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Qualidade microbiológica e bactérias acidúricas em bebidas não alcoólicasacidúricas em bebidas não alcoólicas
Maristela S. Nascimento
Conteúdo programático
� Microrganismos indicadores
� Salmonella
� Bactérias deteriorantes� Báctérias lácticas� Bactérias acéticas� Grupo Bacillus
� Alicyclobacillus
� Clostrídios butíricos
Legislação
ProdutoDeterminação
Limite (UFC ou NMP/g)
Polpa de fruta “in natura” Bolores e leveduras 5,0x103
Ministério da Agricultura (Inst. Norm. n.1, 07/01/00)
Coliformes fecais 1,0
Salmonella (25g) Ausente
Polpa de fruta conservada quim. ou tratada term.
Bolores e leveduras 2,0x103
Coliformes fecais 1,0
Salmonella (25g) Ausente
Legislação
Produto Determinação Limite
Sucos, refrescos, néctar prontos para consumo
Coliformes 35ºC (em 50ml)Ausente
Sucos concentrados* Coliformes 35ºC (em 50ml) Ausente
Salmonella (25ml)
ANVISA (RDC n.12, 02/01/01) – Grupo 17
Salmonella (25ml) Ausente
Suco desidratado Coliformes 35ºC 10/g
Salmonella (25g) Ausente
Xarope Coliformes 35ºC 10/g
Pó para refresco Coliformes 35ºC 1/g
Suco “in natura” Coliformes 45ºC 100/ml
Salmonella (25ml) Ausente
Suco pasteurizado e refrigerado
Coliformes 45ºC 10/ml
Salmonella (25ml) Ausente
Microrganismos Indicadores
Grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentesem um alimento, podem fornecer informações sobredeterioração, contaminação de origem fecal e provável presençade patógenos, podendo indicar condições sanitárias inadequadasdurante o processamento, armazenamento e distribuição doalimento.
(Franco & Landgraf, 2003)
COLIFORMES TOTAIS
� Família Enterobacteriaceae: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella
� Bacilos gram-negativos, não esporulados� Bacilos gram-negativos, não esporulados
� Fermentam lactose com produção de gás a 35-37ºC/24-48h
� Não indicam necessariamente contaminação fecal ou presença de enteropatógenos
Coliformes Termotolerantes e Escherichia coli
� Hábitat primário: trato intestinal
� Fermentam lactose com produção de gás a 44,5 - 45,5ºC / 24h
� 90% de E. coli e algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella� 90% de E. coli e algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella
� Processamento, armazenamento, higienização ou manipulação inadequados
� Recontaminação pós-processamento
� pH 4 a 9� Tº 7 a 46ºC
Escherichia coli
� EPEC – enteropatogênica clássica, gastroenterite em recém nascidos e lactentes
� EIEC – enteroinvasora, semelhante a shigelose
� ETEC – enterotoxigênica, diarréia dos viajantes
� EHEC – entero-hemorrágica, colite hemorrágica evoluindo para síndrome urêmica hemolítica (HUS), sorotipo O157:H7
Metodologia
� Método de Número Mais Provável (NMP)� Série de 3 tubos
� Presença/Ausência em 50ml� 5 tubos de 10ml
� Lauril Sulfato Triptose (LST) � Lauril Sulfato Triptose (LST) � Simples ou duplo
� 35ºC/24-48h
� Verde Brilhante Bile (VB): 35ºC/24-48h
� EC: 45,5ºC/24h
Confirmação E. coli
� Caldos com fator de fluorescência
� Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB) 35ºC/24h
INDICADORES GERAIS
�Aeróbios mesófilos e psicrotróficos.
