impacto dos polimorfismos c677t e a1298c do gene mthfr nos
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PRISCILA QUEIROZ D´ELIA
IMPACTO DOS POLIMORFISMOS C677T E A1298C DO GENE MTHFR NOS RESULTADOS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO EM
MULHERES BRASILEIRAS
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde.
SÃO PAULO 2012
PRISCILA QUEIROZ D´ELIA
IMPACTO DOS POLIMORFISMOS C677T E A1298C DO GENE MTHFR NOS RESULTADOS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO EM
MULHERES BRASILEIRAS
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki Co-orientadora: Profª. Dra. Denise Maria Christofolini
SÃO PAULO
2012
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
D’Elia, Priscila Queiroz Impacto dos Polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR nos resultados de Fertilização In Vitro em Mulheres Brasileiras / Priscila Queiroz D’ Elia. São Paulo, 2012.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Tsutomu Aoki Co-Orientador: Denise Maria Christofolini 1. Fertilidade 2. Reprodução 3. Injeções de esperma
intraplasmáticas 4. Poliformismo genético 5. Genes BC-FCMSCSP/56-12
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Jesus Cristo, por sempre me sustentar e dar condições
de realizar meus sonhos.
Ao meu marido Eduardo, meu verdadeiro amor, companheiro, amigo e
confidente, que com todo carinho, dedicação e apoio me acompanhou em todos
os momentos. Foi sempre paciente e compreensivo e me deu todo suporte que
somente um verdadeiro homem pode dar.
A minha mãe e amiga Angela em quem me espelho como mulher por sua
garra e determinação, meu pai Dimas que sempre muito companheiro e amigo me
incentivou e torceu por minhas conquistas, meus irmãos Vanessa e Junior, super
especiais em minha vida que sempre me compreenderam e amaram dando cada
vez mais forças, aos meus cunhados Vânia e Thiago que sempre estiveram ao
meu lado me incentivando e torcendo por mais essa conquista.
A minha sogra Cecília que esteve por muitas vezes orando e intercedendo por
mim, me acolhendo sempre como uma filha, meu sogro Clóvis, meus cunhados
Alessandra e José Augusto e minha sobrinha Bianca que sempre torceram por
mim.
Aos meus amigos Cybele e Jimmy que compreenderam sempre minhas
ausências e estiveram sempre presentes quando precisei.
"...Sede fecundos, disse-lhes Ele, multiplicai-vos e enchei a terra.” Gênesis 9:1
AGRADECIMENTOS
Seria difícil expressar com palavras o quanto sou grata às pessoas que
me ajudaram na realização deste trabalho. Com certeza muitas pessoas
fazem parte desta conquista e a elas devo meu sincero agradecimento.
Agradeço primeiramente ao Rei dos Reis, Jesus, por ter me abençoado
sempre, me dando sabedoria e todas as condições de realizar mais esse
sonho em minha vida.
A Capes que financiou meus estudos na Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo durante esse tempo e acreditou em
minha vontade de ser pesquisadora. A FAPESP e CNPQ pelo incentivo a
pesquisa e estudo realizados.
A Faculdade de Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo e a
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo que me acolheram
como aluna em sua instituição de ensino.
Ao Prof. Dr. José Mendes Aldrighi, Professor Titular de Ginecologia do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo e diretor do Departamento de
Ginecologia e Obstetrícia (D.O.G.I.) da Irmandade da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo, pela oportunidade de realizar a pesquisa junto a
esse departamento.
Ao meu orientador Prof. Dr. Tsutomu Aoki, Chefe de Clínica de
Reprodução Humana no departamento de Ginecologia e Obstetrícia da
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e Professor Adjunto
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela
paciência, generosidade e profissionalismo sempre presentes e a quem tenho
profunda admiração pela força, humanismo e equilíbrio.
A Faculdade de Medicina do ABC e ao Instituto Ideia Fértil que fazem
um trabalho maravilhoso junto à população infértil, onde realizei esse estudo.
Ao Prof. Dr. Caio Parente Barbosa, Presidente do Instituto Ideia Fértil
na Faculdade de Medicina do ABC, que me acolheu em seu serviço, em um
momento que muito precisei, sendo sempre muito prestativo abrindo as portas
de seu serviço para que eu pudesse realizar essa pesquisa.
A Prof.ª Dra. Ângela Mara Bentes de Souza van Nimwegen,
Coordenadora de Ensino e Pesquisa do Instituto Ideia Fértil e Responsável
pelo Laboratório de Embriologia do Instituto Ideia Fértil pelo apoio sempre
prestados.
A minha co-orientadora Prof.ª Dra. Denise Maria Christofolini,
responsável pelo Laboratório de Citogenética da Faculdade de Medicina do
ABC - Instituto Ideia Fértil, que me ajudou imensamente com todo carinho e
compreensão sendo sempre disposta a me ajudar e a quem me espelho
como pesquisadora.
Ao Prof. Dr. Roberto Adelino de Almeida Prado, Chefe de Clínica pela
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e
Professor Assistente da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de
São Paulo pela contribuição realizada durante a qualificação e banca de
defesa desta Tese de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Thomaz Gabriel Miklos, médico especialista em
Reprodução Humana Assistida e Médico Segundo Assistente do
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Irmandade da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo, pela participação e contribuição em banca de
qualificação e defesa desta Tese de Doutorado.
A Prof.ª Dra. Fabia Lima Vilarino, Pesquisadora da Faculdade de
Medicina do ABC, Médica preceptora do Hospital Estadual de Santo André e
do Centro de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina do ABC, pela
gentileza de participar e contribuir durante a qualificação e defesa desta Tese
de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Izzo, Médico Assistente do Centro de
Reprodução Humana Governador Mário Covas do Hospital das Clínicas da
FMUSP, Diretor da Originare - Centro de Reprodução Humana, pela
disponibilidade e contribuição na participação da banca de defesa desta Tese
de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Newton Eduardo Busso, Professor Assistente da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Professor
Segundo Assistente da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São
Paulo, pela gentileza em contribuir com sua participação como suplente na
defesa desta Tese de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Artur Dzik, Presidente da Sociedade Brasileira de
Reprodução Humana (SBRH) pelo apoio prestado através da participação
como suplente na defesa desta Tese de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Vilmar Marques de Oliveira, Médico Segundo Assistente
na Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e Professor
Instrutor da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por
aceitar participar como suplente na defesa desta Tese de Doutorado.
Ao Prof. Dr. Gilberto da Costa Freitas, Médico assistente da divisão de
reprodução humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher Nutrição
Alimentação e Desenvolvimento e médico da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, pela participação como suplente na defesa desta
Tese de Doutorado.
As minhas colegas de trabalho e a equipe que estiveram sempre
comigo e que participaram ativamente na coleta das amostras e realização
dos exames necessários para o trabalho: Ana Paula, Luciana, Juliana,
Caroline Lopes, Caroline Zulim e Aline.
A Equipe de Enfermagem e Equipe do Departamento de Genética que
sempre contribuíram direta ou indiretamente para essa pesquisa.
As pacientes que contribuíram muito para esse trabalho autorizando a
avaliação dos dados de seu tratamento.
A Equipe da Secretaria de Pós Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo, em especial a Mirtes que sempre
muito solicita me ajudou nos tramites burocráticos da pós-graduação.
A minha amiga Débora Rodrigues Lopes que me ajudou em um
momento em que precisei me dando oportunidade de conhecer o Instituto
Ideia Fértil.
De todo meu coração, agradeço todas as pessoas que contribuíram
direta ou indiretamente para realização deste trabalho, e que Deus abençoe
sempre suas vidas.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ATP – Trifosfato de Adenosina
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
FF – Fluído Folicular
FSHr – FSH recombinante
ICSI – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides
ISCA – Infertilidade Sem Causa Aparente
Mg - Miligramas
MI – Metáfase I
MII – Metáfase II
min – Minuto
mL – Mililitro
mM – milimolar
MTHFR – Metilenotetrahidrofolato redutase
NF - Não Fertilizado
ng – nanograma
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase
PI - Prófase
PN – Pró-núcleo
RHA – Reprodução Humana Assistida
RNA – Ácido ribonucleico
rpm – rotação por minuto
SAH – S-adenosilhomocisteína
SAM – S-adenosilmetionina
SOP – Síndrome dos Ovários Policísticos
μL – microlitro
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO..................................................................................pg 01
1.1 Infertilidade ................................................................................ pg 01
1.2 Reprodução Humana Assistida...................................................pg 03
1.3 Importância do Folato................................................................. pg 05
1.4 O Gene MTHFR e os polimorfismos 677 e 1298 .......................pg 08
1.5 O Folato e a Fertilidade.............................................................. pg 13
2.OBJETIVO.........................................................................................pg 17
3.CASUÍSTICA E MÉTODOS..............................................................pg 18
3.1 Pacientes.................................................................................... pg 18
3.2 Métodos.......................................................................................pg 19
3.2.1 Coleta de história e exame físico....................................... pg 19
3.2.2 Método de indução folicular................................................pg 19
3.2.3 Oócitos, seleção embrionária e transferência embrionária.pg 20
3.2.4 Diagnóstico e evolução das gestações...............................pg 21
3.2.5 Coleta de sangue................................................................pg 21
3.2.6 Extração de DNA.................................................................pg 21
3.2.7 Genotipagem.......................................................................pg 22
3.2.8 Análise estatítica.................................................................pg 23
4.RESULTADOS..................................................................................pg 24
5.DISCUSSÃO.....................................................................................pg 55
6.CONCLUSÕES.................................................................................pg 65
7.ANEXOS...........................................................................................pg 66
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................pg 78
FONTES CONSULTADAS...................................................................pg 90
RESUMO..............................................................................................pg 91
ABSTRACT..........................................................................................pg 92
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Infertilidade
A infertilidade é definida como a ausência de gestação espontânea, após
doze meses ou mais de atividade sexual regular e ausência de métodos
contraceptivos (ASRM, 2008). A inabilidade de procriar é frequentemente
considerada uma tragédia tanto pessoal como para o casal, impactando em
grande parte das vezes sobre a família e até mesmo em pessoas que convivem
com o casal (Bergstrom, 1992). Estimativas globais sugerem que cerca de 72,4
milhões de casais em idade fértil apresentam problemas de infertilidade e que em
aproximadamente 30% dos casos a causa de infertilidade está relacionada a
fatores femininos, em 30% a fatores masculinos, em 30% ambos os fatores estão
presentes e em 10% não apresentam causa aparente (Vigano et al., 2004;
Renner et al., 2006; Boivin et al., 2007). A infertilidade pode apresentar-se de
maneira primária ou secundária, sendo que casais com infertilidade primária são
aqueles que nunca conseguiram engravidar, enquanto que casais com
infertilidade secundária possuem dificuldades em conceber após gestação
anterior, seja esta por gestação a termo ou aborto (WHO, 1991).
Dentre as causas de infertilidade conhecidas, a idade da mulher é uma
das questões mais importantes a ser abordada. Sabe-se que a fertilidade
feminina parece decrescer com o passar dos anos, tendo um declínio aos 30
anos, acentuando-se aos 35 anos e quase desaparecendo aos 45 anos (West,
1987). Além disso, torna-se necessário a abordagem de alguns fatores
importantes como a frequência e tempo entre as relações sexuais, uso de
lubrificantes ou outros produtos que podem prejudicar a fertilidade (Wilcox et al.,
2
1995; Kutteh et al., 1996; Stanford et al., 2002). O tempo de infertilidade e o
histórico de fertilidade do casal e para cada parceiro individualmente também
precisam ser abordados, pois podem afetar o prognóstico e ajudam a determinar
a etiologia da infertilidade (Hull et al., 1985; WHO, 1993).
Além da idade, outras causas podem estar relacionadas à infertilidade
feminina como a obstrução ou ausência das tubas uterinas devido a processos
infecciosos e inflamatórios e a presença de fatores uterinos, destacando-se as
malformações mullerianas, miomas, pólipos, sinéquias e endometrites. Outros
fatores como o fator ovariano devido à síndrome dos ovários policísticos (SOP),
falência ovariana precoce e presença de cistos; alterações decorrentes do
comprometimento anatômico ou funcional do eixo hipotalâmico-hipofisário-
ovariano associado a distúrbios das glândulas anexas (tireoide ou adrenais),
podem ser encontrados (Hull et al., 1985; ASRM, 2004; WHO, 1993; Adamson,
Baker, 2003; Jensen et al., 1998). Do mesmo modo, uma doença que tem um
importante impacto sobre a fertilidade feminina é a endometriose. A
endometriose é uma doença estrogênio-dependente que se caracteriza pela
presença de estroma e/ou epitélio glandular fora da cavidade uterina, e pode
causar algia pélvica e infertilidade (Jubanyik et al., 1997; Vilarino et al., 2011).
No que diz respeito às causas masculinas de infertilidade, qualquer
condição que possa prejudicar a quantidade ou qualidade espermática pode
relacionar-se a fatores de infertilidade masculina. As causas de infertilidade
masculina mais comumente identificadas são: a insuficiência ou disfunção
testicular, também referida como hipogonadismo primário e a disfunção
hipotalâmica-pituitária, também referida como hipogonadismo secundário, uma
condição que afeta o transporte de espermatozoide, porém identificadas com
3
menos frequência (De Kretser, 1997). Alguns outros fatores também podem
levar a alterações seminais como, por exemplo, a varicocele, definida como a
dilatação das veias do plexo pampiniforme, sendo mais frequente do lado
esquerdo devido à disposição anatômica da veia espermática; infecções
geniturinárias por Chlamydia trachomatis e Ureaplasma urealyticum, assim como
a idade, uso de medicamentos, doenças sistêmicas ou genéticas (WHO, 1993;
De Kretser, 1997; WHO, 1999; Jarow, 1994; ASRM, 2004). Importantes detalhes
da anamnese, exames físicos e laboratoriais na avaliação do parceiro masculino
são importantes a fim de avaliar os parâmetros seminais (WHO, 1999).
No entanto, quando após a avaliação detalhada do casal observa-se
condições clínicas e laboratoriais normais em ambos os parceiros classifica-se o
casal como portador de Infertilidade Sem Causa Aparente (ISCA) (ASRM, 2006).
1.2 Reprodução Humana Assistida
Nos últimos anos as técnicas de Reprodução Humana Assistida (RHA) têm
ajudado inúmeros casais inférteis a terem filhos. Desde o nascimento do
primeiro bebê de proveta, Louise Brown em 1978 na Inglaterra, grandes avanços
foram realizados nas técnicas de RHA melhorando significativamente as taxas
de sucesso dos procedimentos (Allen, Reardon, 2005). A fertilização assistida é
definida como um conjunto de técnicas de manipulação de gametas que tem
como objetivo facilitar o encontro do espermatozoide com o óvulo a fim de que
ocorra a fertilização (Myers et al., 2008). As duas principais técnicas utilizadas
atualmente são a fertilização in vitro clássica (FIV clássica) em que após o
preparo seminal ocorre a incubação de espermatozoides pós preparo com o
óvulo ou a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI), em que ocorre
4
a injeção direta de um espermatozoide no óvulo, sob visualização em
microscópio óptico invertido (Myers et al., 2008) (Figura 1).
Previamente à utilização das técnicas laboratoriais de RHA é necessária a
realização de alguns procedimentos como a estimulação ovariana controlada, o
preparo seminal para a separação de espermatozoides e a aspiração folicular.
Para a escolha das diferentes técnicas de reprodução humana assistida, devem
ser consideradas algumas variáveis como: a idade da paciente, o histórico de
infertilidade do casal, o número de gametas disponíveis, o número de embriões
passiveis de transferência, e as condições laboratoriais do serviço (Franco Jr.,
Marinho, 1994).
