhosa, as células apresentam expansões citoplasmáticas, o que dá elas um
aspecto espinhoso, aproximando-as e mantendo-as unidas através dos desmossosmos. Já
na camada granulosa são observados os grânulos contendo queratina e substância
fosfolipídica que irá compor o material extracelular importante para tornar a camada
granulosa impermeável à água. Na camada lúcida, o núcleo celular e as organelas não
podem ser observados devido à digestão dos mesmos. Já a camada córnea é a região mais
queratinizada da pele, na qual se forma o strato córneo (4).
19
A derme é o tecido no qual se apóia da epiderme. É um tecido conjuntivo composto de
fibroblastos e outros tipos celulares que caracteriza-se principalmente pela riqueza de
material extracelular, entre eles fibras colagênicas, elásticas e macromoléculas como
glicosaminoglicanos entre outros (4).
São os fibroblastos os responsáveis pela síntese e organização da matriz extracelular
(MEC), que por sua vez permite a comunicação entre estas e outras células (1). Este tipo
celular é amplamente utilizado em estudos in vitro, dado sua simplicidade de cultura e fácil
manutenção. Dessa forma, o uso de modelos de cultura de fibroblastos in vitro tem se
tornado uma importante ferramenta no mundo científico, permitindo explorar hipóteses
biológicas sem a influência do ambiente (5).
1.21.21.21.2 EnvelhecimentoEnvelhecimentoEnvelhecimentoEnvelhecimento
Por ser um órgão que está em contato direto com o ambiente, a pele é
frequentemente exposta a agressores que com o tempo refletem e acentuam os sinais
visíveis do envelhecimento (6) (7). Em pessoas com exposição constante à radiação solar,
tais efeitos tendem a ser acelerados, caracterizando o envelhecimento precoce da pele (8).
Alterações na estrutura e fisiologia da pele são danos que ocorrem como consequência
natural do envelhecimento do indivíduo, e podem ser acentuadas quando combinados ao
estilo de vida mais exposto ao ambiente (9).
Grande parte dos danos causados, que como consequência promovem o
envelhecimento precoce da pele, é decorrente da ação do estresse oxidativo produzido pelo
excesso de exposição aos fatores ambientais prejudiciais. A exposição às altas intensidades
de radiação UV são consideradas a principal causa desse estresse, resultando em expressão
diferencial de enzimas antioxidantes endógenas, oxidação de proteínas e peroxidação
lipídica (10).
Além dos danos oxidativos lipidícos e proteicos que ocorrem devido a influência da
exposição ambiental, outros fatores (Figura 1) podem acentuar o processo de
envelhecimento precoce, como danos aos telômeros e ativação do Receptor de Aryl
Hidrocarbono – AhR (11).
20
Figura 1. Vierkötter A, Krutmann J. (2012) Environmental influences on skin aging and ethnic-specific manifestations. Dermato-Endocrinology 4:3, 227–231; http://dx.doi.org/10.4161/de.19858.
A ativação dos receptors de Aryl hidrocarbono estimula a síntese das
metaloproteinases, enzimas que contribuem para a degradação das proteínas da matriz
extracelular (11) (12) (13), como colágeno e elastina, que exercem papel importante na
sustentação da pele.
Já o encurtamento dos telômeros é um fenômeno conhecido no envelhecimento,
resultante dos processos oxidativos do metabolismo celular aeróbico. Durante a exposição
solar, a radiação UV promove alterações na molécula de DNA, também resultando neste
encurtamento (14).
As alterações causadas pela ação das espécies reativas de oxigênios incluem, além dos
danos oxidativos já conhecidos, danos ao DNA mitocondrial, alteração do nível intracelular
de cálcio e ativação de receptores de membrana celular, que podem reduzir a síntese de
colágeno e aumentar sua degradação (11).
21
Tanto a epiderme quanto a derme são afetadas pela exposição solar e radiação UV.
Esta áreas expostas ao sol são caracterizadas clinicamente envelhecidas quando
apresentam:
• Atrofia da pele: rugas com linhas finas e mais profundas;
• Hipertrofia da pele devido a elastose: perda de resistência à tração e aumento da
flacidez;
• Pele cérea: amarelada, brilhante e áspera;
• Pele ressecada;
• Telangiectasias e hemorragia devido à fragilidade de pequenos vasos;
• Hiperpigmentação: alterações na pigmentação da pele como surgimentos de
spots mais escuros;
• Ceratoses actinícas: lesões hiperceratóticas salpicadas nas áreas expostas à luz
(15) (16) (8).
A Figura 2 representa a influência do excesso de exposição solar nos sinais de
envelhecimento cutâneo. Nesta imagem um indivíduo de 69 anos de idade, dentre os quais
28 deles passou exercendo a função de motorista em ambiente aberto, apresenta sinais de
hiperceratose, com áreas de elastose e multiplos comedões, além de rugas mais profundas e
em maior número no lado direito da imagem, que coincide com o lado exposto à janela no
veículo (8).
22
Figura 2. Gordon JR, Brieva JC. (2012) Unilateral dermatoheliosis. N Engl J Med. Apr 19;366(16):e25. doi: 10.1056/NEJMicm1104059
Além das características visíveis, existem outras modificações que são percebidas no
processo de envelhecimento humano, como alteração da atividade celular e o
compactamento das junções derme-epiderme. Estudos indicam que existe uma diminuição
da quantidade sintetizada de colágeno e alterações em sua propriedade física além da
composição de glicosaminoglicanos também sofrer diminuição e alterações (7) (17).
A diminuição da atividade celular pode ser explicada em parte, pela diminuição do
tamanho dos telômeros, reduzidos durante o processo de divisão celular ou alta exposição à
radiação UV. Esse processo pode levar a célula a um comportamento de apoptose ou
senescência celular, muito comuns no envelhecimento (18) (19).
1.31.31.31.3 Modelos Modelos Modelos Modelos in vitroin vitroin vitroin vitro
Os ensaios in vitro representam uma ferramenta rica para exploração de tipos
celulares específicos. O estudo de hipóteses em experimentos biológicos utilizando modelos
de culutra celular simples representam grande vantagem devido a possibilidade de manter
ambientes livres de influência desconhecidas (20).
23
Atualmente, muitos grupos de pesquisa têm direcionado seus esforços para o
desenvolvimento de metodologias que visam reduzir a utilização de testes com animais,
principalmente nesta última década na qual modelos animais foram proibidos para
finalidades cosméticas.
Os modelos de cultura celular têm sido amplamente utilizados em substituição aos
modelos animais, apresentando resultados bastante reprodutíveis. Os experimentos com
culturas celulares possibilitam o entendimento e a análise de mecanismos envolvidos nos
processos biológicos, sendo mais facilmente manipuláveis (21).
Além disso, o uso de modelo de cultura celular in vitro utilizando células originárias de
doadores humanos apresenta perfil comportamental semelhante aos modelos in vivo,
reafirmando a hipótese que estudos em modelos celulares podem trazer respostas, sendo
uma excelente alternativa a estudos pré-clínicos, permitindo um screening inicial utilizando-
se técnicas simples e econômicas para comprovação da eficácia de seus produtos (22) (23)
(24) (25).
1.3.11.3.11.3.11.3.1 Modelos Modelos Modelos Modelos in vitroin vitroin vitroin vitro de envelhecimento celularde envelhecimento celularde envelhecimento celularde envelhecimento celular
O crescente interesse de empresas cosméticas no desenvolvimento de novos ativos e
moléculas que possuem meios de reverter ou inibir os efeitos dos sinais do tempo na pele
tem levado diversos grupos ao redor do mundo a desenvolverem diferentes modelos
celulares para avaliação de danos do envelhecimento. A utilização de células artificialmente
envelhecidas, apesar de comumente utilizadas, podem gerar respostas controvérsias, já que
não necessariamente mimetizam exatamente o processo de envelhecimento natural (26).
O processo de envelhecimento se dá de duas principais formas: intrínseco, processo
fisiológico do envelhecimento natural que tem influência do background genético do
indivíduo e extrínseco, que é diretamente influenciado pelos efeitos ambientais e varia
acentuadamente entre os indivíduos e entre as populações étnicas. Uma das principais
causas dessa diferença seria decorrente do tipo de pele que cada indivíduo apresenta,
porém diferenças gênicas e hábitos de vida também podem ser considerados fatores
decisórios no tipo de envelhecimento de pele que cada indivíduo apresentará (11).
É possível desencadear estes dois processos fisiológicos de envelhecimento nas células
utilizando técnicas e ferramentas laboratoriais capazes de simular a estimulação temporal na
24
pele, acelerando o processo de envelhecimento. A exposição à radiação UV confere à cultura
celular danos semelhantes aos causados pela exposição solar (27), enquanto o processo de
aceleração da replicação celular mimetiza os anos passados na vida do indivíduo, através do
aumento no número de divisões celulares (28). O uso de células de indivíduos idosos tem
sido utilizado como uma alternativa ao modelo de envelhecimento replicativo (29).
A atividade de senescência associada à beta-galactosidase é amplamente utilizada
como marcador para experimentos de senescência induzida em células (30). O
envelhecimento celular induzido por metodologias in vitro tem sido utilizado para estudos
de avaliação das alterações na fisiologia celular durante o processo de envelhecimento
porém, alguns cuidados devem ser utlizados para assegurar que as céulas estejam realmente
envelhecidas e não comprometa os resultado da pesquisa.
A utilização da marcação com o substrato X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-d-
galactopyranoside), através da sua reação com a enzima beta-galactosidase lisossomal,
suprime a atividade enzimática garantindo que toda célula senescente apareça marcada
(19).
Outra característica comum ao envelhecimento celular é a redução da velocidade com
que uma cultura celular consegue duplicar sua população (28). Experimentos que avaliem a
velocidade de proliferação celular em diferentes condições experimentais são utilizados na
validação dos modelos relacionados à estimulação do processo de envelhecimento precoce
induzido. Dois modelos foram utiizados neste trabalho: a contagem do número de células
pelo Scepter™ 2.0 Cell Counter e o ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing).
O contador de célula Scepter™ 2.0 Cell Counter utiliza-se do príncipio de Coulter para
detecção de partículas, baseada em Impedância. As células passam através de um sensor,
gerando um aumento da Resistência (determinada em Ohm’s) que causa subsequente
aumento da voltagem. As alterações de voltagem são identificadas como picos a cada
passagem de célula. Os picos de mesmo tamanho são agrupados em um histograma e
contados. O histograma permite a leitura dos dados quantitativos, de morfologia celular que
pode inda ser utilizados para avaliar a qualidade e saúde de sua cultura celular (31) (32).
