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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D

(VDR) E SUA RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO

Helicobacter pylori NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

DINELMA DE JESUS MARTINS

Belém-Pará

2015


POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D

(VDR) E SUA RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO

Helicobacter pylori NA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

Dissertação apresentada ao Programa Pós-

Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito

parcial para a obtenção do grau de Mestre em

Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Profa. Dra. Tereza Cristina de

Oliveira Corvelo.

Belém-Pará

2015


POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR HUMANO DE VITAMINA D (VDR) E SUA

RELAÇÃO NA EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO PELO Helicobacter pylori NA

REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM/PA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientador:

Profa. Dra. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo

Instituto de Ciências Biológicas/UFPA

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves (Avaliador)


Profa. Dra. Delia Cristina Figueira Aguiar (Avaliadora)


Prof. Dra. Hilma Lúcia Tavares Dias, UFPA (Suplente)

Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento

Rural/UFPA

Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto (Suplente)


Belém, 31 de Agosto de 2015

“Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor,

mas, lutamos para que o melhor fosse feito. Não

somos o que deveríamos ser, não somos o que

iremos ser; mas, graças a Deus, já não somos

mais o que éramos”.

(Martin Luther King)

DEDICATÓRIA

A minha mãe, Adelvina França, por seu amor

incondicional, dedicação e exemplo. Ao meu

irmão, Daniel de Jesus Martins, por acreditar no

meu sucesso. A minha avó, Maria Tereza

França, que cuidou de mim durante uma boa

parte de minha infância. Seus ensinamentos

contribuíram muito para a formação do meu

caráter.

AGRADECIMENTOS

A Deus, o único digno de louvor e adoração, aquele que é a própria expressão do amor,

cujo sentimento se reflete na vida de suas criaturas. Através dele, encontrei esperança. Por seu

amor, encontrei a vida eterna e nos momentos de aflição recebi o milagre da cura.

A minha mãe, Adelvina Maria França de Jesus, pois a luz divina revestiu-se na figura

materna como expressão do amor celestial. Esse amor que não mede esforços, que ultrapassa

barreiras, que luta a qualquer custo pela felicidade de sua prole. Um sentimento sublime, que

mesmo diante das agruras da vida, não desiste. A vitória do seu rebento é fruto de seu amor

abnegado, que doa o seu tempo, que é capaz de lançar mão de seus sonhos para viver o maior

deles, o dom de ser mãe.

Ao meu irmão, Daniel de Jesus Martins, pelo companheirismo e momentos de alegria.

À Professora Dra. Tereza Corvelo, pela orientação deste trabalho. Seu empenho,

conselhos, paciência e profissionalismo foram essenciais para o desenvolvimento e conclusão

desta dissertação. Obrigada pelos ensinamentos que contribuíram para o meu crescimento

profissional e que me auxiliaram a divisar novos horizontes no campo do saber.

A Gisely Matos, que não mediu esforços em repassar seus conhecimentos acadêmicos,

estando presente em cada etapa deste trabalho. A Rosane Loyola, pelas orientações e conselhos.

Aos amigos do Laboratório de Imunogenética da UFPA, Rafael Carvalho, Isabella

Oliveira, Camille Sena, Eny Valente, Andreza Oliveira, Marcelo Vieira e Lenor Mandu pela

amizade e por fazerem parte da minha trajetória acadêmica.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação de Biologia em Agentes Infecciosos

e Parasitários, pela competência e ensinamentos valiosos.

Sumário LISTA DE TABELAS E QUADROS......................................................................................... 7

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ........................................................ 8

RESUMO ...................................................................................................................................... 10

ABSTRACT ................................................................................................................................. 11

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 12

1.1. Helicobacter pylori ............................................................................................................ 12

1.1.2. Características gerais................................................................................................ 12

1.1.3. Epidemiologia da infecção pela Helicobacter pylori............................................14

1.1.4. Rotas de transmissão ................................................................................................ 15

1.1.5. Patogenia da Helicobacter pylori ............................................................................. 17

1.2 VITAMINA D ..................................................................................................................... 19

1.2.1. Definição química e metabólitos ............................................................................. 19

1.2.2. Metabolismo da vitamina D..................................................................................... 20

1.2.3. Níveis séricos da vitamina D e fatores determinantes ......................................... 21

1.2.4 Receptor de vitamina D (VDR) ................................................................................ 21

1.2.5. Aspectos imunológicos da vitamina D.................................................................... 22

1.2.6. Gene VDR ................................................................................................................... 23

1.2.7. Polimorfismo do gene VDR ..................................................................................... 24

1.2.8. Variação étnica dos polimorfismos do gene VDR ................................................ 26

1.3. VITAMINA D e Helicobacter. pylori .............................................................................. 28

2.OBJETIVOS ............................................................................................................................. 30

2.1 OBJETIVO GERAL: .......................................................................................................... 30

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 30

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 31

3.1. CASUÍSTICA .................................................................................................................... 31

3.2. CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS ...................................................................... 31

3.3. INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO.................................................................................. 32

3.4. ASPECTOS ÉTICOS ........................................................................................................ 32

3.5. DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS .................................................... 32

3.5.1. Extração do DNA bacteriano e humano ................................................................ 32

3.5.2 Detecção da Helicobacter pylori por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

................................................................................................................................................ 32

