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Métodos laboratoriais para pesquisa e
identificação de Legionella species em
amostras ambientais
05 de abril de 2018
Raquel Esaguy Rodriguesraquel.rodrigues@insa.min-saude.pt
Enquadramento Geral
• > 61 espécies e 70 serogrupos distintos;
• Pelo menos 26 espécies de Legionella estão associadas a doençasno ser humano, como por exemplo, Legionella micdadei, L.bozemanii, L. dumoffii, e L. longbeachae;
Fonte: Norma ISO 11731:2017
• Legionella pneumophila (16 serogrupos) é responsável por 70 a 90%
das infeções no Homem. 2
Características Gerais:• Bacilos gram-negativos;
• 0,3 a 0,9 m de largura;
• 2 a 20 m de comprimento;
• Móveis, exceto Legionella oakridgensis;
• Algumas espécies exibem fluorescência quando observadas sobre
luz U.V;
• L-cisteína e sais de ferro;
• Crescem em BCYE e GVPC.
• Aspeto “vidro-martelado”
3
Habitat • Ambiente: rios, lagos, ribeiros, nascentes, solos húmidos e águas
subterrâneas
• Reservatórios artificiais: torres de arrefecimento de arcondicionado, sistemas de distribuição de água, condensadores,entre outros;
• Capazes de se multiplicarem em 14 espécies de amibas e em 2espécies de protozoários ciliados;
• Bactérias do género Legionella, tornam-se mais resistentes acondições adversas quando associadas a biofilmes. 4
Condições favoráveis ao
desenvolvimento da Legionella
• Temperatura da água entre 20ºC e 45ºC;
• Redução dos níveis de cloro;
• Estagnação da água, pontos “mortos” na rede de abastecimento;
• Matéria orgânica, sedimentos, biofilmes;
• Presença de algas, fungos, protozoários e outras bactérias;
• Reservatórios de água artificiais: corrosão, incrustações.
5
Infeções e sintomas provocados nos
seres humanos
6
LEGIONELOSE
Doença dos Legionários
(pneumonia)
Febre de Pontiac
(síndrome gripal)
• Sintomas idênticos a
uma constipação
Período de incubação
2 a 10 dias
Período de incubação
24 a 48 horas
• Má disposição
(dores de cabeça e tosse)
• Febres muito altas,
arrepios
• Diarreia e vómitos
Risco de infeção depende de fatores
como:
• Concentração de Legionella na água;
• Condições para a sua multiplicação;
• Patogenicidade da bactéria;
• Formação de aerossóis;
• Tempo de exposição;
• Suscetibilidade do indivíduo exposto.
7
Caracterização da Doença dos
Legionários em Portugal• Alguns exemplos publicados de surtos epidémicos da Doença dos
Legionários em território nacional:
– 1994 – Hospital de Santa Cruz em Lisboa;
– 1997 – Unidade hoteleira no Algarve;
– 2000 – Concerto de Rock, Município de Vizela;
– 2006 – Hospital de Coimbra.
– 2011 – Hospital de Bragança.
– 2014 - Vila Franca de Xira (375 casos de doença e 12 óbitos).
– 2017 – Hospital São Francisco Xavier
– 2018 – Hospital CUF Descobertas8
Caracterização da Doença dos
Legionários em Portugal
• 2004 – 35 casos;
• 2005 – 39 casos; 2010 –125 casos;
• 2006 – 90 casos; 2011 – 88 casos;
• 2007 – 78 casos; 2012 – 132 casos;
• 2008 – 91 casos; 2013 – 91 casos;
• 2009– 93 casos; 2014 –588 casos;
2015 –145 casos;
Casos confirmados apenas
Fonte: Vigilância em saúde Pública:
Doença dos Legionários em Portugal 2004_2013 _DGS (2014)
SURVEILLANCE REPORT - Annual epidemiological report for 2015 _ECDC 9
Legislação Nacional
• Portaria 1220/2000, de 29 de Dezembro, aplicada apenas às
águas minerais naturais e as águas de nascente.