O funcionamento do ECIS® é baseado na capacidade de detecção e quantificação de
alterações morfológicas, em sub-nanômetros de alcance. No ECIS®, uma pequena corrente
alternada é aplicada através de um eletrodo padrão, conectado ao equipamento. Isso resulta
25
num potencial (V) que passa através do eletrodo e é medido pelo instrumento. A Impedância
é determinada em Ohm’s. Quando as células são adicionadas ao array e aderem aos
eletrodos, elas agem como isoladores, aumentando a Impedância. Quando as células
proliferam e cobrem os eletrodos, a corrente é então impedida de passar (33).
Essa passagem de corrente está relacionada ao número de células, morfologia ou
natureza da ligação. O dado gerado é em formato de Impedância (determinada pela
Resistência) versus tempo.
Para avaliação do comportamento gênico das células nos três modelos propostos,
genes envolvidos em estudos de envelhecimento foram identificados e selecionados a fim de
se determinar seu papel neste processo.
A proteína de colágeno é um das principais proteínas que compõe a matriz
extracelular do nosso organismos, sendo o colágeno tipo 1 a mais abundante proteina nos
humanos. Ela está presente em grande quantidade na derme, ajudando a manter a
integridade de muitos tecidos através das interações com a superfície celular (34). Outros
tipos de colágenos também estão presentes promovendo uma rede organizacional para
pele, veias e artérias, ossos, tendões e outros tecidos. Acredita-se que sua tripla hélice seja
responsável pela sua resistência à maioria das proteases, com exceção das
metaloproteinases (35).
As metaloproteinases (MMPs) são enzimas conhecidas por exercer um papel
importante na invasão tumoral e nos processos de inflamação e envelhecimento da pele
(36). A radiação UV induz a expressão de algumas MMPs, que degradam o colágeno e outras
proteínas da matriz extracelular que compõe derme (37), causando as rugas e flacidez
características do envelhecimento cutâneo. Estudos referentes aos TIMPs, conhecidos
inibidores de metaloproteinases, demonstram que estas proteínas possuem importante
papel no processo de inibição da degradação de proteínas da matriz extracelular, sendo
chave no processo de prevenção do aparecimento dos sinais de envelhecimento na pele
(38).
Em um outro estudo envolvendo radiação UV e envelhecimento, foi comprovado que
a radiação UVB induz a expressão de IL1 e IL6, que associados a outros mediadores
inflamatórios gerados pelas espécies reativas de oxigênio, contribuem para o surgimento
dos danos cutâneos agudos e crônicos, comuns no envelhecimento (36).
26
O gene CASP3 é responsável pela codificação da proteína caspase 3, que tem papel
central na fase apoptótica celular. Sua ativação foi descrita como marcador em estudos com
protetores solares na exposição UV (39). Outro gene relacionado ao processo fisiológico da
célula em estudos de envelhecimento é o SIRT1, um gene com atuação importante em
estudos de manutenção da longevidade (40).
Mutações na laminina, proteína codificada pelo gene LMNA estão associadas a
diversas doenças, incluindo a Hutchinson-Gilford síndrome progéria. Essa síndrome causa o
envelhecimento precoce do indivíduo, caracterizado pelas doenças senis específicas do
processo de envelhecimento, além das dermatoses cutâneas características (41).
Estudos indicam que exista um padrão de envelhecimento comum para as diferentes
etnias na dermatose senil e que estas diferenças precisariam ser estudadas para se ter um
melhor direcionamento dos cuidados dermatológicos oferecidos à população (42). Apesar
destas diferenças, acredita-se que, de modo geral, numerosos mecanismos biológicos foram
desenvolvidos na pele ao longo do tempo para detectar estímulos ambientais variados, a fim
de manter a homeostase e proteger o organismo inteiro dos danos externos (43).
Neste trabalho, genes que compõe o processo fisiológico saudável da pele e que sofrem
variações durante o envelhecimento foram avaliados para verificar a existência de um
padrão gênico de envelhecimento cutâneo, considerando três modelos de envelhecimento
in vitro. Genes correspondentes aos processos inflamatórios e de manutenção de ciclo
celular também foram considerados para avaliação, dado sua relevância na fisiologia do
envelhecimento.
27
2222 OBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOS
Analisar a expressão gênica de fibroblastos humanos originários de indivíduos jovens e
idosos, mantidos em cultura celular em monocamada, além de células envelhecidas em
modelos de exposição à luz UVB e passagem celular in vitro.
2.12.12.12.1 Objetivos especíObjetivos especíObjetivos especíObjetivos específicosficosficosficos
1. Análise da diferença de expressão gênica entre células de indivíduos jovens e idosos
através da técnica de RT-PCR real time;
2. Análise da diferença de expressão gênica entre células de indivíduos jovens e
envelhecidas em modelo in vitro (UV e passagem celular) através da técnica de RT-
PCR real time;
3. Determinação de um padrão de envelhecimento da pele, através da análise de
expressão gênica das células de indivíduos idosos e envelhecidas em modelos in vitro.
28
3333 METODOLOGIAMETODOLOGIAMETODOLOGIAMETODOLOGIA
3.13.13.13.1 Declaração de éticaDeclaração de éticaDeclaração de éticaDeclaração de ética
Culturas primárias de fibroblastos humanos de doadores saudáveis jovens e idosos
foram obtidas de pele oriunda de postectomia realizadas pelo grupo de cirurgia pediátrica e
blefaloplastias realizadas pelo grupo de plástica oftalmológica da Faculdade de Ciências
Médicas da UNICAMP. Todos os procedimentos utilizando as células humanas, referentes ao
projeto de pesquisa FR378403 foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da
FCM/UNICAMP no dia 26/01/2011.
Os participantes maiores de 18 anos forneceram seu consentimento para
participação neste estudo assinando o TCLE (termo de consentimento livre e esclarecido), de
acordo com a Resolução 196/96 . Para os participantes menores de 18 anos, o
consentimento para participação neste estudo foi fornecido pelos responsáveis que
assinaram o TCLE, de acordo com a Resolução 196/96.
Tabela 1. Informações sobre os doadores jovens e idosos.
Doador Grupo Idade Gênero
Doador 2 Jovens 7 masculino
Doador 4 Jovens 7 masculino
Doador 5 Jovens 8 masculino
Doador 6 Jovens 7 masculino
Doador 7 Jovens 9 masculino
Doador 8 Jovens 7 masculino
Doador 9 Idosos 59 feminino
Doador 10 Idosos 59 feminino
Doador 11 Idosos 50 feminino
Doador 12 Idosos 62 feminino
Doador 13 Idosos 53 feminino
29
3.23.23.23.2 Fibroblastos de doadores jovens (Young)Fibroblastos de doadores jovens (Young)Fibroblastos de doadores jovens (Young)Fibroblastos de doadores jovens (Young) e idosos (Old)e idosos (Old)e idosos (Old)e idosos (Old)
As culturas de fibroblastos humanos de doadores jovens saudáveis (menores que 10
anos de idade) foram obtidas a partir de pele proveniente de postectomia. As culturas de
fibroblastos humanos de doadores com mais de 50 anos de idade foram obtidas a partir de
pele proveniente de blefaropastia.
Os explants foram cortados em fragmentos de aproximadamente 5mm2 e
acondicionados numa placa de petri estéril, separadamente, com 5mL de tripsina da
INVITROGEN, para separar a derme da epiderme. Após 4 horas, adicionou-se 5mL de meio
M199 da GIBCO + 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) da NUTRICELL, para neutralização do
efeito da tripsina e centrifugou-se por 5 minutos com 2000rpm. Após isso, a derme foi
transferida para um frasco de cultura celular com 10mL de meio M199 + 10% SFB por no
mínimo 24 horas. As células foram replicadas no máximo 5 vezes e o mRNA extraído.
3.33.33.33.3 Fibroblastos Fibroblastos Fibroblastos Fibroblastos de doadores jovens irradiados (Ide doadores jovens irradiados (Ide doadores jovens irradiados (Ide doadores jovens irradiados (Irradiated)rradiated)rradiated)rradiated)
As culturas de fibroblastos humanos de doadores jovens saudáveis replicada no
máximo 5 vezes, foi submetida à 1J/cm² de radiação UVB, aplicados em quatro séries de
0,25J/cm² de radiação, utilizando meio de cultura Hanks da SIGMA, sem SFB e o Bio-Sun
(Vilber Lourmat), com 24 horas de pausa entre cada nova irradiação. Após 24 horas da
última irradiação, o mRNA foi extraído.
3.43.43.43.4 Fibroblastos de doadores jovens replicadosFibroblastos de doadores jovens replicadosFibroblastos de doadores jovens replicadosFibroblastos de doadores jovens replicados (R(R(R(Replicated)eplicated)eplicated)eplicated)
As culturas de fibroblastos humanos de doadores jovens saudáveis foram mantidas
em cultura por 20 ciclos de repique utilizando tripsina, até alcançar uma senescência
prematura confirmada pela redução da velocidade de proliferação. Após a sequência de
ciclos, o mRNA foi extraído.
30
3.53.53.53.5 Determinação do processo de Determinação do processo de Determinação do processo de Determinação do processo de ssssenescência enescência enescência enescência pppprematura rematura rematura rematura iiiinduzida nduzida nduzida nduzida por por por por estresseestresseestresseestresse
As culturas celulares de doadores idosos, irradiadas e replicadas foram mantidas em
incubadora celular, à 37°C, 5%CO2 por 24 horas após cada tratamento de envelhecimento
celular para indução do envelhecimento precoce. As células irradiadas foram submetidas à
radiação UVB, simulando o envelhecimento extrínseco da pele, enquanto as células
replicadas foram submetidas a um processo de divisão celular acelerado, simulando o
envelhecimento intrínseco da pele. As células dos doadores idosos também foram avaliadas
quanto seu nível de senescência celular em cultura.
As células de doadores jovens foram mantidas em cutlura nas mesmas condições,
como controle positivo. Passado este período, removeu-se o meio de cultura das células e
lavou-se 2 vezes com solução tampão fosfato-salino (PBS – Sigma Aldrich). Após a lavagem,
adicionou-se a solução fixadora por 6 minutos. Após este período, a solução foi removida e
as células lavadas novamente com PBS e incubadas com a solução corante X-GAL. As
culturas foram protegidas da luz e incubadas em estufa seca a 37⁰C, overnight. Após esse
período, removeu-se a solução corante, lavou-se os poços 2x com PBS a avaliou-se a
marcação obtida em microscópio invertido para visualização de culturas celulares.
