indução neural: determinação do eixo inicial/definição do ......indução neural:...

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Indução neural: determinação do eixo inicial/definição do domínio

neural

1. Indução da formação da PLACA NEURAL pelo Mesoderma (Mudança na forma celular, expressão de marcadores gênicos)

1. Associação da Placa Neural com a Notocorda subjacente; constrição apical nas células da borda da Placa Neural

1. Dobramento da Placa Neural

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1. A convergência do Tubo Neural é uma combinação de fatores: Pressão lateral e constrição nos pontos de dobradiça e extensão convergente

1. Fusão do Tubo Neural na porção dorsal concomitante com a Migração da Crista Neural

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O QUE INDUZ AFORMAÇÃO DOSISTEMA NERVOSO?

Prêmio Nobel em 1935

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Resultados:1. Gerou dois eixos embrionários=

DUPLICAÇÃO AXIAL

1. O segundo embrião é composto de células doadoras E aceptoras.

Conclusão:O Lábio dorsal do blastóporo tem capacidade INDUTIVA

O ORGANIZADOR

Propriedades do Organizador:

1. Inicia Gastrulação 2. Participa do

Mesoderma Dorsal3. Induz formação de

tecido Nervoso a partir do Ectoderma

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https://www.youtube.com/watch?v=rSIurckMtfU

(A origem das células do blastóporo dorsal (Organizador)

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A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA

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Crescente cinza

O Organizador da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)

Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo pela metade

b) Foi um resultado aleatório

c) Porque dividiu o crescente cinza.

d) Porque dividiu o Organizador.

Spemann, 19381

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Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo pela metade

b) Foi um resultado aleatório

c) Porque dividiu o crescente cinza.

d) Porque dividiu o Organizador.

Spemann, 19381

Propriedades do Organizador:

1. Inicia Gastrulação 2. Participa do

Mesoderma Dorsal3. Induz formação de

tecido Nervoso a partir do Ectoderma

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No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada

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No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?Sem Crescente cinza não há região dorsal

ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza?

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Transcrição zigóticaCrescente

CinzaOrganizador

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1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Capaz de compensar pelo efeito do UV

1. Ser de origem materna

•A TRANSCRIÇÃO no embrião de Xenopus só ocorre NA BLÁSTULA

•Os fatores indutivos do Organizador estão presentes ANTES da blástula

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U.V.

Quantidades crescentes de Ultravioleta alteram o desenvolvimento embrionário

U.V.

Dor

sal

Vent

ral

Dor

sal

Vent

ral

O tratamento com UV inibe a rotação cortical, altera a localização de Dsh, que passa de dorsal para homogêneo

Western Blot para DshDishevelled

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Heasman, J. Development 124, 4179-4191 (1997)

Membros da Família Wnt

Obs.: Wnt=Wingless +int

Via de sinalização Wnt

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controle Injetados com XDsh

O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial

Sokol et al.,Development 121:1637-1647 (1995)

1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

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Dor

sal

Vent

ral

O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas

Western Blot para Dsh

1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

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Dor

sal

Vent

ral

O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas

Western Blot para Dsh

Antes da Transcriçãozigótica

1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

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O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo

vent

ral

dors

al

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1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

Schohl and Fagotto Development 129, 37-52 (2002)

Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus

ventral dorsal

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1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

1. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

Development 1992 Mar;114(3):699-709.Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs.Schroeder MM, Gard DL

O centríolo do esperma organiza a polimerização dos microtúbulos que resultam na rotação cortical

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Slide 37 da Profa Nathalie:

A rotação cortical desloca elementos citoplasmáticos especificamente para o crescente cinza

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1. Fertilização

1. Polimerização polarizada dos microtúbulos pelo aster espermático

1. Rotação cortical

1. Concentração de Dsh na região vegetal-dorsal

1. Inibição de GSK-3 na região vegetal-dorsal

1. Atividade da beta-catenina na região vegetal-dorsal

Região Ventral

Região Dorsal

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

Acúmulo de beta catenina nuclear.

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?

Este pedaço é só endoderma!

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Crescente cinza

A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)

No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptora e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

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No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

Acúmulo de beta catenina nuclear.

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?Sem Crescente Cinza não há Organizador e não há gastrulação.

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1. Mas beta-catenina é uma proteína nuclear, e o efeito do Organizador depende de uma proteína secretada…

Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Crescente Cinza

Organizador

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Crescente Cinza

Organizador

?

Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

Neural

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

2. Transcrição zigótica do que?

COMO É FORMADO O ORGANIZADOR?