10
Parâmetros Valores Máximos Recomendados
Por ingestão e em
contacto com as
mucosas
Por via externa
Legionella
pneumophila Não detetada/L Não detetada/L
Legionella spp. não
pneumophila Não detetada/L 100 ufc/L
Legislação Nacional (cont)
• Portaria n.º 353-A/2013, de 4 de dezembro.
11
Parâmetro Condições de referência
Legionella spp
Concentração inferior a 100 ufc/L, exceto no
caso da pesquisa em tanques de torres de
arrefecimento em que deve verificar-se uma
concentração inferior a 1000 UFC/L.
Ausência de Legionella pneumophila.
“European Technical Guidelines for the
prevention, control and investigation of
infeccions caused by Legionella species
(2017)
14
O método de PCR em
Tempo real pode ser
útil na investigação de
potenciais fontes de
infeção e na
monitorização das
ações corretivas
aplicadas;
(…) Continua a não
haver consenso na
interpretação dos
resultados obtidos por
esta metodologia.
“European Technical Guidelines for the
prevention, control and investigation of
infeccions caused by Legionella species.
(2017)
15
Um resultado negativo por PCR
é praticamente certo que será
igualmente um resultado
negativo pelo método cultural;
Este momento é recomendado
para uma realização de uma
análise rápida a diversos locais
de colheita associados a
casos/surtos de modo a
eliminar rapidamente os
negativos e identificar os
positivos. No entanto, os
resultados devem ser sempres
confirmados pelo método
cultural _ Gold Standard.
Norma ISO 12869: 2012
“Water quality — Detection and quantification of Legionella spp.
and/or Legionella pneumophila by concentration and genic
amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)”
Norma ISO 11731:2017
“Water Quality - Enumeration of Legionella ”
16
Componente Ambiental
PCR em Tempo Real (RT-PCR)
• Técnica que possibilita a monitorização do estado de uma reaçãode PCR, através da adição de um sinal (fluorescência) emitido emcada ciclo da reação de PCR, como um indicador de amplificaçãoproduzida;
• Possibilita a medição do aparecimento dos produtos amplificados
durante o próprio processo de amplificação, para resultados
quantitativos e qualitativos:
– deteção qualitativa (resposta Sim/Não)
– quantificação absoluta (resultado: p.ex. UG/ L)
17
Protocolo de colheitas de amostras
18
• Colheita de 2 L de amostra de água.
• As amostras devem ser entregues no Laboratório o mais
rapidamente possível, de preferência no prazo de 24h e não
excedendo as 48 horas.
• Caso a amostra seja analisada no prazo de 24 horas, estas
devem ser guardadas à temperatura ambiente. Caso só sejam
processadas no prazo de 48 horas, estas devem ser armazenadas
entre 2ºC a 8ºC.
NOTA: Amostras de água que sofreram tratamento por biocida só
devem ser submetidas a este tipo de análise 48 horas após a
realização do mesmo.
• Concentração da amostra através de filtração - membranas de
policarbonato;
• Extração de DNA;
• PCR em Tempo Real Qualitativo;
• PCR em Tempo Real Quantitativo;
• Expressão de resultados.
19
Protocolo do PCR em Tempo Real
Interpretação resultados
1º Análise:
Presença / Ausência Legionella spp e Legionella
pneumophila;
2ª Análise:
Quantificação de Legionella spp e Legionella
pneumophila (resultado expresso em Unidades
Genómicas (UG)).21
Vantagens do método de PCR em
Tempo Real
• Capacidade de resposta em poucas horas;
• Extremamente sensível;
• Necessita de quantidades de DNA muito inferiores àsnecessárias para uma reação de PCR.
27
Desvantagens PCR em tempo Real
• Elevado custo;
• Necessidade de pessoal técnico qualificado para a correta
interpretação dos resultados obtidos;
• Não existência de correlação entre UG (unidades genómicas)
e UFC (Unidades formadoras de colónias) – Grande entrave
em Termos Legislativos.
28
• Sementeira direta em amostras suspeitas de elevada
contaminação por Legionella (>104 UFC/L).
•Filtração por membrana, seguida de sementeira direta em
meio de cultura.
• Filtração por membrana, seguida de um processo de eluição.