3.5.3. Amplificação e detecção dos polimorfismos do gene do receptor humano de

vitamina D (VDR) por RFLP-PCR ................................................................................... 33

3.5.4. Análise estatística dos dados .................................................................................... 34

4. RESULTADOS ........................................................................................................................ 36

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 45

6. CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 53

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................... 54

APÊNDICE .................................................................................................................................. 73

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1- Características demográficas e epidemiológicas dos grupos investigados. ............. 36

Tabela 2- Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene VDR em grupo de

infectados e não infectados pela H. pylori na região metropolitana de Belém-PA................... 38

Tabela 3- Distribuição genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR em relação com a fraca

intensidade de atividade neutrofílica no grupo de infectados e não infectados pela H. pylori,

Belém-PA. ..................................................................................................................................... 40

Tabela 4- Distribuição das frequências haplotípicas (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) do gene VDR

nos grupos de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA. ................... 41

Tabela 5- Testes do desequilíbrio de ligação entre os 4 SNPs no gene VDR nos grupos

estudados. Belém-PA. ................................................................................................................... 43

Tabela 6- Comparação entre as distribuições de frequências dos SNPs genotipados e dos

haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) nos grupos estudados entre diferentes populações.................... 43

Tabela 7- Os valores do teste de diferenciação entre pares de população (Fst) na comparação

de frequências locus a locus de amostras brasileiras e referências étnicas do HAPMAP. ....... 44

Quadro 1- Distribuição das frequências alélicas dos polimorfimos no gene VDR provenientes

de grupos étnicos do projeto Hapmap. ......................................................................................... 27

Quadro 2- Identificação dos oligonucleotídeos iniciadores (primer), temperaturas

(anelamento) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do

gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). ................................................................................ 33

Quadro 3 - Identificação das endonucleases de restrição, temperaturas de incubação (digestão

enzimática) e seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do

gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000). ................................................................................ 34

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

µL Microlitro

Bab A Proteína de adesão aos antígenos de grupos sanguíneos

cagA Gene codificante da citoxina CagA

cagA Proteína de adesão aos antígenos e grupos sanguíneos

cagPAI Região da ilha de patogenicidade do cromossoma da bactéria

dupA Gene promotor de úlcera duodenal

DNA Ácido desoxirribonucleico

ELISA Ensaio imunoenzimático

GM-CFS Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos

H. pylori Helicobacter pylori

IgG Imunoglobulina de cadeia pesada ϒ (gama)

IL Interleucina

IFN Interferon

Leb Antígeno Lewis b de grupo sanguíneo

NADPH Coenzima doadora de hidrogênio em sínteses redutoras e em reações para proteção

contra compostos oxidantes

OMP Famílias de proteínas da membrana externa

OipA Proteína inflamatória A da membrana externa

RFLP Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição

rRNA Ácido ribonucleico ribossomal

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

SabA Adesina ligante ao ácido siálico

SNP Polimorfismos de nucleotídeo único

TNF Fator de necrose tumoral

UVB Radiação ultravioleta B

VDR Receptor nuclear de vitamina D humano

vacA Gene codificante da toxina VacA

VacA Citocina vacuolizante

RESUMO

O Helicobacter pylori é um importante patógeno no contexto da saúde pública, pois está

relacionado a etiopatogênese de muitas desordens gástricas. Os fatores genéticos do

hospedeiro, aliado às características do ambiente e diversidade das estirpes bacterianas

contribuem de forma significativa no estabelecimento, progressão e no desdobramento clínico

da infecção. A vitamina D pode influenciar nesse processo, haja vista que ela é considerada

um potente modulador do sistema imune inato e adaptativo. Neste contexto, o presente estudo

teve como objetivo investigar a associação dos polimorfismos do gene receptor de vitamina

D humano (VDR) com a presença da infecção causada pelo Helicobacter pylori. Para tanto,

foi realizado um estudo transversal, analítico-descritivo, incluindo 208 indivíduos adultos

com sintomatologias gástricas residentes na região metropolitana de Belém. A presença da

infecção foi determinada a partir de análises histopatológicas e amplificação de DNA

bacteriano por reação em cadeia de polimerase (PCR). Para genotipagem dos polimorfismos

do gene VDR, a saber: BsmI (rs15444101), TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232) e FokI

(rs228570) foi empregada a técnica de PCR-RFLP, seguida da digestão com endonucleases

específicas. Assim, a infecção pela H. pylori foi detectada em 56,25% dos pacientes

pesquisados. Na análise das proporções genotípicas e alélicas dos polimorfismos FokI, ApaI

e TaqI, verificou-se que não existiu diferenças na distribuição dessas proporções entre as

amostras positivas e negativas para H. pylori, sendo que estas frequências amostrais estão

compatíveis com o modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em relação ao polimorfismo

BsmI, foi observado um desvio significativo das frequências genotípicas observadas em

relação as esperadas pelo teste de Hardy-Weinberg, ocorrendo um aumento do genótipo bb

entre indivíduos com H. pylori positivo quando comparados com aqueles sem a infecção,

63,25% versus 50,55%, respectivamente. E ainda foi notado um aumento de 20,7% na

frequência de heterozigotos Bb no grupo com H. pylori negativo em relação ao grupo de

infectados, 37,36% versus 17,09%, respectivamente. Desse modo, os resultados apresentados

neste estudo apontam para uma possível associação do polimorfismo BsmI com a infecção

pela H. pylori. Entretanto, como ainda não foram descritas evidências consistentes de uma

alteração funcional do receptor VDR com este SNP, se faz necessário efetuar abordagens

mais extensas a nível molecular e que considere os níveis séricos da vitamina D nos pacientes

com desordens gástricas, a fim de esclarecer melhor a relação destes polimorfismos no

receptor VDR com a etiopatogênese da infecção pela H. pylori.