�Quando presentes em número elevado nos alimentos �Quando presentes em número elevado nos alimentos podem causar deterioração e/ou redução da vida-de-prateleira
�Fornecem informações gerais sobre as condições durante o processamento e armazenamento do alimento
AERÓBIOS MESÓFILOS
� FAO/OMS: 104 - 105 (máx permitido)
� A maioria das bactérias patogênicas são mesófilas: alta contagem indica que houve condições para multiplicação de patógenospatógenos
� Metodologia � plaqueamento em profundidade ou superfície� técnica de filtração por membrana� OSA: 30ºC/48h
AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS
� Não há padrão estabelecido
� Inclui alguns patógenos (Listeria, Yersinia) e deteriorantes (Hafnia)
� Metodologia � plaqueamento em superfície
� PCA: 7ºC/10dias
Salmonella
� Família Enterobacteriaceae
� Bastonete Gram-negativo
� Não esporulado
� Anaeróbio facultativo
� Sensibilidade microbiana
� Temperatura: 5º a 47ºC
� pH: 3,8 a 9,5
� Aw: 0,94
� Concentração de NaCl: 8%
Classificação
� Duas espécies� S. enterica com 6
subespécies
� S. bongori
� 2501 sorotipos
� Antígenos somáticos� Antígenos flagelares
Características da Doença
� S. Typhi: Febre tifóide� Febre alta, diarréia, vômito, septicemia, sangramentos� Mortalidade: 10%� Reservatório: homem� Dose infectante: 103
� S. Paratyphi A, B e C: Febre entérica� Mesma sintomatologia, mais branda
� Salmonelose (S. enterica enterica)� Diarréia, febre, dores abdominais e vômito� Mortalidade: 1 a 15%� Dose infectante: >106
Epidemiologia
� Flórida (2001): Salmonella Anatum, suco não pasteurizado
� EUA (1999) – 15 estados, 207 casos, Salmonella Muenchen, suco não pasteurizado
� Rio de Janeiro (2006): suco in natura� 74% coliformes 35ºC� 57% coliformes 45ºC
� Porto Alegre (2005): suco in natura� 3 amostras coliformes 45ºC� 1 amostra Salmonella
Isolamento e identificação
� Método tradicional ISO6579, FDA, FSIS� Pré-enriquecimento
� BPW, Caldo lactosado, TSB: 35-37ºC/18-24h
� Enriquecimento� Caldo tetrationato: 35-37ºC/24h
� Caldo Rappaport-Vassiliadis: 41-42ºC/24h
Plaqueamento: 35-37ºC/24h
� Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)
� Ágar Hectoen (HE)� Ágar Hectoen (HE)
� Ágar Bismuto sulfito (BS)
� Ágar Verde brilhante (BG)
Confirmação bioquímica
� Ágar tríplice açúcar ferro (TSI)� 35-37ºC/24h
� Ágar Lisina ferro (LIA)
Caldo descarboxilase lisina� 35-37ºC/24h
� Ágar Uréia de Christenson
� Teste Indol
Confirmação bioquímica
� Teste Indol
� Voges-Proskauer
� Teste b-galactosidase
Confirmação sorológica
� Poli O: soroaglutinação
� Poli H: soroaglutinação
Testes bioquímicos
Testes sorológicos Resultado bioquímicos Típicos Positivos Confirmado
Típicos Negativos Pode ser
Atípicos Positivos Pode ser
Atípicos Negativos Não confirmado
Bactérias lácticas
� Lactobacillus
� Leuconostoc
� OenococcusOenococcus
� Gram-positivos� Cocos, cocobacilos ou bastonetes� Mesófilos D65ºC = 0,5 a 1min� Catalase negativa� Acidúricos (pH 3 a 7)� Não esporogênicos
Bactérias lácticas
� Homo ou heterofermentativos� Redução do pH� Alteração de sabor e aroma� Acetoína e diacetil� Produção de gás� Produção de gás
� Contagem em placa� OSA (ágar soro de laranja), MRS 30-35ºC/48-72h� Microaerofilia ou sobrecamada
� Presença/Ausência� TAB (caldo Thermoacidurans) ou CA (caldo ácido) 30-35ºC� Caldo APT ou MRS
Bactérias acéticas
� Acetobacter
� Gluconobacter