Fatores ambientais e estilos de vida podem trazer implicações na
subfertilidade, e a nutrição é dentre eles um fator significativo. A nutrição é
importante para a síntese de DNA, importante no desenvolvimento de oócitos e
espermatozoides, e diversas enzimas envolvidas nessa síntese são
dependentes de vitaminas como, por exemplo, a vitamina B (Berker et al., 2009).
A B
Figura 1. A – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI),
B - Fertilização in vitro clássica (FIV), (Acervo Pessoal).
5
1.3 A Importância do Folato
O folato é uma importante vitamina do complexo B e está envolvido em
inúmeros processos fisiológicos e patológicos, incluindo a reprodução (Tamura,
Picciano, 2006). Os folatos constituem um grupo de compostos heterocíclicos ao
qual o ácido pteróico está conjugado com um ou diversos resíduos de ácido L-
glutâmico. Em geral, os termos folato e ácido fólico são considerados sinônimos.
(Lucock et al., 2002).
O ácido fólico (2-amino-4-hidroxi-6-metilenoaminobenzol-L-glutâmico)
(Figura 2), também conhecido como ácido pteroilglutâmico, é a forma mais
estável de folato e é considerada uma vitamina apresentando ação de coenzima,
responsável pelo transporte de unidades químicas de carbono simples (Franco,
Mahan, apud Upia, 2009).
Ácido Fólico
Figura 2– Estrutura química do ácido fólico (Fonte: Sackheim and Lehman, 2001)
2-amino-4-hidroxi-6-
metil-pteridina Ac. P-aminobenzoico Ac. L-glutâmico
6
Sabe-se que o folato é um cofator fundamental envolvido em dois processos
fisiológicos principais: a) metilação de ácidos nucléicos, proteínas e lipídios, que
atuam no controle e estão associados à expressão gênica e manutenção da
estabilidade genômica; b) síntese de purinas e pirimidinas, necessárias a
síntese e reparo do DNA (Jacques et al., 2001).
Nesses processos fisiológicos, a enzima metilenotetrahidrofolato
desidrogenase 1 (MTHFD1) catalisa a conversão de tetrahidrofolato (THF)
para os derivados correspondentes 10-formil, 5,10-metinil e 5,10-
metilenotetrahidrofolato (Hum et al., 1988). A enzima Metilenotetrahidrofolato
redutase (MTHFR), catalisa a conversão do 5,10-metilenotetrahidrofolato para 5-
metilenotetrahidrofolato (5-MTHFR), a principal forma de folato circulante, que
apresenta função de doador de grupos metil para a remetilação da homocisteína
em metionina. Essa reação de metilação é realizada através da catalisação da
enzima metionina sintase (MTR), que requer a cobalamina (vitamina B12) como
cofator e resulta na formação de S-adenosilmetionina (SAM) (Finkelstein et al.,
2000; Pavarino et al., 2005), a qual é retirada o radical metil transformando-se
em S-adenosilhomocisteína (SAH) e posteriormente hidrolisada para adenosina
e homocisteína (Lucock et al., 2002) As elevações de homocisteína
intracelulares podem levar a uma diminuição de SAM e conseqüente aumento
de S-adenosilhomocisteína (SAH) que está associada com inibição de DNA-
metiltransferases e hipometilação do DNA (Balaghi,Wagner, 1993; De Cabo et
al., 1994; Melnyk et al., 2000) (Figura 3).
7
Figura 3. Ciclo dos folatos (Crott et al., 2001).
A deficiência de folatos pode ser determinada geneticamente ou pela dieta,
podendo comprometer a função dessas vias metabólicas, conduzindo a um
acúmulo de homocisteína (Jacques et al., 2001).
A deficiência de ácido fólico além de estar relacionada ao desenvolvimento ou
aumento de certos tipos de câncer, vem sendo também referida a patologias
associadas a tecidos de alta renovação, que dependem do suprimento de folato
para a correta composição e duplicação do DNA (Baluz et al., 2002). Nos últimos
anos, inúmeras evidências indicam que mesmo concentrações moderadamente
elevadas de homocisteína sérica podem estar associadas a um risco aumentado
diversas doenças como a aterosclerose, tromboembolismo, doenças
neurodegenerativas e também com as primeiras ocorrências de doenças em
neonatais (Herrmann, 2001; Gueant et al., 2003). Essa última categoria inclui uma
série de anomalias no desenvolvimento fetal, particularmente defeitos do tubo
neural, bem como complicações na gravidez tardia, como a pré-eclâmpsia,
descolamento prematuro de placenta, retardo no crescimento intrauterino, parto
prematuro e até mesmo morte fetal intrauterina (Eskes, 2000; Nelen, 2001;
Hague, 2003; Steegers-Theunissen et al., 2004; Tamura, Picciano, 2006).
DNA+Proteína
Metilação
Metionina
Homocisteína
Cisteína
Síntese
Metionina
Vitamina B12
5-metil THF
5,10-Metileno THF
DNA Síntese &
Reparo
8
Assim, o folato é indispensável durante períodos de crescimento e
proliferação celular rápida, que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e
folicular. A ingestão insuficiente de folato demonstrou prejudicar também a
fertilidade em modelos animais causando também abortos espontâneos, defeitos
congênitos e outros efeitos adversos na gravidez em humanos (Mohanty, Das,
1982; Mooij et al., 1992; Willmott et al., 1968; George et al., 2002). Além disso, a
deficiência de folato pode ainda aumentar a incorporação inadequada de
monofosfato de desoxiuridina pelo DNA, perturbando sua integridade e
diminuindo a replicação e provocando a apoptose e necrose das células lesadas
(Blount et al., 1997; Duthie, Hawdon, 1998; Huang et al., 1999; Koury et al., 2000;
Courtemanche et al., 2004; Kimura et al., 2004).
1.4 O Gene MTHFR e os polimorfismos 677 e 1298
A enzima MTHFR é codificada pelo gene Metilenotetrahidrofolato redutase
(MTHFR). O gene MTHFR é constituído por 11 éxons e está localizado no braço
curto do cromossomo 1 especificamente na região de posição 1p36.3 (Goyette et
al., 1998) (Figura 4).
Figura 4. Localização do Gene MTHFR (Genetics Home Reference, 2012).
9
Inúmeras variações têm sido identificadas em genes envolvidos na
absorção do folato e nos mediadores de seu metabolismo, entre eles alguns
polimorfismos do gene MTHFR. Estes polimorfismos podem alterar o efeito
benéfico dos folatos e outras vitaminas B que apresentam um papel importante no
metabolismo dos grupos metil, e mudar o fluxo entre os co-fatores do folato, a
síntese de DNA e as reações de metilação (Narayanan et al., 2004, Pavarino-
Bertelli et al., 2004; Shy et al., 2005) (Figura 5).
Figura 5. Reações metabólicas relacionadas à degradação de homocisteína e
influência do gene MTHFR (Fonte: O Autor).
DIETA
Ac.Fólico
Tetrahidrofolato N5,N10
metilenotetrahidrofolato MTHFR (enzima)
N5,N10 metilenotetrahidrofolato
redutase
N5 metil-tetrahidrofolato
Doação Radical
Metil
Vitamina B6 + Cistationa β
Sintase
Ação Vitamina B12
METIONINA
HOMOCISTEÍNA CISTATIONA
CISTEÍNA
Metionina Sintase
GENE MTHFR
Gene Codificador/ Regulador da enzima
MTHFR
10
Polimorfismo é definido como a presença da variabilidade genética de um
determinado loco gênico que ocorre em uma população, em que os alelos
apresentem frequências maiores do que 1 %. Os polimorfismos podem acarretar
em aumento, diminuição ou perda de função das enzimas relacionadas ao gene,
e consequentemente, podem ser a causa direta de uma anormalidade fenotípica,
resultando em um aumento na susceptibilidade a uma doença, com ocorrência
também de maneira silenciosa (Strachan, Read, apud Upia, 2009).
O envolvimento do gene MTHFR com doenças foi publicado pela primeira
vez em 1972, através da identificação de um paciente com homocisteinúria devido
a uma deficiência grave da enzima (Mudd et al., 1972). Este tipo de deficiência da
enzima MTHFR, é um erro inato do metabolismo do folato e é relativamente raro.
Em 1988, uma variante termolábil do gene MTHFR foi identificada através
de ensaios enzimáticos de extratos de linfócitos de pacientes com doença
cardiovascular (Kang et al., 1988). Esta deficiência mais suave pareceu ser mais
comum, e resultou em uma ligeira a moderada elevação da homocisteína total
plasmática, um fator de risco para a doença cardiovascular. As relações, entre as
deficiências graves e leves eram pouco claras, particularmente desde que a
variante termolábil do gene MTHFR também tinha sido observada em algumas
famílias com a homocisteínuria. Naquela época, as investigações da deficiência
da MTHFR foram limitadas aos laboratórios com experiência em bioquímica e
metodologias em genética. (Kang et al., 1991).
Outro estudo, realizado em 1993 através da utilização de oligonucleotídeos
degenerados conseguiu isolar uma sequência de 90 pares de bases do fígado de
suínos. Esta sequência foi comparada com uma biblioteca genômica de fígado
humano, utilizando-se a técnica de fluorescência de hibridização in situ, que
11
demonstrou forte homologia com o gene MTHFR (Goyette, apud Angelita, 2004).
O isolamento do DNA em 1994 abriu caminhos para as abordagens genéticas
moleculares a fim de estudar o gene da MTHFR e suas deficiências (Goyette et
al., 1994). O isolamento de DNA foi rapidamente seguido da identificação de uma
de suas variantes.
Atualmente, sabe-se que a deficiência grave da enzima MTHFR e prejuízos
no metabolismo de folato é rara com aproximadamente 50 casos relatados no
mundo todo, resultando em hiperhomocisteínemia, homocisteinuria e
hipometilação do DNA. Os pacientes que possuem essa deficiência apresentam
retardo em seu desenvolvimento, doença de oclusão vascular, tromboembolismo
e sitomas neurológicos (Rosenblatt, 1995; Green, Miller, 1999; Rosenblatt,
Whitehead, 1999). Entretanto, muito mais comum é a deficiência suave da enzima
MTHFR devida à síntese de uma variante termolábil causando sua redução
catalítica (Schneider et al, 1998).
A primeira mutação identificada no gene MTHFR foi descrita na posição
nucleotídica 677 (éxon 4), onde ocorre uma mutação do tipo substituição de ponto
de Citosina por Timina (Frosst et al., 1995) ocasionando a mudança do
aminoácido alanina para valina dentro do domínio catalítico N-terminal da enzima
(Frosst et al., 1995; Rozen et al., 1996; van der Put et al., 1998). A atividade
específica da enzima MTHFR é reduzida em 35% na presença de heterozigose,
genótipo 677CT, e em 70% em homozigose, genótipo 677TT em relação ao
genótipo normal 677CC (Wainfan, Poirier, 1992; Balaghi, Wagner, 1993; De Cabo
et al.,1994).
Outra mutação identificada nesse gene é substituição de ponto de Adenina
por Citosina, na posição nucleotídica 1298 (éxon 7). Esta mudança leva a
12
substituição do aminoácido glutamato por alanina na proteína (van der Put et al.,
1998). Diferentemente da mutação MTHFR C677T, a mutação MTHFR A1298C
localiza-se no domínio que regula a enzima MTHFR (van der Put et al.,1998;
Weisberg et al., 1998). Esta mutação, tanto no seu estado homozigoto mutante
(CC) ou heterozigótico (AC), parece não ocasionar elevações do nível da
homocisteína plasmática. Entretanto, a combinação em heterozigose de ambas
as mutações (duplo heterozigoto), C677T e A1298C, produzem um genótipo
677CT/1298AC que resulta na elevação significativa do nível da homocisteína
plasmática (van der Put et al., 1998; Weisberg et al., 1998; Weisberg et al., 2001).
O polimorfismo C677T do gene MTHFR pode representar um importante fator
de risco genético para doenças vasculares. Homozigotos com genótipo TT podem
apresentar risco três vezes maior de evoluir para uma doença cardiovascular
(Kluijtman et al.,1996). Além disso, existem vários estudos demonstrando a
ligação entre os polimorfismos do gene MTHFR com o fechamento do tubo
neural, o qual se apresenta como uma malformação congênita grave, ocorrendo
devido às falhas de união da linha média do tubo neural (Sttegers, Mills, apud
Angelita, 2004). Alguns estudos observaram uma redução de três vezes em
relação ao risco de ALL (Leucemia Linfocítica Aguda) em indivíduos heterozigotos
(AC) para mutação MTHFR A1298C e um risco quatorze vezes menor naqueles
que apresentavam o genótipo CC (MTHFR A1298C) (Skibola et al.,1999). Outras
publicações associaram o polimorfismo do gene MTHFR, em mães de crianças
com a síndrome de Down (Hassold et al., 2001).
A frequência desses polimorfismos em diversas populações tem sido
amplamente estudada. Alguns estudos avaliaram a frequência do alelo T em
diferentes etnias e diferentes regiões geográficas e observaram que, em negros,
13
da região da África Subsaariana, o genótipo (677TT) não foi identificado,
sugerindo que a frequência do alelo T é menos comum nessa população que em
outros grupos étnicos. Resultados semelhantes também foram descritos entre
negros que vivem em países fora da África, como por exemplo, Brasil e Estados
Unidos, apresentando frequência do alelo de 1 a 2% nesses povos (Botto et al.,
2005). Outro estudo demonstrou frequência de 10% do alelo T entre os
descendentes europeus, 1,45% entre negros e de 1,2% entre pessoas de
populações indígenas (Arruda et al., 1998).
Quanto à distribuição do polimorfismo 1298, mais especificamente do alelo
C, alguns trabalhos relataram que 4% das populações caucasiana e hispânica e
10% da população canadense eram compostos por indivíduos homozigotos,
enquanto, 42% dos caucasianos e 38% dos hispânicos corresponderam a
indivíduos heterozigotos (Peng et al., 2001; Weisberg et al., 1998). Do mesmo
modo, um estudo realizado em diferentes populações do mundo, demonstrou
frequências gênicas que variavam desde 4% no Senegal a 50% na Namíbia,
sendo encontrado, ainda taxa de 23% em brasileiros (Shi et al., 2003).
1.5 O Folato e a Fertilidade
No que diz respeito às funções reprodutivas, a falta do folato e consequente
acúmulo de homocisteína provocam a deficiência de divisão celular e produção de
citocinas inflamatórias, além de alterações no metabolismo do óxido nítrico,
aumento do estresse oxidativo, elevadas taxas de apoptose e alterações nas
reações de metilação (Gmyrek et al., 2005; Thaler et al., 2003; Agarwal et al.,
2005; Hussein et al., 2005; Forges et al., 2007).
14
Sabe-se que a hiperhomocisteinemia pode afetar diversos processos
reprodutivos em diferentes níveis tanto na fertilidade masculina quanto na
feminina. Nos homens são comuns casos de anormalidades na morfologia
espermática, baixa concentração e perda da motilidade dos espermatozoides
(Steegers-Theunissen et al., 1993; Ebisch et al, 2006).
Em relação à fertilidade feminina, a ligação entre o ácido fólico e as funções
ovarianas já havia sido observada desde 1982 em estudos com macacos Rhesus
demonstrando que uma dieta restritiva de folato traz como consequência ciclos
menstruais irregulares, além de decréscimos progressivos nas concentrações
séricas de estradiol e progesterona quando comparados a animais submetidos a
dietas normais. Biópsias nos ovários desses animais demonstraram degeneração
dos folículos de Graaf, aumento de folículos atrésicos e císticos, além da
diminuição das células da granulosa e redução ou até ausência de corpo-lúteo
(Mohanty et al., 1982).