29
Método Cultural
Filtração
Sementeira da amostra em BCYE e GVPC
Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC
Leitura e Confirmação das colónias suspeitas;
Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não
pneumophila (Teste de aglutinação)
30
Método Cultural – Norma ISO 11731
Filtração
Sementeira da amostra
Sem tratamento Tratamento da amostra
Calor Ácido Calor +Ácido
0,1 ml GVPC; BCYE e/ ou BCYE +AB
Incubação 7 a 10 dias, a 36±2ºC
Leitura e Confirmação das colónias
suspeitas;
Identificação Legionella pneumophila ou Legionella spp. não
pneumophila (Teste de aglutinação)31
Método Cultural – ISO 11731
32
Método Cultural: ISO 11731 – Matriz de
decisão 1º passo: determinar a
origem a as características da
água;
2º passo: determinar o nível
de deteção desejado
(LD_limite de deteção);
3º passo: selecionar os
tratamentos a serem
efetuados;
4º passo: Selecionar o(s)
meio(s) de cultura a ser(em)
utilizado(s).
33
Método Cultural: ISO 11731: Matriz de
decisão
Inoculação direta : Limite de
deteção 10 000 ufc/L.
(1,0x104 ufc/L)
Filtração por membrana _
inoculação direta: filtração
de 10 ml de amostra, o limite
de deteção é de 100 ufc/L.
Filtração por membrana
seguida de eluição: filtração
de 1 Litro de amostra, o limite
de deteção é de 50 ufc/L.
Leitura das placas
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• Colónias características :
“Colónias que crescem em meio específico (GVPC), nunca
antes das 48 horas de incubação, podendo apresentar uma
coloração branca, esverdeada ou outras cores, com aspeto
vidro moído”.
Sem tratamento Calor Ácido
Leitura das placas
• Leitura das placas após incubação, com o auxilio de
uma lupa binocular com luz incidente num
ângulo de 45º;
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• Reisolamento de colónias suspeitas em BCYE e BCYE sem cisteína (ou
gelose de sangue)
• Seroaglutinação com Kit comercial: o kit utilizado no laboratório inclui
partículas azuis de látex, sensibilizadas com anticorpos que aglutinam na
presença de antigénios específicos da parede celular da Legionella,
formando agregados visíveis a olho nu;
• Permite distinguir entre: L. pneumophila (serogrupos 1, 2-14 ou 2-15) e
Legionella spp. não L. pneumophila:
Identificação das colónias suspeitas
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Placa de GVPC - concentrado sem tratamento
Placa de GVPC - concentrado com tratamento por
calor
Placa de GVPC - concentrado com tratamento por
ácido
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Amostra proveniente de uma Torre de
Refrigeração _ Caso Real
Placa de GVPC - direto sem tratamento
Placa de GVPC - direto com tratamento por calor
Placa de GVPC - direto com tratamento por ácido
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Amostra proveniente de uma Torre de
Refrigeração _ Caso Real
Expressão dos resultados
• Não detetada (LD=50 ufc/L)
• Positiva – Nº ufc / L
(ufc – unidades formadoras de colónias)
Legionella pneumophila serogrupo 1
Legionella pneumophila serogrupo 2-14 ou 2-15
Legionella spp. não pneumophila
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• Vantagens:
• Capacidade de isolar as diferentes estirpes de
Legionella;
• Possibilidade de descobrir o agente etiológico nos IE;
• Possibilidade de comparação de estirpes clínicas com
estirpes ambientais;
• Apenas são recuperadas as bactérias viáveis.
Método complexo e exigente em tempo, meios de
cultura, reagentes e experiência técnica.
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Método Cultural
• Apesar de ainda haver alguma discussão acerca da comparação dosresultados obtidos pelos dois métodos referidos (cultural versus PCRem Tempo Real), estes podem ser usados de uma forma expedita ecomplementar na análise de amostras ambientais.
• O PCR em Tempo Real deve ser a primeira escolha sempre que senecessita de um resultado rápido. Este método é capaz de produzirresultados definitivos em menos de 12 horas, o que se traduz numamais valia em situações de risco.
• De ressalvar que as amostras positivas por PCR em Tempo Realdevem ser confirmadas pelo método cultural, o que permitirá tambémcomplementar a identificação da espécie e serogrupo da Legionellaem causa.
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