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FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus... 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR - LABOMAR MESTRADO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
PROSPECÇÃO DE GENES RELACIONADOS À OCORRÊNCIA DE
ENFERMIDADES NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) SOB
CONDIÇÕES DE CULTIVO
RUBENS GALDINO FEIJÓ
FORTALEZA-CE
MARÇO, 2009
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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RUBENS GALDINO FEIJÓ
PROSPECÇÃO DE GENES RELACIONADOS À OCORRÊNCIA DE
ENFERMIDADES NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) SOB
CONDIÇÕES DE CULTIVO
ORIENTADOR: Prof. Rodrigo Maggioni, Ph.D
FORTALEZA-CE MARÇO, 2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Marinhas Tropicais do
Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR) da
Universidade Federal do Ceará (UFC), como
parte dos requisitos necessários para a obtenção
do título de Mestre em Ciências Marinhas
Tropicais, área de concentração Ciências
Biológicas.
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RUBENS GALDINO FEIJÓ
PROSPECÇÃO DE GENES RELACIONADOS À OCORRÊNCIA DE
ENFERMIDADES NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) SOB
CONDIÇÕES DE CULTIVO
Aprovada em: 27/ 04/ 2009.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Rodrigo Maggioni, Ph.D (Orientador) Instituto de Ciências do Mar, LABOMAR
Universidade Federal do Ceará (UFC)
____________________________________ Profa. Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira, Ph.D (Examinadora interna)
Instituto de Ciências do Mar, LABOMAR Universidade Federal do Ceará (UFC)
____________________________________ Prof. Luis Fernando Fernandes Marins, Dr. (Examinador externo)
Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal do Rio Grande (FURG)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar
(LABOMAR) da Universidade Federal do Ceará (UFC), como
parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Marinhas Tropicais, área de concentração
Ciências Biológicas.
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DEDICO
Aos meus pais, Alberto e Conceição,
meus irmãos Rafael e Robson, e ao meu
avô Edvaldo Alves Feijó (in memorium)
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Alberto Magno e Maria Conceição, e irmãos Rafael Feijó e Robson Feijó,
que constituem toda a base de minha educação.
À Profa. Dra. Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira pela amizade, confiança e
conhecimentos repassados durante todos estes anos de convivência, pessoa que respeito e
admiro por ser uma cientista de excelência e de caráter inquestionável. Obrigado por tudo!!!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Maggioni pela oportunidade, confiança e orientação
no desenvolvimento desta pesquisa. Um profissional genial e de visão inestimável pertinente
ao trabalho científico, com quem tenho aprendido deste a minha iniciação acadêmica.
Aos amigos João Mafaldo e Cândida Vila-Nova do Laboratório de Biologia Molecular do
Centro de Diagnóstico de Enfermidades de Organismos Aquáticos (CEDECAM-
LABOMAR/UFC), pela amizade e expressiva contribuição no desenvolvimento do trabalho.
Ao amigo Prof. Régis Vasconcelos pela amizade e contribuição nos procedimentos
laboratoriais.
Aos amigos Diego Apolinário, Cecília Gomes, Graça Coêlho, e a todos do Laboratório de
Histopatologia do CEDECAM-LABOMAR/UFC, pela contribuição no processamento
histológico das amostras.
Aos professores e funcionários do Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR/UFC), que
contribuíram direta ou indiretamente no desenvolvimento deste projeto.
À equipe do Laboratório de Genética Molecular (UFC), em especial à Tuana Correia,
pela disponibilidade e tempo dedicado.
Aos amigos do NUGEN, em especial Michel Kamimura pela amizade, contribuição
cientifica e conhecimentos repassados no âmbito da Biologia Molecular.
Aos meus amigos Fernando Guardinha, Marney BB e Kaká Anjo pelos momentos de total
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descontração vividos.
Aos meus familiares, tios, tias, primos e primas, e em especial à minha avó Raimunda
Rodrigues, pelo afeto e orações dedicadas a mim e a todos de nossa família.
Enfim, a todos que contribuíram de alguma forma para a realização desta minha
conquista.
MUITO OBRIGADO!!!
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“Deus não escolhe os capacitados
capacita os escolhidos
Fazer ou não fazer algo
só depende de nossa vontade
e perseverança”.
Albert Einstein
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RESUMO
Palavras-Chave: Litopenaeus vannamei, Enfermidades, Genes, DDRT-PCR.
A carcinicultura marinha vem assumindo um papel de grande relevância na economia
mundial, não somente pela geração de empregos e rendimentos, mas especialmente por
representar uma alternativa viável para o atendimento da crescente demanda mundial por
alimentos. No entanto, a ocorrência de enfermidades nos cultivos de camarões,
principalmente as de etiologia viral, vem comprometendo significativamente a atividade, por
provocarem elevados índices de mortalidade e conseqüente perda econômica. A identificação
e caracterização de genes relacionados a enfermidades de camarões têm auxiliado
significativamente na compreensão das respostas imunes desencadeadas nos processos
infecciosos, assim como dos mecanismos relacionados à interação patógeno-hospedeiro, ainda
de pouco conhecimento científico. O presente trabalho teve como objetivo principal a
prospecção e caracterização de genes relacionados a enfermidades de camarões da espécie
Litopenaeus vannamei sob condições de cultivo. A investigação sanitária de 40 camarões por
métodos histopatológicos e moleculares de diagnóstico resultou na detecção da IMN, IHHN,
WSS, NHP, vibrioses e gregarinas, o que permitiu o agrupamento destes camarões em classes
diferenciais destinadas ao estudo de prospecção gênica através da técnica de Differential
display RT-PCR (DDRT-PCR). A análise da expressão diferencial de genes nos perfis de
expressão dos camarões agrupados de acordo com o status sanitário resultou na identificação
de três sequências genéticas inéditas e potencialmente relacionadas à ocorrência de
enfermidades no camarão L. vannamei, sendo duas sequências (882-A1R2 e 730-A4R10) de
homologias indeterminada e uma (842-A2R6) com 99% de similaridade nucleotídica com o
gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse envolvida no mecanismo de silenciamento pós-
transcricional de genes do nematóide Caenorhabditis elegans. Este resultado sugere que o
gene 842-A2R6 pode estar relacionado ao mecanismo de silenciamento de dsRNA associadas
ao IMNV.
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ABSTRACT
Keywords: Litopenaeus vannamei, Diseases, Gene, DDRT-PCR
The marine shrimp culture has achieved great importance in the global economy as an
agriculture business, not only for jobs and income generation, but especially because it
represents a viable alternative source of animal protein for the growing global food demand.
However, the occurrence of diseases in shrimp culture, especially those of viral aetiology, has
significantly compromised the activity, causing high mortality rates and consequent economic
loss. The identification and characterization of genes related to shrimp diseases has helped
understanding the immune responses triggered in the infectious processes, and mechanisms
related to host-pathogen interaction, about which very little is known at the moment. The
main objective of the present work was the prospection and characterization of genes related
to diseases of the shrimp species Litopenaeus vannamei under typical rearing conditions. The
health status investigation of 40 shrimps by histopathological and molecular methods of
diagnosis resulted in the detection of IMN, IHHN, WSS, NHP, vibriosis and gregarines in
various degrees and combinations. Shrimps have been grouped in classes for gene prospecting
through the technique of Differential Display RT-CR (DDRT-PCR). The analysis of
differential gene expression in the profiles produced resulted in the identification of three
previously undescribed gene sequences potentially related to the occurrence of diseases in
shrimp L. Vannamei. Two of these sequences (882-A1R2 and 730-A4R10) have not had
homologies to any annotated invertebrate sequences. Fragment 842-A2R6 however, showed
99% nucleotide similarity with the mut-7 gene, which encodes a type of RNAse involved in
the mechanism of post-transcriptional gene silencing through RNAi in the nematode
Caenorhabditis elegans. It is suggested hare that this kind of mechanism may be involved in
the silencing of double stranded RNA from viruses like the IMNV.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Litopenaeus vannamei.
FIGURA 2 - Eletromicrografia do IMNV.
FIGURA 3 - Eletromicrografia do IHHNV.
FIGURA 4 - Eletromicrografia do WSSV.
FIGURA 5 - Fotomicrografia de Víbrio sp.
FIGURA 6 - Eletromicrografia da NHP mostrando o formato helicoidal e
cocobacilo da bactéria.
FIGURA 7 - Combinações de primers utilizados na DDRT-PCR.
FIGURA 8 - Infiltração hemocítica focal no tecido muscular do camarão L.
vannamei (Grau 1)
FIGURA 9 - Necrose muscular de coagulação acompanhada de infiltração
hemocítica (Grau 2).
FIGURA 10 - Necrose muscular de liquefação e fibroses (Grau 3).
FIGURA 11 - Corte histológico mostrando a presença de esferóides no órgão
linfóide de um camarão com IMN (setas).
FIGURA 12 - Fotomicrografia de um camarão acometido com IMN mostrando a
presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide no tecido
muscular (setas).
FIGURA 13 - Glândula antenal de um camarão acometido com IMN. A seta
indica a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide.
FIGURA 14 - Corpo de inclusão do tipo Cowdry A nas brânquias do camarão L.
vannamei (seta).
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FIGURA 15 - Corpos de inclusão do tipo Cowdry A no estômago do camarão L.
vannamei (setas).
FIGURA 16 - Microfotografia mostrando corpo de inclusão do tipo Cowdry A no
epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (seta).
FIGURA 17 - Microfotografia mostrando corpos de inclusão do tipo Cowdry A
no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei
(setas). FIGURA 18 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando
deformação moderada dos túbulos.
FIGURA 19 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando uma
proeminente deformação tubular e ausência de células B e R. FIGURA 20 - Necrose focal em uma lamela branquial do camarão L. vannamei FIGURA 21 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão L. vannamei
mostrando uma infiltração hemocítica entre os túbulos do órgão.
FIGURA 22 - Gregarinas Nematopsis sp. em diferentes estágios de seu ciclo de
vida (trofozoítos e gametocistos) no estômago do camarão L.
vannamei.
FIGURA 23 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da RT-PCR de detecção do
IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo: 328 pb;
(C+) Controle Positivo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®).
FIGURA 24 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da RT-PCR de detecção do
IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)
Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®).
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FIGURA 25 - Gel de agarose 1% referente à PCR de detecção do IHHNV. Poços:
(1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo:
389 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
FIGURA 26 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da Nested PCR de detecção
do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)
Controle Positivo: 1447 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®). FIGURA 27 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da Nested PCR de detecção
do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)
Controle Positivo: 941 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®).
FIGURA 28 - Géis de agarose 2% referentes às combinações A1R1, A1R2,
A1R3, A2R4, A2R5 e A2R6 da DDRT-PCR. Poços: (1-40)
Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®).
FIGURA 29 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações
A3R7, A3R8, A3R9, A4R10, A4R11 e A4R12. Poços: (1-40)
Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus
(INVITROGEN®).
FIGURA 30 - Dendograma das similaridades genéticas dos 40 camarões
L.vannamei investigados, definido pelo método de agrupamento
UPGMA baseado no cálculo do índice de Jacard a partir dos perfis
de expressão gênica produzido pela DDRT-PCR.
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LISTA DE TABELAS
TABELA I - Composição e concentrações empregadas nas reações de
investigação molecular do IMNV, IHHNV, TSV, WSSV e MBV.
TABELA II - Primers e condições de termociclagem utilizados na investigação
molecular dos vírus IMN, IHHN, TS, WSS e MB.
TABELA III - Seqüências dos primers utilizados na DDRT-PCR.
TABELA IV - Classificação dos camarões identificados como positivos para a
IMN de acordo com o grau de severidade da infecção, com base
no método descrito por PEREIRA et al (2008).
TABELA V - Classificação dos camarões identificados como positivos para a
WSS de acordo com o grau de severidade da infecção, segundo
sistema de gradeamento proposto por LIGHTNER (1996a).
TABELA VI - Diagnóstico conclusivo por técnicas histopatológicas e
moleculares de detecção da ocorrência de enfermidades nos
camarões destinados ao estudo de prospecção gênica.
TABELA VII - Detecção e quantificação da expressão diferencial de genes nos
perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR através do
programa KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®).
TABELA VIII - Agrupamentos dos camarões em classes diferenciais de acordo
com a ocorrência de enfermidades.
TABELA IX - Percentual de camarões das classes diferenciais com expressão
detectada para os genes selecionados.
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SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................
ABSTRACT ..................................................................................................................
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................
LISTA DE TABELAS .................................................................................................
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................
2.1. O camarão branco Litopenaeus vannamei...........................................................
2.2. Principais Enfermidades que acometem o camarão cultivado no Brasil..........
2.2.1. Mionecrose Infecciosa (IMN).........................................................................
2.2.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)..............................
2.2.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)..............................................................
2.2.4. Vibrioses.........................................................................................................
2.2.5. Hepatopancreatite Necrosante (NHP).............................................................
2.3. O Sistema Imune de Invertebrados......................................................................
2.4. Análise da Expressão Gênica em Organismos Aquáticos..................................
3. OBJETIVOS..............................................................................................................
3.1. Geral........................................................................................................................
3.2. Específicos...............................................................................................................
4. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................
4.1. Obtenção do Material Biológico...........................................................................
4.2 Extração de Ácidos Nucléicos e Síntese de cDNA................................................
4.2.1. Extração de DNA total....................................................................................
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4.2.2. Extração de RNA total....................................................................................
4.2.3. Síntese de cDNA.............................................................................................
4.3. Investigação da Ocorrência de Enfermidades.....................................................
4.3.1. Procedimentos para o Diagnóstico Histopatológico........................................
4.3.2. Procedimentos para o Diagnóstico Molecular.................................................
4.4. Prospecção Gênica..................................................................................................
4.4.1. Produção de Perfis de Expressão Genética por DDRT-PCR...........................
4.4.2. Análise dos Perfis de Expressão Gênica..........................................................
4.4.3. Seleção de Genes Candidatos...........................................................................
4.4.4. Clonagem dos Genes Selecionados.................................................................
4.4.5. Seqüenciamento dos Clones Transformados...................................................
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................
5.1. Investigação da Ocorrência de Enfermidades.....................................................
5.1.1. Diagnóstico Histopatológico...........................................................................
5.1.1.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)..............................................................
5.1.1.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)...................
5.1.1.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)...................................................
5.1.1.4. Hepatopancreatite Necrosante (NHP).................................................
5.1.1.5. Vibrioses..............................................................................................
5.1.1.6. Gregarinas...........................................................................................
5.1.2. Diagnóstico Molecular.....................................................................................
5.1.2.1. Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV).............................................
5.1.2.2. Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV).
5.1.2.3. Vírus da Mancha Branca (WSSV)........................................................
5.1.3. Diagnóstico Conclusivo...................................................................................
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5.2. Produção e Análise dos Perfis de Expressão Gênica...........................................
5.2.1. Perfis de Expressão Gênica por DDRT-PCR....................................................
5.2.2. Estimativa de Similaridades Genéticas.............................................................
5.2.3. Identificação e Quantificação da Expressão Gênica Diferencial......................
5.3. Prospecção de Genes Relacionados às Enfermidades Detectadas.....................
5.3.1. Seleção de Genes Candidatos...........................................................................
5.3.2. Caracterização dos Genes Selecionados...........................................................
6. CONCLUSÕES........................................................................................................
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
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1. INTRODUÇÃO
A carcinicultura marinha vem assumindo um papel de grande relevância na
economia mundial, não apenas pela geração de empregos e rendimentos, mas especialmente
por representar uma alternativa viável para o atendimento da crescente demanda mundial por
alimentos (BRASIL, 2001). O aperfeiçoamento das técnicas de cultivo tem contribuído
sobremaneira com o aumento da produção mundial de camarões, que vem crescendo cerca de
20% ao ano, chegando ao número de 2 milhões de toneladas no ano de 2006. O camarão da
espécie Litopenaeus vannamei é o responsável pela maior parcela da produção mundial, que
cresceu de 10% para 75% da produção total de camarões cultivados no período de 1998 a
2006 (WIBAN, 2007).
No Brasil, a região Nordeste é a principal produtora de camarões marinhos
cultivados, com 93,1% da produção nacional, sendo os Estados do Rio Grande do Norte e
Ceará os maiores responsáveis por este índice. Durante algum tempo, a atividade
carcinicultora brasileira não enfrentou grandes obstáculos, tendo como conseqüência um dos
maiores índices de produtividade mundial. Todavia, nos anos de 2004 e 2005 houve uma
queda de produção (-15,84%) e produtividade (-24,84%) ocasionada por diversos fatores,
destacando-se a ação antidumping imposta pelos Estados Unidos, diminuição dos preços
internacionais, variação da taxa cambial, bem como da ocorrência de enfermidades,
principalmente as de etiologia viral, com destaque para a Mionecrose Infecciosa (MADRID,
2005; RODRIGUES, 2005). A partir de 2005, houve uma estabilização da produção e
produtividade num patamar de 65.000 t e 4.063 kg/ha, respectivamente. Contudo, a crise do
setor produtivo ainda persistia até o final de 2007, principalmente em decorrência da
incidência de doenças que foi considerada a principal responsável pelas perdas econômicas e
conseqüente descapitalização setorial (ROCHA, 2007).
Segundo MARTINS (2006), o surgimento de enfermidades na carcinicultura está
diretamente relacionado com o equilíbrio entre as condições ambientais do viveiro, o estado
de saúde do camarão e os agentes potencialmente patogênicos. As doenças podem ser
classificadas em infecciosas e não-infecciosas. As infecciosas são causadas por patógenos
transmissíveis como vírus, bactérias, protozoários e fungos, enquanto que as não-infecciosas
são resultantes de agentes abióticos relacionados a fatores nutricionais, genéticos, ambientais
e físicos (NUNES & MARTINS, 2002).
