prof. odir a. dellagostin biblioteca genômica e de cdna
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Prof. Odir A. Dellagostin
Biblioteca Genômica e de Biblioteca Genômica e de cDNAcDNA
Biblioteca GenômicaBiblioteca Genômica
É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo
Características das Bibliotecas Características das Bibliotecas de DNAde DNASão usadas para principalmente para
procariotosEm eucariotos usa-se biblioteca
genômica para estudo de regiões reguladoras
Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA
Biblioteca de cDNABiblioteca de cDNA
É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA.
É usada principalmente para células eucarióticas.
Varia de acordo com o tecido utilizado.
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• É a formação de molécula fita dupla, É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens complementares, mas de origens diferentesdiferentes
• Hibridização Renaturação
HIBRIDIZAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOSDOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
• Triagem de Bibliotecas Genômicas
• Diagnóstico molecular
• Tipagem molecular
• Teste de paternidade
• Medicina forense
Aplicações
Triagem de uma biblioteca
Conhecer parte da Conhecer parte da seqüência do geneseqüência do gene
Seqüência Seqüência completa do genecompleta do gene
Sonda de DNASonda de DNA Utilizar sonda de Utilizar sonda de oligonucleotídeos oligonucleotídeos derivado de uma derivado de uma
proteínaproteína
Codon degeneradoCodon degeneradoConhecer cerca de Conhecer cerca de 6 aa contíguos6 aa contíguos
AnticorposAnticorpos
1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos
Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA
•Radioativa: Radioativa: 3232P P
•Não radioativa: Não radioativa: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina
SONDA de DNASONDA de DNA
- Seqüência de DNA Marcada- Seqüência de DNA Marcada
Marcação da Sonda de DNAMarcação da Sonda de DNA
•Enzimática: Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaperoxidase, fosfatase alcalina
Desnaturação DNA
DNA fita simples
Ligação Fraca
(DNA+ Peroxidase)
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
+ peroxidase complexada com polimero positivo
+ glutaraldeído
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
1
2 3
456
Placas com Colônias
contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA
SondaFilme de Raio - X
2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização
Caracterização da seqüência encontrada
• Seqüenciamento de DNASeqüenciamento de DNA
• PCRPCR
• Expressão da seqüência codificadoraExpressão da seqüência codificadora
Southern Blot - DNASouthern Blot - DNA
Northern Blot - RNANorthern Blot - RNA
Western Blot - ProteínaWestern Blot - Proteína
• Sonda: seqüência de DNA marcada
Transferência de DNA do gel para a membrana
Southern Blot
NORTHERN BLOT
4. Geração de uma sonda marcada
pGEM-T
dATPdGTPdTTP
dCTP
1. Extração do DNA
2. Eletroforese do RNA
3. Transferência para a menbrana
5. Hibridização
6. Visualização
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