Qualidade microbiológica e bactérias acidúricas em bebidas não alcoólicasacidúricas em bebidas não alcoólicas

Maristela S. Nascimento

Conteúdo programático

� Microrganismos indicadores

� Salmonella

� Bactérias deteriorantes� Báctérias lácticas� Bactérias acéticas� Grupo Bacillus

� Alicyclobacillus

� Clostrídios butíricos

Legislação

ProdutoDeterminação

Limite (UFC ou NMP/g)

Polpa de fruta “in natura” Bolores e leveduras 5,0x103

Ministério da Agricultura (Inst. Norm. n.1, 07/01/00)

Coliformes fecais 1,0

Salmonella (25g) Ausente

Polpa de fruta conservada quim. ou tratada term.

Bolores e leveduras 2,0x103

Coliformes fecais 1,0

Salmonella (25g) Ausente

Legislação

Produto Determinação Limite

Sucos, refrescos, néctar prontos para consumo

Coliformes 35ºC (em 50ml)Ausente

Sucos concentrados* Coliformes 35ºC (em 50ml) Ausente

Salmonella (25ml)

ANVISA (RDC n.12, 02/01/01) – Grupo 17

Salmonella (25ml) Ausente

Suco desidratado Coliformes 35ºC 10/g

Salmonella (25g) Ausente

Xarope Coliformes 35ºC 10/g

Pó para refresco Coliformes 35ºC 1/g

Suco “in natura” Coliformes 45ºC 100/ml

Salmonella (25ml) Ausente

Suco pasteurizado e refrigerado

Coliformes 45ºC 10/ml

Salmonella (25ml) Ausente

Microrganismos Indicadores

Grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentesem um alimento, podem fornecer informações sobredeterioração, contaminação de origem fecal e provável presençade patógenos, podendo indicar condições sanitárias inadequadasdurante o processamento, armazenamento e distribuição doalimento.

(Franco & Landgraf, 2003)

COLIFORMES TOTAIS

� Família Enterobacteriaceae: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella

� Bacilos gram-negativos, não esporulados� Bacilos gram-negativos, não esporulados

� Fermentam lactose com produção de gás a 35-37ºC/24-48h

� Não indicam necessariamente contaminação fecal ou presença de enteropatógenos

Coliformes Termotolerantes e Escherichia coli

� Hábitat primário: trato intestinal

� Fermentam lactose com produção de gás a 44,5 - 45,5ºC / 24h

� 90% de E. coli e algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella� 90% de E. coli e algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella

� Processamento, armazenamento, higienização ou manipulação inadequados

� Recontaminação pós-processamento

� pH 4 a 9� Tº 7 a 46ºC

Escherichia coli

� EPEC – enteropatogênica clássica, gastroenterite em recém nascidos e lactentes

� EIEC – enteroinvasora, semelhante a shigelose

� ETEC – enterotoxigênica, diarréia dos viajantes

� EHEC – entero-hemorrágica, colite hemorrágica evoluindo para síndrome urêmica hemolítica (HUS), sorotipo O157:H7

Metodologia

� Método de Número Mais Provável (NMP)� Série de 3 tubos

� Presença/Ausência em 50ml� 5 tubos de 10ml

� Lauril Sulfato Triptose (LST) � Lauril Sulfato Triptose (LST) � Simples ou duplo

� 35ºC/24-48h

� Verde Brilhante Bile (VB): 35ºC/24-48h

� EC: 45,5ºC/24h

Tabela com inoculação de 0,1 - 0,01 e 0,001g ou ml de amostra

Confirmação E. coli

� Caldos com fator de fluorescência

� Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB) 35ºC/24h

� Bioquímica (IMVIC)

VM: +

Confirmação E. coli

Indol : + ou -

VM: +

VP: -

Citrato: -

INDICADORES GERAIS

�Aeróbios mesófilos e psicrotróficos.