3.63.63.63.6 Velocidade de proliferação celularVelocidade de proliferação celularVelocidade de proliferação celularVelocidade de proliferação celular
Para determinação da velocidade de proliferação celular nos modelos de
envelhecimento foram realizadas duas metodologias:
3.6.13.6.13.6.13.6.1 Avaliação Avaliação Avaliação Avaliação pelapelapelapela contagem do número de células contagem do número de células contagem do número de células contagem do número de células
Os fibroblastos humanos primários de doadores jovens foram plaqueados em duas
placas de 6 poços, sendo um poço para cada doador, com 2x104 células/poço em meio de
cultura M199 + 10%SFB a 37°C e 5%CO2. O mesmo foi realizado para os fibroblastos de
doadores idosos, jovens envelhecidos por irradiação e replicação. Após 72 horas, retirou-se
o meio de cultura de uma das placas, referente à leitura do dia 3, tripsinou-se as células até
que todas estivessem descoladas do fundo do poço. Em seguida, inativou-se a ação da
tripsina adicionando 2mL de meio M199 + 10%SFB. Fez-se a leitura da quantidade de células
31
em cada poço utilizando o contador de células Scepter™ 2.0 Cell Counter (Merck Millipore).
Este protocolo foi repetido igualmente para os dias 3 e 6.
3.6.23.6.23.6.23.6.2 Avaliação de proliferação celular em tempo real Avaliação de proliferação celular em tempo real Avaliação de proliferação celular em tempo real Avaliação de proliferação celular em tempo real
Os fibroblastos humanos primários de doadores jovens foram plaqueados em um
array adaptado para cultura celular em 8 poços, específica para uso do equipamento ECIS®,
sendo um poço para cada doador em cada array, com 1x104 células/poço em meio de
cultura M199 + 10% SFB a 37⁰C e 5%CO2. O mesmo foi realizado para os fibroblastos de
doadores idosos, jovens envelhecidos por irradiação e replicação. Foi adicionado meio de
cultura M199 + 10% SFB a um dos poços sem células como controle. Conectou-se cada um
dos arrays no conector ligado ao equipamento. A análise da proliferação celular em tempo
real foi realizada de acordo com o protocolo ECIS®, durante 60 horas utilizando Frequência à
4000 Hz. A leitura foi determinada em resistência (Ohm’s) para cada doador.
3.73.73.73.7 Extração de mRNAExtração de mRNAExtração de mRNAExtração de mRNA
O mRNA dos fibroblastos foi extraído de acordo com o método descrito para o
RNeasy mini kit, da Qiagen. Após a extração, utilizou-se o espectrofotômetro NanoDrop ND-
1000 (THERMO SCIENTIFIC) para quantificar e avaliar a pureza do mRNA extraído.
3.83.83.83.8 RTRTRTRT----PCR real PCR real PCR real PCR real timetimetimetime
O cDNA foi sintetizado utilizando o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da
Applied Biosystems. A análise do PCR em tempo real foi realizada de acordo com o protocolo
taqman, da Applied Biosystems, utilizando primers inventoriados taqman e o termociclador
Rotorgene 3000 (CORBETT RESEARCH – QIAGEN).
3.93.93.93.9 Genes analisadosGenes analisadosGenes analisadosGenes analisados
Os genes analisados neste trabalho foram selecionados de acordo com a
característica das proteínas que sintetizam. Os genes COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1,
32
COL7A1 são responsáveis pela síntese de colágeno, uma importante proteína estrutural da
pele; os genes MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13,
MMP14 são genes que codificam enzimas metaloproteinases, capazes de degradar proteínas
da matriz extracelular; TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4 são genes que sintetizam proteínas
capazes de inibir a ação das metaloproteinases; IL1B, IL1A, IL6, IL8, IL10 participam da
cascata inflamatória e possuem papel importante no processo de envelhecimento e danos
cutâneos; TP53 é um importante marcador de divisão celular; CASP3, gene que codifica uma
proteína importante para o processo apoptótico; LMNA codifica uma proteína que, quando
mutada, resulta em diversas síndromes entre elas a progéria, relacionada ao envelhecimento
precoce do indivíduo; SIRT1, gene que codifica uma proteína de grande importância em
estudos de longevidade e envelhecimento.
3.103.103.103.10 Aumento relativo ao controleAumento relativo ao controleAumento relativo ao controleAumento relativo ao controle
O aumento relativo ao controle foi determinado utilizando a análise de ΔΔCt,
considerando o fibroblasto de doadores jovens como controle da reação. Utilizando-se o Ct
obtido No experimento de PCR real time com todas as amostras celulares, o ΔCt foi
determinado comparando os valores de Ct do gene de interesse com o do gene endógeno.
Após esta análise, determinou-se o ΔΔCt, no qual a comparação foi feita entre os ΔCt
obtidos das amostras com o controle jovem, sendo o controle sempre igual a 1.
3.113.113.113.11 Fold Fold Fold Fold cccchangehangehangehange
Os Cts obtidos das amostras de doadores de cada grupo foram agrupados e então, foi
obtida a média de cada grupo. A partir desta média, o aumento relativo foi determinado
pela análise de ΔΔCt, utilizando o modelo de doadores jovens como controle. Com os valores
de aumento relativo foi possível determinar o fold change das amostras utilizando os
parâmetros do Ingenuity. O valor desta relação foi convertido no seu inverso negativo (-1/x)
para valores entre 0 e 1. A relação de aumento relativo, de valor igual a 0,5 foi convertida
para -2, que representa a molécula duas vezes downregulated. Os valores acima de 1 não
foram afetados.
33
3.123.123.123.12 Análise estatísticaAnálise estatísticaAnálise estatísticaAnálise estatística
A significância estatística entre os grupos dos modelos de envelhecimento, utilizando
o valor de Ct do experimento de PCR em tempo real, foi obtida pelo teste ANOVA no
programa XLSTAT 2007, sendo considerados significativos valores de P<0,05. Já a
significância estatística entre os grupos dos modelos de envelhecimento para avaliação de
proliferação celular por contagem de células foi obtida pelo teste Z no programa XLSTAT
2007, sendo considerados significativos, valores de P<0,05.
34
4444 RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS
4.14.14.14.1 Determinação do processo de Determinação do processo de Determinação do processo de Determinação do processo de ssssenescência enescência enescência enescência pppprematura rematura rematura rematura iiiinduzida nduzida nduzida nduzida por por por por estresseestresseestresseestresse em em em em fibroblastos humanos primáriosfibroblastos humanos primáriosfibroblastos humanos primáriosfibroblastos humanos primários envelhecidos em modelo envelhecidos em modelo envelhecidos em modelo envelhecidos em modelo in vitroin vitroin vitroin vitro
Os fibroblastos dos doadores jovens foram avaliados quanto à promoção da
senescência prematura induzida por estresse, característico do processo de envelhecimento
celular.
As células coradas em azul indicam atividade da enzima β-galactosidase pela sua
reação com o corante X-GAL, indicando efeito positivo para o processo de envelhecimento
precoce induzido.
3a 3b
3c 3d
Figura 3. Fotos da marcação do processo de senescência precoce induzido por stress nos fibroblastos de doadores jovens , idosos e envelhecidos em modelos in vitro. 1a – fibroblastos humanos primários de doadores jovens, representando o controle da reação. A ausência de coloração indica que as células não estão em processo de senescência celular. 1b – fibroblastos humanos primários de doadores idosos. A cor azul indica atividade da enzima β-galactosidase que reagiu com o corante X-GAL. 1c – fibroblastos humanos primários de doadores jovens envelhecidos por irradiação UVB, 1J/cm2. A cor azul indica atividade da enzima β-galactosidase que reagiu com o corante X-GAL. 1d – fibroblastos humanos primários de doadores jovens envelhecidos por aceleração do processo de divisão celular. A cor azul indica atividade da enzima β-galactosidase que reagiu com o corante X-GAL.
35
É possível observar nas culturas celulares submetidas ao estresse do processo de
envelhecimento precoce induzido (Figura 3c e 3d) a atividade aumentada da enzima β-
galactosidase, representada pela coloração azul devido à reação com o corante X-GAL.
Os fibroblastos de doadores idosos (Figura 3b) que foram mantidos em cultura, apesar
do número reduzido de células coradas, também apresentaram as células em processo de
senescência celular quando colocadas em cultura. Por serem provenientes de adultos com
mais de 50 anos de idade, estão envelhecidos naturalmente.
As células jovens (Figura 3a) que não foram submetidas a nenhum tratamento de
envelhecimento não apresentaram tal coloração.
4.24.24.24.2 Determinação da velocidade de proliferação celular Determinação da velocidade de proliferação celular Determinação da velocidade de proliferação celular Determinação da velocidade de proliferação celular de de de de fibroblastos humanos fibroblastos humanos fibroblastos humanos fibroblastos humanos primários envelhecidos em modelo primários envelhecidos em modelo primários envelhecidos em modelo primários envelhecidos em modelo in vitroin vitroin vitroin vitro
4.2.14.2.14.2.14.2.1 Avaliação com Avaliação com Avaliação com Avaliação com contagem do número de células contagem do número de células contagem do número de células contagem do número de células
Todos os grupos celulares foram plaqueados inicialmente com o mesmo número de
células, equivalente a 2x104 célula/poço. O crescimento foi avaliado considerando a média
de todos os doadores de um mesmo grupo. A proliferação celular obtida nos diferentes
modelos de envelhecimento in vitro foi menor quando comparados ao controle jovem
(Figura 4, p-valor 0,002 para idosos e irradiados; p-valor 0,02 para envelhecidos por
passagem celular).
Para os fibroblastos de doadores jovens, o número de células nos dias 3 e 6 foi
equivalente a 1,14x105 e 1,79x105 respectivamente. Esse resultado representa aumento
significativo em relação ao seu controle no dia 0, p-valor<0,0001. Já para os fibroblastos de
doadores idosos, a contagem de número de células nos dias 3 e 6 foi equivalente a
2,52x104e 3,26x104 respectivamente, resultando em aumento significativo em relação ao
controle no dia 0, p-valor<0,0001. As células envelhecidas por radiação UVB obtiveram o
número de células nos dias 3 e 6 equivalentes a 2,65x104 e 3,41x104 respectivamente, o que
representa um aumento estatisticamente significativo em relação ao seu controle do dia 0,
p-valor 0,001. As células envelhecidas por passagem celular apresentaram valores de
36
contagem celular equivalente a 2,70x104 e 2,58x104 para os dias 3 e 6 respectivamente.
Estes valores não representaram aumento significativo em relação ao seu controle do dia 0.
Figura 4. Velocidade de proliferação celular considerando o número de células em cultura. Teste Z para estatística do experimento. (P-valor <0,0001 para young; P-valor <0,0001 para old; P-valor <0,001 para irradiated; P-valor 0,665 para replicative).
4.2.24.2.24.2.24.2.2 Avaliação de proliferação celular em tempo real. Avaliação de proliferação celular em tempo real. Avaliação de proliferação celular em tempo real. Avaliação de proliferação celular em tempo real.
Neste experimento, avaliamos o aumento da população celular, em tempo real,
através da impedância medida pelo equipamento ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance
Sensing) ao longo do tempo.
