precipitaÇÃo de proteÍnas. introduÇÃo constituição e estrutura das proteÍnas constituição ...

PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

INTRODUÇÃO

Constituição e estrutura das PROTEÍNAS Constituição Aminoácidos (aa) com elevada massa molar

(> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas.

Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução.

Estrutura (quatro níveis) : Estrutura primária: refere-se à sequência dos

aminoácidos na cadeia linear peptídica. Estrutura secundária: refere-se ao grau de

ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária. Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína.

As estruturas secundária e terciária conferem à proteína a sua estrutura tridimensional.

Estrutura quaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas. Para sua estabilização concorrem ligações iônicas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes bissulfeto e interações hidrofóbicas.

Representação esquemática das estruturas das proteínas

Estrutura terciária

Estrutura primária

Estrutura secundária

Estrutura quaternária

Princípios de Solubilidade Solubilidade: resultado global das interações

atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e do soluto;

É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e do solvente;

Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals;

Interações eletrostáticas: base da solubilidade de moléculas polares neutras e com cargas em solventes polares;

Solubilidade de Proteínas

Regiões Hidrofóbicas

(Apolares)Regiões Hidrofílicas(Polares)

Determinam a solubilidade

Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.

pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos;

O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.

Carga total zero leva a um aumento da agregação devido à menor repulsão.

perfis de solubilidade em diferentes valores de pH

pH e distribuição de cargas:

pI

- - + +

De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

Desnaturação X Precipitação

A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso.- as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas.

A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína.- as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.

Uso: purificação de proteínas de diferentes fontes Precipitados: agregados protéicos de moléculas de

diferentes tamanhos; Precipitação: operação na qual uma perturbação,

química ou física, em uma solução, promove a formação de partículas insolúveis;

Remoção do precipitado: separação sólido-líquido; Tradicionalmente usado também como etapa de

concentração; Etapa preliminar em diversos procedimentos de

purificação; Pode se empregada como etapa única;

PRECIPITAÇÃO

Vantagens:

Facilidade de operação

Equipamentos relativamente simples

Facilidade de ampliação de escala

Grande número de agentes precipitantes(sendo muitos de baixo custo ou usados em concentrações pequenas)

As técnicas de precipitação se dividem basicamente em dois grupos:

Redução da solubilidade da molécula alvo pela modificação da solução: Adição de sais (sulfato de amônio) em altas

concentrações, de solventes orgânicos (etanol, éter e acetona) e de polímeros não-iônicos (polietilenoglicol).

Redução da solubilidade por alterações da molécula alvo: Mudança da carga das proteínas (adição de

ácidos e bases), uso de precipitantes aniônicos ou catiônicos.

A precipitação deve permitir que a

conformação adequada da proteína seja

recuperada, para que esta possa

“exercer” sua função bioquímica após o

processo.

PRECIPITAÇÃO POR SAIS

Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação

=> agregação dos resíduos hidrofóbicos

Salting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água, que tornam-se escassas, e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas. Estas, expostas, se interagem e se agregam.

Região Hidrofóbica

(Apolar)Regiões Hidrofílicas(Polares)

Sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade.

Os mais usados são:

citrato de sódiosulfato de sódiosulfato de amônio

Salting-in: em baixa concentração de sais ocorre a indução de interações iônicas e agregação das moléculas de proteína.

Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (salting out)

Globulinas se precipitam sob força iônica baixa

Esquema explicativo da precipitação por salting-in.

Primeira descrição quantitativa do salting out foi feita por Cohn, em 1925:

log S = - KS ( I )

Onde:

S = solubilidade da proteína (mol/L)

I = força iônica do meio (mol/L)

= constante que representa a solubilidade da proteína quando I = 0 (mol/L)

KS = constante de salting out

Misturas de proteínas não obedecem à equação!

PRECIPITAÇÃO POR SOLVENTES

A solubilidade das proteínas varia com a

distribuição dos resíduos hidrofílicos e

hidrofóbicos na superfície da molécula;

Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e

outros são usados como precipitantes desde

início do século XIX;

Aplicação clássica: fracionamento das proteínas

do plasma sanguíneo por etanol frio (Método de

Cohn)

MECANISMO

Principal efeito: da constante dielétrica do meio

-

R egiãoH id ro f ó b ica

--

-

-

-

-+

+

++

+-

--

-

+ +

-

-

+ ++ + +

+

-

- -- -

So lv en teO rgân ico

Agregação de proteínas por

interações eletrostáticas entre

superfícies com cargas de sinal oposto em meio

aquoso contendo solvente orgânico.