Sabe-se que os oócitos de mamíferos antes e após a ovulação são
envolvidos por uma massa de células encaixadas em uma matriz extracelular
conhecida como cumullus oophorus. No ovário previamente à ovulação, a
secreção das células do cumullus e das células da granulosa que estão
intimamente relacionadas é acumulada internamente ao antro folicular (Ball et al.,
1982; Salustri et al., 1999). Essa secreção denominada fluido folicular (FF) provê
o microambiente necessário para desenvolvimento do oócito e contêm muitas
substâncias envolvidas na maturação oocitária, fertilização e possivelmente
desenvolvimento do embrião (Schweigert et al., 2006). Assim, a composição do
FF reflete as fases de desenvolvimento do oócito e o grau de maturação folicular
(Eppig et al., 2005; Sugiura et al., 2005).
15
As alterações nesse microambiente folicular podem acarretar em disfunção
ovulatória, má qualidade do oócitária, baixa qualidade embrionária, redução nas
taxas de fertilização e implantação (Pellicer et al., 2000; Garrido et al., 2003). A
presença de folato e homocisteína no FF já foram previamente demonstradas e
inicialmente observou-se que baixas concentrações de homocisteína no fluído
folicular teriam sido relacionadas com um alto grau de maturação oocitária
(Steegers-Theunissen et al., 1993; Szymanski et al. , 2003).
Entretanto, mais recentemente, uma associação inversamente significativa
foi realizada entre as concentrações de homocisteína no fluído folicular e na
qualidade embrionária em mulheres submetidas a ciclos de reprodução assistida
através da utilização de técnicas como FIV clássica ou ICSI (Ebisch et al., 2006).
Dessa maneira, a deficiência primária de folato resultando em um aumento da
concentração total de homocisteína pode ser decisiva na qualidade de oócitos,
subsequentemente da fertilização, implantação, desenvolvimento embrionário e
fetal (Hague et al., 2003; Steegers-Theunissen et al., 2003; Ebisch et al., 2007).
Nos últimos anos, alguns estudos têm sido realizados a fim de avaliar a
presença de polimorfismos do gene MTHFR e a fertilidade. Recentemente
avaliou-se o líquido folicular e as células da granulosa de pacientes submetidas à
estimulação ovariana e verificaram a relação entre a presença do alelo T do
polimorfismo 677 do gene MTHFR e a síntese de estradiol, observando um
decréscimo dos níveis de estradiol do fluido folicular e das células da granulosa
em indivíduos portadores do genótipo TT, sugerindo que a mutação afeta a
produção de estrógeno por folículos terciários. Esse mesmo estudo demonstrou
também que pacientes apresentando genótipo 677T obtiveram menor
recuperação oocitária (Hecht et al., 2009). Outro estudo ainda avaliou as
16
implicações dos polimorfismos C677T e A1298C na fertilidade humana e
concluíram que esses polimorfismos podem trazer reais implicações nas taxas de
fetos não viáveis com taxas de 4-7%, apresentando um papel significativo na
fertilidade (Reyes-Engel et al., 2002).
Assim, faremos um estudo com o objetivo de verificar o impacto entre os
polimorfismos do gene MTHFR (C677T, A1298C) sobre os diversos resultados
obtidos no laboratório de fertilização in vitro em mulheres brasileiras que buscam
auxílio das técnicas de fertilização assistida.
17
2. OBJETIVO
Verificar o impacto entre a presença do alelo mutado dos polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR nos resultados observados de fertilização in
vitro de mulheres brasileiras submetidas às técnicas de reprodução humana
assistida.
18
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 Pacientes
Nesse estudo prospectivo foram triadas 146 mulheres submetidas à
procedimentos de reprodução assistida no Serviço de Reprodução Humana da
Faculdade de Medicina do ABC – Instituto Ideia Fértil, entre Outubro de 2010 a
Fevereiro de 2012.
Os critérios utilizados para a inclusão das pacientes no estudo foram:
- Indicações de fertilização assistida que não apresentasse influência sobre a
resposta ovariana como: soro discordância, falha de implantação, endometriose
graus I e II, fator tubáreo, infertilidade sem causa aparente (ISCA) e Fator
Masculino;
- Apresentar níveis hormonais séricos dentro dos parâmetros de normalidade,
considerando os níveis de FSH até 10mUI/mL e de Prolactina até 25 pg/mL;
- Idade até 37 anos.
Durante a triagem dos casais, foi realizada investigação padrão para casais
inférteis: testes sorológicos, perfil hormonal e bioquímico, teste para doenças
sexualmente transmissíveis, exames de imagem, análise seminal,
histerossalpingografia, histeroscopia e laparoscopia. Todas as pacientes
receberam orientação para suplementação com ácido fólico no início da
estimulação ovariana controlada.
Os dados clínicos e as amostras de sangue periférico foram colhidos somente
após exposição dos objetivos do estudo e assinatura do Termo de Consentimento
Informado aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina
do ABC, número do processo 097/2010.
19
Foram excluídas desse estudo pacientes que não se enquadravam nos
critérios de inclusão ou aquelas que não aceitaram assinar o termo de
consentimento informado.
3.2 Métodos
3.2.1 Coleta de história e exame físico
Na admissão das pacientes foram colhidos dados de sua história clínica e
realizado exame físico completo. Para homogeneização da amostra foram
observados nessas pacientes: Idade, peso, altura, história de tabagismo,
concentrações de FSH, prolactina e TSH. Além disso, após a fertilização foram
avaliados parâmetros como número e grau de maturidade dos oócitos (prófase I,
metáfase I, metáfase II), taxas de fertilização normal, número e qualidade dos
embriões e taxa de gravidez.
3.2.2 Método de Indução folicular
A indução folicular foi realizada através de estimulação com FSHr
(Folitrofina, Puregon®, 100 UI) a partir do segundo dia da menstruação,
administrados entre 8 e 14 dias. Quando os folículos da paciente atingiram o
tamanho adequado (14 mm), determinado por ultrassonografia transvaginal,
administrou-se o antagonista (Acetato de Ganirelix, Orgalutran®).
Aproximadamente entre o 10º e 11º dia, momento em que os folículos
apresentavam diâmetro de aproximadamente 18mm, administrava-se à paciente
uma dose de gonadotrofina coriônica (HCG-Ovidrel®, 250 µg) e após 36 horas
20
realizava-se a aspiração folicular (sob sedação com propofol) para obtenção dos
oócitos.
3.2.3 Oócitos, seleção dos embriões e transferência embrionária
De acordo com o grau de maturação nuclear, os oócitos foram classificados
em maduros = Metáfase II (MII) e imaturos = Metáfase I (MI) ou Prófase (PI). Para
a realização do procedimento de ICSI, foram utilizados somente oócitos em
estágio de MII. Após a ICSI, foi observada a fertilização através da identificação
da presença de formação de dois pró-núcleos (PN) cerca de 16 a 18 horas após o
procedimento, através de microscópio invertido com objetiva de 40 vezes. A
fertilização foi classificada como normal (2PN) ou anormal (3PN, 4PN, vários PN).
Quando não houve fertilização os oócitos injetados foram classificados como não
fertilizados (NF). Embriões com menos de 20% de fragmentação e número de
células adequado para o dia da transferência foram considerados de boa
qualidade (Veek,1999).
Conforme normatização do Conselho Federal de Medicina (CFM) de 15 de
dezembro de 2010 foram transferidos no máximo dois embriões para pacientes
com idade abaixo de 35 anos e no máximo três embriões para pacientes com
idade acima de 35 anos. A transferência foi realizada no terceiro ou quinto dia
após a fertilização, e o suporte da fase lútea foi feita com progesterona via vaginal
na dose de 200 mg três vezes ao dia iniciando-se no dia seguinte a punção
ovariana.
21
3.2.4 Diagnóstico e evolução das gestações
As gestações foram confirmadas através da dosagem sérica da fração beta do
hCG (βhCG) no 12º dia após a transferência embrionária. A gestação clínica foi
considerada, quando identificado saco gestacional intrauterino ao exame de
ultrassonografia transvaginal a partir da quinta ou sexta semana de gestação.
3.2.5 Coleta de sangue
Foram colhidos 15 mL de sangue periférico a partir de venopunções
periféricas para análise do DNA genômico. Após a coleta o tubo destinado à
análise foi armazenado a -80ºC até o momento da extração do DNA.
3.2.6 Extração de DNA
A extração e análise do DNA foram realizadas no Laboratório de Genética e
Biologia Molecular do Centro de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina
do ABC.
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo de Lahiri e Nurnberger (1991).
De acordo com este protocolo cerca de 4 mL de sangue periférico coletados
foram transferidos para um tubo cônico de vidro (Corex) de 15 mL e centrifugados
por 8 minutos a 8000 rpm. O plasma foi então desprezado com pipeta Pasteur e,
ao pellet celular foram adicionados 9 mL de solução TM1 (TM1 solução mãe:
10mM Tris-HCl pH 7,6; 10mM MgCl2; 2 mM EDTA diluídos em solução de Triton
2,75% 1:9 (V:V) para solução de uso). A solução foi homogeneizada várias vezes
com pipeta Pasteur e então centrifugada por 8 minutos a 8000 rpm.
O sobrenadante foi então descartado e ao pellet adicionado 8,5 mL de TM1,
homogeneizado com pipeta Pasteur e em seguida, centrifugado novamente por 8
22
minutos a 8000 rpm. O procedimento foi repetido até que o pellet estivesse
límpido e isento de hemoglobina.
Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet e ressuspendido em
1,6mL de TM2 (10mM Tris-HCl; 10mM KCl; 10mM MgCl2; 2mM EDTA; 0,4M NaCl;
completando-se para 100mL com água). À suspensão foi adicionado 160μL de
SDS 10%, misturada vigorosamente e incubada em banho-maria por 15 minutos a
56ºC.
Adicionou-se 480 μL de NaCl gelado e homogeneizou-se cuidadosamente.
O conteúdo do tubo foi então transferido para 2 tubos tipo eppendorf e
centrifugado por 5 minutos a 12000 rpm. Ao final deste procedimento, o
sobrenadante foi cuidadosamente retirado e colocado em tubo Corex de 15 mL
limpo. Adicionou-se 10 mL de etanol absoluto gelado e o tubo foi invertido para
precipitação do DNA.
Após visualização do DNA precipitado, este foi retirado com o auxílio de
uma pipeta e transferido para um tubo tipo eppendorf contendo 250 μL de água
autoclavada. O DNA foi então mantido a 37ºC em banho-maria overnight e
conservado a 4ºC até a utilização.
3.2.7 Genotipagem
A detecção dos polimorfismos do gene MTHFR foi realizada usando o
sistema TaqMan para PCR em tempo real, utilizando o equipamento Rotor-Gene
Q 6 plex (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Os primers e sondas Taqman para os
polimorfismos estudados estão disponíveis comercialmente pela Applied
Biosystems® (Foster City, CA, USA), conforme descrito na Tab.1, abaixo. Os
ensaios foram realizados com Taqman Universal Master Mix (Applied
23
Biosystems) com 50 ng de DNA por reação. As condições de PCR foram
realizadas de acordo com o fabricante: 50 ciclos de desnaturação a 95°C (15
sec), anelamento/extensão a 60°C (1 min).
Tabela 1. Polimorfismos do gene MTHFR e respectivos ensaios TaqMan.
3.2.8 Análise estatística
Tendo em vista a não normalidade dos dados (teste de Shapiro-Wilk, p<0,05)
optou-se por apresentá-los com base em valores de mediana, percentil 25 e 75.
Para comparar as variáveis quantitativas em relação a presença ou não do alelo
mutado para o polimosfismo 677 e 1298 (0 = não tem alelo mutado; 1 = tem alelo
mutado) utilizou-se teste de Mann-Whitney. Para a avaliação segundo presença
do alelo mutado nos dois polimorfismos (0 = sem alelo mutado; 1 = pelo menos
um alelo mutado em um dos polimorfismos; 2 = os dois alelos mutado), utilizou-
se teste de Kruskal-Wallis. A associação dos genótipos com variáveis qualitativas
foi realizada através da utilização do teste do qui-quadrado. O software
estatístico utilizado foi o Stata 11.0.
Gene Polimorfismo Rs Ensaio TaqMan
MTHFR C677T rs1801133 C___1202883_20
A1298C rs1801131 C____850486_20
24
4. RESULTADOS
No presente estudo, as análises dos polimorfismos 677 e 1298 do gene
MTHFR foram realizadas em 146 pacientes submetidas a ciclos de reprodução
humana assistida. Para a análise estatística dos dados separamos as pacientes
em dois grupos: normal (sem presença de mutação em nenhum dos alelos) e
mutado (presença de mutação em pelo menos um dos alelos).
Ao avaliarmos os dados referentes ao polimorfismo 677, obtivemos um grupo
normal apresentando 60 pacientes e um grupo mutado apresentando 86
pacientes. Ao comparar os grupos, não encontramos diferenças no que diz
respeito à idade (32,0 x 33,0, respectivamente p=0,172). Quanto as variáveis
laboratoriais em relação ao número de oócitos recuperados (8,0 x 8,0,
respectivamente, p = 0,417); porcentagem de oócitos maduros recuperados
(85,7% x 81,1%, respectivamente, p =0,346); taxa de fertilização normal (61,3% x
66,7%,respectivamente, p = 0,275), porcentagem de Não Fertilizados (21,5% x
17,4%,respectivamente, p = 0,407) e porcentagem de bons embriões (66,7% x
60,0%, respectivamente, p = 0,954) e taxas de gestação (28,6% x 29,3%,
respectivamente, p =0,908) não observamos diferença entre os grupos avaliados.
Ao avaliarmos a porcentagem de oócitos imaturos, observamos uma tendência a
maiores porcentagens no grupo mutado (2,9% x 12,9%, respectivamente, p =
0,056) (Tab.2).
Ao avaliarmos os dados para o polimorfismo 1298, obtivemos um grupo com
genótipo normal apresentando 80 pacientes e um grupo mutado apresentando 66
pacientes. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre
os grupos normal e mutado em relação à idade (33,0 x 32,0, respectivamente
p=0,642) e variáveis laboratoriais, tais como, número de oócitos recuperados (8,0
25
x 7,5, respectivamente, p = 0,476); porcentagem de oócitos maduros
recuperados (84,4% x 81,1%, respectivamente, p = 0,724); porcentagem de
oócitos imaturos (11,1% x 12,5%, respectivamente, p = 0,743); porcentagem de
fertilização normal (62,5% x 66,7%, respectivamente, p = 0,975); porcentagem de
Não Fertilizados (16,7% x 20,9%,respectivamente, p = 0,361) e taxas de
gestação (29,6% x 28,6%, respectivamente, p = 0,898). Em relação à
porcentagem de desenvolvimento de bons embriões pudemos observar que o
grupo mutado apresentava valores maiores quando comparados ao normal
(50,0% x 68,3%, respectivamente, p = 0,022) (Tab.2).
26
TABELA 2: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado
dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Normal
(n=60)
Hetero e
Mutado (n=86) p
Normal
(n=80)
Hetero e
Mutado
(n=66)
p
Polimorfismo C677T do gene
MTHFR Polimorfismo A1298C do gene
MTHFR
Mediana (p25 – p75) Mediana (p25 – p75)
Idade* 32,0 (30,0 – 34,0)
33,0 (30,0 – 35,0)
0,172 33,0
(30,0 – 35,0) 32,0
(30,0 – 35,0) 0,642
Nº Oócitos
Recuperados *
8,0 (5,0 – 12)
8,0 (6,0 – 12)
0,417 8,0
(6,0 – 12,0) 7,5
(5,0 – 12,0) 0,476
% Oócitos
Maduros*
85,7 (66,7 – 100)
81,1 (66,7 – 100)
0,346 84,4
(66,7 – 100) 81,1
(66,7 – 100) 0,724
% Oócitos
Imaturos *
2,9 (0 – 16,7)
12,9 (0 – 25,0)
0,056 11,1
(0 – 20,0) 12,5
(0 – 19,0) 0,743
% Fertilização
Normal *
61,3 (33,3 – 86,7)
66,7 (50,0 – 80,0)
0,275 62,5
(50,0 – 80,0) 66,7
(40,0 – 80,0) 0,975
% NF*
21,5 (0 – 40,0)
17,4 (0 – 33,3)
0,407 16,7
(0 – 33,3) 20,9
(0 – 37,5) 0,361
% Bons
Embriões *
66,7 (18,1 – 88,2)
60,0 (28,6 – 83,3)
0,954 50,0
(11,8 – 75,0) 68,3
(40,0 – 100) 0,022
(%) Taxa de gestação **
28,6
29,3
0,908
29,6
28,6
0,898
27
Durante a avaliação estatística percebemos que o fator idade poderia exercer
interferência em nossos resultados podendo mascarar a real importância da
presença do polimorfismo em nosso grupo de estudo. Embora a literatura ainda
não apresente consenso em relação ao valor de corte para a influência da idade
nos resultados laboratoriais e clínicos em reprodução humana assistida,
decidimos ser rigorosos e estabelecer um grupo de pacientes com idade até 30
anos.