É possível observar no experimento utilizando as células de doadores jovens (Figura 5)
que a proliferação celular se mantém constante quando avaliamos o mesmo doador, em
duplicata. Entretanto, existe uma variação entre os diferentes doadores como o doador 5,
que apresenta maior valor de impedância, dada aqui em Resistência (Ohm’s).
Dia 0 Dia 3 Dia 6
young 2,00E+04 1,14E+05 1,79E+05
old 2,00E+04 2,52E+04 3,26E+04
irradiated 2,00E+04 2,65E+04 3,41E+04
replicative 2,00E+04 2,70E+04 2,58E+04
0,00E+00
5,00E+04
1,00E+05
1,50E+05
2,00E+05
2,50E+05
nú
me
ro d
e c
élu
las
Crescimento Celular
37
Figura 5. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens em tempo real através, obtida no ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). A amostra controle se refere ao poço com meio de cultura sem células.
Na Figura 6, considerando as células de doadores idosos, verifica-se que a proliferação
celular apresentou aumento constante, sendo o maior aumento verificado nos doadores 13
e 10.
Figura 6. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores idosos em tempo real através, obtida no ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). A amostra controle se refere ao poço com meio de cultura sem células.
No experimento utilizando células replicadas (Figura 7), observa-se um aumento
constante de proliferação celular, com variação entre os todos os doadores avaliados.
Controle
Proliferação celular dos fibroblastos de doadores idosos
Doador 9
Doador 10
Doador 11 Doador 12
Doador 13
Controle
Doador 12
Doador 10
Doador 11
Doador 13
Controle
Doador 12
38
Figura 7. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens replicados em tempo real através, obtida no ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). A amostra controle se refere ao poço com meio de cultura sem células.
No experimento utilizando as células de doadores irradiados (Figura 8), é possível
observar aumento constante na proliferação celular, com o doador 7i apresentando maior
aumento. O comportamento referente ao doador 5i indica um possível pico de crescimento
no início do experimento seguido de morte celular.
Figura 8. Avaliação do comportamento de proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens irradiados em tempo real através, obtida no ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). A amostra controle se refere ao poço com meio de cultura sem células.
Doador 5p
Proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens replicados
Doador 6p
Doador 2p
Doador 8p
Doador 4p
Controle
Doador 7p
Doador 2i
Proliferação celular dos fibroblastos de doadores jovens irradiados
Doador 4i
Doador 7i
Doador 8i
Doador 5i
Controle
Doador 6i
39
A impedância medida pelo instrumento ECIS® na 35ª hora do experimento, para cada
doador, foi avaliada e em seguida determinou-se a média de cada grupo. O resultado foi
comparado ao o grupo controle de doadores jovens (Figura 9).
Figura 9. Gráfico obtido através da análise da velocidade de proliferação celular, avaliada em tempo real, através da determinação da resistência em relação ao tempo, obtida pela impedância no ECIS® (Electric Cell-substrate Impedance Sensing). A coloração vermelha indica aumento da Impedância, em relação ao controle jovem.
Foi possível observar que nos três modelos de envelhecimento houve aumento da
impedância, medida em Resistência (Ohm's). O aumento da impedância está relacionado ao
aumento da proliferação celular ou alterações em sua morfologia.
4.34.34.34.3 EEEExpressão gênica xpressão gênica xpressão gênica xpressão gênica diferencial dos fibroblastos submetidos aosdiferencial dos fibroblastos submetidos aosdiferencial dos fibroblastos submetidos aosdiferencial dos fibroblastos submetidos aos modelos de modelos de modelos de modelos de envelhecimento envelhecimento envelhecimento envelhecimento in vitroin vitroin vitroin vitro, comparado, comparado, comparado, comparados aoss aoss aoss aos fibroblastos de doadores jovensfibroblastos de doadores jovensfibroblastos de doadores jovensfibroblastos de doadores jovens
Neste experimento, determinou-se o aumento relativo da expressão gênica entre os
três modelos de envelhecimento in vitro, comparando-os com os fibroblastos de doadores
jovens em 29 genes relacionados ao processo de envelhecimento da pele: CASP3, SIRT1,
LMNA, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL7A1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8,
MMP9, MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, IL1B, IL1A, IL6,
IL8, IL10, TP53, PTGS2. Após isso, a relação foi convertida em fold change e agrupada (Tabela
293,64
441,86
561,77
385,07
0
100
200
300
400
500
600
700
800
jovem velho passagem irradadas
Mé
dia
Re
sist
ên
cia
(oh
ms)
Velocidade de crescimento celular - ECIS
jovem
velho
passagem
irradadas
40
2). Os resultados demonstraram expressão gênica diferencial entre os modelos de
envelhecimento e os doadores jovens, indicando que é possível realizar experimentos de
envelhecimento utilizando metodologias in vitro.
Tabela 2. Aumento relativo convertido em fold change.
irradiated old replicative
CASP3 -750,88 -175,99 -1461,67
SIRT1 -1,13 3,19 -3,22
LMNA 1,43 1,08 -2,65
COL1A1 -7,95 -2,43 -7,58
COL1A2 -3,02 18,09 -4,83
COL3A1 -2,38 2,78 1,10
COL4A1 1,00 -1,09 -2,87
COL7A1 4,77 -1,30 2,25
MMP1 1,15 -1,98 -9,11
MMP2 -2,18 1,03 -60,80
MMP3 8,25 -4,66 41,26
MMP7 -53,59 -461,89 -6,58
MMP8 -1,26 -5,36 -5,08
MMP9 19173,23 -1,57 -1,20
MMP10 63,92 -38,76 3,47
MMP12 6,86 8,69 8,17
MMP13 1,05 5,63 6,62
MMP14 2,91 1,32 1,86
TIMP1 3,47 2,26 -1,52
TIMP2 2,35 1,81 -2,22
TIMP3 -11,34 -1,77 -848,65
TIMP4 4,23 -1,44 -1,31
IL1B -16,09 -382,79 -9,04
IL1A -23,61 -37120,19 -6,03
IL6 -5,87 -2,01 -73,91
IL8 6,04 9,70 35,04
IL10 76,56 108,81 113,44
TP53 1,78 -1,20 -5,41
PTGS2 -9,87 -4,53 -1,74
4.44.44.44.4 Análise do Análise do Análise do Análise do network gênico no network gênico no network gênico no network gênico no processo de enprocesso de enprocesso de enprocesso de envelhecimento velhecimento velhecimento velhecimento
Durante o envelhecimento, as células podem sofrer alterações em seu metabolismo
após muitas replicações ou exposição a danos externos excessivos, que podem causar sinais
visíveis de envelhecimento na pele (11). Foram comparados fibroblastos de doadores jovens,
envelhecidos em modelo in vitro e idosos, em relação a sua expressão gênica, a fim de se
observar a existência da influência do envelhecimento na fisiologia celular.
41
Foi possível observar diferença na expressão gênica quando comparou-se os
fibroblastos de doadores jovens com os modelos de envelhecimento celular sendo 12 genes
(COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B, LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53)
considerados biomarcadores elegíveis para este modelo, entretanto não foi possível
identificar biomarcadores exclusivos para nenhum dos casos.
4.54.54.54.5 Determinação de um padrão gênico de modelos celulares de envelhecimento da Determinação de um padrão gênico de modelos celulares de envelhecimento da Determinação de um padrão gênico de modelos celulares de envelhecimento da Determinação de um padrão gênico de modelos celulares de envelhecimento da
pele, pele, pele, pele, in vitroin vitroin vitroin vitro
A fim de se determinar um padrão de envelhecimento celular da pele em diferentes
modelos in vitro, compararam-se os três modelos de envelhecimento propostos neste
estudo, considerando análise de expressão gênica, e os genes COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6,
IL10, IL1A, IL1B, LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53 foram diferentemente expressos,
quando comparados ao controle de doadores jovens e considerados biomarcadores comuns
entre os modelos de envelhecimento in vitro (Tabela 3).
Tabela 3. Biomarcadores comuns entre os três modelos de envelhecimento de células da pele in vitro, quando comparadas com as células
dos doadores jovens.
Symbol Entrez Gene Name Location Family Replicative Irradiated Old P-value
COL1A1 collagen, type I, alpha 1
Extracellular Space
other -7,58 -7,95 -2,43 >0,0001
COL1A2 collagen, type I, alpha 2
Extracellular Space
other -4,83 -3,02 18,09 >0,0001
MMP1 matrix metallopeptidase 1
Extracellular Space
peptidase -9,11 1,16 -1,98 >0,0001
MMP3 matrix metallopeptidase 3
Extracellular Space
peptidase 41,26 8,25 -4,66 >0,0001
LMNA lamin A/C Nucleus other -2,65 1,43 1,08 >0,0001
TP53 tumor protein p53 Nucleus transcription regulator
-5,41 1,78 -1,20 >0,0001
PTGS2 prostaglandin-endoperoxide
synthase 2 (prostaglandin G/H
Cytoplasm enzyme -1,74 -9,87 -4,53 >0,0001
42
synthase and cyclooxygenase)
IL1A interleukin 1, alpha Extracellular Space
cytokine -6,03 -23,61 -37120,2 >0,0001
IL1B interleukin 1, beta Extracellular Space
cytokine -9,04 -16,09 -382,79 >0,0001
IL6 interleukin 6 Extracellular Space
cytokine -73,91 -5,87 -2,01 >0,0001
CXCL8 chemokine (C-X-C motif) ligand 8
Extracellular Space
cytokine 35,04 6,04 9,70 >0,0001
IL10 interleukin 10 Extracellular Space
cytokine 113,44 76,57 108,81 >0,0001
Foram avaliados individualmente o comportamento dos genes biomarcadores, em
cada condição experimental, a fim de se verificar os resultados obtidos no processo de
envelhecimento. Os genes que foram downregulated quando comparados ao controle
jovem, foram identificados com a coloração verde enquanto os genes que foram
upregulated quando comparados ao controle jovem, foram identificados com a coloração
vermelha.
O gene COL1A1 apresentou redução de sua expressão nos três modelos de
envelhecimento, indicando um comportamento semelhante ao esperado na pele
envelhecida (Figura 10).
Figura 10. Gráfico do aumento relativo do gene COL1A1 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
1,00
0,13 0,13
0,41
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
CO
L1A
1 g
en
e e
xpre
ssio
nre
lati
ve in
cre
ase
(ra
tio
)
* *
43
Já o gene COL1A2 apresentou redução de sua expressão nos modelos de
envelhecimento in vitro porém foi upregulated no modelo de fibroblastos de doadores
idosos. Este resultado indica um comportamento semelhante ao esperado na pele
envelhecida para os modelos in vitro porém não se reproduz no modelo de célula
envelhecida naturalmente, indicando que possivelmente a perda da sinalização sistêmica do
ambiente envelhecido fez com que este gene não mantivesse seu comportamento
envelhecido (Figura 11).
