replicação de dna
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REPLICAÇÃO DE DNA
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MAPA DO CROMOSSOMA DE E.coli
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TERMINOLOGIA
Regras básicas para a designação de genes e proteínas:
Genes bacterianos – 3 letras minúsculas em itálico que reflectema sua função aparente
Ex: dna (replicação do DNA), uvr (resistência à lesão porradiação UV), rec (recombinação)
Quando vários genes afectam o mesmo processo, acrescenta-seas letras A, B, C, etc, que reflectem a ordem de descoberta.
Proteínas bacterianas – geralmente a mesma designação do geneque as codifica; 3 letras não-itálicas, a 1ª maiúscula
Ex: DnaA, RecA
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Conceito de Molde
Watson e Crick:
uma cadeia é o
complemento da outra
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REGRAS BÁSICAS PARA
A REPLICAÇÃO DO DNA
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EXPERIÊNCIA DE MESELSON - STAHL
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Questões levantadas:
As cadeias parentais desenrolam-secompletamente antes da replicação?
O início da replicação é aleatório ou não?
Após o início da replicação numdeterminado ponto, a replicação prossegue
numa direcção ou em ambas?
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REPLICAÇÃO DO DNA
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Regiõesricas em
pares A = T
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INÍCIO DA REPLICAÇÃO
A replicação inicia-se nas ORIGENS DE
REPLICAÇÃO, que são sequênciasespecíficas muito ricas em pares A=TE.coli - 1 origem de replicação
Eucariotas - múltiplas origens de replicaçãolocalizadas ao longo do cromossoma
REPLICÃO - unidade de replicaçãoporção de DNA que sofre um processoindividual de replicação
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QUAL O SENTIDO DA REPLICAÇÃO?
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DEFINIÇÃO DAS CADEIAS DE DNA
NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA dá-se na direcção 5’ → 3’e é semi-descontínua
C ÇÃO É S SCO Í
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A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA
CONTÍNUA
DESCONTÍNUA
Fragmentos de Okazaki :
Eucariotas: 100-200 nucleótidosE. coli : 1000-2000 nucleótidos
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POLIMERIZAÇÃO DE NUCLEÓTIDOSFORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiMg2+
Polimerase
Enzima de 3 substratos:
cadeia de DNA que é copiada cadeia neo-sintetizada ou cadeia em crescimento
2’-desoxirribonucleótido-5’-trifosfato incorporado
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ELONGAÇÃO DA CADEIA DE DNA
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PROPRIEDADES DAS DNA POLIMERASES
ACTIVIDADE POLIMERÁSICA 5’ → 3’
NECESSIDADE DE UM MOLDEA cadeia molde complementar é copiada no sentido 3’ → 5’
NECESSIDADE DE UM PRIMER
ACTIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3’ → 5’ E 5’ → 3’
PROCESSIVIDADENúmero de nucleótidos adicionados antes que a enzima se dissocie do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por proteínas associadas.
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FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO
COMPLEMENTARIDADE DE BASESGeometria das bases
Formas tautoméricas das bases
ACTIVIDADE CORRECTORA DAS
DNA POLIMERASESActividade exonucleásica 3’ → 5’
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A GEOMETRIA DAS BASES CONTRIBUIPARA A FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO
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FORMAS TAUTOMÉRICAS DO URACILO
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CORRECÇÃO DE ERROSPELA ACTIVIDADE 3’→5’
EXONUCLEÁSICA DADNA POLIMERASE I
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DNA polimerase I não é a responsável pela
replicação do cromossoma de E.coli :
Velocidade de polimerização demasiado baixa
Processividade baixa
Estudos genéticos demonstraram que a DNApolimerase I não actua sòzinha
Em 1969 John Cairns isolou uma estirpe queproduzia uma DNA polimerase I inactiva
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DNA polimerases IV e V identificadas em 1999Envolvidas numa forma específica de reparação de DNA
FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I
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FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I
ANÁLISE POR DIFRACÇÃO DE RAIOS-X
Fragmento KlenowFrag. pequeno
N C
Tripsina
5’ → 3’exonuclease
3’ → 5’exonuclease Polimerase
MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXO
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MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXODNA POLIMERASE I – DNA
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DNA POLIMERASE III
Enzima responsável pela replicação de DNAem E.coli
In vivo Pol III é uma holo-enzima constituídapor, pelo menos, 10 sub-unidades:
α, ε e θ formam o núcleo da enzima τ liga dois núcleos da polimerase
γ2δδ’χψ associam-se para formar umcomplexo que posiciona o anel (β2)
β dimeriza para formar um anel em torno do
molde de DNA
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A b id d d DNA P li III f
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A sub-unidade β da DNA Polimerase III forma uma
estrutura em anel à volta do DNAe é responsável pela sua elevada
processividade (> 500.000 nucleótidos)
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REPLICAÇÃO EM E.coli