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Propriedades do Organizador:

1. Inicia Gastrulação 2. Participa do

Mesoderma Dorsal3. Induz formação de

tecido Nervoso a partir do Ectoderma

O Organizador de Spemann fica no MESODERMA DORSAL

Organizador de Spemann

Crescente cinza

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Após a gastrulação, as células do Organizador irão formar a notocorda

QUAL É A RELAÇÃO ENTRE

O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!

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Como é formado o MESODERMA?

Nieuwkoop, anos 70O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o

mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica.

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?

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma

Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:

1. Capaz de induzir MESODERMA

1. Expresso no pólo vegetal

1. Ser de origem materna

Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:

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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal que induzem o Mesoderma

Mas, VegT é uma proteína nuclear.....

VegT

Como é formado o MESODERMA DORSAL?

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Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais

b) Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas

c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior

d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza

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Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais

b) Os blastômeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas

c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior

d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza

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Dale and Slack, 1987Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir mesoderma DORSAL no ectoderma

NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP!

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Dorsal/Organizador

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5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição (proteína nuclear)

b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular

secretada

5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição (proteína nuclear)

b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular

secretada

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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do polo vegetal DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL

VegTQue elemento materno está na região dorsal ?

QUAL É A RELAÇÃO ENTRE

O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!

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(VegT)

O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de VegT e Beta-catenina

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β-catenina

VegT e outros TGF-betas

Mesoderma Dorsal

Mesoderma Ventral

Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!!E são maternais (= antes da transcrição zigótica!)

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E agora????!!!!

β-catenina

VegT e outros TGF-betas

Mesoderma Dorsal (Org)

Mesoderma Ventral

?

?

Nieuwkoop

O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o Organizador?

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β-catenina

VegT

Mesoderma Dorsal (Org)

Mesoderma Ventral

?

?

Nieuwkoop

A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição beta-catenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que codificam proteínas secretadas

Genes do Organizador

?

VegT Beta-Catenina

Nieuwkoop

Organizador

1. Ativado por VegT2. Ativado por beta-cat3. Induz Organizador

4. ZIGÓTICO!!

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Genes do

Organizador

Xnr-1/

Nodal

VegTBeta-Catenina Nieuwkoop

Organizador

1. Zigótico

2. Ativado por VegT

3. Ativado por beta-cat

4. Induz Organizador

O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que

induz a formação do Organizador no mesoderma

Xnrs são expressos zigóticamente

Transc. Zigótica1. Zigótico2. Ativado por VegT3. Ativado por beta-cat4. Induz Organizador

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

Nodal(produzido pelo C. Nieuwkoop)

Neural

VegT no pólo vegetal

Propriedades do Organizador:

1. Inicia Gastrulação 2. Participa do

Mesoderma Dorsal3. Induz formação de

tecido Nervoso a partir do Ectoderma por proteínas secretadas

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

Nodal

Neural

VegT no pólo vegetal

?

O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?

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VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP

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Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a ligação de BMP com o seu Receptor

O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como Chordin, Noggin e Follistatin.

NOGGINCHORDIN

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Development October 15, 2003 vol. 130 no. 20 4975-4988

Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo neural.

O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?

Inibidores de BMP

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SE inibição do BMP induz destino neural

BMP

Epidermal

Neural

BMP

Epidermal

Neural

ENTÃO BMP induz destino epidermal

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6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

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mRNA para receptor dominante negativo de BMP (pg) Normal

Duplicação

0 88% 0

20 52% 27%

200 7% 76%

Suzuki et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 25;91(22):10255-9.

Remoção da via de sinalização de BMP>> neural

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O potencial de cada célula é indefinido

A posição de cada célula em relação a fonte de morfógeno

é interpretada em programas de diferenciação distintos

Gradiente morfogenético

Fator Morfogenético:

Tem efeitos diferentes em doses-diferentes

Ou seja:

Gera um gradiente de resposta a partir da origem do fator

BMC Developmental Biology 2007 7:22

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EpitélioNeural

BMP

BMP4

O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio

EpitélioNeural

B M P

BMP4

O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural

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BMP

Epidermal

Neural

SE BMP induz epidermal

Epidermal

Neural

ENTÃO ausência de sinal deve favorecer a diferenciação neural

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Epidermal

Neural

ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL

Modelo de diferenciação neural por default

Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão de genes neuraisof neural markers. Evidence for the “default neural state”

Tropepe, V. et al., 2001. Neuron, 30(1), pp.65–78.

Neu

ralm

arke

rsP

lurii

pote

ncy

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

Nodal

Neural

VegT no pólo vegetal

Inibidor de BMP

Ausência de qq sinal……..

NeuralModelo de diferenciação neural por default

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E em outros modelos, é parecido?

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