� Gram negativas� Gram negativas� Bastonetes ou cocbacilos� Aeróbias� Mesófilas� Catalase positiva� Oxidase negativa
Bactérias acéticas
� Produção de ácido acético� Alteração de sabor e aroma
� PDA acidificado 30ºC/5dias� Confirmação
� Ágar etanol� Ágar GYC
� Coloração de Gram
Bactérias acéticasPrincipais características Acetobacter Aceto. aceti Acidomonas Frateuria Gluconobacter
Gram -/v -/v -/v -/v -/v
Bastonetes ou cocobacilos + + + + +
Oxidação de etanol a ácido acético
+ + + + +
Oxidase - - + - -
Catalase + + +
Pigmento marron nas colônias em Ágar GYC
- - +/- -
Colônias de cor amarela - - +/- + -
Fermentação de d-arabinose - - +/- +
Filamentos +/- - +/-
Cadeias +/- - +/-
Grupo Bacillus (Flat Sour)
� Bacillus coagulans
� Gram-positivos� Termófilo facultativo 30 a 61ºC � Catalase positiva� Acidúricos (pH 3,8)� Esporogênicos� Anaeróbio facultativo
� Redução do pH (ac láctico) sem produção de gás
� TAB (CA) 30-35ºC e 55ºC� DTA (agar Dextrose Triptona) ou TAA (agar Thermoacidurans) 35ºC e 55ºC
Alicyclobacillus
� Wisotzkey (1992)� Bacilos termófilos acidófilos – “flat sour”� Ácidos graxos alicíclicos na membrana celular� Karavaiko (2005): nova classificação� Karavaiko (2005): nova classificação
� Gram-positivos� Aeróbios ou anaeróbios facultativos� Acidófilos estritos (pH 0,5 a 6,0)� Termófilos estritos ou facultativos (mesófilos????) � Catalase positiva ou negativa
Alicyclobacillus
� A. acidoterrestris� 20ºC a 62ºC� D95ºC = 2,5 a 8,7min� Solo, suco de frutas, concentrados� Esporos viáveis: Brix 30º� Esporos viáveis: Brix 30º� Produtor de guaiacol (104 UFC/g)� Sabor estranho, odor fenólico, medicinal
� A. acidocaldarius (termófilo estrito) - suco concentrado UHT
� A. acidiphilus – refrescos ácidos
� A. pomorum – suco misto
Alicyclobacillus
� Metodologia APHA ou IFU (International Federation of Juice Producers)� ALI x YSG (agar extrato de levedura amido glicose) ou BAT (agar Bacillus
acidoterrestris)
� Teste de contagem em placa + P/A� Células vegetativas : sem choque térmico� Células vegetativas : sem choque térmico� Esporos: choque de 80ºC/10min
� Preparo da amostra� Suco pronto para consumo: incubação direta 45ºC/7dias� Amostras solidas e concentradas: 10g : 90ml YSG caldo� Sucos concentrados: 10g : 90ml água
� Contagem em placa� Agar K e Agar BAT ou YSG 45ºC/5dias
Alicyclobacillus
� Presença/Ausência� Incubação do restante da amostra a 45ºC/5dias
� Confirmação � Coloração de Gram� Coloração de Gram� Crescimento em PCA, TSA ou BHI� Crescimento a 30ºC e 65ºC em YSG� Teste de produção de guaiacol
� Princípio do teste de guaiacol
� H2O2 + guaiacol O2 + H2O +composto oxidado(vermelho tijolo/castanho)
peroxidase
Alicyclobacillus
� Tabela. Interpretação de resultados
Característica
Perfil 1Alicyclobacillus
spp não
Perfil 2Alicyclobacillus spp deteriorantes
potenciaisdeteriorantes (principalmente A. acidoterrestris)
Crescimento em Ágar YSG ou BAT a 45ºC
+ +
Crescimento em pH neutro (PCA/TSA/BHI) a 45ºC
- -
Formação de esporos + +
Crescimento em YSG ou BAT a 65ºC + -
Crescimento em YSG ou BAT a 30ºC - +
Crescimento em Ágar K - +
� Cl. pasteurianum
� Cl. butiricum
� Anaeróbios estritos� Esporogênicos� Calatase negativa
Clostrídios
� Calatase negativa� Gram positivos� Mesófilos� pH 4,2-4,4� Emb. estufada (CO2 + H2), odor butírico� TAB (CA) com ágar selo 30-35ºC � TAA 35ºC anaerobiose
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