Palavras-chave: Helicobacter pylori, Vitamina D, Polimorfismo, Gene VDR

ABSTRACT

The Helicobacter pylori is an important pathogen in public health context due its relation to

the etiopathogenesis of many gastric disorders. The host genetic factors, environmental

characteristics and the bacterial strain diversity contribute significantly to establishment,

progression and clinical development of the H. pylori infection. The vitamin D may influence

in this process because it is considered a strong modulator of innate and humoral immunities.

In this context, this study aims to investigate the association between the human vitamin D

receptor gene (VDR) and the Helicobacter pylori infection. Thus, a cross-sectional, descriptive

and analytical study was conducted on 208 adult patients with upper gastrointestinal symptoms

living in the Metropolitan Region of Belem. The presence of H. pylori in gastric biopsies

sample was investigated by histopathological analysis and bacterial DNA amplification

through Polymerase Chain Reaction (PCR).Patients were genotyped for VDR gene

polymorphisms BsmI (rs15444101), TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232) and FokI (rs2228570)

by PCR-RFLP assays followed by specific endonucleases digestion. This way, the H. pylori

infection was detected in 56.25% of patients. In allele and genotypic proportions, analysis of

FokI, ApaI and TaqI polymorphisms did not show distribution differences of H. pylori positive

and negative samples proportions and theses samples frequencies were compatible with Hardy-

Weinberg equilibrium model. The genotype distribution observed for polymorphism BsmI

deviated significantly from the expected by Hardy-Weinberg test, there was a bb genotype

increase among H. pylori positive individuals when compared to those without infection,

63,25% versus 50,55% respectively. In addition, was also noticed a 20,7% increase into Bb

heterozygous frequencies in H. pylori negative group against infected group, 37,36% versus

17,09% respectively. Thereby, the obtained results indicate a possible association between

BsmI polymorphism and H. pylori infection. However, the conclusive evidence for functional

alteration in VDR receptor has not yet been found for this SNP, it is necessary to make more

extent approaches at molecular level which consider Vitamin D serum levels on patients who

have gastric disorders, with the aim to clarify the relation between those VDR receptor polymorphisms and etiopathogenesis of H. pylori infection.

Keywords: Helicobacter pylori, Vitamin D, Polymorphism, VDR gene.

12

1. INTRODUÇÃO

1.1. Helicobacter pylori

A Helicobacter pylori foi descrita pela primeira vez pelos pesquisadores Warren e

Marshall, em 1983, a partir de fragmentos de biópsias gástricas de pacientes com gastrite

crônica e úlcera péptica (Marshall & Warren, 1983). A princípio, este microrganismo foi

classificado no gênero Campylobacter, mas após análises da sua estrutura gênica e de outros

parâmetros bioquímicos, verificou-se, em 1989, que esta bactéria não pertencia ao gênero

descrito inicialmente e, portanto, foi reconhecido um novo gênero, denominado de

Helicobacter (Blaser, 1996; Velázquez & Feirtag, 1999).

De acordo com o sítio eletrônico “List of Prokaryotic Names with Standing in

Nomenclature”, o gênero Helicobacter é constituído de 34 espécies classificadas conforme a

análise do gene rRNA 16S, ácidos graxos e filamentos flagelares. Das espécies que podem ser

encontradas em associação com os processos infecciosos no homem, a H. pylori é

particularmente importante no contexto da saúde pública, pois este microrganismo está

relacionado à etiopatogênese de muitas desordens gástricas (Alcântara-Hernandez et al., 2014;

Huang & Chiou, 2014; Prabhu & Shivani, 2014) e existem evidências que a infecção pela H.

pylori esteja presente em 75% dos casos de adenocarcinoma gástrico (Greenfield & Jones,

2013), sendo classificada pela International Agency for Research on Cancer como carcinógeno

do tipo I (Bouvard et al., 2009).

Em 2012, as neoplasias malignas configuraram-se entre as principais causas de morte

no mundo, sendo responsável por 8,2 milhões de óbito. Deste total, o câncer de estômago foi o

terceiro mais frequente, com 723.000 casos fatais (WHO, 2012). No Brasil, a incidência câncer

gástrico prevista para 2014 foi de 12.870 caso novos em homens e 7.520 casos novos em

mulheres, o que corresponde a um risco estimado de 13,19 casos novos a cada 100 mil homens

e 7,41 casos novos a cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores de pele e melanoma,

este tipo de câncer é o segundo mais frequente em homens (11,10/100.000) e o terceiro em

mulheres (5,91/100.000) na região Norte (Ministério da Saúde, 2014).