Dentre as enfermidades que acometem os camarões cultivados, as de etiologia viral
são, invariavelmente, as que causam maior impacto e por isso maiores prejuízos econômicos a
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atividade carcinicultora. Estas viroses têm se difundindo bastante tanto em camarões
cultivados como também em silvestres. No início de 1988, eram identificados apenas seis
vírus patogênicos para estes camarões (LIGHTNER, 1996b). Atualmente, são conhecidas
mais de 22 agentes virais capazes de infectar camarões peneídeos, sendo quatro deles,
responsáveis pelos maiores índices de mortalidade em sistemas de cultivo no mundo: vírus da
síndrome da mancha branca (White Spot Syndrome Virus, WSSV); vírus da síndrome da
Taura (Taura Syndrome Virus, TSV); vírus da cabeça amarela (Yellow Head Virus, YHV); e o
vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética (Infectious Hypodermal and
Hematopietic Necrosis Virus, IHHNV) (HASSON et al., 2005).
Na carcinicultura brasileira, já foi detectada a ocorrência de sete dos agentes
etiológicos virais mais comuns, sendo eles: baculovírus penaei (Baculovirus penaei, BP)
(BUENO et al., 1989, 1990); baculovirus de Penaeus monodon (Penaeus monodon-type
baculovirus, MBV) (BUENO 1991), vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética
(IHHNV) (BUENO, 1991; GESTEIRA & ANDRADE, 2002; MARTINS, 2003), vírus da
hepatopancreatite (Hepatopancreatic parvovirus, HPV) (BUENO, 1991; GESTEIRA &
ANDRADE, 2002), vírus da síndrome da Taura (TSV) (GESTEIRA & ANDRADE, 2002;
HASSON et al., 1995), vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) (ANDRADE et al., 2007;
LIGHTNER et al., 2004; NUNES et al., 2004; TANG et al., 2005), e recentemente, o vírus da
síndrome da mancha branca (WSSV) que praticamente extinguiu a atividade carcinicultora na
região Sul do país (SEIFFERT et al., 2005). Técnicas desenvolvidas para o diagnóstico de
enfermidades humanas têm sido adaptadas para a detecção de enfermidades em crustáceos e
outros organismos aquáticos, incluindo desde a simples análise clínica e histopatológica até os
métodos moleculares mais sofisticados (ANDRADE et al., 2007; COWLEY et al., 2004;
KHADIJAH et al., 2003; LIGHTNER et al., 2006; MACKAY et al., 2002).
As doenças de origem bacteriana também são consideradas como uma ameaça aos
sistemas de larvicultura e engorda de camarões marinhos, tendo como principais agentes
etiológicos, bactérias pertencentes ao gênero Vibrio, que podem em alguns casos ocasionar
mortalidades de até 100% dos camarões cultivados (BROCK & LEAMASTER, 1992). A
ocorrência de uma alfa-proteobactéria determinante da hepatopancreatite necrosante
(necrositing hepatopancreatitis, NHP) também é bastante comum em cultivos de camarões,
especificamente no continente americano, podendo provocar até 90% de mortalidade (LOY et
al., 1996). Alguns antibióticos podem ser empregados no controle de enfermidades
bacterianas em camarões, sendo utilizados preferencialmente em caráter emergencial, e de
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acordo com dosagens pré-estabelecidas para o combate de determinado agente patogênico
(BROWN, 1999; SANGRUNGRUANG et al., 2004).
Embora tenhamos os vírus como os principais agentes causadores de mortalidade e
conseqüente perda econômica para a carcinicultura, existem poucas informações tanto em
nível celular como molecular a respeito da resposta imune viral dos invertebrados.
Paradoxalmente, mais se sabe a respeito do mecanismo de defesa de invertebrados no
contexto antibacteriano e antifúngico do que mesmo na resposta imunológica direcionada à
ação dos vírus (BACHERE et al., 2000; ROBALINO et al., 2004).
Outras enfermidades ocasionadas pela proliferação de protozoários, bactérias
filamentosas e algas, que geralmente aparecem aderidas às brânquias, cefalotórax, apêndices e
a órgãos internos, podem, dependendo do grau de severidade, gerar efeitos deletérios à saúde
do camarão. Estes agentes podem provocar letargia, redução do crescimento e o aumento da
susceptibilidade do camarão às doenças oportunistas (GUZMÁN & VALLE, 2000; NUNES
& MARTINS, 2002).
Neste contexto, a prevenção e o controle das enfermidades se tornaram
imprescindíveis ao setor, principalmente porque, como conseqüência do rápido crescimento
da indústria de cultivo de camarões, patógenos foram disseminados de uma região para outra,
de um país para outro e entre continentes, muitas vezes antes de terem sua etiologia conhecida
ou mesmo terem sido desenvolvidas ferramentas de diagnóstico (LIGHTNER, 1999).
Entretanto, para que se consiga prevenir e controlar estas doenças é necessário que haja uma
integração entre pesquisas que envolvam conhecimentos inerentes à fisiologia, imunologia,
patologia e genética do camarão cultivado (BACHÈRE, 2000).
Em virtude da inexistência de métodos curativos para as doenças virais que
acometem crustáceos, o controle das enfermidades e as medidas de biosegurança dentro dos
sistemas de cultivo de camarões têm sido considerados como os principais fatores críticos
para a manutenção da sustentabilidade do setor (LIGHTNER et al., 2006). Soluções com o
intuito de amenizar o problema gerado pelos surtos de doenças na carcicultura têm sido
sugeridas e incluem dentre outras, a mudança dos sistemas de cultivo intensivo para semi-
intensivo ou extensivo (DOS SANTOS & VALENTI, 2002), adoção de sistemas baseados no
policultivo (TIAN et al., 2001), criação de estoques de reprodutores resistentes a doenças
(COCK et al., 2009), e a utilização de imunoestimulantes, probióticos e alguns antibióticos
(BROWN, 1999; CHIU et al., 2007; GATESOUPE, 1999).
Ainda que se tenham alguns resultados positivos, especialmente na utilização de
determinados métodos terapêuticos na prevenção de enfermidades, pouco se conhece a
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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respeito de seus efeitos a nível molecular. Contudo, alguns genes relacionados ao sistema
imune de crustáceos têm sido clonados e utilizados como marcadores genéticos em estudos de
investigação do mecanismo da ação de imunoestimulantes e identificação de camarões
resistentes ou tolerantes a enfermidades (PAN et al., 2005; WANG et al., 2008b). O estudo
envolvendo a identificação de genes em crustáceos tem contribuído de forma bastante
significativa no conhecimento da fisiologia, imunologia e patologia do camarão L. vannamei
(GROSS et al., 2001; RAVIV et al., 2006; REYES et al., 2007).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. O camarão branco Litopenaeus vannamei
O camarão Litopenaeus vannamei (Fig. 1) é nativo do oceano Pacífico oriental
distribuindo-se desde a província de Sonora (norte do México) até o Estado de Tumbes, no
Peru, normalmente em águas com temperatura superiores a 20 ºC (BENZIE, 2000). A espécie
tem preferência por habitats de fundo lamoso, podendo ser encontrada no ambiente natural
desde a região do infralitoral, até profundidades de 72 m. Durante os estágios iniciais de seu
desenvolvimento o camarão L. vannamei habita regiões com águas de características
oceânicas, refugiando-se para águas litorâneas na medida em que se desenvolve. Nas regiões
estuarinas ou costeiras estes animais vivem até o estágio de juvenil quando retornam ao alto
mar para se reproduzirem. No período reprodutivo, as fêmeas eliminam cerca de 100.000 a
500.000 ovócitos, que são fecundados externamente pelos espermatozóides no momento da
desova (BARBIERI & OSTRESKY, 2002). Após um período de 14 a 20 horas da desova, as
larvas eclodem como naúplios, que possuem 5 subestágios (NI a NV), e passam posteriormente
para os estágios de protozoéia (PI a PIII) e misis (MI a MIII). A metamorfose se completa na
passagem do subestágio misis III para pós-larva I, estágio em que os animais já possuem
todas as características básicas de um camarão adulto (VINATEIA, 2004).
O rostro da espécie L. vannamei é caracterizado por possuir de 8 a 9 dentes dorsais e
de 1 a 2 dentes ventrais. Possui carapaça com espinhos hepáticos e antenais pronunciados,
sem espinho orbital e pterogostomiano. Abdômen com carena dorsal no quarto, quinto e sexto
segmentos, sendo que no último a carena é terminada em espinho; quarto segmento com uma
Figura 1 - Litopenaeus vannamei Fonte: CEDECAM, 2004.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
22
cicatriz e sexto com três cicatrizes. Télson terminando em espinho. O petasma é simétrico,
semi-aberto, descoberto e sem projeção distomedianas, borda ventral curta com a parte distal
do lobo lateral livre, longa e subelíptica estendendo-se além do lobo mediano. O télico é o
tipo aberto com um par de carenas pontiagudas curvas na parte anterior do esternito XIV;
esternito XIII torna-se grande, protuberância mediana semicircular a sub-retangular (PÉREZ-
FARFANTE, 1988; PÉREZ-FARFANTE & KESLEY, 1997).
De acordo com PEREZ-FARFANTE & KESLEY (1997), a classificação taxonômica
do camarão L. vannamei obedece ao seguinte formato:
Reino Animalia
Filo Arthropoda
Subfilo Crustacea: Pennant, 1777
Classe Malacostraca: Latreille, 1806
Subclasse Eumalacostraca: Grobben, 1892
Superordem Eucarida: Calman, 1904
Ordem Decapoda: Latreille, 1803
Subordem Dendrobranchiata: Bate, 1888
Superfamília Penaeoidea: Rafinesque, 1815
Família Penaeidae: Rafinesque, 1815
Subfamília Penaeinae: Dana, 1852
Gênero Litopenaeus: Pérez-Farfante & Kensley, 1997
Espécie Litopenaeus vannamei: Boone, 1931
Características como rusticidade, rápido crescimento, fácil adaptação a rações
comerciais e boa tolerância a variações ambientais, fizeram do L. vannamei a espécie de
camarão mais cultivada no mundo. Os principais países produtores de camarões são China e
Tailândia, na Ásia, e Equador, México e Brasil, nas Américas (FAO, 2006). No Brasil, a
espécie foi introduzida ainda na década de 80, tendo sido dominados os processos de
reprodução e larvicultura na primeira metade dos anos 90, quando teve início a distribuição
comercial de pós-larvas no país (BRASIL, 2001).
A genética molecular de L. vannamei tem sido abordada de diversos ângulos,
objetivando desde a descrição da variabilidade de plantéis até a caracterização do genoma da
espécie. Estes esforços visam de maneira geral fornecer ferramentas para o desenvolvimento
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
23
de programas de melhoramento de genético da espécie (DE FRANCISCO & GALETTI JR,
2005; SHEN et al., 2007).
2.2. Principais Enfermidades que Acometem o Camarão Cultivado no Brasil
Na carcinicultura brasileira, destaca-se a ocorrência da mionecrose infecciosa (IMN),
infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHN), síndrome da mancha branca (WSS),
hepatopancreatite necrosante (NHP) e de Vibrioses (GESTEIRA, 2006).
2.2.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)
A IMN não era conhecida antes de 2002, quando foi identificada pela primeira vez
em uma fazenda de cultivo do camarão L. vannamei no Estado do Piauí, alastrando-se
posteriormente para outros da região Nordeste, incluindo os Estados do Ceará, Rio Grande do
Norte, Pernambuco, Paraíba e Maranhão (ANDRADE et al., 2007). A virose levou a uma
queda acentuada na produção de 2003 e 2004, afetando diretamente o volume de exportações
de camarões brasileiros no biênio (RODRIGUES, 2005). Esta enfermidade, que até então
tinha sua área de ocorrência limitada a Região Nordeste do Brasil, foi recentemente
diagnostica na Indonésia (SENAPIN et al., 2007).
O Vírus da Mionecrose Infecciosa apresenta simetria icosaédrica, não é envelopado,
possui 40 nm de diâmetro e tem densidade de 1,366 g/mL em CsCl. O seu genoma é
composto de uma única molécula de dsRNA com 7560 pb e provavelmente possui um
capsídeo com quatro polipeptídios de peso molecular 24, 42, 106 e 149 kDa (Fig. 2).
Figura 2 - Eletromicrografia do IMNV. Fonte: (POULOS et al., 2006).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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O sequenciamento do genoma viral indicou a presença de dois ORF’s (open reading
frame). O ORF da extremidade 5’ (ORF 1, nt 136-4953) codifica as proteínas do capsídeo e a
RNA-binding, enquanto que o ORF da extremidade 3’ (ORF 2, nt 5241-7451) contém genes
para a codificação da RNA polimerase RNA-dependente (RdRp). Análises filogenéticas
mostraram similaridades significativas entre a RdRp do IMNV com a de um vírus (Giardia
lamblia vírus - GLV) pertencente a família Totiviridae, indicando que o IMNV pode ser o
único membro desta família capaz de infectar invertebrados (POULOS et al., 2006).
Entretanto, a distância evolutiva entre hospedeiros (Crustáceos x Protozoários flagelados)
somada a novas descobertas referentes à região do ORF 1 do IMNV quando comparados a
membros da família Totiviridae, sugerem estudos futuros para uma classificação definitiva do
IMNV, que pode levar a criação de uma nova família de vírus de dsRNA que infecta
invertebrados (NIBERT, 2007).
Dentre as espécies de camarões identificadas como susceptíveis ao IMNV estão o L.
vannamei, L. stylirostris, Penaeus monodon e o Farfantepenaeus subtilis (GOUVEIA &
FREITAS, 2007; LIGHTNER et al., 2004; TANG et al., 2005). A sintomatologia típica da
doença causada pelo IMNV em L. vannamei é caracterizada por necrose dos músculos
estriados do abdômen, apêndices e cefalotórax. Macroscopicamente, esta lesão se manifesta
através de uma opacidade muscular, principalmente no abdômen distal e na cauda, com áreas
de aspecto leitoso durante a fase inicial da doença. Em estágios mais avançados, pode ocorrer
uma decomposição tecidual da região afetada devido a liquefação da musculatura, que
provoca uma coloração avermelhada, dando uma aparência de camarão cozido (NUNES et
al., 2004). Além de afetar a musculatura estriada, o IMNV pode também lesionar as brânquias
e o órgão linfóide dos camarões infectados (LIGHTNER et al., 2004).
Para o diagnóstico da Mionecrose Infecciosa são utilizadas técnicas histopatológicas
(LIGHTNER et al., 2004) e ferramentas moleculares de detecção. Os métodos moleculares
que utilizam marcadores genéticos específicos para a detecção do IMNV são: hibridização in
situ, transcrição reversa do RNA total seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e
RT-PCR em tempo-real (qRT-PCR) (ANDRADE et al., 2007; ANDRADE et al., 2008;
PINHEIRO et al., 2007).
2.2.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)
O agente etiológico da enfermidade é um vírus cosmopolita que infecta grande parte
das espécies de camarões peneídeos selvagens e cultivados, porém não exclusivo ao gênero,
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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tendo sido detectado também em pós-larvas e juvenis do camarão de água doce
Macrobrachium rosenbergii (LIGHTNER, 1996b; HSIEH et al., 2006). O Vírus da Infecção
Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV) já foi detectado na costa do Pacífico desde o
Peru até o México, no Havaí, Brasil, Filipinas, Japão, Tailândia, Taiwan, Singapura,
Indonésia, Oriente Médio, Nova Caledônia, Guam, Madagascar, Tanzânia e Austrália (BING
et al., 2006; LIGHTNER, 1996b; OLIVEIRA-NETO, 2006; OWENS et al., 1992; PANTOJA
et al., 1999; TANG & LIGHTNER, 2002a, 2006).
O IHHNV é o menor dos vírus que ataca camarões peneídeos, apresenta simetria
icosaédrica, não envelopado, tamanho aproximado de 22 nm, com densidade de 1,40 g/mL em
CsCl. O patógeno contém DNA de fita simples com um tamanho de 4,1 kbp e possui um
capsídeo com quatro polipeptídios de 74, 47, 39 e 37,5 kDa (Fig. 3). Com base nestas
características, o vírus foi classificado como um membro da família Parvoviridae (BONAMI
et al., 1990; BONAMI & LIGHTNER, 1991; MARI et al., 1993).
Uma análise comparativa entre o genoma do IHHNV e de um vírus pertencente ao
gênero Brevidensovirus que ataca mosquitos mostrou alta similaridade genética, o que levou a
classificação do IHHNV como membro do gênero (SHIKE et al., 2000). Além desta
semelhança genética, estes vírus ainda têm em comum o fato de serem transmitidos
principalmente pelas fêmeas de seus hospedeiros e eventualmente através dos machos, no que
infere ao modo de transmissão vertical (EMMERI et al., 2002).
Em camarões, a detecção do IHHNV pode ser feita por métodos histológicos e
moleculares. Os métodos moleculares que utilizam marcadores genéticos específicos para o
diagnóstico do IHHNV são: Dot-blot, a hibridização in situ, a reação em cadeia da polimerase
(PCR) e a PCR em tempo-real (qPCR) (BELL & LIGHTNER, 1988b; LIGHTNER et al.,
Figura 3 - Eletromicrografia do IHHNV Fonte: (LIGHTNER & PANTOJA, 2005).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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1992; LIGHTNER, 1996a; NUNAN et al., 2000; TANG & LIGHTNER, 2001).
A primeira ocorrência da IHHN em camarões foi observada em espécimes de L.
stylirostris no Havaí (LIGHTNER, 1983), e foi caracterizada por causar doença aguda com
alta taxa de mortalidade (superior a 90%) nas fases de juvenil e de sub-adulto. A infecção
provocada pelo IHHNV no camarão L. vannamei é considerada de baixo impacto, levando a
uma enfermidade crônica denominada “síndrome do nanismo deformativo” (runt deformity
syndrome, RDS), que ocasiona deformidades no rostro e na cutícula, antenas enrugadas,
aspereza da carapaça e índices reduzidos de crescimento (KALAGAYAN et al., 1991).