�Quando presentes em número elevado nos alimentos �Quando presentes em número elevado nos alimentos podem causar deterioração e/ou redução da vida-de-prateleira

�Fornecem informações gerais sobre as condições durante o processamento e armazenamento do alimento

AERÓBIOS MESÓFILOS

� FAO/OMS: 104 - 105 (máx permitido)

� A maioria das bactérias patogênicas são mesófilas: alta contagem indica que houve condições para multiplicação de patógenospatógenos

� Metodologia � plaqueamento em profundidade ou superfície� técnica de filtração por membrana� OSA: 30ºC/48h

AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS

� Não há padrão estabelecido

� Inclui alguns patógenos (Listeria, Yersinia) e deteriorantes (Hafnia)

� Metodologia � plaqueamento em superfície

� PCA: 7ºC/10dias

Salmonella

� Família Enterobacteriaceae

� Bastonete Gram-negativo

� Não esporulado

� Anaeróbio facultativo

� Sensibilidade microbiana

� Temperatura: 5º a 47ºC

� pH: 3,8 a 9,5

� Aw: 0,94

� Concentração de NaCl: 8%

Classificação

� Duas espécies� S. enterica com 6

subespécies

� S. bongori

� 2501 sorotipos

� Antígenos somáticos� Antígenos flagelares

Características da Doença

� S. Typhi: Febre tifóide� Febre alta, diarréia, vômito, septicemia, sangramentos� Mortalidade: 10%� Reservatório: homem� Dose infectante: 103

� S. Paratyphi A, B e C: Febre entérica� Mesma sintomatologia, mais branda

� Salmonelose (S. enterica enterica)� Diarréia, febre, dores abdominais e vômito� Mortalidade: 1 a 15%� Dose infectante: >106

Epidemiologia

� Flórida (2001): Salmonella Anatum, suco não pasteurizado

� EUA (1999) – 15 estados, 207 casos, Salmonella Muenchen, suco não pasteurizado

� Rio de Janeiro (2006): suco in natura� 74% coliformes 35ºC� 57% coliformes 45ºC

� Porto Alegre (2005): suco in natura� 3 amostras coliformes 45ºC� 1 amostra Salmonella

Isolamento e identificação

� Método tradicional ISO6579, FDA, FSIS� Pré-enriquecimento

� BPW, Caldo lactosado, TSB: 35-37ºC/18-24h

� Enriquecimento� Caldo tetrationato: 35-37ºC/24h

� Caldo Rappaport-Vassiliadis: 41-42ºC/24h

Plaqueamento: 35-37ºC/24h

� Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)

� Ágar Hectoen (HE)� Ágar Hectoen (HE)

� Ágar Bismuto sulfito (BS)

� Ágar Verde brilhante (BG)

Confirmação bioquímica

� Ágar tríplice açúcar ferro (TSI)� 35-37ºC/24h

� Ágar Lisina ferro (LIA)

Caldo descarboxilase lisina� 35-37ºC/24h

� Ágar Uréia de Christenson

� Teste Indol

Confirmação bioquímica

� Teste Indol

� Voges-Proskauer

� Teste b-galactosidase

Confirmação sorológica

� Poli O: soroaglutinação

� Poli H: soroaglutinação

Testes bioquímicos

Testes sorológicos Resultado bioquímicos Típicos Positivos Confirmado

Típicos Negativos Pode ser

Atípicos Positivos Pode ser

Atípicos Negativos Não confirmado

Bactérias lácticas

� Lactobacillus

� Leuconostoc

� OenococcusOenococcus

� Gram-positivos� Cocos, cocobacilos ou bastonetes� Mesófilos D65ºC = 0,5 a 1min� Catalase negativa� Acidúricos (pH 3 a 7)� Não esporogênicos

Bactérias lácticas

� Homo ou heterofermentativos� Redução do pH� Alteração de sabor e aroma� Acetoína e diacetil� Produção de gás� Produção de gás

� Contagem em placa� OSA (ágar soro de laranja), MRS 30-35ºC/48-72h� Microaerofilia ou sobrecamada

� Presença/Ausência� TAB (caldo Thermoacidurans) ou CA (caldo ácido) 30-35ºC� Caldo APT ou MRS

Bactérias acéticas

� Acetobacter

� Gluconobacter

� Gram negativas� Gram negativas� Bastonetes ou cocbacilos� Aeróbias� Mesófilas� Catalase positiva� Oxidase negativa