1.1.2. Características gerais

A H. pylori é uma bactéria Gram-negativa, não esporulada, microaerofílica, que

coloniza a mucosa gástrica humana (Marshall & Warren, 1983). Ela é constituída de quatro a

seis flagelos helicoidais do tipo unipolar, sendo que cada componente flagelar apresenta

13

dimensões de aproximadamente 30 μm de comprimento e 2,5 nm de espessura (Blaser, 1996).

Em condições viáveis de crescimento, esta bactéria é caracterizada principalmente pela sua

morfologia bacilar espiralada ou encurvada, mas pode exibir a forma cocóide quando exposta

em situações ambientais adversas, conforme observado na figura 1 (Owen, 1998; Azevedo et

al., 2007).

Figura 1- Imagem em microscopia

eletrônica da Helicobacter pylori (Fonte:

Owen, 1998).

A H. pylori apresenta condições ótimas de crescimento em uma atmosfera úmida (96%

a 100%), enriquecido com gás carbônico (7% a 10%), com níveis reduzidos de oxigênio (5% a

15%) e com temperaturas que variam na faixa de 30°C a 37ºC (Siqueira et al., 2007). Os

microrganismos pertencentes a esta espécie são catalase, oxidase e urease positivas e a presença

de ferro, níquel, cobalto e cobre são essenciais para o seu metabolismo energético, manutenção

da pressão osmótica e desenvolvimento (Kusters et al., 2006).

A estrutura genômica da cepa ACTC 26695 da H. pylori é formada por um cromossoma

circular contendo 1590 genes com quase 1,7 milhões de pares de base (Tomb et al., 1997).

Existem descritas na literatura cerca de 40 diferentes tipos da bactéria, classificadas de acordo

a análise do genoma bacteriano. Estas variações no genoma conferem às estirpes bacterianas

distintos fatores de virulência e que determinam a sua colonização e as características das lesões

no hospedeiro (Ladeira et al., 2003).

14

1.1.3. Epidemiologia da infecção pela Helicobacter pylori

A frequência da infecção pela H. pylori apresenta uma distribuição variada nas

diferentes regiões geográficas, com uma estimativa de casos que pode atingir mais da metade

da população mundial. A configuração epidemiológica da infecção está diretamente relacionada

com fatores ambientais, predisposição genética do hospedeiro e heterogeneidade das estirpes

bacterianas (Malaty, 2007; Correa & Piazuelo, 2008).

Na maioria dos países em desenvolvimento a prevalência da infecção pela H. pylori tem

se mantido elevada no decorrer dos anos, com uma proporção de casos que varia de 45% a 95%

(Carter et al., 2011; Cogo et al., 2011 Muhsen et al., 2012; Dorji et al., 2013; Coelho & Coelho,

2014; Zhang et al., 2014). Em contrapartida, na maior parte dos países desenvolvidos, a

prevalência da infecção está declinando, podendo alcançar valores menores que 40%, como

pode ser visto em estudos realizados na Austrália (Moujaber et al., 2008), Estados Unidos

(Everhart et al., 2000; Patterson et al., 2012) e Japão (Ueda et al., 2014). No entanto, em

Portugal, a prevalência estimada da infecção alcançou 84,2% da população adulta residente na

cidade do Porto (Bastos et al., 2013).

Dados epidemiológicos obtidos em seis países da América Latina (Chile, Colômbia,

Costa Rica, Honduras, México e Nicarágua), mostraram que a infecção estava presente em

79,4% dos indivíduos adultos (Porras et al., 2013). No Brasil, a proporção de adultos infectados

pela H. pylori é quase sempre próximo ou superior a 50% (Zaterka et al., 2007; Fialho et al.,

2010; Cogo et al., 2011; Rasmussen et al., 2012), podendo atingir níveis acima de 80% em

populações das regiões Norte e Nordeste (Rodrigues et al., 2005; Cartágenes et al., 2009).

A taxa de aquisição da infecção pode ser bem expressiva na infância, principalmente

nos primeiros cinco anos de vida. Desse modo, o aumento na curva de prevalência reflete o

efeito cumulativo desta taxa ao longo do tempo, atingindo um equilíbrio ou apresentando uma

leve tendência de declínio em faixas etárias superiores a 60 anos. Este declínio observado na

população idosa pode ser explicado pela história natural da gastrite oriunda da infecção pela H.

pylori, em que a atrofia da mucosa gástrica resulta na perda do nicho ecológico deste patógeno

no estomago (Kodaira et al., 2002).

Estudos sobre a prevalência da infecção pela H. pylori em crianças brasileiras, apontam

frequências que oscilam entre 28,7% a 53,7% e os diferentes resultados apresentados estão

relacionados com uma ou mais variáveis contextuais, tais como a falta de saneamento

adequado, higiene básica, nível socioeconômico e superpopulação (Rodrigues et al.,2005;

Rodrigues et al., 2007; Dattoli et al., 2010; Fialho et al., 2010; Miranda et al., 2010).

15

Em Fortaleza, Queiroz et al. (2012) avaliaram a prevalência da infecção em 353 crianças

provenientes de uma comunidade pobre no ano de 2000. Desse total, 37,7% foram

acompanhadas por um período de oito anos. Ao final do estudo, foi observado que a frequência

de casos existentes aumentou de 53,7% para 64,7%. A porcentagem de crianças que

permaneceram infectadas foi de 47,7%.