Replissoma - complexo de enzimas e proteínasnecessários para a replicação
Polimerases Helicases Topo-isomerases
Proteínas de ligação ao DNA (DNA binding proteins) Primases Ligases
Ã
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ETAPAS DA REPLICAÇÃO
1. ETAPA DE INICIAÇÃO (controlo da replicação)• Reconhecimento das origens de replicação por umcomplexo proteico• Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pelaDNA helicase• Síntese do primer
2. ETAPA DE ELONGAÇÃO• Síntese contínua na cadeia leading
• Síntese descontínua na cadeia lagging 3. ETAPA DE TERMINAÇÃO
• Reconhecimento de sequências, sobre as quais se
fixam proteínas, bloqueando o movimento deprogressão da forquilha de replicação
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REPLICAÇÃO EM E.coli
INICIAÇÃO
1. Reconhecimento de sequências naorigem da replicação por uma únicaproteína que se fixa sobre estas mesmas
sequências2. Abertura da dupla cadeia de DNA a nívelda região rica em pares A=T, junto ou no
seio da origem de replicação3. Organização do complexo de replicação
na região aberta do DNA
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oriC
ORIGEM DE REPLICAÇÃO EM E.coli ARRANJO DAS SEQUÊNCIAS CONSERVADAS
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REPLICAÇÃO EM E.coli
INICIAÇÃO
COMPLEXO DE INICIAÇÃOORISSOMA
Conjunto de proteínas que intervêm na
etapa de iniciação Algumas proteínas ligam-se ao DNA,
especificamente (DnaA) Outras participam no orissoma através
do reconhecimento de proteínas já
presentes (DnaB)
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MODELO PARAINICIAÇÃO
DA REPLICAÇÃONA ORIGEMDE E.coli , ori C
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CONTROLO DA ETAPA DE INICIAÇÃO
Permitir que a iniciação se faça no momentoadequado do ciclo de divisão
Impedir que o cromossoma se replique maisdo que uma vez por cada ciclo
Mecanismo de sequestraçãoMetilação de OriC, nas sequências GATC, pela DNA-adenina-metiltransferase (Dam-metilase)
Após replicação, o DNA semi-metilado liga-se àmembrana bacteriana, ficando as origens dereplicação inacessíveis
METILAÇÃO DO DNA E
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ÇINICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO
REPLICAÇÃO EM E.coli
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REPLICAÇÃO EM E.coli REGULAÇÃO DA INICIAÇÃO
Ã
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REPLICAÇÃO EM E.coli
ELONGAÇÃO
Síntese contínua da cadeia leading
Síntese descontínua da cadeia lagging emfragmentos de Okazaki
Coordenação da síntese das duas cadeias:- Ambas as cadeias são sintetizadas por
uma única DNA polimerase assimétrica- O looping do DNA da cadeia lagging junta
os dois pontos de polimerização
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SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI
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SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI
SÍNTESE SEMI-DESCONTÍNUA DO DNA
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PROBLEMA PRINCIPAL
SÍNTESE DE DNA NAS CADEIAS LEADING E LAGGING
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CADEIA LAGGING - REMOÇÃO DE RNA PRIMER
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ÇE SUBSTITUIÇÃO POR DNA
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NICK TRANSLATION
ACTIVIDADES5’→3’ EXONUCLEÁSICA
EPOLIMERÁSICADA
DNA POLIMERASE I
MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA
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MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA
REPLICAÇÃO EM E coli
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REPLICAÇÃO EM E.coli
TERMINAÇÃO
REPLICAÇÃO EM E coli
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REPLICAÇÃO EM E.coli
TERMINAÇÃO
Ã
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REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
A replicação é um acontecimento
muito mais raro nos eucariotas doque nos procariotas. A iniciação dareplicação é fortemente regulada
O DNA não se encontra nu na célula,mas sob a forma de cromatina. Esta
encontra-se organizada sob a formade nucleossomas. Nível superior deorganização implica complexidade
maior para a replicação
CONTROLO DA REPLICAÇÃO PELO CICLO CELULAR
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A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes,durante a fase S
A replicação produz uma única cópia de cada molécula.Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo ciclocelular
A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes dapassagem à fase G2
DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS
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DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS
α - 4 sub-unidades: 180 kDa (actividadepolimerásica), 60 kDa + 50kDa (actividade primase) e72 kDa (?). Fracamente processiva, sem actividade
exonucleásica 3’ → 5’
δ - 2 sub-unidades: 125 kDa (actividade polimerásicae exonucleásica 3’ → 5’) e 50 kDa (?). Moderadamente
processiva quando só; elevada processividadequando associada ao PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)
ε - enzima multimérico: 256-258 kDa (actividadepolimerásica e exonucleásica 3’ → 5’); o nº de outrassub-unidades varia em função da espécie; elevadaprocessividade na ausência de PCNA
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DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS γ - Actividade polimerásica e exonucleásica 3’ → 5’.