2.2.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)
A Síndrome da Mancha Branca foi primeiramente detectada em camarões cultivados
no Norte de Taiwan no ano de 1992 (NAKANO et al., 1994), e desde o seu descobrimento
tem se tornado uma das enfermidades mais ameaçadoras para a atividade carcinicultora no
mundo (ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008). O vírus causador da doença foi pioneiramente
isolado de uma epidemia ocorrida no Japão (INOUYE et al., 1994) e dentro de poucos anos se
alastrou por vários países (FLEGEL, 1997). Em virtude da variação e simultaneidade da
ocorrência da enfermidade em várias regiões do mundo, a WSS recebeu, pelo menos, 13
denominações distintas (SANGAMAHESWARAN & JEYASEELAN, 2001).
O vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) é baciliforme, envelopado e possui
um nucleocapsídeo em forma de bastão (WANG et al., 1995). Este vírus foi recentemente
classificado como pertencente ao gênero Whispovirus, família Nimaviridae (LEU et al.,
2009). O virião possui entre 210-380 nm de comprimento, 70-167 nm de largura máxima e
contém DNA de dupla fita circular com tamanho aproximado de 300 kbp, que varia de acordo
com a localidade onde o vírus é encontrado (CHEN et al., 2002) (Fig. 4).
Figura 4 - Eletromicrografia do WSSV Fonte: (LIGHTNER, 2000).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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Análises genéticas demonstraram que o genoma do WSSV contém de 581 a 684
ORF’s com os nucleotídeos “ATG” como códon de inicialização. Dentre estes ORF’s,
aproximadamente 184 são responsáveis pela codificação de proteínas com tamanhos variando
entre 51 e 6077 aminoácidos, que representam aproximadamente 92% da informação genética
contida no genoma do vírus (VAN HULTEN et al., 2001; YANG et al., 2001).
A enfermidade causada pelo WSSV é caracterizada por provocar mortalidades
massivas em camarões peneídeos cultivados. O vírus possui um amplo número de
hospedeiros, incluindo uma grande variedade de espécies de camarões, lagostas, caranguejos,
poliquetas, membros do filo Chaetognata e Rotifera, além de algumas espécies de insetos
aquáticos (ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008). A doença é considerada como letal em
camarões cultivados quando mortalidades de 90-100% ocorrem dentre 3 a 10 dias, antes
mesmo dos primeiros sintomas surgirem. Os sinais clínicos observados em camarões
infectados se baseiam principalmente na presença de deposição de cálcio (0,5 a 2 mm de
diâmetro) na cutícula do cefalotórax, podendo também apresentar redução no consumo
alimentar, anorexia, letargia e uma coloração avermelhada nos apêndices ou mesmo em todo
corpo do animal (LIGHTNER 1996a; SÁNCHEZ-MARTÍNEZ et al., 2007).
Vários procedimentos de diagnóstico têm sido desenvolvidos para a detecção do
WSSV, e incluem, dentre outras, técnicas de histopatologia (LIGHTNER, 1996a;
RODRÍGUEZ et al., 2003), hibridização in situ (LO et al., 1999), amplificação isotérmica do
DNA (KONO et al., 2004), detecção por anticorpos monoclonais (MAKESH et al., 2006),
PCR (SRITUNYALUCKSANA et al., 2005) e métodos que utilizam sondas de DNA-
Microarray (KHADIJAH et al., 2003).
Em meados de 2005, a WSS foi detectada pela primeira vez na carcinicultura
brasileira, ficando sua ocorrência restrita ao Estado de Santa Catarina, o que acasionou a
proibição da comercialização de camarões para outros Estados e a interdição dos
empreendimentos envolvidos, gerando sérios danos a atividade carcinicultora da região
(SEIFFERT, 2005). Posteriormente, o WSSV foi encontrado também em fazendas do
Nordeste brasileiro tendo sido relatado no Estado do Ceará no ano de 2005. Entretanto, o
vírus encontrado no Nordeste brasileiro não demonstrou o mesmo grau de patogenicidade do
WSSV encontrado nas fazendas do Sul do país (OIE, 2005).
2.2.4. Vibrioses
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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A enfermidade é provocada por algumas bactérias de bacilos curvos pertencentes ao
gênero Vibrio (Fig. 5). As principais espécies que infectam Peneídeos são: Vibrio
parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. dansela, V. harveyi, V. penaeicida V.
anguillarum, V. nereis, V. tubiashi e V. fluvialis (LIGHTNER, 1996c).
Apesar de ocorrerem naturalmente na água e sedimentos marinhos, assim como na
microbiota gastrointestinal do camarão, algumas espécies de víbrios têm sido associadas com
massivas mortalidades em vários países produtores (TAKAHASHI et al., 1985; ANDERSON
et al., 1988; SONG et al., 1993; COSTA et al., 1998). Vários métodos têm sido
desenvolvidos para a detecção de víbrios em amostras de camarões, sedimentos e água de
cultivo, e incluem ferramentas de identificação bioquímica (O’HARA et al., 2003), técnicas
moleculares (GONZALEZ et al., 2004; HERNÁNDEZ & OLMOS, 2003) e análises
imunológicas (LONGYANT et al., 2008).
Contudo, em camarões, as vibrioses têm sido consideradas como enfermidades
secundárias e oportunistas, assumindo uma maior patogenicidade especialmente quando o
animal se encontra sob condições de estresse (SAULNIER et al., 2000; LIU & CHEN, 2004).
Segundo PHUOC et al. (2008), a ocorrência de vibrioses além de provocar lesões e
mortalidades em camarões, contribui fortemente para o aumento da susceptibilidade destes
animais a outras enfermidades.
Na maioria dos casos, as vibrioses em camarões podem ser caracterizadas pela
expansão dos cromatóforos dos pleópodos, pereiópodos e urópodos, opacidade muscular,
assim como pela presença de listras negras nas regiões laterais do cefalotórax. Uma coloração
amarelada das brânquias e do cefalotórax pode também ser um indicativo da ocorrência desta
enfermidade (SUDHEESH & XU, 2001; LONGYANT et al., 2008). As vibrioses podem ser
diagnosticadas por análise a fresco, bacteriológica ou histopatológica, podendo ainda utilizar-
Figura 5 - Fotomicrografia de Víbrio sp. Fonte: FICA, 2007.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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se de métodos bioquímicos, moleculares ou imunológicos para a identificação do agente
patogênico em amostras de tecido ou hemolinfa do camarão (LIGHTNER, 1996a).
2.2.5. Hepatopancreatite Necrosante (NHP)
A Hepatopancreatite Necrosante é causada por uma alfa-proteobactéria gram-
negativa, pleomórfica, obrigatoriamente intracelular e pertencente ao gênero Rickettsia
(FRELIER et al., 1992). O tipo desta Rickettsia de maior patogenicidade e predominância em
camarões é um pequeno cocobacilo com 0,36 µm de diâmetro e que se multiplica no interior
das células epiteliais dos túbulos do hepatopâncreas (LOY et al., 1996) (Fig. 6).
Esta doença foi inicialmente detectada em cultivos de L. vannamei dos Estados
Unidos, mais especificamente no Estado do Texas (KROL et al., 1991), e posteriormente em
países como Peru, Costa Rica, Panamá, Brasil, Venezuela, Equador e México. A ocorrência
da NHP ainda se limita às Américas, sendo capaz de infectar camarões das espécies L.
vannamei, L. setiferus, L. stylirostris, F. aztecus e F. californiensis (PANTOJA &
LIGHTNER, 2003).
Segundo NUNES & MARTINS (2002), camarões L. vannamei afetados com a NHP
podem inicialmente apresentar um quadro clínico assintomático da enfermidade.
Posteriormente, estes animais cessam a alimentação e o crescimento, o que pode ser
facilmente identificado através da observação do trato digestório, que aparece sempre vazio, e
da perda de rigidez da carapaça. Em estágios mais avançados, pode ainda ser observada uma
descoloração das brânquias, bem como evidentes alterações no hepatopâncreas como atrofia e
Figura 6 - Eletromicrografia da NHP mostrando o formato helicoidal e cocobacilo da bactéria. Fonte: (LIGHTNER, 1996a).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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esbranquiçamento. Conforme os autores, as mortalidades acumuladas em decorrência da
infecção por NHP podem alcançar até 50% dos camarões em cultivo. Análises a fresco podem
ser utilizadas na identificação da NHP em camarões durante a fase de intermuda. Nestes
exames são observadas deformidades do hepatopâncreas, que apesar de não sofrer alterações
externas no inicio da infecção, apresentam atrofia e estrangulamento dos túbulos durante a
fase crônica da doença. Pouca reserva de lipídeos e indícios de massas bacterianas podem
também ser observados em camarões infectados com a NHP (MORALES-COVARRUBIAS,
2008).
Métodos histopatológicos e moleculares podem também ser utilizados no diagnóstico
da enfermidade determinada pela bactéria da Hepatopancreatite necrosante (NHP) (RÍO-
RODRÍGUEZ et al., 2006; VINCENT & LOTZ, 2005; NUNAN et al., 2008).
2.3. O Sistema Imune de Invertebrados
O sistema imune é constituído por mecanismos de defesa altamente complexos
utilizados pelos organismos multicelulares no combate a uma ampla variedade de corpos
estranhos ou patogênicos. Dada sua complexidade, este sistema pode ser subdividido em inato
e adaptativo (BOWDEN, 2008). A resposta imune inata ou natural compreende todos os
mecanismos presentes naturalmente nos organismos pluricelulares, constituindo-se na
primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos através do reconhecimento de
moléculas padrões associadas ao agente invasor. Por outro lado, o sistema imune adaptativo é
típico de vertebrados, sendo filogeneticamente mais recente. É caracterizado pela presença de
vários receptores e anticorpos linfocíticos das células B e T, e ainda por células de memória,
que garantem uma resposta de defesa altamente específica, especialmente na ocorrência de
uma segunda infecção pelo mesmo patógeno (LEE & SÖDERHÄLL, 2002).
Diferentemente dos vertebrados, os invertebrados contam apenas com a resposta
imune inata. Segundo BARRACO (2004), a ausência da resposta adaptativa nos
invertebrados, e conseqüentemente de memória imunológica, inviabiliza qualquer tentativa de
desenvolvimento de vacinas, o que diminui expressivamente a possibilidade de prevenção e
controle das enfermidades em camarões cultivados. Porém, estudos recentes evidenciam a
presença de memória imune na resposta inata de invertebrados, através da descoberta de
células de adesão com características análogas aos anticorpos de vertebrados (KURTZ &
ARMITAGE, 2006).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
31
A resposta inata dos invertebrados inclui uma série de reações imunes celulares e
humorais que atuam de forma integrada e estão intimamente associadas à hemolinfa do
animal. Os hemócitos, células circulantes da hemolinfa, são os principais responsáveis pelas
reações imunes celulares, atuando na fagocitose de patógenos e na formação de nódulos e
cápsulas hemocíticas em torno dos organismos invasores, destruindo-os através da liberação
e/ou produção de moléculas tóxicas e microbicidas, que incluem as enzimas lisossomais,
peptídeos antimicrobianos (Antimicrobial peptides, AMPs) e as espécies intermediárias
reativas de oxigênio (Reative Oxygen Intermediates, ROIs) e nitrogênio (Reative Nitrogen
Intermediates, RNIs) (BARRACO et al., 2008). Três populações de hemócitos podem ser
identificadas de acordo com a presença de grânulos citoplasmáticos, sendo assim,
classificados em hialinos, semi-granulares e granulares (JOHANSSON et al., 2000). Segundo
VAN DE BRAAK et al. (2002a), os hemócitos hialinos estariam envolvidos apenas no
processo de coagulação, enquanto os semi-granulares e granulares na fagocitose, formação de
nódulos e encapsulação dos organismos patogênicos. Contudo, o papel de cada população de
hemócitos na defesa imune de invertebrados ainda é um tema bastante discutido, não
existindo, portanto, uma definição universal e totalmente aceita para o mecanismo de ação
destas células (GARGIONI & BARRACO, 1998; JOHANSSON et al., 2000; VAN DE
BRAAK et al., 2002b).
As reações imunes humorais dos invertebrados envolvem a ação de moléculas de
reconhecimento como as lectinas, o sistema de coagulação e o sistema profenoloxidase. As
lectinas são proteínas ou glicoproteínas bivalentes capazes de aglutinar a superfície de
diferentes bactérias e outros patógenos invasores que possuam determinados açúcares. No
processo de aglutinação, as lectinas podem ainda melhorar a eficiência da fagocitose do corpo
invasor pelos hemócitos, funcionando como opsoninas, semelhante ao papel dos anticorpos
nos vertebrados. Entretanto, a ação das lectinas se limita a resíduos de açúcares presentes na
superfície das células do organismo patogênico (MARQUES & BARRACO, 2000).
Dois diferentes tipos de mecanismos de coagulação têm sido caracterizados para os
invertebrados, especialmente para os artrópodes (THEOPOLD et al., 2004). No limulídeo
Tachypleus tridentatus, o sistema de coagulação envolve uma cascata proteolítica que é
acionada pelo processo de degranulação dos hemócitos. Esta atividade hemocítica é induzida
pela presença de pequenas quantidades de lipopolissacarídeos de bactérias e β-1,3-glucanos
de fungos e culmina na ativação de uma pró-enzima, responsável pela catalisação e conversão
de uma proteína solúvel do plasma, o coagulogênio, em um agregado insolúvel, a coagulina,
cujo principal objetivo é o de limitar a infecção (IWANAGA, 2002). Já no lagostim
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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Pacifastacus leniusculus, o sistema de coagulação não envolve cascatas proteolíticas. Neste
crustáceo, a polimerização das proteínas de coagulação (Clotting protein, CP) é catalizada por
enzimas transglutaminases (Transglutaminase, TGase) dependentes de cálcio. As TGase estão
usualmente compartimentalizadas dentro dos hemócitos e são capazes de formar ligações
covalentes (λ-glutamil-ε-lisina) entre certas proteínas, como a proteína de coagulação presente
no plasma, resultando na formação de um gel insolúvel (MANINGAS et al., 2008).
O sistema profenoloxidase consiste em um conjunto de reações iniciada pela
oxidação de compostos fenólicos em quinonas por ação da enzima fenoloxidase
(Phenoloxidase, PO), que é sintetizada pelos hemócitos na sua forma inativa
(profenoloxidades) e convertida para sua forma ativa (PO) através de uma cascata de serina-
protease. Por meio de vias não enzimáticas, as quinonas são transformadas em vários
compostos citotóxicos e na melanina. A encapsulação dos patógenos por estes compostos
confere uma coloração escura às áreas de infecção, comumente denominada de melanização.
A ativação do sistema profenoloxidase se dá através do reconhecimento não-próprio de
moléculas padrões associadas à patógenos (Pathogen-associated molecular patterns,
PAMP’s) como lipopolissacarídeos ou peptidoglicanos de bactérias e β-1,3- glucanos de
fungos (CERENIUS et al., 2008).
Os invertebrados possivelmente contam ainda com dois mecanismos próprios da
resposta inata antiviral, que incluem os sistemas interferon (Interferon, IFN) e de RNA de
interferência (RNA interference, RNAi). Até pouco tempo atrás o sistema interferon era
considerado exclusivo de vertebrados, até que uma proteína homóloga a IFN-α de mamíferos
foi identificada em hemócitos do peneídeo P. japonicus (HE et al., 2005). Em vertebrados,
esta proteína juntamente com a IFN-β são induzidas por infecções virais e possuem a
capacidade de estimular a expressão de uma série de genes participantes de respostas
antivirais inespecíficas (PESTKA, 2007). ROBALINO et al. (2004), já haviam comprovado a
existência da resposta antiviral inespecífica em camarões L. vannamei através de injeções de
seqüências inespecíficas de dsRNA. A presença destas seqüências induziu a resposta antiviral
nos camarões, conferindo, conseqüentemente, um aumento expressivo da resistência a
infecções provocadas por dois vírus não relacionados, TSV e WSSV.
O mecanismo de silenciamento pós-transcricional de genes, também conhecido como
RNA de interferência, envolve o processamento ou maturação de precursores longos de
dsRNA em pequenos RNAs de 20-50 pb (short interfering RNAs, siRNA; repeat-associated
short interfering RNAs, rasiRNAs; e microRNAs, miRNAs) a partir de reações catalizadas por
endonucleases do tipo RNAse III dsRNA-específico, como as enzimas Drosha e Dicer. Estes
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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pequenos RNAs (RNAi) podem conduzir a clivagem de moléculas complementares de RNA
a partir de um complexo de silenciamento multiprotéico (RNA-induced silencing complex,
RISC), promovendo uma degradação específica ou a repressão da tradução do mRNA do
organismo patogênico (MEISTER & TUSCHL, 2004). Em camarões L. vannamei, este
mecanismo foi ativado a partir da injeção de longas moléculas de dsRNA referentes a
fragmentos da subunidade ribonucleotídeo redutase (Ribonucleotide reductase small subunit,
RR2), DNA polimerase (DNA polymerase, DP) ou do ORF-WSV252 (Open reading frame,
ORF-WSV252) provenientes do WSSV (ROBALINO et al., 2005).