Figura 11. Gráfico do aumento relativo do gene COL1A2 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens,
utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene MMP1 apresentou aumento de sua expressão nos modelos de
envelhecimento por irradiação UVB in vitro, porém foi downregulated nos outros dois
modelos de envelhecimentos. Este resultado corrobora os dados de envelhecimento da pele,
indicando que a alta exposição à radiação solar aumenta a síntese de enzimas de degradação
de matriz extracelular (Figura 12).
1,000,33 0,21
18,09
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
CO
L1A
2 g
en
e e
xpre
ssio
nre
lati
ve in
cre
ase
(ra
tio
)
*
* *
44
Figura 12. Gráfico do aumento relativo do gene MMP1 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene MMP3 apresentou aumento de sua expressão nos dois modelos de
envelhecimento in vitro, porém foi downregulated no modelo de envelhecimento natural da
pele. É possível inferir que os modelos in vitro de avaliação do comportamento gênico para o
envelhecimento da pele necessitam de uma sinalização externa para estimulação deste
comportamento. Além disso, este resultado corrobora os dados de envelhecimento da pele
o qual sugerem que no envelhecimento da pele tem-se o aumento da síntese de enzimas de
degradação de matriz extracelular (Figura 13).
Figura 13. Gráfico do aumento relativo do gene MMP3 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
1,00
1,15
0,11
0,50
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
MM
P1
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
1,008,25
41,26
0,210,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
MM
P3
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
*
45
O gene LMNA (Figura 14) é responsável pela síntese de diferentes proteínas
chamadas lamininas. A expressão do gene LMNA mostrou-se aumentada nos modelos de
envelhecimento por irradiação e nas células envelhecidas naturalmente, porém foi
downregulated no modelo cujo o processo de proliferação celular foi acelerado, inferindo
que possivelmente o aumento de sua expressão esteja relacionada com o processo de
envelhecimento.
Figura 14. Gráfico do aumento relativo do gene LMNA das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene TP53 codifica a proteína p53, que tem papel fundamental no controle do
processo de proliferação celular. Podemos observar aqui o aumento da expressão do gene
TP53 (Figura 15) na condição de envelhecimento por irradação UV, mas não nos modelos de
células de idosos ou envelhecidas por passagem, acentuando a importância da presença da
proteína p53 na inibição do surgimento de células tumorigênicas pelo causada pelo excesso
de exposição ao sol.
1,00
1,43
0,38
1,08
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
LM
NA
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
*
46
Figura 15. Gráfico do aumento relativo do gene TP53 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene PTGS2 codifica a enzima COX-2, presente apenas em áreas em processo de
inflamação no corpo humano. Este gene, nos três modelos de envelhecimento avaliados
neste trabalho apresentou redução de sua expressão (Figura 16).
Figura 16. Gráfico do aumento relativo do gene PTGS2 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
1,00
1,78
0,18
0,83
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
TP
53
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
ese
(ra
tio
)
*
*
1,00
0,10
0,57
0,22
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
PTG
S2 g
en
e e
xpre
ssio
nre
lati
ve in
cre
ase
(ra
tio
)
47
O gene IL1A e IL1B codificam as interleucinas IL1α e IL1β, citocinas pró-inflamatórias.
Estes genes, nos três modelos de envelhecimento avaliados neste trabalho, apresentaram
redução de sua expressão (Figura 17 e Figura 18).
Figura 17. Gráfico do aumento relativo do gene IL1A das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
Figura 18. Gráfico do aumento relativo do gene IL1B das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene IL6 codifica a interleucina IL6, uma citocina pró-inflamatória. Este gene, nos
três modelos de envelhecimento avaliados neste trabalho, apresentou redução de sua
expressão (Figura 19).
1,00
0,040,17
0,000,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
IL1
a ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
* *
1,00
0,06 0,11 0,000,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
IL1
b g
en
e e
xpre
ssio
nre
lati
ve in
cre
ase
(ra
tio
)
*
48
Figura 19. Gráfico do aumento relativo do gene IL6 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle de fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene CXCL8 codifica a interleucina IL8, uma citocina pró-inflamatória. Este gene,
nos três modelos de envelhecimento avaliados neste trabalho, apresentou aumento de sua
expressão (Figura 20).
Figura 20. Gráfico do aumento relativo do gene IL8 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
O gene IL10 codifica a interleucina IL10, uma citocina anti-inflamatória. Este gene,
nos três modelos de envelhecimento avaliados neste trabalho, apresentou aumento de sua
expressão (Figura 21).
1,00
0,170,01
0,50
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
IL6
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
*
1,00
6,04
35,04
9,70
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
IL8
ge
ne
exp
ress
ion
rela
tive
incr
eas
e (
rati
o)
*
49
Figura 21. Gráfico do aumento relativo do gene IL10 das células envelhecidas, quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, utilizando a análise ΔΔCt. O resultado é referente à média dos doadores em cada grupo. *P-value<0,05.
1,00
76,56
113,44108,81
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Young Irradiated Replicative Old
mR
NA
IL1
0 g
en
e e
xpre
ssio
nre
lati
ve in
cre
ase
(ra
tio
) *
*
50
5555 DISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃO
Neste estudo, observamos que as células envelhecidas em modelos in vitro
apresentaram um comportamento de proliferação celular reduzido quando comparado ao
controle de fibroblastos jovens, no experimento de avaliação por aumento do número de
células. O modelo de envelhecimento por replicação requereu tempo maior de proliferação
celular, sugerindo início do processo de senescência. O aumento no tempo de proliferação
da cultura celular também foi observado por Hayflick, em seu estudo sobre o tempo de vida
de culturas celulares humanas quando mantidas em condições in vitro, associando também
este fenômeno ao processo de envelhecimento e senescência celular (28).
As células envelhecidas avaliadas no ECIS apresentaram aumento no tempo de
proliferação quando comparadas ao controle fibroblastos jovens, indicando possivelmente,
que nos modelos de envelhecimento in vitro as células proliferaram com maior velocidade
ou apresentaram alguma alteração em sua morfologia, como demonstraram Keese e Giaever
em seu trabalho sobre monitoramento da morfologia celular utilizando biossensores (44).
Comparando-se o resultado de crescimento celular em tempo real no ECIS com o
resultado obtido no experimento de determinação do número de células em cultura,
observamos resultados inversos, sugerindo que o processo de envelhecimento causou
alterações na morfologia celular deixando-as maiores, interferindo na medição da
impedância. Phipps et al, em seu estudo sobre envelhecimento de culturas celulares,
também observou evidências de envelhecimento associado ao aumento de tamanho e
volume celular (45) (46).
De acordo com a avaliação da expressão gênica das culturas celulares, podemos
observar que os genes avaliados foram modulados em todos os modelos de envelhecimento
deste trabalho, demonstrando resultado consistente sobre como o envelhecimento pode
interferir no metabolismo celular e sua funcionalidade. De forma semelhante, um estudo
realizado por Mao et al obteve resultados consistentes no uso de novas moléculas para
prevenção de envelhecimento em estudos de expressão gênica utilizando modelos celulares
in vitro (27).
51
Observamos neste trabalho que os genes COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B,
LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53 foram diferentemente expressos quando comparados
ao controle de doadores jovens e podem ser considerados biomarcadores biológicos comuns
entre os modelos de envelhecimento in vitro.
Os genes COL1A1 e COL1A2 juntos codificam a cadeia pro-alpha1 e pro-alpha2 do
colágeno tipo 1. Neste estudo, o modelo de envelhecimento natural com células
provenientes de doadores idosos, permitiu observar que COL1A1 foi downregulated
enquanto o COL1A2 foi upregulated. Para o gene COL1A1 o comportamento de diminuição
da expressão reproduziu a resposta esperada, como descreveu inicialmente Vierkötter et al
(11) em seu estudo sobre influência do envelhecimento intrínseco e extrínseco na pele,
porém o COL1A2 possívelmente perdeu a sinalização necessária para o controle de sua
expressão e por isso, obteve aumento de expressão ao invés de redução. Entretanto, mesmo
quando um dos genes é mais expresso, a fibra de colágeno é dependente da junção das duas
e o aumento da expressão gênica de apenas uma delas não representa um aumento da
proteína colágeno.
Nos modelos de envelhecimento in vitro, foi possível observar que ambos COL1A1 e
COL1A2 foram downregulated, indicando possivelmente decréscimo da síntese proteica de
colágeno.
A perda de sinalização nos experimentos realizados também pode explicar a redução
da expressão gênica dos genes MMP1 e MMP3 no modelo de envelhecimento natural com
células de idosos, indicando que os valores basais neste modelo não são ideais para
avaliação do comportamento do potencial de degradação de matriz extracelular.
Já no modelo in vitro de replicação celular, os genes MMP1 e MMP3 foram
upregulated, diferentemente do modelo de envelhecimento natural, confirmando a
necessidade da sinalização externa ao processo fisiológico celular, para avaliação destes
genes em modelos in vitro. No modelo de irradiação podemos observar aumento apenas do
gene MMP1, corroborando a importância da presença do estímulo de UV na sinalização
deste gene, assim como também demonstrou Quan et al em seu estudo de degradação de
matriz extracelular por MMPs, durante o fotoevelhecimento (37).
52
O aumento da expressão gênica das metaloproteinases e o decréscimo da expressão
do colágeno reforça a hipótese que grande parte do processo de envelhecimento da pele
esteja associada à perda das proteínas estruturais da pele. O decréscimo das funções
metabólicas no envelhecimento fisiológico da célula reduz sua capacidade de síntese
proteica e, no envelhecimento cutâneo, o colágeno é diretamente afetado dado à redução
da sua síntese e aumento de sua degradação.
Os genes PTGS2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A e IL1B foram também identificados neste
trabalho como marcadores biológicos de envelhecimento da pele. Estes genes estão
envolvidos na cascata inflamatória, sugerindo que a inflamação pode ser uma condição
comum neste processo. A associação do envelhecimento ao aumento nos níveis de citocinas
pró-inflamatórias também foi identificada por Michaud et al, em seu estudo relacionado à
citocinas pró-inflamatórias, envelhecimento e doenças senis (47).
É possível observar, quando comparadas às células de doadores jovens, o aumento da
expressão do gene IL10 que codifica a citocina anti-inflamatória e a diminuição da expressão
dos genes PTGS2, IL6, IL1A e IL1B, estes últimos responsáveis por traduzir as citocinas
envolvidas na resposta pró-inflamatória, indicando neste estudo um mecanismo de
restabelecimento do equilíbrio celular.