Responsável pela replicação do DNA mitocondrial,processo autónomo sob o ponto de vista cronológicoe enzimático
β - enzima monomérico (40 kDa); pouco processiva esem actividade exonucleásica 3’ → 5’. Não parece terpapel na replicação mas intervém nos processos de
reparação por excisão de bases erradas
HOMOTRÍMERO DE PCNAESTRUTURA
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ESTRUTURA
Notar a semelhança desta estrutura comcom o dímero β2 da DNA Polimerase III de E.coli
REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
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REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
INICIAÇÃO
A replicação inicia-se em múltiplas origens.
Porquê?O movimento da forquilha de replicação é ~20x mais lentonos eucariotas do que nos procariotas (50 nt/seg). A estavelocidade a replicação de um cromossoma humano detamanho médio levaria 500 horas
As origens de replicação ou sequências dereplicação autónoma (Autonomously Replicating
Sequence ou ARS) foram identificadas eestudadas na levedura. Existem cerca de 400ARS no genoma da levedura
CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ARS
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Identificaram-se 400 ARS no genoma da levedura. Amaioria, mas não a totalidade, constitui origens dereplicação
As origens encontram-se espaçadas a intervalosirregulares ao longo do cromossoma. O intervalomédio é cerca de 40 kb
As ARS são constituídas por sequênciasconservadas: 5’ (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A) 3’
O complexo de reconhecimento da origem (ORC),
constituído por pelo menos 6 polipéptidos, liga-seàquelas sequências conservadas A ligação de ORC induz modificação conformacional
no DNA, necessária para a replicação e transcrição
MECANISMO DE REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
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PCNA
RFC
RPA
Helicase
Primase
RNase HDNA ligase
Pol δ
Pol α
Pol δ = SSB
(remove RNA primers)
• Pol α / primase - síntese deRNA-DNA primers para
iniciação da replicação;baixa processividade
• Pol δ / PCNA - funçõescomplexas na replicação de
ambas as cadeias; elevadaprocessividade
REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR
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Ç
+
5’ 3’
3’ 5’
Síntese da cadeia leading
5’ 3’3’ 5’
RNA
primer
Síntese da cadeia lagging 3’
5’
5’ 3’
Replicação
+
5’ 3’Cadeia filha completa
5’ 3’
Cadeia filha incompleta3’ 5’
Remoção do
RNA primer
REPLICAÇÃO NOS TELÓMEROS
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As extremidades dos cromossomas são estabilizadas pelos telómeros,
requerendo uma transcriptase reversa para a sua replicação
Os telómeros humanos consistem em 1000-1500 cópias de TxGy
OUTRAS PROTEÍNAS
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IMPLICADAS NA REPLICAÇÃO PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE ENZIMÁTICA
Topo-isomerase tipo ITopo-isomerase tipo IIRNase H3 DNA ligases
DNA helicase
PROTEÍNAS COM PAPEL ESTRUTURALPCNA
RFCRPA
PROTEÍNAS MODULADORAS
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