Para a avaliação do polimorfismo 677, obtivemos um total de 45 pacientes
com idade até 30 anos, 19 pacientes no grupo normal e 26 pacientes no grupo
mutado. Após a análise de nossos resultados em relação às variáveis
laboratoriais, não foi observado diferença estatisticamente significante entre os
grupos normal e mutado no que diz respeito à idade (28,0 x 29,0,
respectivamente, p = 0,294) número de oócitos recuperados (12,0 x 7,0,
respectivamente, p = 0,399); porcentagem de oócitos maduros recuperados
(84,6% x 82,3%, respectivamente, p = 0,834); porcentagem de oócitos imaturos
(0% x 14,3%, respectivamente, p = 0,062); porcentagem de fertilização normal
(66,7% x 65,7%, respectivamente, p = 0,518); porcentagem de Não Fertilizados
(12,5% x 20,0%,respectivamente, p = 0,267); porcentagem de desenvolvimento
de bons embriões (70,0% x 50,0%, respectivamente, p = 0,071) e taxas de
gestação (26,3% x 40,9%, respectivamente, p = 0,326) (Tab. 3).
28
TABELA 3: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado
do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.
Variáveis Normal
(n=19)
Hetero e Mutado
(n=26) p
Idade ≤ 30 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,0 (26,0 – 30,0)
29,0 (27,0 – 30,0)
0,294
Nº Oócitos Recuperados *
12,0
(5,0 – 16) 7,0
(5,0 – 12,0) 0,399
% Oócitos Maduros * 84,6 (66,7 – 100)
82,3 (71,4 – 100)
0,834
% Oócitos Imaturos * 0 (0 – 15,4)
14,3 (0 – 25)
0,062
% Fertilização Normal * 66,7 (50,0 – 83,3)
65,7 (45,5 – 80,0)
0,518
% NF * 12,5 (0 – 33,3)
20,0 (5,9 – 33,3)
0,267
% Bons Embriões * 70,0 (50,0 – 100)
50,0 (20,0 – 75,0)
0,071
(%) Taxa de gestação**
26,3 40,9 0,326
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
29
Ao avaliarmos os dados quanto ao polimorfismo 1298, obtivemos um total de
45 pacientes, 22 no grupo normal e 23 no grupo mutado. Não foram encontradas
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos normal e mutado em
relação à idade (28,0 x 29,0, respectivamente, p = 0,382) número de oócitos
recuperados (8,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,991); porcentagem de oócitos
maduros recuperados (85,2% x 80,0%, respectivamente, p = 0,223); porcentagem
de oócitos imaturos (8,0% x 12,5%, respectivamente, p = 0,677); porcentagem de
fertilização normal (63,6% x 66,7%, respectivamente, p = 0,531); porcentagem de
Não Fertilizados (19,1% x 20,0%,respectivamente, p = 0,926); porcentagem de
desenvolvimento de bons embriões (63,3% x 70,0%, respectivamente, p = 0,583)
e taxas de gestação (40,0% x 28,6%, respectivamente, p = 0,440) (Tab. 4)
30
TABELA 4: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado
do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.
Variáveis Normal
(n=22)
Hetero e Mutado
(n=23) p
Idade ≤ 30 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,0 (27,0 – 29,0)
29,0 (26,0 – 30,0)
0,382
Nº Oócitos Recuperados *
8,0
(5,0 – 13,0) 8,0
(5,0 – 16,0) 0,991
% Oócitos Maduros * 85,2 (80,0 – 100)
80,0 (66,7 – 100)
0,223
% Oócitos Imaturos * 8,0 (0 – 16,7)
12,5 (0 – 25,0)
0,677
% Fertilização Normal * 63,6 (50,0 – 80,0)
66,7 (33,3 – 83,3)
0,531
% NF * 19,1 (5,9 – 33,3)
20,0 (0 – 36,5)
0,926
% Bons Embriões * 63,3 (45,5 – 75,0)
70,0 (25,0 – 93,8)
0,583
(%) Taxa de gestação**
40,0 28,6 0,440
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
31
Também realizamos a avaliação estatística das pacientes apresentando idade
até 35 anos. Para a avaliação do polimorfismo 677 obtivemos um total de 117
pacientes, 52 pacientes do grupo normal e 65 pacientes do grupo mutado. Na
avaliação do polimorfismo 1298 obtivemos um grupo total também com 117
pacientes sendo, 80 do grupo normal e 37 do grupo mutado. Entretanto, assim
como a avaliação realizada com pacientes apresentando idade até 30 anos não
obtivemos diferença estatística em nenhuma das variáveis avaliadas embora o
número de pacientes avaliado tenha sido maior (Tab 5 e 6).
32
TABELA 5: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado
do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.
Variáveis Normal
(n=52)
Hetero e Mutado
(n=65) p
Idade ≤ 35 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,5 (29,0 – 34,0)
32,0 (30,0 – 34,0)
0,851
Nº Oócitos Recuperados *
8,0
(5,0 – 12,0) 8,0
(6,0 – 12,0) 0,459
% Oócitos Maduros * 85,2 (66,7 – 100)
81,8 (66,7 – 100)
0,599
% Oócitos Imaturos * 6,8 (0 – 18,3)
13,3 (0 – 25,0)
0,120
% Fertilização Normal * 64,6 (33,3 – 77,5)
66,7 (50,0 – 80,0)
0,287
% NF * 21,5 (0 – 40,0)
20,0 (5,9 – 33,3)
0,623
% Bons Embriões * 66,7 (26,8 – 94,4)
54,5 (20,0 – 81,8)
0,453
(%) Taxa de gestação**
33,3 31,0 0,801
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
33
TABELA 6: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado
do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.
Variáveis Normal
(n=80)
Hetero e Mutado
(n=37) p
Idade ≤ 35 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 32,0 (29,0 – 34,0)
31,0 (30,0 – 34,0)
0,657
Nº Oócitos Recuperados *
8,0
(6,0 – 12,0) 6,0
(5,0 – 12,0) 0,183
% Oócitos Maduros * 84,4 (66,7 – 100)
81,3 (66,7 – 100)
0,848
% Oócitos Imaturos * 12,5 (0 – 24,0)
11,1 (0 – 18,8)
0,298
% Fertilização Normal * 65,7 (50,0 – 80,0)
66,7 (40,0 – 80,0)
0,577
% NF * 19,1 (0 – 33,3)
20,0 (0 – 36,4)
0,810
% Bons Embriões * 52,3 (14,6 – 75,0)
66,7 (28,6 – 93,8)
0,172
(%) Taxa de gestação**
33,9 30,0 0,665
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
34
Com o objetivo de avaliar se a ocorrência concomitante dos polimorfismos em
ambos os loci gênicos (677 e 1298) poderia exercer alguma influência em nossos
resultados, dividimos nossas pacientes em três grupos: pacientes que não
apresentaram polimorfismos em nenhum dos loci, pacientes que apresentaram
polimorfismo em pelo menos um dos loci e pacientes que apresentaram
polimorfismos em ambos os loci concomitantemente. Após a análise dos dados
entre os grupos avaliados: Ausência de Polimorfismos (n=31) x Presença de Pelo
Menos um Polimorfismo (n=78) x Presença de Dois Polimorfismos (n=37), não
encontramos diferença estatisticamente significante no que diz respeito à idade
das pacientes avaliadas (32,0 x 32,5 x 32,0, respectivamente, p = 0,810);número
de oócitos recuperados (8,0 x 7,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,793);
porcentagem de oócitos maduros recuperados (84,6% x 85,7% x 80,0%,
respectivamente, p = 0,461); porcentagem de oócitos imaturos (10,0% x 0 % x
16,7%, respectivamente, p = 0,159); porcentagem de fertilização normal (60,0% x
66,7% x 66,7%, respectivamente, p = 0,738); porcentagem de Não Fertilizados
(12,5% x 20,0% x 20,0%, respectivamente, p = 0,952); porcentagem de bons
embriões (50,0% x 57,3% x 75,0%, respectivamente, p = 0,269) e porcentagem
de gestação (28,6% x 29,6% x 28,6%, respectivamente, p = 0,992) (Tab.7).
35
TABELA 7: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=31)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=78)
Presença de dois
polimorfismos
(n=37)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 32,0
(30,0 – 34,0)
32,5
(30,0 – 35,0)
32,0
(30,0 – 35,0)
0,810
Nº Oócitos*
Recuperados
8,0
(6,0 – 12,0)
7,0
(5,0 – 12,0)
8,0
(6,0 – 12,0)
0,793
% Oócitos
Maduros*
84,6
(66,7 – 100)
85,7
(66,7 – 100)
80,0
(66,7 – 85,7)
0,461
% Oócitos
Imaturos *
10,0
(0 – 20,0)
0
(0 – 19,0)
16,7
(0 – 23,8)
0,159
% Fertilização
Normal*
60,0
(33,3 – 80,0)
66,7
(50,0 – 80,0)
66,7
(40,0 – 83,3)
0,738
% NF* 12,5
(0 – 40,0)
20,0
(0 – 33,3)
20,0
(0 – 36,4)
0,952
% Bons
Embriões*
50,0
(0 – 70,0)
57,3
(28,6 – 83,3)
75,0
(40,0 – 93,8)
0,269
(%) Taxa de gestação**
28,6 29,6 28,6 0,992
36
Da mesma maneira foram avaliadas pacientes com idade até trinta anos em
relação aos mesmos grupos Ausência de Polimorfismos (n=9) x Presença de Pelo
Menos um Polimorfismo (n=23) x Presença de Dois Polimorfismos (n=13). Não foi
observada diferença estatisticamente significante em relação à idade das
pacientes avaliadas (28,0 x 28,0 x 30,0, respectivamente, p = 0,142); número de
oócitos recuperados (12,0 x 8,0 x 6,0, respectivamente, p = 0,828); porcentagem
de oócitos maduros recuperados (84,6% x 84,6% x 80,0%, respectivamente, p =
0,596); porcentagem de oócitos imaturos (7,7% x 0 % x 18,7%, respectivamente,
p = 0,220); porcentagem de fertilização normal (58,3% x 66,7% x 66,7%,
respectivamente, p = 0,981); porcentagem de Não Fertilizados(16,7% x 18,2% x
21,7%, respectivamente, p = 0,755); porcentagem de bons embriões (70,0% x
50,0% x 66,7%, respectivamente, p = 0,310) e porcentagem de gestação (33,3% x
33,3% x 36,4%, respectivamente, p = 0,984) (Tab.8).
Do mesmo modo, foram avaliadas pacientes com idade até 35 anos, mas
assim como na avaliação do grupo de pacientes com idade até 30 anos não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Tab.9).
37
TABELA 8: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=9)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=23)
Idade ≤ 30 anos
Presença de dois
polimorfismos
(n=13)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,0
(28,0 – 29,0)
28,0
(25,0 – 30,0)
30,0
(29,0 – 30,0)
0,142
Nº Oócitos*
Recuperados
12,0
(6,0 – 13,0)
8,0
(5,0 – 16,0)
6,0
(5,0 – 12,0)
0,828
% Oócitos
Maduros*
84,6
(80,0 – 100)
84,6
(71,4 – 100)
80,0
(66,7 – 100)
0,596
% Oócitos
Imaturos *
7,7
(0 – 15,4)
0
(0 – 19,0)
18,7
(0 – 25,0)
0,220
% Fertilização
Normal*
58,3
(50,0 – 75,0)
66,7
(50,0 – 80,0)
66,7
(33,3 – 83,3)
0,981
% NF* 16,7
(0 – 25,0)
18,2
(0 – 33,3)
21,7
(0 – 36,4)
0,755
% Bons
Embriões*
70,0
(66,7 – 100,0)
50,0
(20,0 – 75,0)
66,7
(25,0 – 93,8)
0,310
(%) Taxa de gestação**
33,3 33,3 36,4 0,984
38
TABELA 9: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=27)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=62)
Idade ≤ 35 anos
Presença de dois
polimorfismos
(n=28)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,0
(29,0 – 34,0)
32,0
(29,0 – 34,0)
31,0
(30,0 – 34,0)
0,957
Nº Oócitos*
Recuperados
8,0
(6,0 – 12,0)
7,0
(5,0 – 12,0)
7,0
(5,0 – 13,0)
0,890
% Oócitos
Maduros*
84,6
(66,7 – 100)
85,2
(66,7 – 100)
80,0
(66,7 – 97,2)
0,863
% Oócitos
Imaturos *
11,1
(0 – 20,0)
8,8
(0 – 25,0)
15,5
(0 – 22,5)
0,563
% Fertilização
Normal*
60,0
(36,4 – 83,3)
66,7
(50,0 – 80,0)
66,7
(40,0 – 84,5)
0,934
% NF* 12,5
(0 – 40,0)
20,0
(10,0 – 33,3)
17,1
(0 – 34,8)
0,716
% Bons
Embriões*
66,7
(0 – 87,5)
63,3
(28,6 – 83,3)
66,7
(22,5 – 89,2)
0,868
(%) Taxa de gestação**
33,3 33,9 26,9 0,810
39
Com o objetivo de identificar com maior clareza a interferência dos
polimorfismos 677 e 1298 do gene MTHFR nas variáveis laboratoriais realizamos
uma avaliação com pacientes apresentando apenas fator masculino como causa
de infertilidade, conseguindo dessa maneira avaliar apenas pacientes que não
apresentassem nenhuma alteração em sua fertilidade. Assim, nosso grupo de
pacientes que inicialmente apresentava-se com 146 pacientes foi reduzido ao
número de 82 pacientes.
Nessa segunda análise, foram realizadas as mesmas avaliações que haviam
sido feitas com o grupo inicial. Assim, na avaliação do polimorfismo 677 obteve-se
um grupo normal apresentando 35 pacientes e um grupo mutado apresentando
47 pacientes. Considerando os dados de idade (31,0 x 32,0, respectivamente
p=0,235) e variáveis laboratoriais em relação ao número de oócitos recuperados
(8,0 x 9,0, respectivamente, p = 0,382); taxa de fertilização normal (60,0% x
57,1%, respectivamente, p = 0,847), porcentagem de Não Fertilizados (25,0 % x
25,0%,respectivamente, p = 0,785); porcentagem de bons embriões (66,7% x
60,0%, respectivamente, p = 0,754) e taxas de gestação (33,3% x 36,6%,
respectivamente, p =0,771) não observamos diferença entre os grupos avaliados.
Ao avaliarmos a porcentagem de porcentagem de oócitos maduros recuperados
(86,7% x 75,0 %, respectivamente, p =0,006) e oócitos imaturos recuperados
(7,7% x 16,7 %, respectivamente, p =0,003) observamos diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos avaliados (Tab.10).