Estudos recentes no campo da imunologia de camarões identificaram a presença de
receptores do tipo “Toll” em células dos peneídeos L. vannamei (IToll) e P. monodon
(PmToll). O alto índice de similaridades destes “Tolls” de camarões com os encontrados em
insetos levantam a hipótese da associação destas proteínas com o sistema imune inato do
camarão, inclusive na resposta antiviral. Na mosca Drosophila melanogaster, estes tipos de
receptores induzem a transcrição do AMP drosomicina. A análise das seqüências dos “Tolls”
dos peneídeos mostra um alto grau de conservação dos domínios LRR e TIR, semelhante ao
encontrado em “Tolls” de vertebrados. Por outro lado, não foi constatado nenhum sítio de
união para PAMP’s no domínio LRR, o que coloca em questão a atividade funcional destas
proteínas na resposta imune de camarões (YANG et al., 2007; ARTS et al., 2007). Em
vertebrados, o reconhecimento de PAMP’s através de sítios de união localizados no domínio
LRR permite a indução da expressão de importantes citocinas do sistema interferon (IFNs),
bem como de moléculas ativas da resposta imune adaptativa (AKIRA & TAKEDA, 2004).
2.4. Análise da Expressão Gênica em Organismos Aquáticos
A análise da expressão gênica permite o estudo de caracterização gênica na tentativa
de se compreender a relação entre os genes e seus fenótipos correspondentes em diferentes
estágios do desenvolvimento de um organismo e sob diferentes condições fisiológicas e
ambientais (BREYNE & ZABEAU, 2001).
A primeira ferramenta desenvolvida com o intuito de se determinar de modo global os
níveis de expressão gênica se baseou no sequenciamento massivo de transcritos (Expressed
Sequence Tag, EST’s), particularmente útil para a descoberta de novos genes, porém
extremamente trabalhosa e dispendiosa (ADAMS et al., 1995). Posteriormente, foram
desenvolvidas várias técnicas alternativas para a detecção e/ou quantificação da expressão
gênica. As principais ferramentas empregadas se baseiam em três distintos princípios
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
34
metodológicos: 1º) Hibridização de sondas (Ex: cDNA-microarray; Oligo-microarray e
Suppression subtractive hybridisation, SSH); 2º) Sequenciamento de regiões especificas de
fragmentos de cDNA (Ex: Serial Analysis of Gene Expression, SAGE; Massive Parallel
Signature Sequencing, MPSS); e 3º) Análises de fragmentos de cDNA amplificados pela
reação em cadeia da polimerase (Ex: Differential display reverse transcription-polymerase
chain reaction, DDRT-PCR; Real Time quantitative Reverse Transcription-PCR, qRT-PCR e
cDNA-amplified fragment length polymorphism, cDNA-AFLP) (BREYNE & ZABEAU,
2001). A utilização dessas técnicas tem contribuído substancialmente para estudos envolvendo
a expressão gênica diferencial, análise de transcritos e caracterização da transcrição em
determinadas células ou tecidos sob condições fisiológicas diversas (ONEAL et al., 2008;
BREYNE et al., 2002; TORRES et al., 2006; WHETTEN et al., 2001).
A literatura traz diversos exemplos dos avanços tecnológicos que têm permitido ao
homem a identificação e caracterização de genes em organismos aquáticos de relevante
interesse para a aqüicultura e pesca. O estudo de mecanismos moleculares na diferenciação
sexual em peixes, por exemplo, tem demonstrado claramente o papel dos esteróides e
especialmente dos estrógenos. No entanto, este estudo tem sido focado em um pequeno
número de espécies, basicamente espécies de significativos valores comerciais (DEVLIN &
NAGAHAMA, 2002). Pesquisas recentes com tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus)
envolvendo a técnica de cDNA-microarray identificaram a presença de genes expressos
diferentemente em machos e fêmeas antes da diferenciação gonadal, permitindo, deste modo, a
sexagem prévia de espécies que não possuem dimorfismo sexual através da utilização dos
genes descobertos como marcadores genéticos (SHIGEHO et al., 2008).
A técnica da transcrição reversa do RNA total seguido da reação em cadeia da
polimerase em tempo real (qRT-PCR) foi utilizada para a caracterização da expressão dos
genes 3 RMF, 2 MEF e 2 miostatina no músculo de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
durante 9 estágios de seu desenvolvimento. O nível de expressão e o conhecimento das
funções de cada gene testado foram utilizados para inferir o grau de hiperplasia, hipertrofia e
limitação do crescimento muscular durante cada estágio de desenvolvimento estudado
(JOHANSEN & OVERTURF, 2005). A qRT-PCR também foi utilizada na perfilagem da
expressão de 22 genes relacionados com processos controlados por andrógeno e estrógeno
como a reprodução, crescimento e desenvolvimento de fêmeas e machos do peixe pateta
(Pimephales promelas). Para esta análise, tecidos de gônadas e fígado foram expostos ao anti-
andrógeno flutamida e ao estrógeno sintético 17α-etilestradiol (EE2). Nas duas formas de
tratamento foram produzidos fenótipos como a indução do plasma vitelogênico, redução
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
35
gonadossomático e redução secundária dos caracteres sexuais dos peixes. No entanto,
observou-se uma expressão diferencial dos genes analisados para os diferentes tratamentos,
sugerindo que estes operam basicamente por vias de mecanismos moleculares distintos
(FILBY et al., 2007).
BOUTET et al. (2005) investigaram a expressão do mRNA referente ao gene AST
(Aspartate aminotransferase) em diferentes tecidos da ostra Crassostrea gigas quando
exposta à hidrocarbonetos, pesticidas, condições de hipoxia e ao estresse causado por uma
hipo-salinidade. Os resultados desta pesquisa demonstraram que a expressão do gene AST
respondeu a exposição à hidrocarbonetos, condições de hipoxia e ao estresse salino, mas não
quando os animais eram expostos a pesticidas durante um determinado período de contato.
Entretanto, os autores afirmam que a utilização do gene AST como um emergente
biomarcador genético para o monitoramento de distúrbios ambientais ainda necessita de
estudos complementares.
Um recente trabalho de prospecção gênica utilizando metodologia modificada da
técnica de Differential Display RT-PCR detectou genes do camarão-rosa Farfantepenaeus
paulensis relacionados com o seu crescimento e tolerância à salinidade. O estudo resultou na
identificação dos genes da ciclofilina e hemocianina, que até então não tinham sido descritos
para a espécie estudada (KAMIMURA et al., 2008).
Dentre as pesquisas inerentes à prospecção e caracterização gênica em organismos
aquáticos, várias são as abordagens que tratam do acometimento de enfermidades em
camarões. Segundo BARRACCO et al. (2008), a identificação e quantificação da expressão
gênica de diferentes moléculas imunológicas em crustáceos têm auxiliado significativamente
na compreensão das respostas imunes desencadeadas nos processos infecciosos, assim como
dos mecanismos relacionados à interação patógeno-hospedeiro, ainda de pouco conhecimento
científico. DHAR et al. (2003), verificaram que genes codificadores de proteínas
imunológicas, estruturais, bem como aquelas de funções não conhecidas, tiveram sua
expressão maximizada em camarões L. vannamei infectados com o vírus da mancha branca
(WSSV). Neste estudo, a expressão do mRNA foi identificada e quantificada por cDNA-
microarray que se constituiu na primeira análise quantitativa da expressão gênica em
organismos aquáticos.
MONTAÑO-PÉREZ et al. (2005), utilizando a técnica de Differential Display RT-
PCR identificaram a expressão diferencial de genes em hemócitos do camarões L. vannamei
infectados experimentalmente com o Vibrio alginolyticus ou inoculados com partículas
abióticas (DEAE-Sephadex). A identificação dos genes detectados demonstrou que as células
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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de hemócitos são capazes de reconhecer e distinguir diferentes corpos estranhos, além de
responderem de forma bastante especifica a cada tipo, o que sugere alguma especificidade na
resposta imune do camarão.
A pesquisa voltada a descoberta de genes relacionados à resistência de camarões a
doenças têm despertado significativo interesse, especialmente na identificação daqueles
envolvidos na resistência viral. LUO et al. (2003) foram pioneiros na prospecção gênica
associada a resistência viral de camarões através da identificação do gene PmAV em camarões
Penaeus monodon resistentes ao WSSV. Outros estudos vêm explorando este campo de
pesquisa, porém, a ausência de linhagens celulares permanentes em crustáceos tem dificultado
a caracterização de genes através de ensaios in vitro de infecção ou de atividade antiviral (LIU
et al., 2001; LIGHTNER et al., 2006).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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3. OBJETIVOS
3.1. Geral
• O presente trabalho teve como objetivo geral prospectar e caracterizar genes
relacionados a enfermidades de camarões da espécie Litopenaeus vannamei sob
condições de cultivo.
3.2. Específicos
• Investigar a ocorrência de enfermidades em camarões L. vannamei, sob condições de
cultivo, através de métodos histopatológicos e moleculares de detecção.
• Produzir perfis de expressão gênica de camarões L. vannamei através da perfilagem do
RNA total seguido da transcrição reversa da polimerase utilizando-se a técnica
Differential Display RT-PCR (DD-RTPCR).
• Identificar, pela análise dos padrões de expressão de camarões infectados e saudáveis,
genes potencialmente relacionados às enfermidades detectadas nos camarões
investigados.
• Caracterizar os genes candidatos através de clonagem, sequenciamento e homologia a
sequências conhecidas.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Obtenção do material biológico
Nesta pesquisa foram utilizados 40 camarões com aproximadamente 10g (±2)
pertencentes à espécie Litopenaeus vannamei. Os animais foram coletados em um viveiro
localizado no município de Paraípaba (CE) com 140 dias de cultivo durante a época de estio
do ano de 2007. A análise prévia do histórico de cultivo deste viveiro indicou características
inerentes à ação de patógenos como alta taxa de conversão alimentar, elevado índice de
mortalidade e a presença de camarões moribundos no sistema de cultivo.
No momento da amostragem, os camarões estavam sendo mantidos sob as seguintes
condições: densidade de 30 camarões/m2; pH 8,98; temperatura de 27,6 °C; salinidade 5‰;
4,7 mg/L de oxigênio dissolvido; e 27 cm de transparência da água. A captura dos animais foi
realizada com o auxílio de uma tarrafa, sendo a coleta efetivada em apenas um ponto do
viveiro.
Para a investigação molecular de enfermidades e prospecção gênica nos camarões
coletados foram retirados os pleópodos de cada camarão e conservados em álcool etílico 96%
(MERCK) até o processo de extração de ácidos nucléicos. Após a retirada dos pleópodos, os
camarões foram fixados com aproximadamente 30 mL de solução de Davidson AFA’s (BELL
& LIGHTNER, 1998a) e imersos na mesma solução até o seu processamento histológico.
Todo o material biológico coletado foi devidamente etiquetado em ordem numérica e
encaminhado ao Centro de Diagnósticos de Enfermidades de Organismos Aquáticos
(CEDECAM/LABOMAR-UFC) para as análises genéticas e histopatológicas. As amostras
destinadas a estudos moleculares foram transportadas em caixas isotérmicas contendo gelo e
armazenadas à -70 °C.
4.2. Extração de Ácidos Nucléicos e Síntese de cDNA
4.2.1. Extração de DNA total
O DNA genômico total foi extraído de acordo com o protocolo descrito por
SAMBROOK et al. (1989) e utilizado no diagnóstico molecular de vírus de DNA. Este
material genético foi extraído de aproximadamente 20 mg de tecido muscular de pleópodo
conservado em álcool 96% (MERCK®). Para a extração, o material biológico foi lavado com
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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uma solução de Tris-HCl (10 mM, pH 7,0) e colocado em microtubos do tipo Eppendorf de
1,5 ml contendo 500 µL de tampão de extração (Tris-HCl 100 mM, SDS 1%). Em seguida,
adicionou-se 30 µL de proteinase K (10 mg/ml) e misturou-se bem por inversão.
As amostras foram incubadas a 65 °C por 3 horas até o tecido está completamente
digerido, misturando-se ocasionalmente por inversão. Após a digestão do tecido, foi
adicionado 500 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) (INVITROGEN®)
misturando-se por inversão durante 5 min. Para a separação das fases, as amostras foram
centrifugadas a 17.760 g/5 min. Uma alíquota de 450 µL da fase aquosa superior foi
transferida para outro microtubo tomando-se o cuidado essencial para não perturbar a
interface. Numa segunda etapa de purificação, 500 µL de clorofórmio:álcool isoamílico
(24:1) foram novamente adicionados à amostra e misturou-se por inversão durante 5 min. As
amostras foram novamente centrifugadas a 17.760 g/5 min e 450 µL da fase aquosa superior
foi transferido para outro microtubo de 1,5 mL. Para precipitação do DNA, foi adicionado 1,0
mL de etanol absoluto e 50 µL de acetato de sódio às amostras, incubando-as a 20 °C/30 min.
Após este passo, as amostras foram centrifugadas a 17.760 g/15 min a 4 °C. O sobrenadante
foi removido cuidadosamente por inversão. As amostras foram então lavadas com 500 µL de
etanol 70%, invertendo-se algumas vezes para posteriormente serem centrifugadas a 17.760
g/5 min. O etanol foi descartado cuidadosamente e os microtubos invertidos sobre um papel
toalha a fim de maximizar o processo de secagem a temperatura ambiente (15 a 25 °C) por 10
minutos.
O DNA das amostras foi ressuspendido em 50 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1
mM) e tratado com 2,0 µL de RNase (10 mg/mL). Para a ativação da RNase, as amostras
foram incubadas a 37 °C/30 min. Antes da utilização do DNA total extraído, sua integridade
foi avaliada por corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, preparado em 150 mL de TAE
(1X) (0,04 M Tris Base; 0,04 M acetato e 0,001 M EDTA) contendo 0,1 µg/mL de Brometo
de Etídio. O gel foi preparado em uma cuba Electophoresis Systems FB-SB-1316
(FISHERBIOTECH®) contendo o tampão TAE (1X). 1,0 µL de cada amostra de DNA foi
misturada a 1,0 µL do corante Blue juiceTM 10X (INVITROGEN®) e aplicada no gel. A
corrida eletroforética foi realizada com a potência de 0,58 volts/cm2 de corrente contínua
durante 60 minutos. O gel foi visualizado em um transiluminador ultravioleta SelectTMSeries
(ESPECTROLINE®) e fotodocumentado através do sistema de análise e fotodocumentação de
eletroforese (Electrophoresis Documentation and Analysis System 290, EDAS 290)
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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(KODAK®) que utiliza o programa de computador KODAK 1D Image Analysis Software
(PIZZONIA, 2001).
O DNA total de cada amostra foi ainda quantificado em um aparelho
espectrofotômetro BIOMATE 3 (THERMO®, Electron Corporation), utilizando-se a
absorbância na faixa de 260 nm. A relação de absorbância (260A/280A) também foi analisada
para a certificação do grau de pureza do DNA total extraído.
4.2.2. Extração de RNA total
O RNA total foi extraído a partir de aproximadamente 50 mg de tecido muscular de
pleópodos, com a utilização do reagente Trizol (INVITROGEN®), seguindo metodologia
recomendada pelo fabricante, e usado para as sínteses dos cDNAs destinados a produção dos
perfis genéticos ou diagnóstico molecular de vírus de RNA. Inicialmente, o material biológico
foi lavado com uma solução de Tris-HCl (10 mM, pH 7,0) e colocado em microtubos de 1,5
mL contendo 500 µL de Trizol. Os pleópodos foram macerados e depois incubados durante 5
minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, adicionou-se 200 µL de clorofórmio às
amostras, agitando-as vigorosamente durante 15 segundos. Em seguida, as amostras foram
incubadas a temperatura ambiente por 10 min. Para a separação das fases, as amostras foram
centrifugadas a 17.760 g/15 min a 4 °C. Transferiu-se cuidadosamente 450 µL da fase
superior (RNA total) para um tubo de 2,0 mL, onde foi agregado 500 µL de álcool
isopropílico. As amostras foram incubadas durante 15 minutos a 30 °C, e centrifugadas a
17.760 g/10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido por inversão, tomando-se os
devidos cuidados para não se perder o pellet. As amostras foram lavadas com 1,0 mL de
etanol 75%, mescladas no vortex e centrifugadas a 8.600 rpm/5 min a 4 °C. O etanol foi
descartado cuidadosamente e os tubos invertidos sobre um papel toalha para secagem sob
temperatura ambiente durante 10 minutos. O RNA total foi dissolvido em 50 µL de água
tratada com dietil-pirocarbonato (DEPC). A certificação da integridade do material extraído
foi checada por eletroforese em gel de agarose obedecendo às mesmas condições descritas
para a análise do DNA total extraído. Para a quantificação espectrofotométrica do RNA
extraído utilizou-se a absorbância na faixa de 260 nm para análise de RNA. A relação entre as
medidas de absorbância (260A/280A) também foi utilizada para a verificação do grau de
pureza do RNA total obtido.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
41
4.2.3. Síntese de cDNA
Para a obtenção dos cDNAs utilizados no diagnóstico molecular de vírus de RNA ou
na produção dos perfis genéticos, um volume equivalente a 2,5 µg de RNA total foi
empregado no processo de transcrição reversa através da utilização do kit SuperScriptTM First-
Strand Synthesis Systems for RT-PCR (INVITROGEN®) conforme recomendações do
fabricante. Em microtubos de 0,2 mL foram adicionados 2,5 µg do RNA total extraído; 10
mM de dNTP’s; 150 ng de primers randômicos hexâmeros ou 0,5 µg de primers Oligo(dT)12-
18; e água tratada com DEPC em quantidades suficientes para completar o volume final de 10
µL. As amostras foram incubadas a 65 °C/5 min e posteriormente resfriadas em gelo por 1
min. Em seguida, 9,0 µL de uma mistura contendo 2,0 µL de tampão RT (10X); 4,0 µL de
MgCl2 (25 mM); 2,0 µL de DTT (ditiotreitol) (0,1 M) e 1,0 µL de RNaseOUTTMRecombinant
RNase Inhibitor foi adicionada a cada amostra, que foram em seguida vortexadas, brevemente
centrifugadas e incubadas a 42 °C/2 min. Para a efetivação da reação de transcrição reversa,
1,0 µL da enzima SuperScriptTM II RT (50 unidades) foi adicionado em cada tubo,
misturando-se bem, e seguindo o processo com uma incubação a 42 °C/50 min. A reação de
transcrição foi terminada com a incubação das amostras a 70 °C/15 min. Após uma breve
centrifugação, adicionou-se ainda às amostras, 1µL de RNase H, terminando o processo com
uma incubação a 37 °C/20 min. As amostras foram armazenadas em congelador a -20 °C até o
processamento.