Em Porto Velho, Rondônia, Rodrigues et al. (2007), concluíram que a soroprevalência

variou significativamente em crianças na faixa etária de 2 a 13 anos, de acordo com o nível

socioeconômico. Do total de crianças soropositivas para a infecção, 51% estavam em condições

socioeconômicas desfavoráveis e 24% estavam categorizados no grupo de indivíduos de classe

média alta. Em Belém, Pará, uma pesquisa realizada por Barile et al. (2009), apontou uma

prevalência global da infecção de 67,5% no público infantil e o aumento de risco de transmissão

esteve correlacionado com as precárias condições de higiene e saneamento e com a presença da

infecção no ambiente intrafamiliar.

Além dos fatores de risco mencionados acima, que estão relacionados com a prevalência

da infecção pela H. pylori, deve-se levar em consideração que os aspectos associados ao estilo

de vida do indivíduo contribuem de forma significativa na persistência e evolução clínica da

infecção (Correa & Piazuelo, 2008). Neste sentido, estudos epidemiológicos evidenciam que

fatores ligados a dieta, como o consumo frequente de alimentos com elevado teor de sal podem

atuar como um dos elementos importantes para o desenvolvimento de câncer gástrico (Tsugane

et al., 2007; Bertuccio et al., 2013; Gaddy et al., 2013). As agressões contínuas da mucosa

gástrica também podem ser exacerbadas pelo hábito tabágico e consumo de bebidas alcoólicas

(Bonequi et al., 2013).

1.1.4. Rotas de transmissão

A mucosa gástrica humana é o principal reservatório da H. pylori (Kusters et al., 2006;

Yang et al., 2013). Esta bactéria pode ser transmitida diretamente de pessoa para pessoa pelas

vias fecal-oral, oral-oral e gastro-oral. O aumento do risco de contágio está correlacionado com

as precárias condições higiênico-sanitárias e socioeconômicas, o que favorece a disseminação

do parasita em água e alimentos contaminados (Ahmed et al., 2007; Zhu et al., 2014). A nível

marginal, a propagação do microrganismo entre doentes também pode acontecer pelos efeitos

iatrogênicos dos procedimentos endoscópicos gastrointestinais (Van Duynhoven & Jonge,

2001).

16

1.1.4.1. Rota de transmissão fecal-oral

A hipótese da transmissão fecal-oral da H. pylori foi levantada inicialmente através dos

estudos de Thomas et al. (1992). Estes autores isolaram a H. pylori a partir de amostras fecais

de crianças provenientes de comunidades carentes do Oeste Africano. Estes resultados levaram

os pesquisadores deste estudo a sugerirem que a elevada prevalência da infecção neste grupo

populacional seria em decorrência da propagação da infecção pela via fecal-oral, sobretudo, por

se tratar de uma comunidade com péssimas condições de higiene e saneamento. Para eles, esta

via de transmissão poderia ser uma das explicações prováveis para a diferença na prevalência

da infecção em países em desenvolvimento e desenvolvidos.

Com base nesta evidência foi proposto que a disseminação do patógeno poderia ocorrer

em água e alimentos contaminados com produtos fecais (Hopkins et al., 1993). A relação da

fonte hídrica como possível reservatório da H. pylori foi analisada por Hulten et al. (1996),

através da detecção deste agente infecioso em águas advindas do sistema de abastecimento

público de comunidades de baixo poder aquisitivo, situadas próximo a capital peruana. Na

avaliação de amostras de águas coletadas em regiões costeiras do Porto Rico, Trinidad e

Geórgia, as quantidades detectadas de H. pylori nestas amostras foram consideradas baixa em

relação a dose mínima infectante sugerida para este microrganismo, apesar de não existir um

consenso quanto ao padrão microbiológico necessário para estimar os possíveis riscos à saúde

pública (Holman et al., 2014).

1.1.4.2 Rota de transmissão gastro-oral

O mecanismo de transmissão pela via gastro-oral foi proposto a partir do isolamento da

H. pylori em amostras de secreções da mucosa gástrica, podendo ser este um veículo que

facilitaria a passagem deste organismo na forma viável para a boca. A regurgitação e o vômito

estão entre os sinais clínicos característicos na fase aguda ou inicial da infecção em crianças.

Em adultos, a liberação destas secreções é comum em episódios de refluxo gastresofágico,

especialmente na fase aguda da infecção (Deltenre & Koster, 2000; Parsonnet et al., 2000).

1.1.4.3. Rota de transmissão oral-oral

A presença da H. pylori na cavidade oral foi documentada pela primeira vez em 1989,

por meio do cultivo da bactéria em amostras extraídas da placa dental de pacientes com doenças

gástricas associadas a este agente infeccioso (Krajden et al., 1989). Este patógeno também tem

sido identificado na saliva (Ferguson et al., 1993; Medina et al., 2010; Yee et al., 2013) e sua

distribuição na microbiota bucal pode envolver regiões das placas supragengivais (AVCU et

17

al., 2001), placas subgengivais (Riggio & Lennon, 1999; Gebara et al., 2004) e dorso da língua

(Oshowo et al., 1998; Dowsett, 1999).

1.1.5. Patogenia da Helicobacter pylori

A colonização da H. pylori se processa no antro e no corpo gástrico, e envolve diversos

mecanismos e fatores de virulência específicos que afetam as propriedades da mucosa gástrica

e determinam a adesão e sobrevivência do microrganismo no ambiente ácido do estomago

(Yang et al., 2013).