Bactérias acéticas

� Produção de ácido acético� Alteração de sabor e aroma

� PDA acidificado 30ºC/5dias� Confirmação

� Ágar etanol� Ágar GYC

� Coloração de Gram

Bactérias acéticasPrincipais características Acetobacter Aceto. aceti Acidomonas Frateuria Gluconobacter

Gram -/v -/v -/v -/v -/v

Bastonetes ou cocobacilos + + + + +

Oxidação de etanol a ácido acético

+ + + + +

Oxidase - - + - -

Catalase + + +

Pigmento marron nas colônias em Ágar GYC

- - +/- -

Colônias de cor amarela - - +/- + -

Fermentação de d-arabinose - - +/- +

Filamentos +/- - +/-

Cadeias +/- - +/-

Grupo Bacillus (Flat Sour)

� Bacillus coagulans

� Gram-positivos� Termófilo facultativo 30 a 61ºC � Catalase positiva� Acidúricos (pH 3,8)� Esporogênicos� Anaeróbio facultativo

� Redução do pH (ac láctico) sem produção de gás

� TAB (CA) 30-35ºC e 55ºC� DTA (agar Dextrose Triptona) ou TAA (agar Thermoacidurans) 35ºC e 55ºC

Alicyclobacillus

� Wisotzkey (1992)� Bacilos termófilos acidófilos – “flat sour”� Ácidos graxos alicíclicos na membrana celular� Karavaiko (2005): nova classificação� Karavaiko (2005): nova classificação

� Gram-positivos� Aeróbios ou anaeróbios facultativos� Acidófilos estritos (pH 0,5 a 6,0)� Termófilos estritos ou facultativos (mesófilos????) � Catalase positiva ou negativa

Alicyclobacillus

� A. acidoterrestris� 20ºC a 62ºC� D95ºC = 2,5 a 8,7min� Solo, suco de frutas, concentrados� Esporos viáveis: Brix 30º� Esporos viáveis: Brix 30º� Produtor de guaiacol (104 UFC/g)� Sabor estranho, odor fenólico, medicinal

� A. acidocaldarius (termófilo estrito) - suco concentrado UHT

� A. acidiphilus – refrescos ácidos

� A. pomorum – suco misto

Alicyclobacillus

� Metodologia APHA ou IFU (International Federation of Juice Producers)� ALI x YSG (agar extrato de levedura amido glicose) ou BAT (agar Bacillus

acidoterrestris)

� Teste de contagem em placa + P/A� Células vegetativas : sem choque térmico� Células vegetativas : sem choque térmico� Esporos: choque de 80ºC/10min

� Preparo da amostra� Suco pronto para consumo: incubação direta 45ºC/7dias� Amostras solidas e concentradas: 10g : 90ml YSG caldo� Sucos concentrados: 10g : 90ml água

� Contagem em placa� Agar K e Agar BAT ou YSG 45ºC/5dias

Alicyclobacillus

� Presença/Ausência� Incubação do restante da amostra a 45ºC/5dias

� Confirmação � Coloração de Gram� Coloração de Gram� Crescimento em PCA, TSA ou BHI� Crescimento a 30ºC e 65ºC em YSG� Teste de produção de guaiacol

� Princípio do teste de guaiacol

� H2O2 + guaiacol O2 + H2O +composto oxidado(vermelho tijolo/castanho)

peroxidase

Alicyclobacillus

� Tabela. Interpretação de resultados

Característica

Perfil 1Alicyclobacillus

spp não

Perfil 2Alicyclobacillus spp deteriorantes

potenciaisdeteriorantes (principalmente A. acidoterrestris)

Crescimento em Ágar YSG ou BAT a 45ºC

+ +

Crescimento em pH neutro (PCA/TSA/BHI) a 45ºC

- -

Formação de esporos + +

Crescimento em YSG ou BAT a 65ºC + -

Crescimento em YSG ou BAT a 30ºC - +

Crescimento em Ágar K - +

� Cl. pasteurianum

� Cl. butiricum

� Anaeróbios estritos� Esporogênicos� Calatase negativa

Clostrídios

� Calatase negativa� Gram positivos� Mesófilos� pH 4,2-4,4� Emb. estufada (CO2 + H2), odor butírico� TAB (CA) com ágar selo 30-35ºC � TAA 35ºC anaerobiose

OBRIGADA!

mnascimento@ital.sp.gov.br