A extração do RNA representa uma condição experimental do momento analisado. Nos
modelos de envelhecimento aqui propostos, a extração ocorreu 24 horas após a estimulação
do estresse. A modulação da expressão destes genes obtida sugere um feedback negativo e
positivo causado pela presença das citocinas pró-inflamatórias no ambiente celular, que
pode apresentar um período de transcrição-tradução menor que 24 horas. As proteínas pró-
inflamatória sintetizadas podem ter gerado uma sinalização que inibiu a expressão destes
genes, a fim de diminuir sua síntese proteica. Essas mesmas citocinas pró-inflamatórias
podem ter gerado também uma sinalização de estimulo da expressão do gene IL10, uma
citocina anti-inflamatória, que vai agir na condição de inflamação deste ambiente celular.
O gene TP53, que codifica a proteína p53, é responsável pela regulação da divisão
celular, inibindo o comportamento de proliferação descontrolada das células além de
exercer um papel importante na apoptose e inibição da angiogênese. Essa proteína tem a
capacidade de ativar o processo de reparo de DNA, manter a regulação celular na fase G1/S
53
de proliferação e ainda iniciar a cascata de apoptose, como demonstrado por Mrozek-
Wilczkiewicz et al (48).
O aumento da expressão de TP53 obtido neste estudo com células irradiadas, pode
indicar uma potencial condição de controle da divisão celular e início de senescência ou
ainda, o início da cascata de apoptose nas células danificadas pelo excesso de irradiação. O
controle de replicação, das células mutadas ou com seu DNA danificado, pela p53 ajudaria a
prevenir o aparecimento de tumores. O modelo de fotoenvelhecimento com irradiação UVB
é também utilizado como um modelo para avaliação de câncer na pele, como descrito por
Bastien et al (49).
A LMNA é responsável pela síntese de diferentes proteínas chamadas lamininas. As duas
maiores proteínas produzidas por este gene, laminina A e laminina C, são produzidas na
maioria das células do corpo (50). Mutações nestas proteínas configuram, entre outras
síndromes, uma chamada Progéria que causa o envelhecimento precoce do indivíduo. As
células do indivíduo portador de Progéria são bastante estudadas no envelhecimento a fim
de se melhorar o entendimento desta condição. Dada à raridade desta enfermidade, neste
estudo não realizamos essa comparação, que poderia nos fornecer dados adicionais aos
outros processos fisiológicos de envelhecimento da pele.
54
6666 CCCCONCLUSÃOONCLUSÃOONCLUSÃOONCLUSÃO
Os modelos de envelhecimento in vitro utilizados nesse estudo foram avaliados
separadamente e agrupados, considerando a expressão dos genes envolvidos no processo
de envelhecimento cutâneo e validados através dos resultados encontrados.
Todos os genes deste estudo foram considerados importantes no processo de
envelhecimento da pele e por isso, mesmo pequenas variações de expressão foram
consideradas para determinação do padrão comum de envelhecimento da pele, nos
modelos celulares in vitro propostos.
Os modelos de envelhecimento, quando analisados isoladamente, não apresentaram
marcadores gênicos exclusivos. Porém, quando comparados conjuntamente, foi possível
identificar 12 genes: COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B, LMNA, MMP1, MMP3,
PTGS2, TP53 como biomarcadores comuns entre os modelos de envelhecimento. O
acompanhamento destes biomarcadores durante a análise de novas moléculas em estudos
de envelhecimento, nestes modelos, se faz necessário para que o resultado da pesquisa
apresente maior robustez na comprovação da eficácia afim de garantir a indicação dos
melhores tratamentos para os diferentes processos de envelhecimento.
Deste modo, podemos concluir que existe diferença de expressão gênica entre as
células de indivíduos jovens, idosos e envelhecidas em modelo in vitro (UV e passagem
celular) porém não foram identificados marcadores gênicos exclusivos para cada modelo.
Além disso, foi possível identificar a existência de um padrão gênico de envelhecimento da
pele em modelos de cultura celular in vitro, nas condições testadas.
55
7777 ANÁLISE ESTATÍSTICA ANÁLISE ESTATÍSTICA ANÁLISE ESTATÍSTICA ANÁLISE ESTATÍSTICA
7.17.17.17.1 PTGS2PTGS2PTGS2PTGS2 XLSTAT 2007.2 - ANOVA
Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$AE$3:$AE$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs irradiados -3,138 -2,509 2,843 0,094 Não
jovens vs idosos -2,053 -1,482 2,843 0,469 Não
jovens vs passagem -0,636 -0,509 2,843 0,956 Não
passagem vs irradiados -2,502 -2,098 2,843 0,193 Não
passagem vs idosos -1,417 -1,063 2,843 0,716 Não
idosos vs irradiados -1,085 -0,814 2,843 0,847 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 24,230 A
passagem 24,866 A
idoso 26,283 A
irradiados 27,368 A
Jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens 3,138 2,509 2,574 3,219 Não
idosos vs jovens 2,053 1,482 2,574 3,567 Não
passagem vs jovens 0,636 0,509 2,574 3,219 Não
56
7.27.27.27.2 TPTPTPTP53535353 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$AD$3:$AD$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs passagem -3,264 -15,343 2,843 < 0,0001 Sim
irradiados vs jovens -0,717 -3,212 2,843 0,024 Sim
irradiados vs idosos -0,649 -2,727 2,843 0,063 Não
idosos vs passagem -2,615 -10,996 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -0,068 -0,276 2,843 0,992 Não
jovens vs passagem -2,547 -11,416 2,843 < 0,0001 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 20,528 A
idosos 21,177 A B
jovens 21,245 B
passagem 23,792 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -0,717 -3,212 2,574 0,574 Sim
idosos vs jovens -0,068 -0,276 2,574 0,636 Não
passagem vs jovens 2,547 11,416 2,574 0,574 Sim
57
7.37.37.37.3 IL10IL10IL10IL10 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$AC$3:$AC$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
passagem vs jovens -7,492 -2,959 2,843 0,040 Sim
passagem vs idosos -1,048 -0,388 2,843 0,979 Não
passagem vs irradiados -0,567 -0,235 2,843 0,995 Não
irradiados vs jovens -6,925 -2,735 2,843 0,062 Não
irradiados vs idosos -0,481 -0,178 2,843 0,998 Não
idosos vs jovens -6,444 -2,298 2,843 0,138 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
passagem 17,791 A
irradiados 18,358 A B
idosos 18,838 A B
jovens 25,282 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens -7,492 -2,959 2,574 6,516 Sim
irradiados vs jovens -6,925 -2,735 2,574 6,516 Sim
idosos vs jovens -6,444 -2,298 2,574 7,219 Não
58
7.47.47.47.4 ILILILIL8888 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$AB$3:$AB$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Número de observações com dados faltantes substituídos: 1
Estimação dos dados faltantes: Média ou moda
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
passagem vs jovens -4,924 -3,078 2,843 0,031 Sim
passagem vs irradiados -2,536 -1,663 2,843 0,372 Não
passagem vs idosos -1,853 -1,087 2,843 0,702 Não
idosos vs jovens -3,071 -1,733 2,843 0,338 Não
idosos vs irradiados -0,683 -0,401 2,843 0,978 Não
irradiados vs jovens -2,388 -1,493 2,843 0,463 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
passagem 21,527 A
idosos 23,380 A B
irradiados 24,063 A B
jovens 26,451 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens -4,924 -3,078 2,574 4,117 Sim
idosos vs jovens -3,071 -1,733 2,574 4,561 Não
irradiados vs jovens -2,388 -1,493 2,574 4,117 Não
59
7.57.57.57.5 IL6IL6IL6IL6 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$AA$3:$AA$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Número de observações com dados faltantes substituídos: 1
Estimação dos dados faltantes: Média ou moda
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs passagem -5,832 -4,122 2,843 0,004 Sim
jovens vs irradiados -2,178 -1,539 2,843 0,437 Não
jovens vs idosos -0,630 -0,402 2,843 0,977 Não
idosos vs passagem -5,202 -3,449 2,843 0,015 Sim
idosos vs irradiados -1,548 -1,026 2,843 0,737 Não
irradiados vs passagem -3,654 -2,709 2,843 0,065 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 27,720 A
idosos 28,350 A
irradiados 29,898 A B
passagem 33,552 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens 5,832 4,122 2,574 3,642 Sim
irradiados vs jovens 2,178 1,539 2,574 3,642 Não
idosos vs jovens 0,630 0,402 2,574 4,035 Não
60
7.67.67.67.6 IL1AIL1AIL1AIL1A Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$Z$3:$Z$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs idosos -16,833 -12,624 2,843 < 0,0001 Sim
jovens vs irradiados -4,698 -3,903 2,843 0,006 Sim
jovens vs passagem -2,729 -2,267 2,843 0,145 Não
passagem vs idosos -14,105 -10,992 2,843 < 0,0001 Sim
passagem vs irradiados -1,969 -1,716 2,843 0,346 Não
irradiados vs idosos -12,136 -9,458 2,843 < 0,0001 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 16,151 A
passagem 18,879 A B
irradiados 20,848 B
idosos 32,984 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens 16,833 12,624 2,574 3,432 Sim
irradiados vs jovens 4,698 3,903 2,574 3,098 Sim
passagem vs jovens 2,729 2,267 2,574 3,098 Não
61
7.77.77.77.7 IL1BIL1BIL1BIL1B Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$Y$3:$Y$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Número de observações com dados faltantes substituídos: 1
Estimação dos dados faltantes: Média ou moda
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs idosos -8,485 -4,623 2,843 0,001 Sim
jovens vs irradiados -3,913 -2,362 2,843 0,123 Não
jovens vs passagem -3,081 -1,860 2,843 0,281 Não
passagem vs idosos -5,404 -3,059 2,843 0,033 Sim
passagem vs irradiados -0,832 -0,526 2,843 0,952 Não
irradiados vs idosos -4,572 -2,589 2,843 0,081 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 20,877 A
passagem 23,958 A
irradiados 24,789 A B
idosos 29,361 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens 8,485 4,623 2,574 4,725 Sim
irradiados vs jovens 3,913 2,362 2,574 4,265 Não
passagem vs jovens 3,081 1,860 2,574 4,265 Não
62
7.87.87.87.8 TIMP4TIMP4TIMP4TIMP4 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$X$3:$X$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs idosos -2,906 -4,861 2,843 0,001 Sim
irradiados vs passagem -2,475 -4,628 2,843 0,001 Sim
irradiados vs jovens -2,428 -4,329 2,843 0,002 Sim
jovens vs idosos -0,478 -0,769 2,843 0,867 Não
jovens vs passagem -0,047 -0,083 2,843 1,000 Não