SOLVENTES

Devem ser miscíveis em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bons precipitantes;

Mais usados: metanol, etanol e acetona; Outros: n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e

outros álcoois, éteres e cetonas;

VARIÁVEIS QUE AFETAM O PROCESSO

Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a xxxxxxxxxxxxxxxxxdesnaturação

< 0º C pode garantir que xxxxxxxxxxxnão haja desnaturação

Adição do solvente temperatura => deve ser lenta e sob refrigeração

Concentração de sais: concentrações dificultam interações eletrostáticas => dificuldade de precipitação => % solvente

pH: próximo ao pI favorece a precipitação

PRECIPITAÇÃO FRACIONADA

Meios a serem purificados, em geral, constituem misturas Precipitação fracionada corresponde à precipitação em

duas ou mais etapas Na primeira removem-se proteínas indesejáveis menos

solúveis e, nas seguintes, precipitam-se uma ou mais moléculas-alvo

Em um estágio: útil como técnica de concentração Fracionada: aplicação industrial para purificação; Na precipitação fracionada em geral varia-se a

concentração do agente precipitante, mas também pode-se variar outros fatores;

Os estágios são chamados de “cortes” (em geral, dois);

Representação teórica dos perfis de solubilidade de uma molécula de interesse e outras presentes no meio, em concentrações crescentes de precipitante.

30% v/v

50% v/v

pH 4,6

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

% R

ecu

pe

raçã

o

xilanase

beta-xilosidase

proteínas totais

Recuperação (%) das enzimas: xilanase (), -xilosidase () e proteínas totais ().

Parâmetros de Avaliação Recuperação de proteínas totais: Rp = teor de proteínas após precipitação x 100

teor de proteínas inicial

Recuperação de atividade: Ra = atividade após precipitação x 100

atividade inicial

Aumento de pureza: AP = atividade específica após precipitação

atividade específica inicial

Resultados obtidos após precipitação fracionada com etanol das enzimas xilanase, -xilosidase e proteínas totais.

-xilosidase

Amostra RP1

(%)RA2

(%) AP3

Inicial - - 1,0

20% etanol 71 8 0,1

60% etanol 12 74 5,9

80% etanol 18 6 0,4

Xilanase

Amostra RP(%)

RA(%)

AP(AEf/AEini)

Inicial - - 1,0

20% etanol 71 6 0,1

60% etanol 12 7 0,6

80% etanol 18 81 4,4

1Recuperação de proteínas totais; 2Recuperação de Atividade; 3Aumento de pureza.

PRECIPITAÇÃO POR POLÍMEROS

PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar, neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização;

Em geral, proporções de polímero (15 a 30%); 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso; Concentração depende do tamanho da molécula a

ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína;

Remoção do polímero: ultrafiltração, diálise, adição de etanol.

Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual; Policátion polietilenoimina e poliânion ácido

poliacrílico Mecanismo: agregação à proteína (floculação)

ou eletrostático (neutralização de cargas);

PRECIPITAÇÃO PELA TEMPERATURA Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação => exposição de grupos hidrofóbicos que interagem e formam complexos insolúveis;

PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA Resulta da atração eletrostática das proteínas

quando estas estão próximas a seu pI; Método bastante simples: ajuste do pH

Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas;

Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturação

Obs: Método útil para precipitar proteínas indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;

Outros tipos de precipitação

Por afinidade: uso de interações específicas e seletivas da molécula-alvo com algum ligante; Ex.:Cibracon blue em metilmetacrilato para

purificar lactato desidrogenase.

Por íons metálicos: íons metálicos polivalentes podem ser usados eficientemente na precipitação: manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco e cádmio.

Mecanismo: mudanças do pI e formação de ligações cruzadas com outras proteínas.

Principais métodos de precipitação de proteínas

Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens

Sais neutros(salting-out)

Interações hidrofóbicas pela redução da camada de hidratação da proteína

- Uso universal- Baixo custo

- Corrosivo- Liberação de amônia em pH alcalino

Polímeros não-iônicos

Exclusão da proteína da fase aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da proteína

- Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Aumento da viscosidade

Calor interações hidrofóbicas e interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio,

- Baixo custo- Simples

- Risco de desnaturação

Polieletró-litos

Ligação com a molécula de proteína atuando como agente floculante

- Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Risco de desnaturação

Precipitação isoelétrica

Neutralização da carga global da proteína pela alteração do pH do meio

- Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Risco de desnaturação

Sais metálicos

Formação de complexos - Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Risco de desnaturação

Solventes orgânicos

Redução da constante dielétrica do meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares

- Facilidade de reciclagem- Facilidade na remoção do precipitado

- Risco de desnaturação de proteínas- Inflamável e explosivo