Ao avaliarmos o genótipo referente ao polimorfismo 1298, obtivemos um
grupo normal apresentando 44 pacientes e um grupo mutado apresentando 38
pacientes. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre
os grupos normal e mutado em relação à idade (32,0 x 31,0, respectivamente
40
p=0,899) e variáveis laboratoriais, tais como, porcentagem de oócitos maduros
recuperados (81,4% x 80,0 %, respectivamente, p = 0,590); porcentagem de
oócitos imaturos (11,8% x 13,8%, respectivamente, p = 0,805); porcentagem de
fertilização normal (57,7% x 63,3%, respectivamente, p = 0,985); porcentagem de
Não Fertilizados (25,0% x 25,0%,respectivamente, p = 0,896); desenvolvimento
de bons embriões (52,3% x 66,7%, respectivamente, p = 0,261) e taxas de
gestação (39,5% x 30,6%, respectivamente, p = 0,422). Em relação ao número de
oócitos recuperados pudemos observar que o grupo apresentando genótipo
normal apresentou valores superiores quando comparado ao genótipo mutado
(10,5 x 8,0, respectivamente, p = 0,044) (Tab.10).
41
TABELA 10: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo
mutado dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR em pacientes
férteis.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Normal
(n=35)
Hetero e
Mutado (n=47) p
Normal
(n=44)
Hetero e
Mutado
(n=38)
p
Polimorfismo C677T do gene
MTHFR Polimorfismo A1298C do gene
MTHFR
Mediana (p25 – p75) Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,0 (29,0 – 34,0)
32,0 (29,0 – 35,0)
0,235 32,0
(29,0 – 34,0) 31,0
(29,0 – 34,0) 0,899
Nº Oócitos
Recuperados *
8,0 (5,0 – 13,0)
9,0 (6,0 – 15,0)
0,382 10,5
(7,5 – 16,0) 8,0
(5,0 – 12,0) 0,044
% Oócitos
Maduros*
86,7 (76,9 – 100)
75,0 (62,5 – 84,6)
0,006 81,4
(66,7 – 81,4) 80,0
(66,7 – 87,5) 0,590
% Oócitos
Imaturos *
7,7 (0 – 15,4)
16,7 (7,7 – 28,6)
0,003 11,8
(0 – 26,6) 13,8
(0 – 23,8) 0,805
% Fertilização
Normal *
60,0 (33,3 – 75,0)
57,1 (40,0 – 75,0)
0,847 57,7
(50,0 – 75,0) 63,3
(33,3 – 75,0) 0,985
% NF*
25,0 (10,0 – 40,0)
25,0 (11,1 – 37,5)
0,785 25,0
(10,0 – 36,9) 25,0
(11,1 – 40,0) 0,896
% Bons
Embriões *
66,7 (0 – 85,7)
60,0 (25,0 – 83,3)
0,754 52,3
(8,3 – 75,0) 66,7
(25,0 – 100) 0,261
(%) Taxa de gestação **
33,3
36,6
0,771
39,5
30,6
0,422
42
Assim como no grupo inicial realizamos nossas avaliações segregando
pacientes em grupos com idade até 30 anos e idade até 35 anos a fim de
conseguirmos excluir o fator idade como interferente em nossa avaliação do papel
dos polimorfismos em variáveis laboratoriais. Assim, para o polimorfismo 677
obtivemos um total de 34 pacientes com idade até 30 anos, sendo que 16
pacientes no grupo normal e 18 pacientes no grupo mutado. Após a análise de
nossos resultados em relação às variáveis laboratoriais, não foi observado
diferença estatisticamente significante entre os grupos normal e mutado no que
diz respeito à idade (28,5 x 29,0, respectivamente, p = 0,523) número de oócitos
recuperados (12,0 x 7,0, respectivamente, p = 0,239); porcentagem de oócitos
maduros recuperados (84,6% x 79,3%, respectivamente, p = 0,138); porcentagem
de fertilização normal (66,7% x 53,6%, respectivamente, p = 0,315); porcentagem
de Não Fertilizados (18,3% x 22,5%,respectivamente, p = 0,637); porcentagem de
desenvolvimento de bons embriões (68,3% x 58,3%, respectivamente, p = 0,217)
e taxas de gestação (31,3% x 40,0%, respectivamente, p = 0,611). Entretanto,
pudemos observar diferença estatisticamente significante entre os grupos normal
e mutado em relação à porcentagem de oócitos imaturos (0% x 19,5%,
respectivamente, p = 0,006) (Tab.11).
43
TABELA 11: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo
mutado do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres férteis com idade
até 30 anos.
Variáveis Normal
(n=16)
Hetero e Mutado
(n=18) p
Idade ≤ 30 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,5 (25,5 – 29,5)
29,0 (27,0 – 30,0)
0,523
Nº Oócitos Recuperados *
12,0
(5,5 – 14,5) 7,0
(5,0 – 12,0) 0,239
% Oócitos Maduros * 84,6 (80,0 – 100)
79,3 (66,7 – 84,6)
0,138
% Oócitos Imaturos * 0 (0 – 13,9)
19,5 (7,7 – 28,6)
0,006
% Fertilização Normal * 66,7 (50,0 – 81,7)
53,6 (33,3 – 80,0)
0,315
% NF * 18,3 (0 – 33,3)
22,5 (0 – 36,4)
0,637
% Bons Embriões * 68,3 (50,0 – 92,9)
58,3 (16,7 – 75,0)
0,217
(%) Taxa de gestação**
31,3 40,0 0,611
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
44
Ao avaliarmos o genótipo referente ao polimorfismo 1298, obtivemos um total
de 34 pacientes, 17 pacientes no grupo normal e 17 pacientes no grupo mutado.
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
normal e mutado em relação à idade (28,0 x 29,0, respectivamente, p = 0,378)
número de oócitos recuperados (12,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,436);
porcentagem de oócitos maduros recuperados (84,6% x 80,0%, respectivamente,
p = 0,076); porcentagem de oócitos imaturos (8,3% x 14,3%, respectivamente, p =
0,709); porcentagem de fertilização normal (58,3% x 66,7%, respectivamente, p =
0,756);porcentagem de Não Fertilizados (20,0% x 20,0%,respectivamente, p =
0,972); porcentagem de desenvolvimento de bons embriões (66,7% x 66,7%,
respectivamente, p = 0,890) e taxas de gestação (40,0% x 31,3%,
respectivamente, p = 0,611) (Tab. 12)
45
TABELA 12: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo
mutado do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade
até 30 anos.
Variáveis Normal
(n=17)
Hetero e Mutado
(n=17) p
Idade ≤ 30 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,0 (27,0 – 29,0)
29,0 (26,0 – 30,0)
0,378
Nº Oócitos Recuperados *
12,0
(6,0 – 13,0) 8,0
(5,0 – 12,0) 0,436
% Oócitos Maduros * 84,6 (80,0 – 100)
80,0 (66,7 – 83,3)
0,076
% Oócitos Imaturos * 8,3 (0 – 19,0)
14.3 (0 – 25,0)
0,709
% Fertilização Normal * 58,3 (50,0 – 75,0)
66,7 (33,3 – 85,7)
0,756
% NF * 20,0 (5,9 – 33,3)
20 (0 – 36,5)
0,972
% Bons Embriões * 66,7 (50,0 – 75,0)
66,7 (25,0 – 85,7)
0,890
(%) Taxa de gestação**
40,0 31,3 0,611
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
46
Ao avaliarmos o grupo de pacientes com idade até 35 anos para o polimorfismo
677 obtivemos um total de 71 pacientes sendo 32 pacientes no grupo normal e 39
pacientes no grupo mutado. Após a análise de nossos resultados em relação às
variáveis laboratoriais, não foi observado diferença estatisticamente significante
entre os grupos normal e mutado em relação à idade (30,5 x 31,0,
respectivamente, p = 0,534) e número de oócitos recuperados (9,5 x 8,0,
respectivamente, p = 0,812). Entretanto, observamos diferenças estatisticamente
significantes entre os grupos normal e mutado no que diz respeito à porcentagem
de oócitos maduros recuperados (87,1% x 75,0%, respectivamente, p = 0,013); e
porcentagem de oócitos imaturos (6,8% x 16,7%, respectivamente, p = 0,002). Ao
avaliarmos a porcentagem de fertilização normal (64,6% x 54,5%,
respectivamente, p = 0,543); porcentagem de Não Fertilizados (21,5% x
25,0%,respectivamente, p = 0,468); porcentagem de desenvolvimento de bons
embriões (66,7% x 60,0%, respectivamente, p = 0,980) e taxas de gestação
(36,7% x 36,4%, respectivamente, p = 0,797) não foram encontradas diferenças
estatisticamente significantes (Tab.13).
47
TABELA 13: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo
mutado do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres férteis com idade
até 35 anos.
Variáveis Normal
(n=32)
Hetero e Mutado
(n=39) p
Idade ≤ 35 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 30,5 (28,5 – 33,5)
31,0 (29,0 – 34,0)
0,534
Nº Oócitos Recuperados *
9,5
(5,0 – 13,0) 8,0
(6,0 – 15,0) 0,812
% Oócitos Maduros * 87,1 (78,5 – 100)
75,0 (62,5 – 84,2)
0,013
% Oócitos Imaturos * 6,8 (0 – 16,0)
16,7 (10,5 – 28,6)
0,002
% Fertilização Normal * 64,6 (43,1 – 77,5)
54,5 (40,0 – 75,0)
0,543
% NF * 21,5 (9,1 – 36,7)
25,0 (11,1 – 40,0)
0,468
% Bons Embriões * 66,7 (26,8 – 92,9)
60,0 (20,0 – 83,3)
0,797
(%) Taxa de gestação**
36,7 36,4 0,980
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
48
Em relação ao polimorfismo 1298 obtivemos um grupo também com 71
pacientes, 39 no grupo normal e 32 no grupo mutado. Não foram encontradas
diferenças estatisticamente significantes no que diz respeito à idade das
pacientes avaliadas (31,0% x 30,0%, respectivamente, p = 0,561); porcentagem
de oócitos maduros (81,8% x 80,0%, respectivamente, p = 0,608); porcentagem
de oócitos imaturos (12,5% x 12,9%, respectivamente, p = 0,326); porcentagem
de fertilização normal (58,3% x 63,3%, respectivamente, p = 0,867); porcentagem
de Não Fertilizados (25,0% x 25,0%, respectivamente, p = 0,995); porcentagem
de desenvolvimento de bons embriões (60,0% x 66,7%, respectivamente, p =
0,567) e taxas de gestação (39,4% x 33,3%, respectivamente, p = 0,618). Durante
essa avaliação encontramos diferença estatisticamente significante entre os
grupos normal e mutado no que diz respeito ao número de oócitos recuperados
(11,0% x 8,0%, respectivamente, p = 0,024) (Tab.14).
49
TABELA 14: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo
mutado do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade
até 35 anos.
Variáveis Normal
(n=39)
Hetero e Mutado
(n=32) p
Idade ≤ 35 anos
Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,0 (29,0 – 34,0)
30,0 (29,0 – 32,0)
0,561
Nº Oócitos Recuperados *
11,0
(7,0 – 17,0) 8,0
(5,0 – 12,0) 0,024
% Oócitos Maduros * 81,8 (66,7 – 100)
80,0 (66,7 – 100)
0,608
% Oócitos Imaturos * 12,5 (0 – 28,6)
12,9 (0 – 22,5)
0,326
% Fertilização Normal * 58,3 (50,0 – 75,0)
63,3 (33,3 – 77,5)
0,867
% NF * 25,0 (10,0 – 37,5)
25,0 (9,7 – 40,0)
0,995
% Bons Embriões * 60,0 (30,0 – 75,0)
66,7 (22,5 – 100)
0,567
(%) Taxa de gestação**
39,4 33,3 0,618
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado
50
Com o objetivo de avaliar se a ocorrência concomitante dos polimorfismos em
ambos os loci gênicos (677 e 1298) poderia exercer alguma influência em nossos
resultados, dividimos as pacientes dessa nova avaliação em três grupos:
pacientes que não apresentaram polimorfismos em nenhum dos loci, pacientes
que apresentaram polimorfismo em pelo menos um dos loci e pacientes que
apresentaram polimorfismos em ambos os loci concomitantemente. Após a
análise dos dados entre os grupos avaliados: Ausência de polimorfismos (n=19) x
Presença de um polimorfismo (n=41) x Presença de dois polimorfismos (n=22),
não encontramos diferença estatisticamente significante no que diz respeito à
idade das pacientes avaliadas (31,0 x 32,0 x 31,5, respectivamente, p = 0,539);
número de oócitos recuperados (11,0 x 8,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,718);
porcentagem de oócitos imaturos (9,1% x 11,1 % x 17,9%, respectivamente, p =
0,100); porcentagem de fertilização normal (60,0% x 57,1% x 61,9%,
respectivamente, p = 0,894); porcentagem de Não Fertilizados (25,0% x 25,0% x
25,0%, respectivamente, p = 0,945); porcentagem de bons embriões (66,7% x
50,0% x 70,8%, respectivamente, p = 0,524) e porcentagem de gestação (33,3% x
40,0% x 28,6%, respectivamente, p = 0,675). Pudemos observar uma tendência a
maiores resultados no grupo de pacientes com ausência de polimorfismos no que
diz respeito à porcentagem de oócitos maduros recuperados (88,9% x 81,0% x
76,8%, respectivamente, p = 0,061) (Tab.15).
51
TABELA 15: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=19)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=41)
Presença de dois
polimorfismos
(n=22)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,0
(29,0 – 34,0)
32,0
(29,0 – 34,0)
31,5
(30,0 – 35,0)
0,539
Nº Oócitos*
Recuperados
11,0
(8,0 – 13,0)
8,0
(6,0 – 16,0)
8,0
(6,0 – 12,0)
0,718
% Oócitos
Maduros*
88,9
(76,9 – 100)
81,0
(62,5 – 90,0)
76,8
(66,7 – 83,3)
0,061
% Oócitos
Imaturos *
9,1
(0 – 20,0)
11,1
(0 – 25,0)
17,9
(13,3 – 25,0)
0,100
% Fertilização
Normal*
60,0
(36,3 – 83,3)
57,1
(50,0 – 75,0)
61,9
(40,0 – 75,0)
0,894
% NF* 25,0
(8,3 – 43,8)
25,0
(12,5 – 36,4)
25,0
(8,3 – 40,0)
0,945
% Bons
Embriões*
66,7
(0 – 70,0)
50,0
(25,0 – 80,0)
70,8
(25,0 – 100)
0,524
(%) Taxa de gestação**
33,3 40,0 28,6 0,675
52
Realizamos a avaliação em relação aos mesmos grupos Ausência de
Polimorfismos (n=8) x Presença de um polimorfismo (n=17) x Presença de dois
polimorfismos (n=9) em pacientes com idade até trinta anos. Não observamos
diferença estatisticamente significante em relação à idade das pacientes
avaliadas (28,5 x 28,0 x 30,0, respectivamente, p = 0,118); número de oócitos
recuperados (12,0 x 8,0 x 6,0, respectivamente, p = 0,387); porcentagem de
oócitos maduros recuperados (92,3% x 81,0% x 75,0%, respectivamente, p =
0,074); porcentagem de fertilização normal (62,5% x 64,7% x 50,0%,
respectivamente, p = 0,865); porcentagem de Não Fertilizados (20,8% x 20,0% x
25,0%, respectivamente, p = 0,939); porcentagem de bons embriões (68,3% x
50,0% x 66,7%, respectivamente, p = 0,622) e porcentagem de gestação (37,5% x
33,3% x 37,5%, respectivamente, p = 0,971). Ao avaliarmos a porcentagem de
oócitos imaturos observamos diferença estatisticamente significante entre os
grupos com porcentagem de oócitos imaturos maior no grupo de pacientes
apresentando presença de dois polimorfismos simultaneamente (8,0% x 0 % x
25,0%, respectivamente, p = 0,036) (Tab.16).
Do mesmo modo, foram avaliadas pacientes com idade até 35 anos, mas
assim como na avaliação do grupo de pacientes com idade até 30 anos não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes (Tab.17).