A habilidade do microrganismo de atravessar o lúmen gástrico e atingir a camada de

mucina é observado pela motilidade de suas estruturas flagelares e pela sua capacidade de

síntese da enzima urease (figura 2). Esta enzima é essencial para que a H. pylori obtenha amônia

através da hidrólise da uréia, viabilizando a formação de um microambiente com pH neutro ao

redor da bactéria (Kusters et al., 2006; Yang et al, 2013).

Figura 2- Patogênese da infecção pela Helicobacter pylori e resposta

imune do hospedeiro. Adaptado de Cadamuro et al. (2014)

O passo seguinte é a aderência do patógeno a superfície do epitélio gástrico por

múltiplas proteínas expressas em sua membrana externa (OMP), como SabA, BabA, AlpA.

Destas proteínas, a BabA foi caracterizada como uma estrutura que se liga ao antígeno do grupo

sanguíneo do tipo Lewis (Leb) presentes nas células gástricas, facilitando a colonização e

induzindo a expressão de IL-8, a infiltração granulocítica, assim como a progressão da infecção,

18

os quais estão relacionadas com a formação de lesões pré-oncogênicas (Rad et al., 2002;

Dossumbekova et al., 2012; Ishijima et al., 2011).

A ilha de patogenicidade cag PAI engloba um conjunto de genes que produzem um dos

fatores mais importantes de virulência da H. pylori. A região tem aproximadamente 40 Kb e

permite que a bactéria module as vias do metabolismo celular da célula hospedeira. Entre os

produtos gênicos dessa região, tem-se destaque para a proteína citotóxica associada ao gene A

(CagA), a qual está envolvida na patogênese da gastrite e da ulceração gastroduodenal (Censini

et al., 1996; Odenbreit et al., 2006).

O complexo sistema de genes cag PAI interage conjuntamente através de um sistema

de secreção T4SS do tipo IV, que funciona como uma “seringa” molecular capaz de injetar o

fator de virulência CagA na superfície das células epiteliais gástricas e promover a transcrição

do fator NF-kβ, e, consequentemente, a secreção das quimiocinas IL-8 e IL-1β (Kim et al.,

2013; Cadamuro et al., 2014). A maioria das cepas cagA positivas também apresentam a

proteína pró-inflamatória A da membrana externa (OipA), o que causa maiores danos à mucosa,

uma vez que a OipA é considerada um intensificador da resposta inflamatória pela produção de

IL-8 e está associada a um risco maior de desenvolvimento de doenças ulcerosas e câncer

gástrico (Tabassam et al., 2008; Torres & Backert, 2008; Yamaoka et al., 2006).

O efeito citotóxico deste bacilo é reforçado pela produção de toxinas vacuolizantes a

partir do gene vacA, presente em todas as cepas de H. pylori. As variações polimórficas do gene

vacA são identificadas dentro de duas principais regiões e que determinam o grau de

citotoxicidade das diversas estirpes bacterianas: uma região indutora de sinal peptídico (região

s) e uma porção medial (região m). As diferentes cepas podem ser classificadas de acordo com

os tipos de alelos identificados neste gene (Dundon et al., 2001; Suzuki et al., 2012). Assim, a

região indutora de sinal peptídico pode apresentar dois alelos, s1 e s2, enquanto a estrutura

medial pode ser subdividida nos alelos m1 e m2. A toxina VacA afeta diversos tipos de células,

incluindo as células epiteliais e células T. As diferentes atividades induzidas por esta substância

podem causar diversas respostas, tais como a indução de apoptose celular (via mitocondrial) e

a inibição da proliferação das células T (Boquet & Ricci, 2012; Palframan et al., 2012).

Outro fator de virulência importante que foi descrito em 2005, refere-se ao gene

promotor de úlcera gástrica dupA (Lu et al., 2005). O mecanismo de patogenicidade do dupA

parece estar relacionado com a indução de altos níveis de IL-8 e com o aumento da infiltração

de células inflamatórias na mucosa gástrica (Wang et al., 2015). Neste sentido, a presença de

cepas de H. pylori positivas para o gene dupA representam um risco aumentado para o

19

desenvolvimento da úlcera duodenal e carcinoma gástrico, podendo ser considerado um

marcador específico para estas doenças (Douraghi et al., 2008; Zhang et al., 2008).

1.2 VITAMINA D

1.2.1. Definição química e metabólitos

O termo vitamina D é designado para um grupo de substâncias lipossolúveis

classificadas como secoesteróides, os quais atuam como nutrientes importantes para a saúde

humana (Chiellini et al., 2011) A principal forma nutricional deste composto é o colecalciferol

(vitamina D3), sintetizado na pele através da absorção da radiação ultravioleta (UV) pelo 7-

desidrocolesterol. Além da produção endógena, quantidades significativas da vitamina D3

também podem ser encontradas naturalmente em peixes de água salgada (salmão, atum e

cavala) e em doses pequenas no fígado bovino e ovos (Holick et al., 2011; Schmid & Walther,

2013). Outra fonte da vitamina D é o ergocalciferol (vitamina D2), que pode ser produzido

sinteticamente a partir da exposição UVB do ergosterol presente em leveduras e fungos

(Stephensen et al., 2012; Krings et al., 2014). Tanto o colecalciferol quanto o ergocalciferol são

produzidos comercialmente para o uso em suplementos vitamínicos e na fortificação de

alimentos (Wacker & Holick, 2013).