passagem vs idosos -0,431 -0,721 2,843 0,887 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 25,423 A
jovens 27,851 B
passagem 27,898 B
idosos 28,329 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -2,428 -4,329 2,574 1,444 Sim
idosos vs jovens 0,478 0,769 2,574 1,599 Não
passagem vs jovens 0,047 0,083 2,574 1,444 Não
63
7.97.97.97.9 TIMP3TIMP3TIMP3TIMP3 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$W$3:$W$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs passagem -9,584 -4,802 2,843 0,001 Sim
jovens vs irradiados -3,358 -1,682 2,843 0,363 Não
jovens vs idosos -0,341 -0,154 2,843 0,999 Não
idosos vs passagem -9,243 -4,344 2,843 0,002 Sim
idosos vs irradiados -3,017 -1,418 2,843 0,506 Não
irradiados vs passagem -6,226 -3,272 2,843 0,021 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 17,820 A
idosos 18,161 A
irradiados 21,178 A
passagem 27,404 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens 9,584 4,802 2,574 5,138 Sim
irradiados vs jovens 3,358 1,682 2,574 5,138 Não
idosos vs jovens 0,341 0,154 2,574 5,692 Não
64
7.107.107.107.10 TIMP2TIMP2TIMP2TIMP2 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$V$3:$V$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs passagem -2,383 -10,121 2,843 < 0,0001 Sim
irradiados vs jovens -1,312 -5,313 2,843 0,000 Sim
irradiados vs idosos -0,319 -1,214 2,843 0,627 Não
idosos vs passagem -2,063 -7,839 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -0,992 -3,628 2,843 0,010 Sim
jovens vs passagem -1,071 -4,337 2,843 0,002 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 20,849 A
idosos 21,168 A
jovens 22,161 B
passagem 23,231 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -1,312 -5,313 2,574 0,636 Sim
idosos vs jovens -0,992 -3,628 2,574 0,704 Sim
passagem vs jovens 1,071 4,337 2,574 0,636 Sim
65
7.117.117.117.11 TIMP1TIMP1TIMP1TIMP1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$U$3:$U$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs passagem -2,403 -3,919 2,843 0,006 Sim
irradiados vs jovens -1,777 -2,763 2,843 0,058 Não
irradiados vs idosos -0,728 -1,062 2,843 0,716 Não
idosos vs passagem -1,675 -2,443 2,843 0,106 Não
idosos vs jovens -1,048 -1,472 2,843 0,475 Não
jovens vs passagem -0,626 -0,974 2,843 0,766 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 29,487 A
idosos 30,215 A B
jovens 31,264 A B
passagem 31,890 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -1,777 -2,763 2,574 1,655 Sim
idosos vs jovens -1,048 -1,472 2,574 1,834 Não
passagem vs jovens 0,626 0,974 2,574 1,655 Não
66
7.127.127.127.12 MMP14MMP14MMP14MMP14 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$T$3:$T$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs jovens -1,661 -5,123 2,843 0,000 Sim
irradiados vs idosos -1,104 -3,195 2,843 0,025 Sim
irradiados vs passagem -0,645 -2,088 2,843 0,197 Não
passagem vs jovens -1,016 -3,133 2,843 0,028 Sim
passagem vs idosos -0,459 -1,327 2,843 0,559 Não
idosos vs jovens -0,557 -1,550 2,843 0,431 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 17,501 A
passagem 18,146 A B
idosos 18,605 B C
jovens 19,162 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -1,661 -5,123 2,574 0,835 Sim
passagem vs jovens -1,016 -3,133 2,574 0,835 Sim
idosos vs jovens -0,557 -1,550 2,574 0,925 Não
67
7.137.137.137.13 MMP13MMP13MMP13MMP13 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$S$3:$S$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Número de observações com dados faltantes substituídos: 1
Estimação dos dados faltantes: Média ou moda
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
passagem vs jovens -2,740 -1,114 2,843 0,686 Não
passagem vs irradiados -2,663 -1,135 2,843 0,674 Não
passagem vs idosos -0,486 -0,185 2,843 0,998 Não
idosos vs jovens -2,254 -0,827 2,843 0,841 Não
idosos vs irradiados -2,177 -0,830 2,843 0,839 Não
irradiados vs jovens -0,077 -0,031 2,843 1,000 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
passagem 31,357 A
idosos 31,843 A
irradiados 34,020 A
jovens 34,097 A
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens -2,740 -1,114 2,574 6,333 Não
idosos vs jovens -2,254 -0,827 2,574 7,016 Não
irradiados vs jovens -0,077 -0,031 2,574 6,333 Não
68
7.147.147.147.14 MMP12MMP12MMP12MMP12 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$R$3:$R$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs jovens -4,122 -2,999 2,843 0,037 Sim
idosos vs irradiados -1,255 -0,949 2,843 0,780 Não
idosos vs passagem -1,003 -0,758 2,843 0,872 Não
passagem vs jovens -3,120 -2,514 2,843 0,093 Não
passagem vs irradiados -0,252 -0,213 2,843 0,996 Não
irradiados vs jovens -2,868 -2,311 2,843 0,135 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 25,894 A
passagem 26,896 A B
irradiados 27,148 A B
jovens 30,016 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -4,122 -2,999 2,574 3,538 Sim
passagem vs jovens -3,120 -2,514 2,574 3,194 Não
irradiados vs jovens -2,868 -2,311 2,574 3,194 Não
69
7.157.157.157.15 MMP10MMP10MMP10MMP10 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$Q$3:$Q$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs idosos -10,584 -9,362 2,843 < 0,0001 Sim
irradiados vs jovens -5,931 -5,593 2,843 0,000 Sim
irradiados vs passagem -4,201 -4,155 2,843 0,003 Sim
passagem vs idosos -6,383 -5,646 2,843 0,000 Sim
passagem vs jovens -1,730 -1,631 2,843 0,388 Não
jovens vs idosos -4,653 -3,960 2,843 0,005 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 18,117 A
passagem 22,318 B
jovens 24,048 B
idosos 28,701 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -5,931 -5,593 2,574 2,730 Sim
passagem vs jovens -1,730 -1,631 2,574 2,730 Não
idosos vs jovens 4,653 3,960 2,574 3,024 Sim
70
7.167.167.167.16 MMP9MMP9MMP9MMP9 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$P$3:$P$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs jovens -14,886 -6,758 2,843 0,000 Sim
irradiados vs passagem -14,489 -6,899 2,843 0,000 Sim
irradiados vs idosos -13,828 -5,889 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -1,059 -0,434 2,843 0,972 Não
idosos vs passagem -0,662 -0,282 2,843 0,992 Não
passagem vs jovens -0,397 -0,180 2,843 0,998 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 20,235 A
idosos 34,063 B
passagem 34,724 B
jovens 35,121 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -14,886 -6,758 2,574 5,670 Sim
idosos vs jovens -1,059 -0,434 2,574 6,281 Não
passagem vs jovens -0,397 -0,180 2,574 5,670 Não
71
7.177.177.177.17 MMP8MMP8MMP8MMP8 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$O$3:$O$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs idosos -4,313 -2,197 2,843 0,164 Não
jovens vs passagem -2,369 -1,337 2,843 0,554 Não
jovens vs irradiados -0,359 -0,203 2,843 0,997 Não
irradiados vs idosos -3,954 -2,093 2,843 0,195 Não
irradiados vs passagem -2,010 -1,189 2,843 0,641 Não
passagem vs idosos -1,944 -1,029 2,843 0,735 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 32,517 A
irradiados 32,876 A
passagem 34,886 A
idosos 36,830 A
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens 4,313 2,197 2,574 5,054 Não
passagem vs jovens 2,369 1,337 2,574 4,562 Não
irradiados vs jovens 0,359 0,203 2,574 4,562 Não
72
7.187.187.187.18 MMP7MMP7MMP7MMP7 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$N$3:$N$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs idosos -8,396 -6,947 2,843 0,000 Sim
jovens vs irradiados -5,747 -5,268 2,843 0,000 Sim
jovens vs passagem -2,720 -2,494 2,843 0,097 Não
passagem vs idosos -5,676 -4,881 2,843 0,001 Sim
passagem vs irradiados -3,026 -2,909 2,843 0,044 Sim
irradiados vs idosos -2,649 -2,278 2,843 0,143 Não
Valor crítico de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 20,564 A
passagem 23,284 A
irradiados 26,310 B
idosos 28,960 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens 8,396 6,947 2,574 3,111 Sim
irradiados vs jovens 5,747 5,268 2,574 2,808 Sim
passagem vs jovens 2,720 2,494 2,574 2,808 Não
73
7.197.197.197.19 MMP3MMP3MMP3MMP3 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$M$3:$M$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
passagem vs idosos -6,617 -3,794 2,843 0,007 Sim
passagem vs jovens -4,870 -2,977 2,843 0,038 Sim
passagem vs irradiados -2,322 -1,489 2,843 0,465 Não
irradiados vs idosos -4,295 -2,463 2,843 0,103 Não
irradiados vs jovens -2,548 -1,557 2,843 0,428 Não
jovens vs idosos -1,747 -0,964 2,843 0,771 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
passagem 18,390 A
irradiados 20,713 A B
jovens 23,260 B
idosos 25,008 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens -4,870 -2,977 2,574 4,211 Sim
irradiados vs jovens -2,548 -1,557 2,574 4,211 Não
idosos vs jovens 1,747 0,964 2,574 4,665 Não
74
7.207.207.207.20 MMP2MMP2MMP2MMP2 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$L$3:$L$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs passagem -6,008 -5,131 2,843 0,000 Sim
idosos vs irradiados -1,209 -1,032 2,843 0,733 Não
idosos vs jovens -0,112 -0,092 2,843 1,000 Não
jovens vs passagem -5,896 -5,367 2,843 0,000 Sim
jovens vs irradiados -1,097 -0,998 2,843 0,752 Não
irradiados vs passagem -4,800 -4,582 2,843 0,001 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 10,352 A
jovens 10,464 A
irradiados 11,560 A
passagem 16,360 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -0,112 -0,092 2,574 3,133 Não
passagem vs jovens 5,896 5,367 2,574 2,828 Sim
irradiados vs jovens 1,097 0,998 2,574 2,828 Não
75
7.217.217.217.21 MMP1MMP1MMP1MMP1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$K$3:$K$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs passagem -3,395 -1,586 2,843 0,412 Não
irradiados vs idosos -0,982 -0,410 2,843 0,976 Não
irradiados vs jovens -0,778 -0,347 2,843 0,985 Não
jovens vs passagem -2,617 -1,165 2,843 0,656 Não
jovens vs idosos -0,204 -0,082 2,843 1,000 Não
idosos vs passagem -2,413 -1,008 2,843 0,747 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 19,772 A
jovens 20,550 A
idosos 20,754 A
passagem 23,167 A
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -0,778 -0,347 2,574 5,781 Não
passagem vs jovens 2,617 1,165 2,574 5,781 Não
idosos vs jovens 0,204 0,082 2,574 6,404 Não
76
7.227.227.227.22 COL7A1COL7A1COL7A1COL7A1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$J$3:$J$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