53
TABELA 16: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade até 30 anos.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=8)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=17)
Idade ≤ 30 anos
Presença de dois
polimorfismos
(n=9)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 28,5
(27,5 – 29,5)
28,0
(25,0 – 29,0)
30,0
(29,0 – 30,0)
0,118
Nº Oócitos*
Recuperados
12,0
(9,0 – 13,0)
8,0
(5,0 – 16,0)
6,0
(5,0 – 12,0)
0,387
% Oócitos
Maduros*
92,3
(82,3 – 100)
81,0
(71,4 – 87,5)
75,0
(66,7 – 80,0)
0,074
% Oócitos
Imaturos *
8,0
(0 – 16,0)
0
(0 – 19,0)
25,0
(16,7 – 25,0)
0,036
% Fertilização
Normal*
62,5
(52,3 – 79,2)
64,7
(50,0 – 80,0)
50,0
(33,3 – 85,7)
0,865
% NF* 20,8
(4,2 – 29,2)
20,0
(0 – 33,3)
25,0
(0 – 36,4)
0,939
% Bons
Embriões*
68,3
(58,3 – 85,0)
50,0
(25,0 – 80,0)
66,7
(20,0 – 83,3)
0,622
(%) Taxa de gestação**
37,5 33,3 37,5 0,971
54
TABELA 17: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,
presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade até 35 anos.
p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado
Variáveis Ausência de
Polimorfismos
(n=17)
Presença de pelo menos
um polimorfismo
(n=37)
Idade ≤ 35 anos
Presença de dois
polimorfismos
(n=17)
p
Mediana (p25 – p75)
Idade* 31,0
(29,0 – 34,0)
31,0
(29,0 – 33,0)
30,0
(30,0 – 32,0)
0,928
Nº Oócitos*
Recuperados
12,0
(8,0 – 13,0)
8,0
(5,0 – 16,0)
8,0
(6,0 – 12,0)
0,351
% Oócitos
Maduros*
88,9
(80,0 – 100)
81,0
(62,5 – 90,0)
75,0
(66,7 – 80,0)
0,889
% Oócitos
Imaturos *
9,1
(0 – 20,0)
11,1
(0 – 28,1)
16,7
(13,3 – 25,0)
0,241
% Fertilização
Normal*
62,5
(50,0 – 83,3)
57,1
(37,5 – 75,0)
50,0
(40,0 – 85,7)
0,675
% NF* 16,7
(8,3 – 33,3)
25,0
(12,5 – 37,5)
25,0
(8,3 – 25)
0,737
% Bons
Embriões*
66,7
(44,4 – 70,0)
54,5
(28,6 – 83,3)
66,7
(20,0 – 100)
0,926
(%) Taxa de gestação**
37,5 38,7 31,3 0,877
55
5. DISCUSSÃO
O gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) é o gene codificador da
enzima 5-metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) relacionada ao metabolismo
do folato (Goyette et al., 1998). A deficiência de folato e a hiperhomocisteinemia
são fatores de risco para infertilidade e diversos estudos tem demonstrado que
polimorfismos ligados a esse gene exercem um papel importante na fertilidade
feminina (Tamura, Picciano, 2006; Azem et al., 2004; Thaler et al., 2006).
Os polimorfismos C677T e A1298C relacionados a esse gene podem trazer
alterações na atividade específica da enzima MTHFR, como a redução em 35%
na presença do genótipo 677CT, e redução em 70% quando em homozigose na
presença do genótipo 677TT em relação ao genótipo normal 677CC
(Wainfan,Poirier, 1992; De Cabo et al., 1994; Balaghi, Wagner, 1993). Além
disso, esses polimorfismos têm sido também associados às malformações fetais
e perdas gestacionais espontâneas recorrentes (Nelen et al., 1998; Isolato et al.,
2000; Zetterberg et al., 2002).A baixa atividade da enzima MTHFR limita a
viabilidade dos grupos metil provenientes da S-adenosilmetionina, resultando na
hipometilação de diversas moléculas biológicas, incluindo o DNA, devido ao fato
deste estar envolvido na regulação da expressão gênica e manutenção da
integridade genômica (Laird, 2003). Assim, a hipometilação resulta em
instabilidade cromossômica e danos no DNA, levando ao comprometimento das
funções celulares (Eden et al., 2003).
Diversos estudos têm sido realizados para tentar elucidar a influência da
presença dos polimorfismos C677T e A1298C na infertilidade feminina e
masculina, como por exemplo, a incidência do genótipo MTHFR 677 TT e 1298
CC em pacientes com falha de implantação (Azem et al., 2004; Haggarty et al.,
56
2006), assim como o efeito destes na síntese de estradiol folicular (Hech et
al.,2009), ISCA (Altmae et al., 2010), Infertilidade Masculina (Gava et al., 2011),
entre outros.
Nosso estudo foi realizado de duas maneiras, inicialmente com 146 pacientes
as quais apresentavam diversas causas de infertilidade masculinas e femininas.
Posteriormente, com o objetivo de excluir os fatores interferentes na fertilidade
feminina, realizamos as mesmas avaliações somente para pacientes
apresentando fator masculino de infertilidade onde conseguimos agrupar 82
pacientes.
Em nossa análise inicial, onde foram avaliadas pacientes apresentando alelos
normais e mutados para o polimorfismo 677 e 1298, embora não tenhamos
encontrado diferenças estatisticamente significantes em relação às variáveis
laboratoriais como número de oócitos recuperados, porcentagem de oócitos
maduros, porcentagem de fertilização normal, porcentagem de NF, porcentagem
de bons embriões e taxa de gestação, pudemos observar diferenças relevantes
em relação à maturidade oocitária quando avaliamos o polimorfismo 677 do gene
MTHFR. Na avaliação com o grupo total de pacientes (aquelas apresentando
todos os fatores de infertilidade) encontramos uma tendência a maiores
porcentagens de oócitos imaturos no grupo apresentando genótipo mutado,
enquanto que na avaliação realizada com o grupo de pacientes apresentando
apenas fator masculino pudemos observar valores estatisticamente significantes,
revelando também uma porcentagem maior de oócitos imaturos naquelas
pacientes apresentando presença de mutação para o polimorfismo C677T.
Embora, apenas tenhamos obtido resultado estatisticamente significante em
relação à porcentagem de oócitos maduros no grupo de pacientes com fator
57
masculino de fertilidade, em concordância com outros estudos já publicados
anteriormente, acreditamos que esses resultados possam estar relacionados ao
aumento de homocisteína no líquido folicular, o qual pode ter refletido em um
ambiente subótimo para a maturação oocitária como descrito em estudos
anteriores (Szymanski, Kazdepka-Zieminska, 2003; Boxmeer et al., 2008).
Interessantemente ao avaliarmos pacientes com alelos normais e mutados
para o polimorfismo A1298C do gene MTHFR pudemos observar diferença
estatisticamente significante em relação à porcentagem de embriões de boa
qualidade no grupo de pacientes exibindo diversas causas de infertilidade e
alelos mutados (C). Igualmente a esses resultados, observamos nessa mesma
avaliação diferença estatisticamente significante em relação ao número de
oócitos recuperados em pacientes apresentando apenas fator masculino como
causa de infertilidade. Esses resultados são diferentes dos publicados
previamente, pois relata-se que o polimorfismo 1298 exerce influência apenas
quando aparece de maneira concomitante ao polimorfismo 677 (van der Put et
al., 1998; Weisberg et al., 1998; Weisberg et al., 2001). Além disso, recentes
estudos revelaram que a presença do alelo C no polimorfismo 1298 pode estar
relacionada a altas concentrações de FSH basal e diminuição da resposta à
estimulação ovariana (Rosen et al., 2007; Laanpere et al., 2011).
A fim de tentar ser ainda mais rigorosos em relação aos fatores que poderiam
interferir no efeito dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR e sua
relação com as variáveis de infertilidade resolvemos restringir nossos grupos e
realizamos as mesmas avaliações previamente descritas com pacientes
segregadas em grupos com idade até 30 anos e com idade até 35 anos. Sabe-se
que com o aumento da idade feminina inicia-se um declínio na fertilidade, sendo
58
este um processo lento, mas constante em mulheres entre 30 e 35 anos, seguido
de um acelerado declínio com o aumento da idade (Menken J, et al.1986;
ESHRE, 2005). Após essas avaliações, nossos resultados demonstraram que em
pacientes apresentando apenas fator masculino de infertilidade existe diferença
estatisticamente significante entre os grupos normal e mutado do polimorfismo
C677T do gene MTHFR no que diz respeito à porcentagem de oócitos imaturos
recuperados tanto na avaliação das pacientes com idade até 30 anos quanto na
avaliação das pacientes com idade até 35 anos. Entretanto, somente na
avaliação das pacientes com idade até 35 anos encontramos diferença
estatisticamente significante na porcentagem de oócitos maduros, sendo este
maior para o grupo de pacientes apresentando genótipo normal para este
polimorfismo. Além disso, encontramos valores superiores e estatisticamente
significantes para o número de oócitos recuperados no grupo de pacientes com
genótipo normal para o polimorfismo 1298.
Devido ao fato de não terem sido analisados os níveis de homocisteína em
nosso estudo não podemos confirmar se a presença de alelos mutantes nos
polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR realmente reduz a metilação de
homocisteína em metionina, mas esses resultados entram do mesmo modo em
concordância com relatos da literatura, onde a presença do alelo mutante no
polimorfismo 677 pode influenciar as concentrações intrafoliculares de
homocisteína e em consequência disso tornar esse ambiente hostil à maturação
oocitária (Boxmeer et al., 2008).
Considerando as outras variáveis avaliadas as quais não obtivemos diferença
estatística, os dados estão consistentes com outros estudos anteriormente
realizados, exceto pela avaliação da maturidade oocitária. No estudo realizado
59
por Dobson et al., em 2007 foram avaliados 197 casais submetidos a ciclos de
reprodução assistida, sendo estudada a associação entre os polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR presentes em homens e mulheres, em relação
ao sucesso de gestação e resultados laboratoriais.
Nesse estudo o autor segregou as pacientes em três grupos de genótipos:
normal, heterozigoto e mutante e avaliou a presença dos genótipos C677T e
A1298C individualmente e simultaneamente. Em ambas as avaliações esse
estudo não encontrou associação entre a presença dos polimorfismos e
resultados laboratoriais como número e qualidade dos embriões transferidos,
além de taxas de gestação nos ciclos de fertilização assistida realizados.
Outro estudo recente avaliou retrospectivamente 273 pacientes submetidas a
ciclos de fertilização in vitro, as quais foram analisadas em dois grupos, um grupo
apresentando mutação em homozigose para o polimorfismo C677T do gene
MTHFR e outro grupo com ausência de mutação. Esse estudo demonstrou que o
grupo de pacientes apresentando mutação necessitava de mais tempo de
estimulação e maiores doses de FSH recombinante em relação ao grupo de
pacientes com genótipo normal. Além disso, o grupo de pacientes com genótipo
normal apresentou maiores taxas de fertilização nos ciclos de FIV realizados
quando comparadas aquelas do grupo mutado (73,4% x 62,6%, p<0,01).
Entretanto, apresentaram taxas de implantação e gestação equivalentes entre os
grupos avaliados. Dessa maneira, esse estudo sugeriu que a mutação C677T do
gene MTHFR não afeta os resultados de FIV (Marci et al., 2012).
Outro estudo ainda correlacionou a presença do polimorfismo C677T com
qualidade embrionária através da avaliação das variantes genéticas do
60
metabolismo do folato e resultados de FIV em 439 mulheres submetidas a ciclos
de fertilização assistida. Esse estudo concluiu que em relação ao polimorfismo
C677T do gene MTHFR, pacientes apresentando genótipo em heterozigose CT
apresentam maiores proporções de embriões de melhor qualidade e aumento
das chances de gestação quando comparadas as pacientes apresentando
genótipos em homozigose TT ou genótipos normal CC (Laanpere et al., 2011).
Embora tenhamos encontrado alguns resultados estatisticamente
significativos em pacientes com alelo mutado para o polimorfismo 1298, já é
postulado que a mutação MTHFR A1298C tanto no seu estado homozigoto
mutante (CC) ou heterozigótico (AC), parece não ocasionar elevações do nível da
homocisteína plasmática quando ocorre de maneira isolada. No entanto, pode
trazer prejuízos quando aparecer concomitantemente em heterozigose com a
mutação no loci 677 (duplo heterozigoto), C677T e A1298C, produzindo um
genótipo 677CT/1298AC (van der Put et al., 1998; Weisberg et al., 1998;
Weisberg et al., 2001). Por essa razão, examinamos também três grupos de
pacientes comparando: a presença do polimorfismo na posição 1298 de forma
concomitante ao polimorfismo na posição 677 versus a presença de pelo menos
um dos polimorfismos versus ausência dos dois polimorfismos. Entretanto, após a
realização dessas análises estatísticas tanto com o grupo apresentando as
diversas causas de infertilidade, como com o grupo com infertilidade por fator
masculino, avaliando pacientes com idade até 35 anos e com idade até 30 anos,
observamos novamente diferença estatisticamente significante apenas na
porcentagem maior de oócitos imaturos recuperados em pacientes apresentando
dois polimorfismos simultaneamente, infertilidade devido a fator masculino e idade
até 30 anos. Não observamos diferença dos resultados entre os grupos em
61
nenhuma das outras variáveis laboratoriais avaliadas.
Alguns estudos demonstraram que os altos níveis de homocisteína no líquido
folicular podem causar diminuição nas divisões celulares e alta fragmentação
embrionária, o que significa decréscimo tanto na qualidade oocitária quanto na
qualidade embrionária (Aitken et al., 1991; Berker et al., 2009). Embora tenhamos
apenas encontrado uma tendência à embriões de melhor qualidade em pacientes
com genótipo normal para o polimorfismo 677 do gene MTHFR, podemos
entender que este estudo está em concordância com outros estudos publicados
até o momento. Existe realmente uma grande preocupação em relação ao efeito
da ausência de ácido fólico, consequente hiperhomocisteínemia e mudanças na
hipometilação do DNA, pois processos epigenéticos complexos podem modificar
o estado genômico de metilação, fundamental na regulação gênica dos
mamíferos (Razin, Shemer, 1995). Além disso, os grupos Metil passam de ácido
fólico através de uma série de enzimas, contribuindo para a produção de S-
adenosilmetionina (SAM), o último doador metil envolvido em centenas de
reações biológicas de transmetilação. Dessa maneira, o ácido fólico torna-se
indispensável ao desenvolvimento embrionário (Lucock, 2000; Khosla et al., 2001;
Shi, Haaf, 2002).
Ainda que as consequências das altas concentrações de homocisteína no
fluído folicular não estejam totalmente claras, sabe-se que a homocisteína é um
thiol conhecido por liberar espécies reativas de oxigênio (ROS), sendo este um
fator importante para a maturação oocitária e fertilização. Altas concentrações de
ROS nos meios de cultura embrionárias têm demonstrado resultados como baixas
taxas de clivagem, altos índices de fragmentação embrionários, além de baixas
taxas de formação de blastocistos (Bedaiwy et al., 2004).
62
Dessa maneira, essa tendência a influenciar a qualidade embrionária talvez
seja consequência de alterações na metilação do DNA, resultando assim em
falência do desenvolvimento embrionário. Os embriões de fertilização in vitro são
comumente cultivados em meio de cultura carente de ácido fólico, vitamina B12,
metionina, S-adenosilmetionina (SAM), metabólitos e cofatores necessários a
metilação do DNA e outras proteínas e lipídios essenciais. Além do mais,
elevados níveis de SAM inibem alostericamente a MTHFR e a inabilidade de
processar a homocisteína e a metionina, ou remover a trans-sulfuração, leva a
elevação dos níveis de S-adenosilhomocisteína (SAH), a qual inibe a metilação de
DNA (De Cabo et al., 1994; Lee, Zhu, 2006 Matthews et al., 1984; Jencks,
Mathews, 1987).