Figura 3- Estrutura química do ergocalciferol (vitamina D2) e do

colecalciferol (vitamina D3). Figura adaptada de Jovicic et al.

(2012).

20

Como observado na figura 3, a vitamina D2 se diferencia estruturalmente da D3 pela

dupla ligação entre o carbono 22 e 23 e pela adição de um grupo metil no carbono 24 (Jovicic

et al., 2013). Ainda existe discordância se esses dois compostos atuam de forma diferente no

organismo humano, mas análises epidemiológicas atuais sugerem que a suplementação diária

com o colecalciferol é mais efetiva na melhora dos níveis séricos da vitamina D3 quando

comparado com o uso da vitamina D2 (Tripkovic et al., 2012; Lehmann et al., 2013; Logan et

al., 2013). Através de um ensaio clínico randomizado com 33 adultos saudáveis foi postulado

que a vitamina D3 produz um efeito substancialmente maior do que a D2, aumentando os níveis

de armazenamento de vitamina D de 2 a 3 vezes mais que seu equivalente químico (Heaney et

al., 2011).

1.2.2. Metabolismo da vitamina D

A ativação da vitamina D proveniente da síntese endógena ou da ingestão alimentar é

caracterizada por uma sequência de hidroxilações que se processam no fígado e nos rins. Na

síntese endógena, a formação do colecalciferol (vitamina D3) ocorre através da exposição do

tecido cutâneo à radiação ultravioleta B (UVB) com um comprimento de onda de 290 a 320

nm. A ação fotoquímica induz a conversão do 7-desidrocolesterol em previtamina D3 (Fuse et

al., 2012). Nessa etapa, a previtamina D3 sofre um processo de isomerização que resulta na

formação do colecalciferol, o qual, posteriormente, liga-se principalmente à proteína

transportadora de vitamina D (DBP, vitamin D binding protein) presente na corrente sanguínea

para ser armazenado no fígado (Chun, 2012). Na forma exógena, a vitamina D é absorvida nas

células intestinais por difusão passiva, incorporadas aos quilomícrons e armazenadas no tecido

hepático (Gonçalves et al., 2013). Parte dessa vitamina também é estocada no tecido adiposo e

muscular (Garg et al., 2012).

Ao serem armazenados no fígado, os metabólitos secoesteróides da vitamina D são

catalisados por diversas enzimas, incluindo a enzima mitocondrial CYP27A1 e a enzima

microssomal CYP2R1 (Chanakul et al., 2013). O produto desta reação enzimática é

caracterizado pela hidroxilação da vitamina D na posição do carbono 25, produzindo a 25-

hidroxivitamina D (calcidiol: 25 [OH] D3; ercalcidiol: 25[OH] D2); sendo considerada a

principal forma circulante no plasma (Henry et al., 2012).

A etapa final da bioativação é a conversão da 25-hidroxivitamina D em 1,25-

dihidroxivitamina D (calcitriol: 1,25[OH]2D3; ercalcitriol: 1,25[OH]2D2), mediada pela enzima

CYP27B1(1-α-hidroxilase). O mecanismo primário desta reação ocorre principalmente nos

21

rins, porém, outros tipos de células tais como os queratinócitos, macrófagos e osteoblastos

também podem contribuir para a síntese da 1,25-dihidroxivitamina D (Haussler et al., 2012).

1.2.3. Níveis séricos da vitamina D e fatores determinantes

O status da vitamina D é determinado principalmente pela dosagem dos níveis séricos

da 25-hidroxivitamina D3 (Personne et al., 2013). A meia vida da 25-hidroxivitamina D3 é de

aproximadamente de 15 dias na corrente sanguínea, com uma concentração que varia de 25 a

200 nmol/L, enquanto que, a meia vida da 1,25(OH)2D3 no plasma é de no máximo 15 horas

(Jones, 2008).

De acordo com os critérios estabelecidos por Grant & Holick (2005) para estimar as

concentrações plasmáticas adequadas de 25-hidroxivitamina D3 (25[OH] D3), foi proposto que

os valores séricos ótimos estão acima de 80 nmol/L, enquanto que concentrações abaixo de 50

nmol/L indicam a deficiência da vitamina D.

Os níveis séricos da vitamina D são influenciados por diversos fatores, incluindo

aspectos ambientais, fisiológicos e estilo de vida (Hossein-Nezhad & Holick, 2013). A

exposição inadequada à luz solar constitui um elemento importante para a definição das causas

da deficiência da vitamina D. Os indivíduos com maior grau de pigmentação da pele produzem

uma quantidade menor de colecalciferol pela via cutânea, uma vez que a melanina compete

com o 7-desidrocolsterol pelos fótons UVB (Libon et al., 2013). A quantidade e a qualidade da

exposição solar também podem ser reduzidas pelas condições do ambiente, como a poluição do

ar e as variações sazonais (Tsiaras & Weinstock, 2011).