O cDNA obtido foi quantificado por espectrofotometria utilizando a absorbância na
faixa de 260 nm para DNA de dupla fita. A eficiência da síntese foi certificada através da
amplificação do gene da ß-actina por RT-PCR a partir dos primers ß-AC Forward (5’-
ACHAACTGGGAYGAYATGG-3’) e ß-AC Reverse (5’-TAGATGGGBACDGTGTGGG-
3’) (SANDRINI et al., 2006).
4.3. Investigação da Ocorrência de Enfermidades
Os camarões amostrados foram submetidos a procedimentos de diagnósticos
histopatológicos e/ou moleculares para a investigação da ocorrência de enfermidades
infecciosas. Nestes animais, foram investigadas evidências das principais enfermidades
detectadas nos sistemas de cultivo de camarões no Brasil como a IMN (Mionecrose
Infecciosa), IHHN (Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética), WSS (Síndrome da
Mancha Branca), NHP (Hepatopancreatite necrosante) e Vibrioses, bem como de doenças de
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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ocorrência já detectada no país, por exemplo, a TS (Síndrome da Taura), a MB (Doença do
Monodon Baculovírus) e a HPV (Hepatopancreatite Parvovírus).
4.3.1. Procedimentos para o Diagnóstico Histopatológico
Após 24 horas de imersão na solução de Davidson (AFA’s), os camarões foram
lavados em água corrente e seccionados nas regiões do cefalotórax e abdômen através de
cortes transversais e longitudinais. Os fragmentos foram transferidos para histocassetes e
submersos em álcool 70%, dando início ao seu processamento histológico, segundo a técnica
de histologia clássica de desidratação em série crescente de álcool, diafanização em xilol,
impregnação em parafina a 60 °C e emblocamento (BELL & LIGHTNER, 1988a). Cortes
histológicos de 4µm foram obtidos em micrótomo manual e os tecidos corados através do
método de Hematoxilina & Eosina (JUNQUEIRA & JUNQUEIRA, 1983). As lâminas
histológicas foram analisadas em microscópio de luz e microfotodocumentadas por uma
câmera Canon através do software (ZoomBrowser EX®CANON). Alterações citológicas
resultantes da ação de patógenos como IMNV, IHHNV, WSSV, TSV, MBV, HPV, NHP e
Vibrioses, bem como de outros agentes patogênicos, foram investigadas de acordo com
literatura clássica de patologia de crustáceos (LIGHTNER, 1996a; PEREIRA et al., 2008).
4.3.2. Procedimentos para o Diagnóstico molecular
Ferramentas moleculares de diagnóstico baseadas no princípio da Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) foram utilizadas na investigação da ocorrência do IMNV, IHHNV, TSV,
WSSV e MBV nos camarões estudados, e incluíram técnicas como a reação em cadeia da
polimerase (PCR), Transcrição Reversa do RNA total seguida da PCR (RT-PCR), Nested
PCR e RT-PCR em dois passos, que foram empregadas de acordo com modificações de
metodologias descritas para a detecção das enfermidades investigadas (VILA-NOVA et al.,
2008; OIE, 2003; NUNAN et al., 1998; LO et al., 1996; SURACHETPONG et al., 2005)
(Tab. I e II).
As amostras de cDNA utilizadas nas reações de RT-PCR foram as sintetizadas a
partir de primers randômicos hexâmeros. Os controles positivos das reações de detecção do
IMNV e IHHNV foram obtidos a partir de camarões infectados com os respectivos agentes.
Para os vírus da TS, WSS e MB foram utilizados controles positivos adquiridos de kits
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
43
comerciais (DIAGXOTICS® INC.). Como controle negativo utilizou-se água ultrapura em
substituição às amostras investigadas.
Tabela I - Composição e concentrações empregadas nas reações de investigação molecular do IMNV, IHHNV, TSV, WSSV e MBV.
Reagentes da
Reação1
RT-PCR em duas
etapas PCR RT-PCR Nested PCR
IMNV
(1° etapa)
IMNV
(2° etapa) IHHNV MBV TSV
WSSV
(1º passo)
WSSV
(2º passo)
dNTP’s
(100 mM) 200 µM 200 µM 200 µM 200 µM 300 µM 200 µM 200 µM
Primer Foward
(10 mM) 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,3 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM
Primer Reverse
(10 mM) 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,3 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM
MgCl2 (50 mM) 1,5 mM 1,5 mM 2,0 mM 1,5 mM 2,0 mM 1,5 mM 1,5 mM
Taq polimerase
(500 U) 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U
Amostra 300 ng 1,0 µL2 100 ng 100 ng 300 ng 100 ng 2,0 µL2
Vol. da reação 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL
1 Cada reação conteve ainda água e tampão (1X) em QSP o volume final da reação. 2 Alíquota do produto do 1° passo da PCR ou RT-PCR.
Tabela II - Primers e condições de termociclagem utilizados na investigação molecular dos vírus IMN, IHHN, TS, WSS e MB.
Técnica Primers (5’- 3’) Condições de
Termociclagem*
Amplicons
(pb)
IMNV
RT-PCR
em duas
etapas
IMNV4586-F
(CGACGCTGCTAACCATACAA);
IMNV4914-R
(ACTCGGCTGTTCGATCAAGT)
94 ºC/2 min;
30 ciclos (94 ºC/20 s,
62º C/20 s, 72º C/30
s); 72º C/30 s
328
IHHNV PCR 389-F (CGGAACACAACCCGACTTTA);
389-R (GGCCAAGACCAAAATACGAA)
95 ºC/5 min;
35 ciclos (95 ºC/30 s,
55º C/30 s, 72º C/1
min); 72º C/7 min
389
TSV RT-PCR TSV9195-F (TCAATGAGAGCTTGGTCC);
TSV9992-R (AAGTAGACAGCCGCGCTT)
94 ºC/2 min;
40 ciclos (94 ºC/45 s,
60 ºC/45 s); 60 ºC/7
min
231
WSSV Nested F1 (ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG); 94 ºC/4 min; 1447
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
44
PCR R1 (TAATGCGGGTGTAATGTTCCTTACG)
e
F2 (GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA);
R2 (TACGGCAGCTGCCTGCACCTTTA)
39 ciclos (94 ºC/1
min, 55º C/1 min, 72
ºC/2 min); 72 ºC/5
min
e
941
MBV PCR 261-F (AATCCTAGGCGATCTTACCA);
261-R (CGTTCGTTGATGAACATCTC)
94 ºC/4 min;
35 ciclos (94 ºC/30 s,
60º C/30 s, 72º C/30
s); 72º C/7 min
261
*As reações foram efetivadas em um termociclador Flexygene®TECHNE
Para a eletroforese, 8,0 µL de cada produto da PCR ou RT-PCR foram
homogeneizado a 1 µL do corante Blue juiceTM (10X) (INVITROGEN®) e aplicado em gel de
agarose 1%, preparado em 150 mL de TAE (1X) e corado com 0,1 µg/mL de brometo de
etídio. A corrida eletroforética foi realizada em uma cuba (FISCHER SCIENTIFIC®) a uma
potência de 0,58 volts/cm2 de corrente contínua durante 60 minutos. A visualização das
bandas no gel foi feita em um transiluminador ultravioleta (SPECTROLINE®) e a
fotodocumentação através do sistema EDAS 290 (KODAK®).
4.4. Prospecção Gênica
4.4.1. Produção de Perfis de Expressão Genética por DDRT-PCR
A metodologia utilizada para a obtenção dos perfis de expressão gênica dos 40
camarões estudados baseou-se em um protocolo modificado da técnica de Differential Display
RT-PCR (DDRT-PCR) (LIANG & PARDEE, 1992). As reações de DD foram efetivadas com
a utilização de 4 primers âncoras (A1...4) em combinação com 12 primers randômicos (R1...12)
(OPERON TECHNOLOGIES®) (Tab. III). Dentre as 48 combinações possíveis entre estes
primers, 12 foram utilizadas de acordo com o formato descrito na figura 7.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
45
Tabela III - Seqüências dos primers utilizados na DDRT-PCR.
Primers Seqüências (5’- 3’)
A1 TTTTTTTTTTTVA
A2 TTTTTTTTTTTVG
A3 TTTTTTTTTTTVC
A4 TTTTTTTTTTTVT
R1 TGATCCCTGG
R2 GGACTGGAGT
R3 TGCTCTGCCC
R4 GTCCACACGG
R5 CTGCTGGGAC
R6 CCTTGACGCA
R7 TCCGCTCTGG
R8 TTTGCCCGGA
R9 CCACAGCAGT
R10 GGACCCTTAC
R11 GGAGGGTGTT
R12 AGGGAACGAG
Cada DDRT-PCR conteve 1X do tampão proprietário (INVITROGEN®); 200 µM de
dNTP’s; 1,5 mM de MgCl2; 1,2 µM do primer âncora; 0,4 µM do primer randômico; 1 U da
enzima Taq Platinum (INVITROGEN®); 100 ng de cDNA sintetizados a partir de primers
Oligo(dT)12-18; e água ultrapura ajustada para o volume final de 10 µL. A reação foi efetivada
em um termociclador Primus 96 Plus (MWG-BIOTECH®) iniciando-se com um ciclo de
desnaturação a 94 ºC/5 min, seguido de 40 ciclos a 94 °C/30 s, 42 °C/2 min e 72 °C/30 s,
Figura 7 - Combinações de primers utilizados na DDRT-PCR.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
46
equivalentes às etapas de desnaturação, anelamento dos primers e extensão do DNA,
respectivamente. A reação foi concluída com uma extensão final do DNA a 72 °C/7 min.
Um volume de 8,0 µL do produto da DDRT-PCR, homogeneizado a 1,0 µL do
corante Blue juiceTM (10X) (INVITROGEN®), foi aplicado em gel de agarose 2% contendo 0,1
µg/mL de brometo de etídio em tampão TAE (1X). A eletroforese foi realizada sob uma
corrente contínua de 0,63 volts/cm2 durante 75 minutos. Os perfis genéticos foram
visualizados em um transiluminador ultravioleta (SPECTROLINE®) e fotodocumentados
através do sistema EDAS 290 (KODAK®).
4.4.2. Análise dos Perfis de Expressão Gênica
Os perfis genéticos produzidos foram analisados através do programa de computador
KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®) (PIZZONIA, 2001), utilizado na detecção
e quantificação da expressão diferencial dos genes amplificados pela DDRT-PCR. Na
quantificação da expressão gênica pelo software empregado, considerou-se a intensidade das
bandas emitidas nos perfis genéticos para o cálculo da massa molecular de cada banda
expressa de acordo com a massa conhecida de cada banda obtida com a utilização do
marcador 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
Padrões de bandas foram identificados em cada perfil produzido e convertidos em
uma matriz de dados binários, atribuindo-se o valor 1 para a presença de bandas e 0 para sua
ausência. Esta matriz foi utilizada para a estimativa de similaridades genética entre os 40
camarões estudados, utilizando-se o coeficiente de Jacard (MAGURRAN, 1988) e o
agrupamento pelo método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean),
através do módulo Neighbor do pacote PHYLIP versão 3.5 (FELSENSTEIN, 1993).
.
4.4.3. Seleção de Genes Candidatos
A escolha dos genes candidatos foi realizada a partir da análise da expressão gênica
em classes de camarões formadas de acordo com a ocorrência das enfermidades detectadas,
considerando-se os perfis de expressão produzidos em animais infectados e livres das
enfermidades investigadas.
4.4.4. Clonagem dos Genes Selecionados
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
47
Os fragmentos referentes aos genes selecionados foram excirsados e recuperados do
gel de agarose segundo protocolo modificado de MCKAY (2006). A clonagem destes
fragmentos foi realizada de acordo com recomendações do fabricante do kit pGEM®-T Easy
Vector Systems (PROMEGA®). A ligação dos fragmentos ao plasmídeo pGEM-T (razão
molar 3:1) procedeu a 4 ºC/18 horas. Os produtos ligados foram eletroporados a 2.500 V
(Eletroporador 2510 - EPPENDORF®) em células eletrocompetentes de E. coli TOP10F’.
Após o choque foi adicionado 1 mL de meio SOC (triptona 2%; extrato de levedura 0,5%;
NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; Glucose 20 mM; pH 7,0) pré-aquecido a 37 ºC ao
eletroporado. Com o auxílio de uma alça de Drigalsky plaqueou-se 100 µL da solução
contendo as células eletroporadas com os produtos de ligação em meio contendo LB Ágar
(ampicilina 100 µg/mL, estreptomicina 30 µg/mL, IPTG 0,5 mM e Xgal 80µg/mL). Após
uma incubação a 37 ºC/16 h observou-se o crescimento de colônias brancas e azuis. Para a
extração dos plasmídeos apenas as colônias brancas foram selecionadas.
A partir da colônia selecionada foi feito, com o auxilio de uma ponteira, um inóculo
em 1,5 mL de meio LB caldo (ampicilina 100 µg/mL; estreptomicina 30 µg/mL). Os inóculos
foram incubados a 37 ºC/16 horas. Os plasmídeos foram extraídos de acordo com o método
da lise alcalina (SAMBROOK et al., 1989). Para esta etapa, as células foram ressuspendidas
em 200 µL de tampão GET (glucose 50 mM; EDTA 10 mM; Tris-HCl 25 mM; pH 8,0).
Adicionou-se 200 µL de uma solução NaOH/SDS (NaOH 4 M; SDS 10%) às amostras,
invertendo os tubos suavemente para a homogeneização da mistura. As amostras foram, em
seguida, incubadas a 4 ºC/5 min. Após este período, foram adicionados 200 µL de acetato de
potássio 3M, invertendo novamente os tubos, que foram posteriormente centrifugados a
13.000 g/25 ºC/20 min. O sobrenadante foi coletado e transferido para novos microtubos de
1,5 mL. Aos volumes transferidos foram adicionados 2/3 de isopropanol 100% e
centrifugados a 13000 g/25 ºC/30 min. Descartou-se o sobrenadante, lavou-se o precipitado
com etanol 70% e centrifugaram-se novamente as amostras a 13.000 g/25 ºC/30 min. O etanol
foi descartado e os tubos invertidos sobre um papel toalha para secagem sob temperatura
ambiente durante 10 minutos. Os plasmídeos foram recuperados em 50 µL de água ultrapura
estéril.
A confirmação da transformação dos clones se deu a partir da amplificação por PCR
de fragmentos de tamanhos correspondentes a cada gene selecionado. Nesta reação foram
utilizados primers específicos para a região M13 presente no plasmídio pGEM-T easy vector
(PROMEGA®, USA): M13 Forward (5’-GTAAAACGACGGCCA-3’) e M13 Reverse (5’-
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’). Em adicional, foram utilizadas as enzimas de
restrição Nde I e Nco I para a digestão de sítios plasmídiais específicos.
4.4.5. Seqüenciamento dos clones transformados
O sequenciamento dos plasmídeos transformados com os genes candidatos foi
realizado no Laboratório de Genética Molecular da Universidade Federal do Ceará (UFC). O
seqüenciamento foi realizado de forma bidirecional, e obedeceu-se especificações do
fabricante do kit DYEnamic ET Dye Terminator (AMERSHAM BIOSCIENCES®) para o
sequenciador MegaBACETM 1000. A reação conteve 4,0 µL do pré-mix proprietário do kit;
1,0 µL do primer M13-F ou M13-R (0,5 µM); e 300-400 ng de DNA plasmidial, completando
o volume final de 10 µL. As amostras foram distribuídas em uma placa de sequenciamento
(Seq. Mix 2) e termocicladas no Primus 96 Plus (MWG-BIOTECH®) em 35 ciclos a 95 ºC/20
s; 54 °C/15 s e 60 °C/90 s. Após este processo, as amostras foram precipitadas pelo método
do isopropanol (SAMBROOK et al., 1989) e ressuspendidas em 10 µL de MegaBACETM
loading solution. As amostras foram homogeneizadas a 10 µL de agarose (0,12%) e
encaminhadas ao seqüenciador automático modelo MegaBACETM 1000 (AMERSHAM
BIOSCIENCES®).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
49
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Investigação da Ocorrência de Enfermidades
5.1.1. Diagnóstico Histopatológico
Alterações citológicas características de infecções provocadas pelos vírus da IMN,
IHHN e WSS, assim como por bactérias determinantes da Hepatopancreatite Necrosante
(NHP) e vibrioses, foram observadas nos exames histopatológicos. Através deste estudo foi
possível também a constatação da ocorrência de gregarinas (Nematopsis sp.) no estômago de
alguns camarões investigados. Contudo, nenhuma evidência histopatológica foi encontrada
para os vírus da TS, MB e HP. A histologia tem sido empregada com bastante êxito tanto na
investigação anatomopatológica de camarões como também na avaliação de seus processos
fisiológicos. Este método tem se tornado uma ferramenta de diagnóstico de rotina
imprescindível para a investigação de infecções causadas por vírus, bactérias e parasitas em
organismos aquáticos (REDDINGTON & LIGHTNER, 1994; GUZMÁN & VALLE, 2000).