Acreditamos que algumas limitações possam ter influenciado alguns de
nossos resultados. Inicialmente, a maior limitação de nosso estudo foi o baixo
número de pacientes que pode ter reduzido o poder estatístico de nossa
avaliação, trazendo dessa maneira resultados inferiores aos esperados.
Encontramos também outras limitações como a heterogeneidade de
características étnicas da população estudada, o que dificultou estabelecer um
perfil epidemiológico em relação aos polimorfismos C677T e A1298C do gene
MTHFR. Este fato deve-se a mistura étnica presente na população brasileira
estudada, ocorrida durante a sua formação, principalmente entre os grupos
parentais Ameríndio, Africano e Europeu.
Outro fator que também deve ser levado em consideração deve-se ao fato de
que foi indicado às pacientes o uso de ácido fólico (5 mg/dia) a fim de prevenir
defeitos no tubo neural. Por essa razão, o efeito negativo dos polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR pode ter sido potencialmente aliviado pela
63
administração das doses de ácido fólico pré-concepção, especialmente em
pacientes homozigotos T/T para o polimorfismo 677, pois o regime terapêutico
tem demonstrado ser mais efetivo em indivíduos que carregam a mutação em
ambos os alelos (Malinow et al., 1997). As deficiências severas de folato pré-
concepção e durante a gestação podem trazer problemas no desenvolvimento de
oócitos, foliculogènese, receptividade endometrial, implantação e
desenvolvimento fetal. Além disso, estudos recentes demonstraram correlação
positiva entre as concentrações de homocisteína folicular e o diâmetro dos
folículos (Boxmeer et al., 2008). Em 2007 foi realizado um estudo com 48 casais
onde as mulheres apresentavam elevadas concentrações de homocisteína, ao
dividirem essas pacientes em dois grupos, com e sem tratamento para
hiperomocisteinemia, observaram-se melhores resultados em relação às taxas de
gravidez no grupo com tratamento versus o grupo sem tratamento (47,8% x
17,3%), taxas de implantação (21,4% x 9,2%) e piores resultados em relação às
taxas de aborto (18,2% x 50%) (Pacchiarotti et al., 2007). Assim, a deficiência
severa de folato materno pré-concepção e durante a gestação tem sido
demonstrada como um fator que dificulta a fertilidade feminina e a viabilidade fetal
em diversos modelos animais, sendo o folato enfatizado essencialmente durante
o desenvolvimento folicular de mamíferos e desenvolvimento fetal (Mooij et al.,
1992). Em humanos a suplementação com ácido fólico pré concepção exerce um
efeito significativo nas concentrações de homocisteína intrafolicular o qual
influencia o microambiente de maturação oocitária além de posteriormente
impedir o comprometimento da qualidade dos embriões (Boxmeer et al., 2008).
Além do mais, o uso regular de suplementos multivitamínicos incluindo o folato
tem sido relatado como fator de diminuição dos riscos de infertilidade ovulatória
64
(Chavarro et al., 2008). Alguns outros riscos importantes devem ser levados em
consideração como complicações na gravidez, pois todos esses processos estão
envolvidos no desenvolvimento de oócitos, preparação da receptividade
endometrial, implantação embrionária e gravidez (Tamura, Picciano, 2006).
Dessa maneira, os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR estão
associados ao sucesso de ciclos de FIV e altas concentrações de folato antes da
gestação podem aumentar as chances de gestação gemelar, embora não
garantam o sucesso nos resultados dos ciclos de FIV (Haggatty et al., 2006).
Além disso, sabe-se que o genótipo do gene MTHFR está relacionado à
capacidade da mãe produzir embriões de melhor qualidade e que caso o
potencial genético exista, as concentrações de folato podem aumentar o potencial
de embriões viáveis aumentando então as chances de sucesso de bebês
nascidos (Haggatty et al., 2006).
Apesar das mutações do gene MTHFR já terem sido relacionadas a doenças
como a Síndrome de Down (James et al., 1999), malformações do tubo-neural e
outras malformações (Finnell et al., 1998; van der Put, et al., 1995), complicações
gestacionais (Ray et al., 1999) e perdas gestacionais recorrentes (Nelen et al.,
1998; Isolato et al., 2000; Zetterberg et al. 2002), as pesquisas em relação ao
papel dos polimorfismos C677T e A1298C na fertilidade estão em fase inicial e
ainda existem poucos estudos explorando a real influência desses polimorfismos
nos ciclos de fertilização in vitro. Dessa maneira, acreditamos que nosso estudo
vem enriquecer um pouco mais a literatura a respeito dos dados laboratoriais em
fertilização in vitro relacionados a esses polimorfismos principalmente em uma
população heterogênea como a população brasileira.
65
6. CONCLUSÕES
1. O polimorfismo C677T do gene MTHFR demonstrou associação com a
porcentagem de oócitos maduros e imaturos em ciclos de fertilização in
vitro.
2. O polimorfismo A1298C do gene MTHFR demonstrou associação com o
número de oócitos recuperados e qualidade de embriões provenientes de
fertilização in vitro.
66
7. ANEXOS
ANEXO 1:
Autorização do comitê de ética em pesquisa Faculdade Medicina ABC
67
ANEXO 2:
Registro na comissão nacional de ética em pesquisa (CONEP)
68
ANEXO 3:
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
AVALIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS 677 E 1298DO GENE MTHFR E SUA
CORRELAÇÃO COM OS INDICADORES DE FERTILIDADE EM
MULHERES INFÉRTEIS SUBMETIDAS A CICLOS DE REPRODUÇÃO
HUMANA ASSISTIDA
As seguintes informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. Nesta avaliação serão estudadas mulheres com infertilidade com o objetivo de avaliar fatores genéticos envolvidos nos resultados de reprodução assistida.
Serão obtidas amostras de 15 ml de sangue, por meio de coleta da veia do
antebraço, que serão utilizados para extração de DNA. Será utilizado material
estéril e descartável. Os desconfortos decorrentes da coleta podem ser dor e
vermelhidão no local, porém este procedimento não tem apresentado
complicações na clínica diária.
A qualquer etapa do estudo o paciente ou seu responsável terá acesso aos
profissionais relacionados com a pesquisa para o esclarecimento de dúvidas.
Os principais investigadores são Priscila Queiroz D´Elia e Prof. Dra. Denise
Maria Christofolini, que podem ser encontrados na FMABC, Rua Príncipe de
Gales 821, Departamento de Ginecologia, Disciplina de Genética e
reprodução Humana, telefone 11 – 4438-7299.
É garantida a liberdade de retirada de consentimento a qualquer momento e
deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade do seu
tratamento na instituição.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes,
não sendo divulgada a identificação de nenhum paciente. Os resultados
obtidos estarão à disposição do paciente.
Não há despesas pessoais decorrentes da pesquisa para o participante em
qualquer fase do estudo, incluindo exames e consulta. Também não há
compensação financeira relacionada à participação.
Na eventualidade de ocorrer qualquer dano pessoal causado direta ou
indiretamente pelos procedimentos propostos neste estudo (nexo casual
comprovado), o participante terá direito a tratamento médico na instituição,
bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
Acredito ter sido suficientemente esclarecido a respeito das informações que li
ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo. Por esse documento eu declaro minha decisão de participar do estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
69
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades, prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido.
---------------------------------------------------------------------------------Data
Assinatura do participante
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento livre e
Esclarecido deste paciente ou seu representante legal para participação neste
estudo.
-------------------------------------------------------------------------------Data
Assinatura do responsável pelo estudo
70
ANEXO 4:
Planilha de Dados
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº
Oócitos
% Oóc.Mad
% Oóc.Imat.
% Fert. Total
% Fert.
Normal
% Fert.
Anormal
% NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
1 LFFK Fator Masculino 25 Normal Homozigoto Positiva 16 81,3 12,5 80,0 80,0 0,0 20,0 50 50
3 MMG Fator Masculino 30 Homozigoto Homozigoto Negativa 6 50 33,3 100,0 100,0 0,0 0,0 66,7 33,3
4 ACM Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 21 81,0 19,0 88,2 70,6 20,0 5,9 76,9 23,1
6 KCMC Fator Masculino 34 Homozigoto Normal Negativa 20 100 0 80,0 50,0 37,5 20,0 30 70
7 VEMG Fator Masculino 30 Normal Normal Positiva 5 80 20 75,0 75,0 0,0 25,0 100 0
9 MS Fator Masculino 31 Normal Normal Positiva 8 100 0 87,5 62,5 28,6 12,5 100 0
11 SGC Fator Masculino 29 Homozigoto Normal Negativa 21 81,0 19,0 64,7 64,7 0,0 5,9 45,5 54,5
13 CRS Fator Masculino 35 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 66,7 16,7 40,0 40,0 0,0 60,0 100 0
18 RVR Casal
Sorodiscordante 34 Homozigoto Normal Negativa 6 83,3 16,7 80,0 80,0 0,0 20,0 40 60
19 GLR Fator Masculino 30 Normal Heterozigoto Negativa 8 100 0 62,5 50,0 20,0 12,5 50 50
24 ECSH Fator Masculino 32 Homozigoto Normal Negativa 19 84,2 10,5 68,8 68,8 0,0 31,3 90,9 9,1
26 LPM Endometriose I 28 Normal Normal Negativa 3 66,7 0,0 100,0 50,0 50,0 0,0 100 0
28 MYIH Fator Tubo Peritoneal 37 Heterozigoto Normal Negativa 10 100,0 0,0 80,0 50,0 37,5 0,0 100 0
33 ACPR Fator Tubo Peritoneal 36 Homozigoto Normal Negativa 4 100,0 100,0 100,0 100,0 0,0 0,0 50 50
39 VPS Fator Masculino 29 Normal Normal Negativa 13 84,6 7,7 45,5 36,4 20,0 54,5 50 50
40 FCO Fator Masculino 33 Heterozigoto Normal Positiva 9 100 0 66,7 55,6 16,7 33,3 100 0
46 ACS Fator Masculino 36 Normal Heterozigoto Negativa 7 85,7 14,3 50,0 50,0 0,0 33,3 0 100
50 DOPG Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 17 94,1 5,9 56,3 50,0 11,1 43,8 0 100
52 FRJM Fator Masculino 35 Homozigoto Normal Positiva 15 46,7 53,3 50,0 37,5 25,0 37,5 0 100
53 AAAO Fator Masculino 32 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 15 80 13,3 91,7 91,7 0,0 8,3 81,8 18,2
71
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
54 LRSLS Fator Masculino 25 Normal Heterozigoto Positiva 5 80 20 75,0 75,0 0,0 0,0 25 75
56 ACN Casal Sorodiscordante 34 Heterozigoto Normal Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100
57 SF Fator Masculino 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 66,7 16,7 75,0 75,0 0,0 25,0 0 100
59 JRL Fator Masculino 30 Heterozigoto Normal Negativa 7 71,4 28,6 80,0 80,0 0,0 20,0 75 25
60 ACL Casal Sorodiscordante 31 Heterozigoto Normal Positiva 12 83,3 0,0 90,0 80,0 11,1 10,0 12,5 87,5
67 CSA ISCA 27 Heterozigoto Heterozigoto Não Transferido 23 100,0 0,0 78,3 69,6 11,1 21,7 93,8 6,25
70 EGILV Fator Masculino 33 Homozigoto Normal Positiva 8 50 25 75,0 75,0 0,0 25,0 33,3 66,7
71 FM ISCA 33 Normal Heterozigoto Positiva 6 66,7 33,3 50,0 16,7 66,7 50,0 100 0
73 DRSB Fator Tubo Peritoneal 36 Normal Heterozigoto Negativa 8 100,0 0,0 87,5 75,0 14,3 12,5 66,7 33,3
81 JRCV Endometriose I 33 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100
90 ARLT ISCA 37 Heterozigoto Normal Negativa 5 80,0 0,0 100,0 75,0 25,0 0,0 33,3 66,7
91 FM Fator Masculino 35 Normal Normal Não Transferido 9 88,9 11,1 25,0 0,0 100,0 62,5 0 0
95 EMA Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Positiva 15 86,7 13,3 76,9 69,2 10,0 23,1 11,1 88,9
96 AASM Endometriose II 32 Normal Heterozigoto Positiva 8 62,5 0,0 80,0 80,0 0,0 20,0 0 100
99 VGGS Fator Tubo Peritoneal 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 4 75,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 66,7 33,3
102 DBS Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 4 75 25 66,7 66,7 0,0 0,0 100 0
104 CDS Fator Masculino 29 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 12 66,7 25 75,0 50,0 33,3 25,0 100 0
108 VJSL Fator Tubo Peritoneal 32 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 75,0 12,5 75,0 62,5 16,7 0,0 80 20
110 TCS Fator Tubo Peritoneal 35 Heterozigoto Normal Negativa 5 100,0 0,0 80,0 80,0 0,0 0,0 75 25
112 FAZ Fator Masculino 28 Heterozigoto Normal Positiva 8 87,5 12,5 71,4 57,1 20,0 0,0 75 25
72
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
117 JO Casal Sorodiscordante 29 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 16 81,3 18,8 23,1 23,1 0,0 69,2 33,3 66,7
121 GSPP Fator Masculino 22 Homozigoto Normal Negativa 4 100 0 50,0 25,0 50,0 50,0 100 0
124 MBN Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Não Transferido 12 66,7 25 33,3 33,3 0,0 33,3 25 75
126 ABL Fator Masculino 34 Homozigoto Normal Não Transferido 24 45,8 50 54,5 54,5 0,0 36,4 54,5 45,5
128 RMSE Fator Masculino 29 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 83,3 16,7 40,0 20,0 50,0 60,0 0 100
132 GF ISCA 36 Heterozigoto Normal Negativa 15 100,0 0,0 40,0 40,0 0,0 60,0 33,3 66,7
135 JBNS Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Não Transferido 4 100 0 25,0 0,0 100,0 50,0 0 0
138 AMRS Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 7 71,4 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20
139 PF Fator Masculino 26 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 14 78,6 14,3 45,5 45,5 0,0 36,4 20 80
144 SCSA Fator Masculino 28 Normal Normal Positiva 12 100 0 91,7 83,3 9,1 8,3 70 30
145 ROJ Fator Masculino 31 Normal Normal Positiva 8 100 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3
146 TCSL Fator Masculino 23 Normal Heterozigoto Negativa 18 27,8 0 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20
151 AMF ISCA 34 Normal Heterozigoto Negativa 4 100,0 0,0 50,0 25,0 50,0 50,0 50 50
156 KSLO Fator Tubo Peritoneal 32 Heterozigoto Normal Negativa 7 85,7 14,3 85,7 85,7 0,0 0,0 66,7 33,3
159 AB Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 83,3 16,7 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20
160 FACV Fator Masculino 29 Normal Normal Negativa 6 100 0 66,7 50,0 25,0 0,0 66,7 33,3
161 PMS ISCA 32 Heterozigoto Normal Negativa 7 28,6 57,1 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100
163 DCSV Fator Masculino 36 Normal Normal Negativa 8 75 12,5 33,3 33,3 0,0 50,0 0 100
164 LGR Fator Masculino 31 Heterozigoto Normal Não Transferido 32 62,5 28,1 80,0 80,0 0,0 15,0 47,8 52,2
168 MFS ISCA 36 Homozigoto Heterozigoto Negativa 11 63,6 18,2 57,1 57,1 0,0 42,9 100 0
73
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total
% Fert.
Normal
% Fert.