irradiados vs idosos -2,847 -6,007 2,843 < 0,0001 Sim
irradiados vs jovens -2,387 -5,368 2,843 0,000 Sim
irradiados vs passagem -1,081 -2,551 2,843 0,087 Não
passagem vs idosos -1,766 -3,726 2,843 0,008 Sim
passagem vs jovens -1,305 -2,936 2,843 0,042 Sim
jovens vs idosos -0,460 -0,935 2,843 0,787 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
irradiados 23,223 A
passagem 24,304 A
jovens 25,609 B
idosos 26,069 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens -2,387 -5,368 2,574 1,144 Sim
passagem vs jovens -1,305 -2,936 2,574 1,144 Sim
idosos vs jovens 0,460 0,935 2,574 1,268 Não
77
7.237.237.237.23 COL4A1COL4A1COL4A1COL4A1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$I$3:$I$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs passagem -1,777 -2,269 2,843 0,145 Não
jovens vs idosos -0,949 -1,095 2,843 0,698 Não
jovens vs irradiados -0,252 -0,321 2,843 0,988 Não
irradiados vs passagem -1,525 -2,042 2,843 0,212 Não
irradiados vs idosos -0,698 -0,836 2,843 0,837 Não
idosos vs passagem -0,827 -0,991 2,843 0,757 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 23,031 A
irradiados 23,282 A
idosos 23,980 A
passagem 24,807 A
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens 1,777 2,269 2,574 2,016 Não
idosos vs jovens 0,949 1,095 2,574 2,233 Não
irradiados vs jovens 0,252 0,321 2,574 2,016 Não
78
7.247.247.247.24 COL3A1COL3A1COL3A1COL3A1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$H$3:$H$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs irradiados -2,327 -3,532 2,843 0,012 Sim
idosos vs jovens -1,043 -1,523 2,843 0,446 Não
idosos vs passagem -0,932 -1,414 2,843 0,508 Não
passagem vs irradiados -1,395 -2,368 2,843 0,122 Não
passagem vs jovens -0,111 -0,180 2,843 0,998 Não
jovens vs irradiados -1,284 -2,078 2,843 0,200 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 17,306 A
passagem 18,238 A B
jovens 18,349 A B
irradiados 19,633 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -1,043 -1,523 2,574 1,762 Não
passagem vs jovens -0,111 -0,180 2,574 1,591 Não
irradiados vs jovens 1,284 2,078 2,574 1,591 Não
79
7.257.257.257.25 COL1A2COL1A2COL1A2COL1A2 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$G$3:$G$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs passagem -6,976 -16,644 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs irradiados -6,300 -15,031 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -4,665 -10,709 2,843 < 0,0001 Sim
jovens vs passagem -2,311 -5,878 2,843 < 0,0001 Sim
jovens vs irradiados -1,635 -4,159 2,843 0,003 Sim
irradiados vs passagem -0,676 -1,803 2,843 0 ,306 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 14,648 A
jovens 19,313 B
irradiados 20,948 C
passagem 21,624 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -4,665 -10,709 2,574 1,121 Sim
passagem vs jovens 2,311 5,878 2,574 1,012 Sim
irradiados vs jovens 1,635 4,159 2,574 1,012 Sim
80
7.267.267.267.26 COL1A1COL1A1COL1A1COL1A1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$F$3:$F$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs irradiados -3,105 -5,015 2,843 0,001 Sim
jovens vs passagem -3,037 -4,905 2,843 0,001 Sim
jovens vs idosos -0,824 -1,202 2,843 0,634 Não
idosos vs irradiados -2,281 -3,455 2,843 0,015 Sim
idosos vs passagem -2,212 -3,352 2,843 0,018 Sim
passagem vs irradiados -0,068 -0,116 2,843 0,999 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 16,755 A
idosos 17,579 A
passagem 19,792 B
irradiados 19,860 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
irradiados vs jovens 3,105 5,015 2,574 1,594 Sim
passagem vs jovens 3,037 4,905 2,574 1,594 Sim
idosos vs jovens 0,824 1,202 2,574 1,766 Não
81
7.277.277.277.27 LMNALMNALMNALMNA Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$E$3:$E$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs passagem -2,213 -6,154 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -0,742 -1,987 2,843 0,231 Não
idosos vs irradiados -0,289 -0,804 2,843 0,852 Não
irradiados vs passagem -1,924 -5,982 2,843 < 0,0001 Sim
irradiados vs jovens -0,453 -1,344 2,843 0,549 Não
jovens vs passagem -1,470 -4,359 2,843 0,002 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 21,118 A
irradiados 21,407 A
jovens 21,861 A
passagem 23,331 B
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -0,742 -1,987 2,574 0,962 Não
irradiados vs jovens -0,453 -1,344 2,574 0,868 Não
passagem vs jovens 1,470 4,359 2,574 0,868 Sim
82
7.287.287.287.28 SIRT1SIRT1SIRT1SIRT1 Y / Quantitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos /
Intervalo = 'Ct todos '!$D$3:$D$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística ANOVA expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo
= 'Ct todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
Utilizar médias estimadas: Sim
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
idosos vs passagem -3,486 -10,902 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs irradiados -1,975 -6,177 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs jovens -1,738 -5,230 2,843 0,000 Sim
jovens vs passagem -1,748 -5,827 2,843 0,000 Sim
jovens vs irradiados -0,237 -0,790 2,843 0,858 Não
irradiados vs passagem -1,511 -5,283 2,843 0,000 Sim
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
idosos 24,963 A
jovens 2 6,701 B
irradiados 26,938 B
passagem 28,448 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
idosos vs jovens -1,738 -5,230 2,574 0,855 Sim
passagem vs jovens 1,748 5,827 2,574 0,772 Sim
irradiados vs jovens 0,237 0,790 2,574 0,772 Não
83
7.297.297.297.29 CASP3CASP3CASP3CASP3 Y / Quantitativas: Documento = estatística expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo = 'Ct
todos '!$C$3:$C$25 / 22 linhas e 1 coluna
X / Qualitativas: Documento = estatística expressão gênica TODOS.xlsx / Planilha = Ct todos / Intervalo = 'Ct
todos '!$B$3:$B$25 / 22 linhas e 1 coluna
Validação / Número de observações: 1
Restrições: an=0
Intervalo de confiança (%): 95
Seleção do modelo: Melhor modelo / R² ajustado
Min variáveis: 1 / Max variáveis: 1
jovens / Tukey (HSD) / Análise das diferenças entre as categorias, intervalo de confiança de 95%:
Contraste Diferença Dif padronizada Valor crítico Pr > Dif Significante
jovens vs passagem -10,618 -26,812 2,843 < 0,0001 Sim
jovens vs irradiados -9,657 -24,385 2,843 < 0,0001 Sim
jovens vs idosos -7,564 -17,242 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs passagem -3,053 -7,233 2,843 < 0,0001 Sim
idosos vs irradiados -2,092 -4,957 2,843 0,001 Sim
irradiados vs passagem -0,961 -2,545 2,843 0,088 Não
Valor crítico d de Tukey: 4,02
Categoria Média estimada Grupos
jovens 16,817 A
idosos 24,381 B
irradiados 26,474 C
passagem 27,435 C
jovens / Dunnett (bilateral) / Análise das diferenças entre categorias, intervalo de confiança de 95%:
Categoria Diferença Dif padronizada Valor crítico Dif crítica Significante
passagem vs jovens 10,618 26,812 2,574 1,019 Sim
irradiados vs jovens 9,657 24,385 2,574 1,019 Sim
idosos vs jovens 7,564 17,242 2,574 1,129 Sim
84
7.307.307.307.30 Teste z Teste z Teste z Teste z Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (Replicadas, Dia 3 e Dia 6):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -2520,000
z (Valor observado) -0,433
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) 0,665
alfa 0,05
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (Irradiadas, Dia 3 e Dia 6):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -8620,000
z (Valor observado) -3,249
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) 0,001
alfa 0,05
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (idosos, Dia 3 e Dia 6):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -8790,000
z (Valor observado) -9,607
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) < 0,0001
alfa 0,05
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (Jovens, Dia 3 e Dia 6):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -69080,000
z (Valor observado) -4,511
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) < 0,0001
alfa 0,05
85
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (jovens x irradiadas):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -35581,818
z (Valor observado) -3,032
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) 0,002
alfa 0,05
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (jovens x replicadas):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -30727,273
z (Valor observado) -2,321
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) 0,020
alfa 0,05
Teste z para duas amostras pareadas / Teste bilateral (jovens x idosos):
Intervalo de confiança de 95% para a diferença entre as médias:
Diferença -38236,000
z (Valor observado) -3,038
z (Valor crítico) 1,960
p-valor (bilateral) 0,002
alfa 0,05
86
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in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92:9363-
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90
9999 APÊNDICESAPÊNDICESAPÊNDICESAPÊNDICES
Fold change todos os genes:
Gene Irradiated Old Replicative
CASP3 -750,88 -175,99 -1461,67
SIRT1 -1,13 3,19 -3,22
LMNA 1,43 1,08 -2,65
COL1A1 -7,95 -2,43 -7,58
COL1A2 -3,02 18,09 -4,83
COL3A1 -2,38 2,78 1,10
COL4A1 1,00 -1,09 -2,87
COL7A1 4,77 -1,30 2,25
MMP1 1,15 -1,98 -9,11
MMP2 -2,18 1,03 -60,80
MMP3 8,25 -4,66 41,26
MMP7 -53,59 -461,89 -6,58
MMP8 -1,26 -5,36 -5,08
MMP9 19173,23 -1,57 -1,20
MMP10 63,92 -38,76 3,47
MMP12 6,86 8,69 8,17
MMP13 1,05 5,63 6,62
MMP14 2,91 1,32 1,86
TIMP1 3,47 2,26 -1,52
TIMP2 2,35 1,81 -2,22
TIMP3 -11,34 -1,77 -848,65
TIMP4 4,23 -1,44 -1,31
IL1B -16,09 -382,79 -9,04
IL1A -23,61 -37120,19 -6,03
IL6 -5,87 -2,01 -73,91
IL8 6,04 9,70 35,04
IL10 76,56 108,81 113,44
TP53 1,78 -1,20 -5,41
PTGS2 -9,87 -4,53 -1,74
91
Solução FIXADORA:
- formaldeído 37%: 540uL
- glutaraldeído: 80uL
- água deionizada: qsp 10mL
Solução corrante X-GAL:
- X-gal estoque 20mg/ml em DMSO, armazenado -20oC: 0,5 ml
- Tampão ac. Cítrico 0,2M + fosfato (pH 6,0) : 2 ml
- Ferrocianeto de potássio 100mM: 0,5 ml
- Ferrocianeto de protássio 100mM: 0,5 ml
- Cloreto de sódio 1M: 1,5 ml
- Cloreto de Magnésio 1M: 20 ul
- Água: 5 ml
Volume final: 10 ml.
92
10101010 ANEXOSANEXOSANEXOSANEXOS
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