5.1.1.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)
A Mionecrose Infecciosa foi detectada nos camarões 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19,
21, 22, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 34 e 39 através da observação de danos na musculatura
estriada do abdômen e cefalotórax. Os 22 camarões identificados como positivos para a IMN
foram agrupados de acordo com classificação descrita por PEREIRA et al. (2008) que se
baseiam no grau de severidade da infecção (Fig. 8, 9 e 10) (Tab. IV). A fase inicial da doença
(Grau 1) foi identificada através da detecção de infiltrações hemocíticas focais na musculatura
dos camarões 28, 29, 30, 31 e 32. Já a fase aguda (Grau 2), foi identificada nos camarões 3, 5,
6, 7, 10, 19, 21, 22, 25, 26 e 34 através da observação de necroses coagulativas e edemas nas
fibras musculares, que ocasionalmente eram substituídas pelo tecido conjuntivo. Nestes
animais ainda foram observadas infiltrações hemocíticas musculares e corpos de inclusão
intranucleares com halo de coloração pálida a basofílico em células do tecido muscular. Nos
camarões 1, 2, 4, 8, 9 e 39 foram observadas necroses musculares de liquefação que
eventualmente vinham acompanhadas de infiltrações hemocíticas e fibrose, características da
fase crônica da doença (Grau 3).
Segundo ANDRADE et al. (2007), a presença de um grande número de hemócitos na
musculatura do camarão, especialmente durante as fases pré-aguda e aguda da IMN, sugere
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
50
que estas células imunológicas poderiam ser as primeiras precursoras no processo de
regeneração das fibras musculares. Esta hipótese corrobora com a pesquisa realizada por
UHRIK et al. (1989), que investigaram o papel dos hemócitos no tecido muscular do lagostim
Astacus fluviatilis.
Tabela IV - Classificação dos camarões identificados como positivos para a IMN de acordo com o grau de severidade da infecção, com base no método descrito por PEREIRA et al.(2008).
Grau de Severidade da Mionecrose Infecciosa
Classificação Grau 1 Grau 2 Grau 3
Camarões 28, 29, 30, 31 e 32. 3, 5, 6, 7, 10, 19, 21, 22,
25, 26 e 34. 1, 2, 4, 8, 9 e 39.
Hipertrofia do órgão linfóide foi observada nos camarões 1, 3, 6, 7, 8, 19, 30, 32 e
34. Entretanto, nenhuma relação direta foi constatada entre este achado e o grau de severidade
da infecção. De acordo com HASSON et al. (1995), a hipertrofia do órgão linfóide em
Figura 8 - Infiltração hemocítica focal no tecido muscular do camarão L. vannamei (Grau 1).
Figura 9 - Necrose muscular de coagulação acompanhada de infiltração hemocítica (Grau 2).
Figura 10 - Necrose muscular de liquefação e fibroses (Grau 3).
50 µm
50 µm 50 µm
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camarões L. vannamei contaminados com o TSV está diretamente associada a rápida
proliferação e sucessiva morfogênese dos chamados esferóides do órgão linfóide (Lymphoid
Organ Spheroids - LOS), que aparentemente é resultante de uma resposta não específica do
sistema imune do camarão contra uma variedade de agentes patogênicos. No presente estudo,
a ocorrência dos LOS nos animais acometidos pela IMN se limitou aos camarões que
apresentavam o órgão linfóide hipertrofiado, porém estudos posteriores devem ser
implementados para a confirmação desta relação em camarões infectados pelo IMNV. A
figura 11 mostra a presença destes esferóides em um camarão acometidos com a IMN.
Além das enfermidades provocadas pelo TSV e IMNV, a presença de esferóides no
órgão linfóide está também associada a outras seis doenças de etiologia viral que acometem
peneídeos: (1) vírus da vacuolização do órgão linfóide (lymphoid organ vacuolization vírus,
LOW) (BONAMI et al., 1992); (2) parvo-like vírus linfoidal (lymphoidal parvo-like virus,
LPV) (OWENS et al., 1991); (3) vírus do órgão linfóide (lymphoid organ vírus, LOV)
(SPANN et al., 1995); (4) rabdovírus de camarões peneídeos (rhabdovirus of penaeid shrimp,
RPS) (NADALA et al., 1992); (5) vírus da cabeça amarela (yellow head virus, YHV)
(FLEGEL et al., 1992); e (6) nodavírus de Penaeus vannamei (Penaeus vannamei nodavirus,
PvNV) (TANG et al., 2007). Curiosamente, todos os vírus relacionados com a presença de
LOS em camarões infectados contêm o RNA como material genético, o que sugere que a
ocorrência deste achado anatomopatológico possa estar atribuída a esta condição.
Em alguns camarões analisados foi constatada a presença de esferóides ectópicos do
órgão linfóide, especialmente nas proximidades da glândula antenal e na musculatura estriada
de camarões com sintomas evidentes da IMN (Fig. 12 e 13). De acordo com LIGHTNER et
Figura 11 - Corte histológico mostrando a presença de esferóides no órgão linfóide de um camarão com a IMN (setas).
50 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
52
al. (2004), estes esferóides ocorrem geralmente em camarões que se encontram em estágios
mais avançados da IMN, sendo comumente detectados no hemocelo e no tecido conjuntivo
frouxo, especialmente no lúmen do coração e próximo a glândula antenal.
Em virtude da ocorrência de esferóides no órgão linfóide ou ectópicos ser
relacionada a uma variedade de infecções virais, a detecção destas alterações fisiológicas em
camarões por histopatologia não pode ser considerada como conclusiva para o diagnóstico de
uma enfermidade específica, sendo, portanto necessário a implementação de métodos
complementares de detecção da doença investigada (HASSON et al., 1999).
5.1.1.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)
A enfermidade causada pelo vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética
(IHHNV) foi detectada nos camarões 1, 11 e 19 através da observação de corpos de inclusão
intranucleares do tipo Cowdry A (CAI’s), identificados especialmente nas células das
brânquias e/ou estômago dos animais investigados (Fig. 14 e 15). Segundo LIGHTNER
(1996a), o diagnóstico por histopatologia da IHHN pode ser realizado através da detecção de
corpos de inclusão intranucleares do tipo Cowdry A, bastante proeminentes e com cromatina
marginal. Quando o processamento histológico aplicado inclui a fixação do camarão com
solução de Davidson e coloração de seus tecidos por H&E, estes corpos de inclusão
apresentam uma coloração eosinofílica e podem ser encontrados tanto em tecidos de origem
ectodérmica quanto mesodérmica.
Figura 12 - Fotomicrografia de um camarão acometido com a IMN mostrando a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide no tecido muscular (setas).
Figura 13 - Glândula antenal de um camarão acometido com a IMN. A seta indica a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide.
50 µm50 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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Contudo, poucos CAI’s característicos da IHHN foram observados nos camarões
diagnosticados na atual pesquisa, o que pode sugerir, segundo sistema de gradeamento
proposto por LIGHTNER (1996a), a inclusão destes camarões na classificação Grau 1 de
infecção, que considera a quantidade de corpos de inclusão detectados por campo analisado
em microscópio de luz. Apesar do IHHNV não causar letalidade a espécie L. vannamei, que
demonstra certa resistência ao vírus, a infecção provocada por este agente pode causar a
síndrome do nanismo deformativo (RSD) (CHAYABURAKUL et al., 2005).
Segundo (ALVAREZ-BORREGO & CHÁVEZ-SÁNCHEZ, 2001), a identificação
por histopatologia de corpos de inclusão característicos da IHHN pode ser dificultada pela
multiplicidade de órgãos passiveis de infecção. Os autores ressaltam ainda que variações no
tamanho e na coloração dos CAI’s em decorrência do ciclo viral e de peculiaridades do órgão
afetado podem também ser consideradas como fatores críticos de sua identificação. No
entanto, métodos alternativos podem ser utilizados na identificação de corpos de inclusão do
IHHNV. Estes métodos incluem a análise de imagens digitais de tecidos e órgão processados
por histologia (digital color correlation) ou a detecção in situ de seqüências genéticas
específicas (Hibridização in situ) (ALVAREZ-BORREGO & CHÁVEZ-SÁNCHEZ, 2001;
HSIEH et al., 2006a).
5.1.1.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)
Corpos de inclusão do tipo Cowdry A típicos da síndrome da mancha branca (WSS)
foram identificados nos camarões 6, 8, 18, 21, 27, 30, 34 e 35, nos quais foram detectados
predominantemente em células do estômago, exceto para a amostra 35, onde foram
observados também nas brânquias. Segundo RODRÍGUEZ et al. (2003), a histopatologia de
Figura 14 - Corpo de inclusão do tipo Cowdry A nas brânquias do camarão L. vannamei (seta).
Figura 15 - Corpos de inclusão do tipo Cowdry A no estômago do camarão L. vannamei (setas).
20 µm 20 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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camarões infectados com o WSSV revela a presença de corpos de inclusão intranucleares do
tipo Cowdry A, comumente encontrados em células do epitélio cuticular e do tecido
conjuntivo, e menos freqüentemente, nas células do epitélio da glândula antenal, membrana
do órgão linfóide, tecido hematopoiético e do coração.
Os CAI’s detectados nos camarões 18, 21, 27, 30 e 34 se mostraram semelhantes aos
encontrados para a enfermidade causada pelo IHHNV (Fig. 16), enquanto que nos camarões
6, 8 e 35, estes se apresentaram bem desenvolvidos e sem cromatina marginalizada (Fig. 17).
Segundo LIGHTNER (1996a), durante a fase inicial do desenvolvimento da WSS, os CAI’s
são eosinofílicos e com cromatina marginalizada, podendo muitas vezes ser confundidos com
os CAI’s característicos da IHHN. Por outro lado, em estágios mais avançados, os CAI’s são
maiores, mais desenvolvidos, e não possuem halo marginal, sendo, portanto, mais facilmente
relacionados ao WSSV. Os CAI’s detectados nesta pesquisa tiveram sua etiologia
comprovada a partir da detecção por PCR convencional e Nested PCR de fragmentos
genéticos específicos dos vírus da IHHN ou WSS, respectivamente (ver 5.1.2).
Os camarões acometidos com a WSS foram agrupados de acordo com sistema de
gradeamento sugerido por LIGHTNER (1996a) para a estimativa do grau de severidade da
infecção pelo WSSV (Tab. V), análogo ao proposto para a IHHN.
Tabela V - Classificação dos camarões identificados como positivos para a WSS de acordo com o grau de severidade da infecção, segundo sistema de gradeamento proposto por LIGHTNER (1996a).
Grau de Severidade da Síndrome da Mancha Branca
Classificação Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4
Camarões 18, 21, 27, 30 e 34 6, 8 e 35 - -
Figura 16 - Microfotografia mostrando corpo de inclusão do tipo Cowdry A no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (seta).
Figura 17 - Microfotografia mostrando corpos de inclusão do tipo Cowdry A no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (setas).
20 µm20 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
55
5.1.1.4. Hepatopancreatite Necrosante (NHP)
A análise histopatológica do hepatopâncreas dos camarões 5 e 8 indicou alterações
citológicas características da ação da bactéria da Hepatopancreatite Necrosante (NHP), que
incluiu a observação de deformação e ausência de células epiteliais nos túbulos do
hepatopâncreas dos referidos animais (Fig. 18 e 19).
A NHP em camarões pode ser detectada em exames histopatológicos pela
observação de atrofia do hepatopâncreas e lesões granulomatosas multifocais envolvendo um
ou mais túbulos do órgão, decorrentes da multiplicação bacteriana no citoplasma das células
epiteliais tubulares (LIGHTNER, 1996a). Estas lesões podem ser representadas por necroses,
melanizações e pela deformação dos túbulos do hepatopâncreas, resultante do desprendimento
das células B e R. A infecção por NHP pode, eventualmente, vir acompanhadas de infiltrações
hemocíticas (JIMENEZ et al., 1997).
5.1.1.5. Vibrioses
Características sugestivas de vibrioses como necroses focais nas brânquias e/ou
infiltrações hemocíticas no hepatopâncreas foram observadas nos camarões 1, 2, 4, 8, 24 e 34
(Fig. 20 e 21). Contudo, apenas infecções brandas foram detectadas para a referida
enfermidade. Segundo QUINTANA et al. (2004), a histopatologia que se utiliza do método
de coloração por H&E em tecidos de camarões com vibrioses, pode revelar a presença de
Figura 19 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando uma proeminente deformação tubular e ausência de células B e R.
Figura 18 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão demonstrando deformação moderada dos túbulos.
200 µm 200 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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infiltrações hemocíticas, necroses focais e formação de nódulos no órgão linfóide, coração,
brânquias, hepatopâncreas, epitélio cuticular ou tecido conjuntivo.
LOTZ & DAVIDSON (2001), afirmam que as enfermidades bacterianas são mais
nocivas aos camarões durante os estágios iniciais da vida quando comparados a juvenis e
adultos. Entretanto, nestes últimos estágios, a infecção bacteriana pode ser agravada em
decorrência de fatores condicionantes de estresse como altas densidades de cultivo, má
qualidade da água, erros de manejo ou variações bruscas de temperatura e salinidade, que
contribuem também para o aumento da susceptibilidade do camarão a outros patógenos
presentes no sistema de cultivo.
5.1.1.6. Gregarinas
Gregarinas da espécie Nematopsis sp. foram observadas no trato digestório de 12
animais, camarões 6, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 24, 27, 36 e 39 (Fig. 22). No entanto,
nenhuma alteração citológica foi detectada no estômago ou intestino destes animais. A
infecção provocada por gregarinas pode causar sérios danos ao epitélio intestinal, o que pode
prejudicar sensivelmente a absorção de nutrientes, e conseqüentemente, interferir no
crescimento e sanidade do animal (JIMÉNEZ-SANTISTEVAN, 1991). Segundo
SAAVEDRA-BUCHELI et al. (2008), a ocorrência deste endoparasita em camarões
independe da condição de sanidade do animal, estando, portando, mais relacionada a fatores
do ambiente, especialmente a sazonalidade. Os autores ressaltam que as maiores incidências
Figura 20 - Necrose focal em uma lamela branquial do camarão L. vannamei (seta).
Figura 21 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão L. vannamei mostrando uma infiltração hemocítica entre os túbulos do órgão.
20 µm 20 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
57
de gregarinas em viveiros de cultivo de camarões na Colômbia ocorrem, principalmente,
durante a época seca (estio), em decorrência da baixa variação de salinidade neste período.
Uma expressiva relação foi observada entre a ocorrência de gregarinas e do WSSV
nos camarões em estudo, onde dentre os 12 camarões infectados com gregarinas, 8 estavam
também infectados com o WSSV. Uma relação também significativa entre a ocorrência destes
dois agentes foi referida durante o surto da WSS ocorrido no Estado de Santa Catarina no ano
de 2004 (SEIFFERT, 2005). Estes achados sugerem maiores investigações a cerca do papel
das gregarinas sobre a incidência do WSSV em camarões ou mesmo da possibilidade destes
endoparasitas funcionarem como vetores potenciais da doença.
Dada a dificuldade de se identificar certas alterações citológicas inerentes à ação de
alguns patógenos em camarões por exames histopatológicos, métodos adicionais devem ser
utilizados na obtenção de um diagnóstico conclusivo (PANTOJA & LIGHTNER, 2008).
Segundo FLEGEL et al. (2004), presença de camarões assintomáticos para determinadas
enfermidades também sugere a utilização de métodos de diagnósticos alternativos a
histopatologia de camarões, como os que utilizam princípios moleculares de detecção.
5.1.2. Diagnóstico Molecular
Dentre as enfermidades investigadas por métodos moleculares foram detectados
fragmentos genéticos correspondentes aos vírus da IMN, IHHN e WSS. Porém, nenhuma
positividade foi constatada para os vírus da TS e do MB também investigados. Atualmente,
metodologias que se utilizam de sondas genéticas estão cada vez mais difundidas, não
Figura 22 - Gregarinas Nematopsis sp. em diferentes estágios de seu ciclo de vida (trofozoítos e gametocistos) no estômago do camarão L. vannamei.
200 µm
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
58
somente no diagnóstico de enfermidades, mas também em pesquisas relacionadas a
mecanismos de infecção, patogenicidade e da defesa imune do hospedeiro (MARQUES et al.,
2006).
5.1.2.1. Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV)
Fragmentos de 328 pb referente ao gene codificante das proteínas do capsídeo e
RNA-binding do IMNV foram detectados através de sua amplificação por RT-PCR em duas
etapas nos camarões 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 19, 21, 25, 26, 30 e 34 (Fig. 23 e 24). A
metodologia da RT-PCR tem sido amplamente desenvolvida para o diagnóstico do IMNV,
tendo demonstrado maior sensibilidade de detecção quando comparada a utilização de kits
comerciais de diagnóstico (PINHEIRO et al., 2007; SENAPIN et al., 2007).
Figura 23 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da RT-PCR de detecção do IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
Figura 24 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da RT-PCR de detecção do IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
59
5.1.2.2. Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV)
O IHHNV foi detectado nos camarões 1, 11, 15, 16 e 19 a partir da amplificação por
PCR convencional de um fragmento de 389 pb referente ao gene da proteína não-estrutural 1
(NS1) do vírus investigado (Fig. 25). TANG & LIGHTNER (2002b) estudando a
variabilidade do IHHNV nas Américas, encontraram uma taxa de substituição de nucleotídeos
de apenas 0,6% na região referente ao gene da proteína NS1, o que evidencia o alto nível de
conservação da região estudada.
FEIJÓ et al. (2008) investigando a variabilidade genética do IHHNV em camarões
da espécie Farfantepenaeus subtilis, certificaram que o vírus presente nos sistemas de cultivo
do Nordeste brasileiro apresenta elevado índice de similaridade com as cepas isoladas no
Havaí, mostrando uma grande consistência em termos geográficos com similaridades
diminuindo claramente a partir das Américas em direção ao Oceano Índico. Com estes
resultados, os autores comprovaram que não há uma variação significante do IHHNV
encontrado em fazendas do Nordeste brasileiro ao ponto de comprometer a detecção da
enfermidade por métodos moleculares que se utilizam de sondas específicas para o vírus
encontrado no Havaí. Contudo, é necessário que haja um monitoramento periódico a fim de
Figura 25 - Gel de agarose 1% referente à PCR de detecção do IHHNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 389 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
60
verificar possíveis variações genéticas do IHHNV e de outros vírus presentes nos cultivos
brasileiros.