Anormal
% NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
177 RGA Fator Masculino 36 Normal Normal Negativa 3 100 0 33,3 33,3 0,0 33,3 0 100
188 AKN ISCA 30 Normal Homozigoto Negativa 20 60,0 40,0 100,0 83,3 16,7 0,0 70 30
189 RHC Casal Sorodiscordante 36 Heterozigoto Normal Negativa 5 80,0 20,0 100,0 50,0 50,0 0,0 50 50
192 KMC Fator Tubo Peritoneal 35 Normal Normal Positiva 6 66,7 16,7 75,0 75,0 0,0 0,0 33,3 66,7
195 RCZ Fator Masculino 26 Normal Normal Negativa 12 100 8,3 66,7 66,7 0,0 33,3 100 0
198 CC Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 7 85,7 14,3 66,7 66,7 0,0 33,3 50 50
202 JJNA Fator Masculino 27 Heterozigoto Normal Não Transferido 7 71,4 28,6 0,0 0,0 * 83,3 0 0
205 SLR Fator Masculino 33 Heterozigoto Normal Negativa 6 50 50 33,3 33,3 0,0 66,7 100 0
209 RSP Fator Masculino 20 Heterozigoto Normal Positiva 5 80 0 75,0 50,0 33,3 0,0 50 50
210 FALS Fator Masculino 31 Normal Heterozigoto Positiva 3 66,7 33,3 33,3 33,3 0,0 33,3 100 0
211 ASV Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Positiva 8 62,5 0 80,0 60,0 25,0 20,0 66,7 33,3
214 SEM ISCA 31 Normal Normal Não Transferido 4 50,0 0,0 0,0 0,0 * 100,0 0 0
219 CAC Endometriose I 34 Normal Heterozigoto Negativa 7 57,1 42,9 75,0 75,0 0,0 25,0 100 0
224 RAP Fator Masculino 31 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 80 0 25,0 25,0 0,0 25,0 100 0
228 EVC Fator Masculino 24 Normal Homozigoto Negativa 22 27,3 0 33,3 33,3 0,0 50,0 0 100
229 TASC Fator Masculino 27 Heterozigoto Normal Não Transferido 21 57,1 28,6 58,3 50,0 14,3 25,0 16,7 83,3
233 MPBT Fator Tubo Peritoneal 30 Heterozigoto Normal Negativa 7 85,7 14,3 66,7 66,7 0,0 33,3 50 50
238 NJC Fator Masculino 32 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 62,5 37,5 60,0 40,0 33,3 40,0 50 50
243 CNKK Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 10 40 50 25,0 25,0 0,0 75,0 100 0
245 RFS Fator Masculino 27 Normal Normal Negativa 13 84,6 15,4 90,9 54,5 40,0 0,0 66,7 33,3
74
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
250 ASP Endometriose 37 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 11 72,7 27,3 62,5 50,0 20,0 37,5 100 0
252 FCDR Aborto de Repetição 27 Heterozigoto Normal Positiva 11 90,9 0,0 90,0 80,0 11,1 10,0 11,1 88,9
254 CBL Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 21 66,7 23,8 57,1 57,1 0,0 42,9 75 25
262 CGFL Fator Masculino 27 Homozigoto Heterozigoto Negativa 5 80 20 100,0 100,0 0,0 0,0 75 25
263 MAS Fator Tubo Peritoneal 36 Normal Homozigoto Negativa 13 46,2 0,0 83,3 83,3 0,0 16,7 40 60
271 AMPM Fator Masculino 30 Normal Normal Positiva 18 66,7 16,7 83,3 83,3 0,0 16,7 70 30
275 SMSA Fator Masculino 30 Normal Heterozigoto Negativa 3 100 0 66,7 66,7 0,0 33,3 100 0
278 SRS Fator Masculino 29 Normal Heterozigoto Negativa 5 80 0 25,0 25,0 0,0 75,0 100 0
280 EARS Endometriose I 31 Normal Normal Não Transferido 8 25,0 75,0 0,0 0,0 * 100,0 0 0
286 MAP Fator Masculino 37 Heterozigoto Normal Negativa 9 66,7 11,1 66,7 50,0 25,0 16,7 0 100
288 MGOF Fator Masculino 34 Heterozigoto Normal Não Transferido 22 81,8 13,6 77,8 72,2 7,1 22,2 75 25
289 CMO Fator Masculino 29 Normal Homozigoto Negativa 8 87,5 0 100,0 100,0 0,0 0,0 85,7 14,3
291 APMM Endometriose I 35 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 18 94,4 11,1 94,1 76,5 18,8 0,0 84,6 15,4
293 RMS Fator Masculino 31 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 24 83,3 12,5 75,0 66,7 11,1 4,2 100 0
295 BMSMS Fator Masculino 36 Heterozigoto Normal Positiva 38 10,5 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3
304 SCGB ISCA 32 Heterozigoto Normal Positiva 7 85,7 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 83,3 16,7
307 SOSP Fator Masculino 29 Homozigoto Normal Negativa 3 100 0 66,7 66,7 0,0 33,3 0 100
312 JRL Fator Masculino 31 Heterozigoto Normal Negativa 8 62,5 12,5 100,0 100,0 0,0 0,0 60 40
314 RIM Fator Masculino 35 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 8 75 25 50,0 50,0 0,0 50,0 66,7 33,3
317 AAGB Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 3 100 0 33,3 33,3 0,0 66,7 0 100
75
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
318 KB ISCA 35 Normal Heterozigoto Negativa 4 100,0 0,0 100,0 75,0 25,0 0,0 75 25
319 GLS Fator Tubo Peritoneal 37 Heterozigoto Normal Negativa 8 87,5 12,5 85,7 85,7 0,0 14,3 83,3 16,7
320 CHS Endometriose I 31 Normal Heterozigoto Positiva 15 86,7 13,3 76,9 69,2 10,0 23,1 88,9 11,1
324 VMDGG Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 18 66,7 33,3 91,7 83,3 9,1 8,3 70 30
326 GCV Fator Masculino 32 Heterozigoto Normal Negativa 9 88,9 11,1 75,0 50,0 33,3 12,5 50 50
328 EMGDP Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Normal Negativa 7 57,1 14,3 75,0 75,0 0,0 0,0 100 0
332 LGS ISCA 36 Normal Normal Negativa 10 100,0 0,0 90,0 50,0 44,4 0,0 57,1 42,9
340 RPS ISCA 32 Normal Normal Negativa 10 100,0 0,0 90,0 80,0 11,1 0,0 87,5 12,5
345 MRML Fator Masculino 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 9 100 0 88,9 88,9 0,0 11,1 0 100
346 APS Fator Masculino 35 Heterozigoto Normal Negativa 6 50 50 33,3 33,3 0,0 66,7 0 100
349 AMCP Fator Masculino 29 Heterozigoto Normal Positiva 13 84,6 7,7 81,8 81,8 0,0 18,2 66,7 33,3
354 FVL Fator Tubo Peritoneal 30 Heterozigoto Normal Positiva 8 87,5 12,5 75,0 62,5 16,7 12,5 60 40
357 MAZPS Fator Tubo Peritoneal 28 Heterozigoto Normal Negativa 5 100,0 0,0 80,0 80,0 0,0 20,0 20 80
360 EMT ISCA 33 Normal Heterozigoto Negativa 6 100,0 0,0 50,0 50,0 0,0 50,0 66,7 33,3
362 EB Endometriose II 31 Normal Normal Positiva 7 71,4 28,6 60,0 60,0 0,0 40,0 66,7 33,3
364 DPS Fator Masculino 36 Homozigoto Normal Positiva 12 100 0 100,0 58,3 41,7 0,0 28,6 71,4
365 FLNJ Fator Masculino 33 Normal Normal Positiva 11 90,9 9,1 90,0 90,0 0,0 10,0 44,4 55,6
369 FBZ Endometriose 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 100,0 0,0 100,0 83,3 16,7 0,0 40 60
371 ACI Fator Tubo Peritoneal 32 Homozigoto Normal Negativa 6 100,0 0,0 83,3 50,0 40,0 16,7 100 0
373 KCOB Fator Tubo Peritoneal 34 Normal Normal Negativa 5 60,0 20,0 33,3 33,3 0,0 0,0 100 0
76
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
376 POP Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 87,5 0 85,7 71,4 16,7 14,3 60 40
378 KMA ISCA 37 Heterozigoto Normal Não Transferido 3 100,0 0,0 33,3 0,0 100,0 66,7 0 0
390 RAL Endometriose 33 Normal Normal Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100
393 MN Endometriose II 32 Heterozigoto Homozigoto Negativa 6 66,7 16,7 80,0 40,0 50,0 0,0 50 50
395 RAS Endometriose 35 Homozigoto Normal Negativa 7 100,0 0,0 71,4 71,4 0,0 14,3 80 20
396 CCR Fator Tubo Peritoneal 34 Normal Normal Negativa 7 85,7 14,3 100,0 100,0 0,0 0,0 50 50
397 AALD Endometriose I 31 Heterozigoto Normal Negativa 10 70,0 30,0 71,4 57,1 20,0 28,6 50 50
398 MSP Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 13 76,9 23,1 80,0 60,0 25,0 10,0 0 100
403 MMCB Fator Masculino 34 Heterozigoto Normal Positiva 12 66,7 33,3 50,0 50,0 0,0 50,0 83,3 16,7
408 PACX ISCA 26 Normal Homozigoto Negativa 6 100,0 0,0 83,3 66,7 20,0 0,0 75 25
411 HML ISCA 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 100,0 0,0 60,0 40,0 33,3 20,0 0 100
412 SCOS Endometriose I 37 Heterozigoto Normal Negativa 4 75,0 0,0 100,0 33,3 66,7 0,0 0 100
413 MGF Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Negativa 4 100 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3
421 VBB Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Negativa 10 90 10 77,8 66,7 14,3 11,1 28,6 71,4
423 JFMS Fator Masculino 32 Normal Normal Negativa 5 80 20 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100
424 PVLB Fator Tubo Peritoneal 35 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 17 82,4 17,6 85,7 78,6 8,3 7,1 45,5 54,5
428 LCT Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Negativa 5 100 0 40,0 20,0 50,0 40,0 100 0
431 DPDO Fator Tubo Peritoneal 37 Normal Normal Negativa 10 80,0 10,0 100,0 75,0 25,0 0,0 33,3 66,7
436 CVRC Fator Masculino 37 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 37,5 37,5 66,7 33,3 50,0 33,3 100 0
439 SCS Endometriose I 34 Normal Normal Negativa 6 50,0 16,7 66,7 33,3 50,0 33,3 0 100
77
Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %
Oóc.Mad %
Oóc.Imat. %
Fert. Total %
Fert. Normal %
Fert. Anormal % NF
% Bons
Embriões
% Embriões
Ruins
445 VGRP ISCA 34 Homozigoto Normal Negativa 5 100 0 80,0 80,0 0,0 20,0 75 25
457 LFS Fator Masculino 28 Normal Normal Negativa 12 100 0 75,0 58,3 22,2 25,0 50 50
470 LMS Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 11 63,6 36,4 85,7 85,7 0,0 14,3 83,3 16,7
489 MRNA ISCA 34 Normal Heterozigoto Negativa 3 100 0 66,7 33,3 50,0 33,3 100 0
490 APC ISCA 36 Normal Heterozigoto Negativa 5 100 0 60,0 60,0 0,0 40,0 100 0
492 APPMC Endometriose I 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 100 0 80,0 80,0 0,0 20,0 100 0
78
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Introdução: Acredita-se que o folato apresente crucial importância nos processos de reprodução humana e, que sua deficiência possa comprometer a função das vias metabólicas relacionadas, conduzindo a um acúmulo de homocisteína (hcy). O gene MTHFR codificador da enzima 5-MTHFR que metaboliza essas reações e os polimorfismos C677T e A1298C desse gene estão relacionados à diminuição da atividade enzimática e consequente alterações nos níveis de hcy. Essas alterações relacionam-se a diversas doenças e comprometem etapas do mecanismo reprodutivo.
Objetivo: Verificar o impacto entre os polimorfismos do gene MTHFR e variáveis laboratoriais em mulheres brasileiras submetidas às técnicas de reprodução assistida (TRA).
Casuística e Métodos: Estudo prospectivo, realizado no Serviço de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina do ABC – Instituto Ideia Fértil, de Dezembro 2010 a Abril 2012, onde em 146 mulheres foi realizada genotipagem para os polimorfismos 677 e 1298 do gene MTHFR e avaliação dos resultados laboratoriais e gestação. Para a análise estatística utilizou-se teste de Shapiro-Wilk (p<0,05), Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e qui-quadrado. As pacientes foram separadas em dois grupos (diversas causas de infertilidade e apenas fator masculino) e avaliadas de três maneiras: pacientes com até 37 anos, pacientes com até 35 anos e pacientes com até 30 anos. Para os três grupos foram comparados polimorfismo ausente (normais) x polimorfismo presente (mutado) nos pontos 677 e 1298 e presença do genótipo mutado 677 e 1298 concomitantemente. Os dados foram analisados em relação a idade, número de oócitos recuperados, (%) oócitos maduros, (%) oócitos imaturos, (%) fertilização normal, (%) NF, (%) bons embriões e taxas de gestação.
Resultados: Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes na avaliação das pacientes apresentando apenas fator masculino de infertilidade em relação ao número oócitos recuperados nas avaliações do polimorfismo 1298 idade até 37 anos/idade até 35 anos, (%) oócitos maduros avaliações do polimorfismo 677 idade até 37 anos/ idade até 35 anos, (%) imaturos avaliações do polimorfismo 677 idade até 37 anos/ idade até 35 anos/idade até 30 anos e ausência de polimorfismos idade até 30 anos. Observou-se também (%) de melhores embriões no grupo de pacientes com diversas causas de infertilidade para o grupo mutado do polimorfismo 1298.
Conclusão: Os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR demonstraram associação com ao número de oócitos recuperados e porcentagem de oócitos imaturos em ciclos de fertilização in vitro.
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D'ELIA PQ. Impact of polymorphisms C677T and A1298C of MTHFR gene in Brazilian women and results of in vitro fertilization. Tese. Doutorado. 2012.
Introduction: It is believed that folate has a crucial function in human reproduction process, and it’s deficiency can compromise function of metabolic pathways correlated, leading to an accumulation of homocysteine (Hcy). MTHFR gene encodes 5-MTHFR enzyme, responsible to metabolize these reactions and C677T/A1298C polymorphisms of this gene are related to decrease enzyme activity and consequent changes in Hcy levels. These changes are related to several diseases and can compromise reproductive system.
Objective: The aim of this study is to evaluate the impact between MTHFR gene polymorphisms and laboratory variables in brazilian women undergoing assisted reproduction techniques (ART).
Patients and Methods: Prospective study performed in Human Reproduction Department at Medicine ABC University – Ideia Fértil Institute, between December 2010 and April 2012, with 146 women submitted to MTHFR C677T and A1298C polymorphism genotyping and laboratory results/ pregnancy rates evaluation. For statistical analysis we used the Shapiro-Wilk (p <0.05), Mann-Whitney, Kruskal-Wallis and chi-square tests. Patients were separated into two groups (various causes of infertility and male factor only) and evaluated in three ways: patients up to 37 years, patients up to 35 years and patients up to 30 years. The three groups were compared: patients with no incidence polymorphism (normal) with patients with presence of polymorphism (mutated) of 677 and 1298 loci. The presence of polymorphisms C677T and A1298C simultaneously also were accessed. Data were analyzed in relation to age, number of oocytes retrieved (%) mature oocytes (%) immature oocytes, normal fertilization rate (%), (%) NF, (%) good quality embryos and pregnancy rates.
Results: Our evaluation demonstrated statistically significant differences in patients presenting only male factor infertility in relation to the number of oocytes retrieved in evaluations of polymorphism on age up to 37 years / age up to 35 years, (%) mature oocytes evaluation of polymorphism 677 on age up to 37 years / age up to 35 years, (%) immature oocytes evaluation of polymorphism 677 age up to 37 years / age up to 35 years / age up to 30 years and absence of polymorphisms group on age up to 30 years. It was also observed (%) of good quality embryos in patients with different causes of infertility for mutated group of 1298 polymorphism.
Conclusion: C677T and A1298C MTHFR gene polymorphisms showed association with the number of oocytes retrieved and the percentage of immature oocytes of in vitro fertilization cycles.
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