5.1.2.3. Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV)
Na detecção molecular do vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) por Nested
PCR foram amplificados fragmentos referentes ao gene WSBV Sal1 1461 bp em amostras dos
camarões 6, 8, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 34, 35 e 36 (Fig. 26 e 27). A
técnica de Nested PCR permite a detecção de vírus de DNA em duas etapas de amplificações
de fragmentos genéticos específicos, sendo considerada até dez vezes mais sensível do que o
método de detecção que se utiliza apenas de uma etapa de amplificação (PCR convencional)
(AYUB et al., 2008). Estas duas ferramentas de diagnóstico foram recentemente validadas
para a detecção do WSSV em cultivos de camarões na Tailândia, onde demonstraram índices
de 100% de especificidade e 97,3% de sensibilidade, quando respeitados os números de
cópias virais detectáveis por ambas as técnicas, ou seja, no mínimo 1000 cópias virais para a
detecção por PCR convencional e de 100 cópias por Nested PCR (SRITUNYALUCKSANA
et al., 2005).
Figura 26 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da Nested PCR de detecção do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 1447 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
Figura 27 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da Nested PCR de detecção do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 941 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
61
Interessantemente, a amplificação de fragmentos genéticos virais nas referidas
amostras só pôde ser visualizada na segunda etapa da Nested PCR. A detecção por Nested
PCR do WSSV em camarões da espécie Penaeus monodon antes e depois do processo de
desova, mostrou, através da detecção do vírus na primeira ou segunda etapa da técnica, que o
estresse gerado por esta condição fisiológica pode funcionar como um gatilho da replicação
viral (HSU et al., 1999). Segundo OTTA et al. (2003), a Nested PCR pode ser utilizada como
um método semi-quantitativo da carga viral em camarões infectados pela diferença de
sensibilidade de detecção entre as duas etapas de amplificação do método. Deste modo, a não
detecção do WSSV na primeira etapa da Nested PCR empregada na atual pesquisa pode
implicar na presença de baixa carga viral nos camarões investigados.
5.1.3. Diagnóstico Conclusivo
A utilização simultânea de métodos de detecção de enfermidades em camarões tem
sido amplamente empregada em seus diagnósticos e envolve a combinação de metodologias
baseadas em princípios moleculares, histopatológicos, químicos e imunológicos (DHAR et
al., 2001; HOSSAIN et al., 2004; KASORNCHANDRA et al., 1998; PHALITAKUL et al.,
2006). A sensibilidade e especificidade dos métodos de diagnósticos utilizados na
investigação de enfermidades em camarões são requisitos de fundamental importância,
particularmente na detecção de enfermidades virais (QUÉRÉ et al., 2002).
Através dos métodos histopatológicos e/ou moleculares empregados no diagnóstico
dos 40 camarões investigados, identificaram-se evidências da ocorrência do IMNV (55%),
WSSV (42,5%), gregarinas (30%), vibrioses (15%), IHHNV (12,5%) e NHP (5%). Por outro
lado, nenhuma evidência foi encontrada para os vírus da TS, MB e HP. As evidências
detectadas corresponderam a amplificação de fragmentos genéticos específicos do agente
patogênico, alterações citológicas característica da ação de determinados patógenos ou da
observação do agente etiológico da doença através da histopatologia. A presença de pelo
menos uma destas evidências foi considerada como determinante para o diagnóstico de
enfermidades no presente estudo.
Dentre os 40 camarões investigados, 34 foram diagnosticados como portadores de
pelo menos uma enfermidade, sendo também verificada a presença de duas, três e até quatro
enfermidades em um mesmo camarão. A ausência de evidências de enfermidades nos
camarões 12, 23, 33, 37, 38 e 40 nos permitiu classificá-los como saudáveis ou livres das
enfermidades investigadas. A ocorrência de dupla infecção viral foi detectada nos camarões 1,
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
62
6, 8, 15, 16, 19, 21, 25, 28, 30, 31 e 34, sendo na maioria dos casos observadas a presença
simultânea do IMNV e WSSV (66,66%) (Tab. VI). A ocorrência de múltiplas infecções em
camarões já foi anteriormente observada através de alterações citopatológicas inerentes a
quatro enfermidades provocadas pelos vírus WSS, IHHN, YH e MB em um único animal,
porém não houve confirmação do diagnostico por ferramentas moleculares (MADHAVI et
al., 2002). Embora a presença de vários agentes patológicos de etiologia viral em um mesmo
hospedeiro seja pouco relatada para crustáceos, a identificação histopatológica e/ou molecular
de duplas infecções virais é bastante comum em camarões cultivados (MOHAN et al., 1998;
NATIVIDAD et al., 2006; OTTA et al., 2003; QUÉRÉ et al., 2002). Tabela VI - Diagnóstico conclusivo por técnicas histopatológicas e moleculares de detecção da ocorrência de enfermidades nos camarões destinados ao estudo de prospecção gênica.
Enfermidades /
Amostras IMNV WSSV IHHNV TSV MBV HPV NHP Vibrioses Gregarina
1 +a/+b - +a/+b - - - - +b - 2 +b - - - - - - +b - 3 +a/+b - - - - - - - - 4 +a/+b - - - - - - +b - 5 +a/+b - - - - - +b - - 6 +b +a/+b - - - - - - +c
7 +a/+b - - - - - - - - 8 +a/+b +a/+b - - - - +b +b - 9 +a/+b - - - - - - - -
10 +a/+b - - - - - - - - 11 - - +a/+b - - - - - +c 12 - - - - - - - - - 13 - +a - - - - - - +c 14 - - - - - - - - +c 15 - +a +a - - - - - +c 16 - +a +a - - - - - - 17 - +a - - - - - - +c 18 - +a/+b - - - - - - +c 19 +a/+b - +a/+b - - - - - - 20 - - - - - - - - +c 21 +a/+b +a/+b - - - - - - - 22 +b - - - - - - - - 23 - - - - - - - - - 24 - +a - - - - - +b +c 25 +a/+b +a - - - - - - - 26 +a/+b - - - - - - - - 27 - +a/+b - - - - - - +c 28 +b +a - - - - - - - 29 +b - - - - - - - - 30 +a/+b +a/+b - - - - - - - 31 +b +a - - - - - - - 32 +b - - - - - - - - 33 - - - - - - - - - 34 +a/+b +a/+b - - - - - +b - 35 - +a/+b - - - - - - - 36 - +a - - - - - - +c
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
63
37 - - - - - - - - - 38 - - - - - - - - - 39 +b - - - - - - - +c 40 - - - - - - - - -
Percentual de Infectados 55% 42,5% 12,5% 0% 0% 0% 5% 15% 30%
+a - Detecção de fragmentos genéticos específicos do agente patogênico.
+b - Detecção de alterações citológicas característica da ação do patógeno.
+c - Identificação do agente etiológico por histopatologia.
Um quadro clínico assintomático para as enfermidades da IHHN e da WSS foi
observado para os camarões 15 e 16 (IHHN); e 13, 15, 16, 17, 24, 25, 28, 31 e 36 (WSS). A
presença de camarões assintomáticos para algumas enfermidades em sistemas de cultivo do L.
vannamei pode implicar na tolerância ou resistência das populações cultivadas ao agente
determinante da doença (BOADA et al., 2008; FLEGEL, 2001).
A tolerância viral em crustáceos é definida como sendo uma adaptação a novos vírus
através do desenvolvimento de uma espécie de memória específica utilizada na inibição do
mecanismo de apoptose induzida pelo agente patogênico. Esta condição de tolerância
contrasta com a de resistência viral, na qual corresponde a eliminação definitiva do agente
etiológico pelos sobreviventes, que apesar de não se infectarem, esboçam sinais evidentes de
defesa relacionada à resposta imune (FLEGEL et al., 2007). Contudo, a distinção entre
camarões tolerantes e resistentes a infecções virais somente é possível sob condições
experimentais específicas de bioensaios, especialmente devido, dentre outros fatores, à
necessidade da certeza de exposição de todos os animais analisados ao agente patogênico
investigado (FLEGEL, 2001). É importante ressaltar a ocorrência de integrações genômicas
virais em camarões, especialmente por vírus de DNA, em virtude da possibilidade de
diagnósticos falsos positivos para a presença de camarões assintomáticos nos sistemas de
cultivos (TANG & LIGHTNER, 2006). Segundo VAN BLERKOM (2003), o genoma de
quase todos os vírus de DNA é constituído por DNA de fita dupla, semelhante ao genoma das
células que infectam. Essa similaridade em estrutura e replicação propicia a esses vírus de
DNA uma relação molecular muito íntima com o genoma de seus hospedeiros, ao qual são
capazes de se integrar, sendo transmitidos para a próxima geração como se fosse uma
característica mendeliana.
De forma interessante, o exame histopatológico dos camarões 2, 6, 22, 28, 29, 31, 32
e 39 indicou a presença de sintomas anatomopatológicos característicos da enfermidade
provocada pelo IMNV, sem, no entanto, haver a confirmação da presença deste agente por
método molecular de detecção. TANG et al. (2007) investigando camarões L. vannamei
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
64
cultivados em Belize, detectaram sinais clínicos e alterações citológicas características da
IMN. Porém, nenhuma positividade para o IMNV foi detectada através do emprego de
técnicas moleculares como RT-PCR e Hibridização in situ, o que sugeriu que a enfermidade
fosse causada por outro agente patogênico. O seqüenciamento de 928 pb de um inserto
genômico obtido a partir do RNA total de camarões infectados indicou 69% de similaridade
quando comparado a seqüências do MrNv (Macrobrachium rosenbergii nodavirus), revelando
a descoberta de um novo vírus denominado de PvNv (Penaeus vannamei nodavírus). Além da
possibilidade de ocorrência deste novo agente viral nos camarões investigados na atual
pesquisa, outros fatores como a ocorrência de variantes genéticas virais, variação da carga
viral ou a eficiência do sistema de defesa do hospedeiro podem ter influenciado a não
identificação do IMNV em algumas amostras por método molecular.
Recentemente, a detecção do WSSV por PCR no México foi dificultada pela
presença de três variantes genéticas do vírus neste país, o que impossibilitou a amplificação
da região alvo do genoma do WSSV a partir de primers desenvolvidos para a detecção de
apenas uma variante conhecida do vírus. Vários camarões diagnosticados como positivo para
a enfermidade através de exames histopatológicos não tiveram o diagnóstico confirmado por
PCR (GALAVÍZ-SILVA et al., 2004). A ocorrência de variantes genéticas virais em cultivos
de camarões já foi relatada também para os vírus IHHN, MB, HP, TS e YH (CÔTÉ et al.,
2008; DOUBROVSKY et al., 1988; KRABSETSVE et al., 2004; PHROMJAI et al., 2001;
WIJEGOONAWARDANEA et al., 2008). De acordo com LAKE et al. (1999), o processo de
replicação dos vírus de RNA, como no caso dos TSV, YHV e IMNV, é mais propenso a erros,
com elevadas taxas de substituição de nucleotídeos (de 10 a 100 mil vezes maior que as de
vírus de DNA) pelas enzimas virais, que tipicamente não possuem sistema de reparo.
Segundo HSU et al. (1999), existe a possibilidade de variação do número de
partículas virais em diferentes pleópodos provenientes do mesmo espécime de camarão, o que
geralmente implica na obtenção de resultados falsos negativos por métodos que se utilizam de
sondas genéticas. Deste modo, a detecção do IMNV pela técnica de RT-PCR utilizada no
atual estudo poderia ter sido inibida em decorrência da quantidade de partículas virais
presente nos pleópodos dos animais investigados. Todavia, outros autores validam a utilização
de pleópodos de camarões como uma forma não destrutiva de investigação de enfermidades
por ferramentas moleculares, incluindo a PCR (BELL & LIGHTNER, 1990). Um estudo
comparativo entre a sensibilidade das técnicas de Dot Blot e PCR para a detecção do WSSV
em diferentes tipos de tecidos do camarão Penaeus monodon como cutícula, pleópodos,
pereiópodos, urópodos, telson, brânquias e pendúculo ocular, indicou que apesar da eficiência
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
65
da detecção deste vírus por ambas as metodologias em amostras de pleópodos, pereiópodos,
urópodos e pendúculo ocular, os métodos se mostraram mais sensíveis quando da utilização
de tecidos da cutícula, telson e brânquias, respectivamente (SHEKHAR et al., 2006).
A presença de esferóides no órgão linfóide ou ectópicos nos camarões acometidos
pelo IMNV pode ter resultado na diminuição ou eliminação da carga viral nos camarões
investigados. BELL & LIGHTNER (1988a) consideram o órgão linfóide como um
componente integrante do sistema circulatório do camarão, tendo como função básica a
filtragem da hemolinfa do animal. Segundo VAN DE BRAAK et al. (2002b), o órgão linfóide
parece participar dos processos de eliminação e depuração dos agentes patogênicos por meio
de fagocitose, resultando em muitos casos, na formação de corpos esferoidais durante as
infecções. Contudo, ainda não está claro se o processo de fagocitose ocorre no órgão linfóide
ou se os hemócitos contendo os microorganismos já fagocitados migram para este órgão no
intuito de se realizar a depuração.
5.2. Produção e Análise dos Perfis de Expressão Genética
5.2.1. Perfis de Expressão Gênica por DDRT-PCR
A técnica de Differential Display utilizada na produção dos perfis genéticos envolveu
a reação em cadeia da polimerase a partir da transcrição reversa do ácido ribonucléico total,
sendo por isso comumente denominada de DDRT-PCR (Differential Display Reverse
Transcription - polimerase chain reaction). Esta metodologia foi descrita originalmente por
LIANG & PARDEE (1992), com o intuito de prover uma ferramenta efetiva para a detecção e
identificação de espécies de mRNA expressos diferencialmente em distintos processos
celulares de eucariotos.
Na presente pesquisa, dentre as combinações de primers utilizadas na DDRT-PCR,
apenas a combinação A1R1 não obteve êxito na amplificação dos perfis de expressão. No
entanto, para as combinações A1R2, A1R3, A2R4, A2R5, A2R6, A3R7, A3R8, A3R9,
A4R10, A4R11 e A4R12 foram produzidos excelentes perfis genéticos (Fig. 28 e 29). De
acordo com STURTEVANT (2000), a DDRT-PCR pode ser utilizada de forma rápida e
eficiente na identificação de qualquer gene expresso diferencialmente, permitindo a
determinação de perfis de transcrição com base qualitativa ou semi-quantitativa.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
66
A1R2 A1R3A1R1
A2R4 A2R5 A2R6
Figura 28 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações A1R1, A1R2, A1R3, A2R4, A2R5 e A2R6. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
67
5.2.2. Estimativa de Similaridades Genéticas
A estimativa das similaridades genéticas entre os camarões estudados foi
determinada pela expressão ou supressão de 73 genes detectados nos padrões de bandas de
cada perfil de expressão gênica produzido.
O dendograma abaixo, construído pelo método de UPGMA, mostra a distribuição dos
camarões investigados em dois grupos segundo as similaridades genéticas estimadas pelo
cálculo do índice de Jacard (Fig. 30).
A3R7 A3R8 A3R9
A4R10 A4R11
Figura 29 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações A3R7, A3R8, A3R9, A4R10, A4R11 e A4R12. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).
A4R12
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
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5.2.3. Identificação e Quantificação da Expressão Gênica Diferencial
A expressão diferencial de 24 genes foi detectada e quantificada através do programa
de computador KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®) nos perfis de expressão
gênica dos 40 camarões submetidos a DDRT-PCR (Tab. VII). VENKATESH et al. (2005)
investigando o efeito de metabólitos secundários da canola Brassica napus sobre o
transcriptoma do fungo Leptosphaeria maculan validaram método para o estudo semi-
quantitativo da expressão gênica através da análise de imagens digitalizadas referentes à
perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR.
Grupo 1
Grupo 2
Figura 30 - Dendograma das similaridades genéticas dos 40 camarões L.vannamei investigados, definido pelo método de agrupamento UPGMA, baseado no cálculo do índice de Jacard a partir dos perfis de expressão gênica produzido pela DDRT-PCR.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
69
Tabela VII - Detecção e quantificação da expressão diferencial de genes nos perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR através do programa KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®).
- * Expressão identificada, porém não quantificada em virtude da sensibilidade do software empregado.
- Unidade: ng
5.3. Prospecção de Genes Relacionados às Enfermidades Detectadas
5.3.1. Seleção de Genes Candidatos
O status sanitário dos camarões diagnosticados na presente pesquisa permitiu o
agrupamento de classes diferenciais destinadas a prospecção gênica relacionada ao
acometimento de doenças provocadas pelo IMNV, WSSV, IHHNV, Víbrios e Gregarinas
(Tab. VIII). Para o estudo de prospecção gênica foram consideradas como representativas
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
70
apenas as classes diferenciais que continham no mínimo 10% do total dos camarões
investigados.
Vários genes codificadores de proteínas como peptídeos antimicrobianos,
profenoloxidase (proPO), lectinas do tipo-C e like-interferon têm sido identificados e
associados as respostas imunes antivirais ou antibacterianas de camarões peneídeos (DE
LORGERIL et al., 2008; HE et al., 2005; LUO et al., 2003; LUO et al., 2006;
SRITUNYALUCKSANA et al., 1999; ZHANG et al., 2004). A investigação da expressão de
genes codificadores de enzimas relacionadas à atividade imune de camarões tem sido
direcionada principalmente para prospecção gênica em células de hemócitos ou tecidos
passiveis de serem infiltrados por estas células como brânquias, coração, hepatopâncreas,
tecido hematopoiético e muscular (HSIEH et al., 2006; WANG et al., 2006).
WANG et al. (2008a), demonstrou existir alguma especificidade no padrão de
expressão gênica produzido por camarões Fenneropenaeus chinensis infectados com o WSSV
ou Víbrios. No entanto, a ocorrência de duplas ou múltiplas infecções em camarões parece ter
influência significativa sobre a expressão de alguns genes expressos diferencialmente.
Recentemente, YEH et al. (2008) identificaram um decréscimo na expressão dos genes da
LGBP, proPO e PE em hemócitos de camarões L. vannamei co-infectados com os vírus da
IHHN e WSS quando comparados com camarões infectados apenas com o WSSV. Estudos
anteriores já evidenciavam esta interação viral ao demonstrar a influência do IHHNV na
redução da patogenicidade do WSSV em camarões peneídeos pré-infectados com o WSSV
(BONNICHON et al., 2006; TANG et al., 2003).
Tabela VIII - Agrupamentos dos camarões em classes diferenciais de acordo com a ocorrência de enfermidades.
AGRUPAMENTO I
Classes diferenciais (1) Camarões
Infectados com o IMNV
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19, 21,
22, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 34 e
39
Infectados com o IMNV (Grau 1) 28, 29, 30, 31 e 32
Infectados com o IMNV (Grau 2) 3, 5, 6, 7, 10, 19, 21, 22, 25, 26 e
34
Infectados com o IMNV (Grau 3) 1, 2, 4, 8, 9 e 39
Infectados somente com o IMNV 3, 7, 9, 10, 22, 26, 29 e 32
Livres do IMNV 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20,
23, 24, 27, 33, 35, 36, 37, 38 e 40
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
71
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO II
Classes diferenciais (2) Camarões
Infectados com o IMNV+WSSV 6, 8, 21, 25, 28, 30, 31 e 34
Infectados somente com o IMNV+WSSV 21, 25, 28, 30 e 31
Livres do IMNV+WSSV
1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24,
26, 27, 29, 32, 33, 35, 36, 37, 38,
39 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO III
Classes diferenciais (3) Camarões
Infectados com o IMNV+Vibrios 1, 2, 4, 8 e 34
Livres do IMNV+Vibrios
3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
35, 36, 37, 38, 39 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO IV
Classes diferenciais (4) Camarões
Infectados com Vibrios 1, 2, 4, 8, 24 e 34
Livres de Víbrios
3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35,
36, 37, 38, 39 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO V
Classes diferenciais (5) Camarões
Infectados com o WSSV 6, 8, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25,
27, 28, 30, 31, 34, 35 e 36
Livres do WSSV
1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 19,
20, 22, 23, 26, 29, 32, 33, 37, 38,
39 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO VI
Classes diferenciais (6) Camarões
Infectados com o WSSV+Gregarinas 6, 13, 15, 17, 18, 24, 27 e 36
Livres de WSSV+Gregarinas 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14,
16, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 28,
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
72
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 38,
39 e 40
Infectados somente com o WSSV+Gregarinas 13, 17, 18 e 36
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO VII
Classes diferenciais (7) Camarões
Infectados com Gregarinas 6, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 24, 27,
36 e 39
Livres de Gregarinas
1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 19,
21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 37, 38 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO VIII
Classes diferenciais (8) Camarões
Infectados com o IHHNV 1, 11, 15, 16 e 19
Livres de IHHNV
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14,
17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,
36, 37, 38, 39 e 40
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
AGRUPAMENTO IX
Classes diferenciais (9) Camarões
Infectados com 1 agente etiológico 3, 7, 9, 10, 14, 20, 22, 26, 29, 32 e
35
Infectados com 2 agente etiológico 2, 4, 5, 11, 13, 16, 17, 18, 19, 21,
25, 27, 28, 30, 31, 36 e 39
Infectados com 3 agente etiológico 1, 6, 15, 24 e 34
Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40
A análise de similaridade genética (ver figura 29) entre os camarões estudados indica
não haver proximidade entre os animais agrupados com base na ocorrência de enfermidades,
o que pode sugerir baixa especificidade da expressão gênica relacionada ao status de sanidade
de cada camarão em estudo. Esta suposição pôde ser confirmada pela identificação e
quantificação da expressão gênica diferencial nos perfis genéticos dos referidos animais. A
quantificação dos níveis de expressão dos genes prospectados no presente estudo não indicou
nenhuma relação com a ocorrência das enfermidades detectadas. Porém, alguns fatores
associados às condições de cultivo dos camarões como o acesso ao alimento ofertado, ciclo de
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
73
muda, variação genética intraespecífica, variações ambientais, bem como as interações entre
patógenos, podem estar contribuindo na regulação dos genes prospectados.
Contudo, dentre os 24 genes de expressão diferencial detectada na presente pesquisa,
os genes 882-A1R2, 376-A2R6, 842-A2R6, 644-A3R8, 730-A4R10, 930-A4R11 e 500-
A4R12 foram selecionados como candidatos, clonados e seqüenciados, por indicarem
tendências na expressão ou supressão relacionada à ocorrência das enfermidades provocadas
pelo IMNV (842-A2R6 e 644-A3R8); WSSV+IMNV (842-A2R6, 644-A3R8 e 930-A4R11);
WSSV+Gregarinas (730-A4R10 e 930-A4R11); Gregarinas (376-A2R6) e IHHNV (500-
A4R12); bem como por estarem relacionados a quantidade de agentes etiológicos detectados
nos camarões investigados (882-A1R2 e 376-A2R6) (Tab. IX). A análise da expressão
diferencial destes genes indicou potencial relação com a resistência, infecção ou
patogenicidade inerente às enfermidades relacionadas.
Tabela IX - Percentual de camarões de cada classe diferencial com expressão detectada para os genes selecionados.
STATUS DE SANIDADE
PERCENTUAL DE CAMARÕES COM EXPRESSÃO
PARA OS GENES SELECIONADOS
Gen
e 88
2-A
1R2
Gen
e 37
6-A
2R6
Gen
e 84
2- A
2R6
Gen
e 64
4- A
3R8
Gen
e 73
0- A
4R10
Gen
e 93
0- A
4R11
Gen
e 50
0- A
4R12
Cla
sses
di
fere
ncia
is (1
)
Infectados com o IMNV 0,42 0,05 0,52 0,48 0,19 0,23 0,14
Infectados com o IMNV (Grau 1)
0,40 0 1,0 1,0 0,20 0,20 0,20
Infectados com o IMNV (Grau 2)
0,55 0,09 0,36 0,73 0,09 0,09 0,09
Infectados com o IMNV (Grau 3)
0,50 0 0,33 0,17 0,50 0,50 0,17
Infectados somente com o IMNV
0,48 0 0,51 0,25 0,12 0,38 0,38
Livres do IMNV 0,44 0,05 0,44 0,33 0,33 0,05 0,05
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (2
)
Infectados com o IMNV+ WSSV
0,75 0,13 0,63 0,75 0,12 0 0
Infectados somente com o IMNV+WSSV
0,60 0 0,80 1,00 0,40 0 0,20
Livres do IMNV+WSSV 0,40 0,03 0,43 0,28 0,33 0,19 0,12
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
74
Cla
sses
di
fere
ncia
is (3
) Infectados com o IMNV+Vibrioses
0,60 0 0,40 0,20 0,20 0,40 0
Livres do IMNV+Vibriose 0,46 0,05 0,48 0,62 0,28 0,11 0,11
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (4
) Infectados com Vibrios 0,67 0 0,50 0,33 0,33 0,33 0
Livres de Víbrios 0,44 0,05 0,47 0,61 0,26 0,11 0,11
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (5
) Infectados com o WSSV 0,59 0,12 0,65 0,53 0,17 0 0,05
Livres do WSSV 0,39 0 0,35 0,30 0,35 0,26 0,13
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (6
)
Infectados com WSSV+Gregarinas
0,50 0,25 0,50 0,25 0,25 0 0,13
Infectados somente com WSSV+Gregarinas
0,50 0 0,75 0 0,25 0 0
Livres de WSSV+Gregarinas
0,47 0 0,47 0,41 0,25 0,19 0,09
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (7
) Infectados com Gregarinas 0,58 0,17 0,42 0,25 0,25 0 0,08
Livres de Gregarinas 0,43 0 0,50 0,42 0,29 0,22 0,10
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (8
) Infectados com o IHHNV 0,40 0 0,80 0,60 0,40 0,20 0,20
Livres de IHHNV 0,48 0,05 0,42 0,57 0,28 0,14 0,08
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
Cla
sses
di
fere
ncia
is (9
)
Infectados com 1 agente etiológico
0,22 0 0,44 0,67 0 0,33 0,22
Infectados com 2 agentes etiológicos
0,26 0 0,35 0,26 0,09 0 0,06
Infectados com 3 agentes etiológicos
0,63 0,25 0,25 0,50 0,50 0,13 0,13
Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
75
5.3.1. Caracterização dos Genes Selecionados
Dentre os 7 genes candidatos, sequências de nucleotídeos referentes aos genes 882-
A1R2, 730-A4R10 e 842-A2R6 (Anexo 1) foram obtidas e submetidas a uma avaliação de
qualidade através do programa de computador Phred (índice de confiabilidade ≥ 20) (EWING
et al., 1998). As seqüências produzidas foram agrupadas em consenso (clusters) através do
programa CAP3 (Sequence Assembly Program) (HUANG & MADAN, 1999) e analisadas
quanto a homologia às sequências depositadas no banco de dados do GenBank através das
ferramentas BLASTn e BLASTx (disponíveis em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
(ALTSCHUL et al., 1997). Nenhuma homologia foi encontrada para as seqüências referentes
aos genes 882-A1R2 e 730-A4R10. No entanto, a seqüência 842-A2R6 demonstrou 99% de
similaridade nucleotídica com o gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse (RNAse D)
envolvida no mecanismo de silenciamento pós-transcricional de genes (RNAi) do nematóide
Caenorhabditis elegans (Nº de acesso: NM_066704.5).
O mecanismo de silenciamento pós-transcricional gênico foi inicialmente descoberto
em plantas e posteriormente em uma variedade de organismos eucarióticos estando
intimamente relacionado ao reconhecimento de moléculas de dsRNA específicas.
Naturalmente, estas moléculas podem ser produzidas a partir da RNA polimerase RNA-
dependente, proveniente de patógenos virais, ou então pela hibridização de transcritos
sobrepostos resultantes da transposição gênica (MEISTER & TUSCHL, 2004). Em
invertebrados, o mecanismo de RNAi já foi descrito para o nematóide C. elegans (FIRE et al.,
1998) e para a mosca Drosophila melanogaster (GOTO et al., 2003), sendo recentemente,
identificado nos camarões P. monodon e L. vannamei através de injeções de moléculas de
dsRNA específicas dos vírus da WSS, TS e YH (ROBALINO et al., 2005; YODMUANG et
al., 2006; TIRASOPHON et al., 2005). Segundo ROBALINO et al. (2007), a identificação do
mecanismo de RNAi por indução experimental em camarões peneídeos, anteriormente citada,
não consiste em prova concreta da utilização natural deste tipo de resposta imune antiviral
específica por estes animais.
Contudo, a expressão da seqüência 842-A2R6 em camarões L. vannamei apresentada
no atual estudo somada a detecção da IMN em 55% dos animais investigados, sugere a
indução natural do mecanismo de silenciamento pós-transcricional (RNAi) no camarão L.
vannamei, evidenciando ainda a capacidade de suas células de reconhecer e acumular dsRNA
viral em ambiente de cultivo.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
76
Com base nos resultados obtidos na presente pesquisa, recomenda-se que estudos
futuros sejam implementados no intuito de se confirmar a real potencialidade da utilização
dos marcadores genéticos aqui identificados, em investigações relacionadas à infecção,
resistência ou patogenicidade das enfermidades que acometem o camarão L. vannamei. De
acordo com WANG et al. (2007), a prospecção e caracterização de genes relacionados às
enfermidades de camarões têm sido amplamente empregadas, contribuindo, desta forma, para
um melhor entendimento da imunologia do camarão, ainda de pouco conhecimento científico.
A detecção destes genes têm ainda proporcionado o emprego de biomarcadores genéticos
utilizados na identificação de camarões resistentes ou até mesmo como um método
quantitativo da resposta imune antiviral.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
77
6. CONCLUSÕES
Nos 40 camarões L. vannamei investigados foram detectadas por métodos histopatológicos
e/ou moleculares de diagnóstico a ocorrência da IMN (55%), WSS (42,5%) e IHHN
(12,5%), NHP (5%) e vibrioses (15%). Também foi observada a presença de gregarinas
Nematopsis sp. no estômago de 12 camarões (30%).
Foi verificada a ocorrência de até quatro enfermidades por espécime do L. vannamei, com
predominância para as duplas infecções que foram detectadas em 42,5% dos animais
investigados.
A infecção simultânea por IMNV e WSSV, de ocorrência ainda não descrita, foi
pioneiramente detectada em 20% dos camarões L. vannamei investigados no presente
estudo.
A expressiva relação entre a ocorrência de gregarinas e do WSSV nos camarões em estudo
sugere maiores investigações a cerca do papel das gregarinas sobre a incidência do WSSV
em camarões L. vannamei ou mesmo da possibilidade destes endoparasitas funcionarem
como vetores potenciais da doença.
A técnica de Differential Display RT-PCR apresentou eficiência satisfatória na produção
de perfis genéticos do camarão L. vannamei, mostrando também boa relação custo-
benefício.
Através da DDRT-PCR foi possível selecionar 7 genes de expressão diferencial
relacionados à ocorrência de enfermidades provocadas pelo IMNV (842-A2R6 e 644-
A3R8); WSSV+IMNV (842-A2R6, 644-A3R8 e 930-A4R11); WSSV+Gregarinas (730-
A4R10 e 930-A4R11); Gregarinas (376-A2R6) e IHHNV (500-A4R12); e/ou relacionados
a quantidade de agentes etiológicos detectados nos camarões investigados (882-A1R2 e
376-A2R6).
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
78
Três sequências genéticas inéditas relacionadas à ocorrência de enfermidades do camarão
L. vannamei foram produzidas, sendo duas sequências (882-A1R2 e 730-A4R10) de
homologias indeterminadas e uma (842-A2R6) com 99% de similaridade nucleotídica com
o gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse envolvida no mecanismo de silenciamento
pós-transcricional de genes do nematóide C. elegans.
A expressão da seqüência 842-A2R6 em camarões L. vannamei apresentada no atual
estudo somada a detecção da IMN em 55% dos animais investigados, sugere a indução
natural do mecanismo de silenciamento pós-transcricional (RNAi) no camarão L.
vannamei.
FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...
79
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ANEXO 1 - Sequências de nucleotídeos referentes aos genes 882 (A1R2), 730 (A4R10) e 842
(A2R6) prospectados.
- Gene 882 (A1R2) GGACTGGAGTAACATTCGGGAAGCTAGACTGTCCATTATAACAGGCAATGTACACGTTCTCTTCCT
TCAAAGACATCTCAGAGACCACTTACTGAGACACTGTAACCCGGAGTAATCTAAGCTCACTCCTAA
CAAAAGGCTATATGGAAATGAAACTAGCCACAATGAGAATTGAAGATAAGCGTGACGTTTCGAAC
TCTCCACGAGTTCCTCTTCAGACAAAAACTGAAATGGATACCAGAAGAGAAGTTTATATAGTGATA
GGGAGACAGAATTAACAAGATCTGAATCAGGTCTCAGGCGGTGGGT
- Gene 730 (A4R10) ACGATTGGACCCTTACTATAAAACAAGGCAACGAGATCATCATTTATTCAACATTTAAAAGATTCA
TTGGTTCCAATTGAAAGATGTATGTATGCCACTGAAACACTTCTTTACTTATTTTTATATATTTTAAA
GACGTATCAATACAGAAAAATTTAGTGCTAGCCAACAGAGTAAATTATGATGATTGTGTAAGACGA
GGTGTGTTGAGTGCTATTATTAGAAATCGCTTTTTGCCCAAATATTGGATGTTGTGATGCTTGAAAG
GTGAATTAATATAGTTTTGAATGTGTGTTTTGTATTGAGATAATTCAGACGAGGTCCTGCTCTCCCC
CCATGTGCAAAGAGAAGAAAAGATTGAGAAAATTTGTGGTGAAAACAACACGCCAGGATGCCTTG
TTGTTAGGAACATAAAAATAGTTGCTGATTTATATATTTTTGGCCCATGGATACAGCAATGGAATTA
ATCAAAGGTGACAGTTCCAGTGGTATCAAGTAACAGATTGAGAATATAATAGTTTATGTGAAGTGT
AGCAGAGGAAAATTATGGAGATTTAAAAGAATGATTACCTTACATGCAAGTAAAATAATGGAAAG
ATGCTGGTAGAATGGAGGTAAGGGTCCA
- Gene 842 (A2R6) ATTTCTGTCTGAGCTCCGTCTCCTGTCCCGACTCTTTTAACCAAACTCCAAAATCCTCCAGATACCA
AACCGCCAAACTTTGTCCCGATGTTTTTCCTCTATCCGGCATCTTTTTCATCATATCCACAGCCATTC
CGTAGATGTTGACTCCTGATCTATACTCCTCGTTGAAAAATTCTCGATTTTTGGCTCGAACTTTTCTC
TCCCGCTCAGACTCGGGTCCATTCATAATTGCTTTCAGAACTTCCCGGCGTGACTTCAACGGTTCGG
CGTAGTCTGTTCGATATTTTGCCTTTTTCTCGGCTTTCGTTAGCTTTCTTTTGTACGGTTCTTCTTCCA
TTACCTTACGCTTCTTCTTTGGTT
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