1.2.4 Receptor de vitamina D (VDR)

O VDR é membro da superfamília dos receptores nucleares e atua como um fator de

transcrição ligante-dependente (Zhang et al., 2011). Ele tem sido detectado em vários tecidos e

células do corpo humano, estando presente nos ossos (osteoblastos e condrócitos), epitélio

intestinal, túbulos renais, tecido pancreático, sistema imune (monócitos, macrófagos e

linfócitos T), glândulas (paratireoides, pituitárias, mamárias e próstata) e brônquios (Wang et

al., 2012).

O receptor VDR apresenta 4 regiões distintas e estruturalmente bem definidas. Duas

dessas regiões são constituídas por segmentos relativamente constantes: o domínio de ligação

do ligante (LBD) e o domínio de ligação do DNA (DBD). Estas duas estruturas se conectam

por uma curta sequência de aminoácidos flexíveis denominada de região de dobradiça. O

22

domínio aminoterminal é a porção mais variável do receptor tanto no comprimento quanto na

sequência, contendo apenas 24 aminoácidos em sua estrutura (Helsen & Claessens, 2014).

Quando a 1,25-dihidroxivitamina D interage com o domínio LBD ela ocupa de 55 a

57% do sítio de ligação do ligante (Wu et al., 2013). A ligação de uma substância agonista na

região C-terminal do LBD induz uma reorientação das estruturas α-hélices presente neste

receptor. Essa mudança conformacional permite o recrutamento de coativadores peptídeos

envolvidos no processo de transcrição gênica. A interação com o DNA ocorre através do

domínio DBD, em uma porção do gene denominada de elemento de resposta hormonal

(VDREs), o que favorece a regulação da transcrição de genes específicos (Helsen & Claessens,

2013).

1.2.5. Aspectos imunológicos da vitamina D

A vitamina D promove um amplo espectro de interações fisiológicas que contribuem

para a mineralização da matriz óssea e manutenção da homeostase do cálcio e fosfato (Carlberg

& Campbell, 2013; Prietl et al., 2013). Além de seus efeitos clássicos no sistema endócrino,

tem sido demonstrado que a vitamina D age de forma autócrina e parácrina na modulação dos

sistemas imune inato e adaptativo (Kamen et al., 2010).

Neste sentido, os níveis séricos da vitamina D pode desempenhar um papel importante

na resistência do hospedeiro aos agentes infecciosos, como pode ser observado em diversos

estudos conduzidos com Mycobacterium tuberculosis (Areeshi et al., 2014; Joshi et al., 2014;

Hong et al., 2014), o vírus da imunodeficiência humana (Eckard et al., 2013; Guzman-

Fulgencio et al., 2014;) e da hepatite C (Villar et al., 2013).

As análises moleculares sobre os efeitos dessa vitamina no sistema imune inato revelam

que a sua forma ativa, a 1,25 dihidroxivitamina D3, modula a expressão de genes envolvidos

na síntese de peptídeos antimicrobianos (Wang et al., 2004; Liu et al., 2006) e exerce diferentes

efeitos na diferenciação de monócitos, macrófagos (Di Rosa et al., 2012), células dendríticas

(Sommer & Fabri, 2015) e neutrófilos (Youssef et al., 2011).

Em um modelo experimental realizado em pacientes com tuberculose, verificou-se que

a síntese de 1,25(OH)2D3 em células monocíticas constitui um fator importante na montagem

da resposta imune inata para esta infecção microbiana. A ativação dos receptores TLR/2 em

isolados de macrófagos, através da interação com o Mycobacterium tuberculosis, induz a

expressão de genes que codificam o receptor VDR e a enzima CYP27B1. Esta enzima estimula

a conversão da 25 hidroxivitamina D3 em 1,25(OH)2D3 a nível celular. A sinalização mediada

23

pelo complexo formado pela 1,25(OH)2D3 e o receptor VDR contribui para a melhora da

expressão de catelicidinas antimicrobianas nos macrófagos e reforça os efeitos do sistema

imune inato a fim de eliminar o patógeno (Liu et al., 2006).

A ação da 1,25(OH)2D3 na imunidade adaptativa pode ser observada em linhagens de

células linfocíticas tanto do tipo T quanto do tipo B. Esse metabólito inibe a produção de IFNƴ

e de interleucinas IL-2 e IL-5 pelas células T auxiliares e atua como agente indutor da

diferenciação e aumentando a síntese de interleucina IL-4 (Boonstra et al., 2001; Mahon et al.,

2003). É provável que a expressão do receptor VDR seja importante na regulação da

proliferação das células naïve T CD8+ em doenças inflamatórias do trato gastrointestinal (Chen

et al., 2014). Em um trabalho experimental foi demonstrado que a 1,25(OH)2D3 interage na

modulação de linfócitos B, inibindo a sua diferenciação celular e a secreção de

imunoglobulinas IgG (Chen et al., 2007).

1.2.6. Gene VDR

O gene responsável pela expressão do receptor de vitamina D humano (VDR) está

localizado no cromossomo 12q13.11 (Taymans et al., 1999). A sua estrutura gênica abrange

uma região de aproximadamente 70,49 Kb (National Center for Biotechnology Information),

sendo que a extremidade 5’ do gene contém uma região promotora heterogênea (figura 4),

constituída por sequencias exônicas (1A,1B,1C,1D,1E,1F) não codificantes e que por

intermédio de um processamento alternativo, geram sequências diferenciadas na região

promotora, onde interage os fatores de transcrição. Para este gene, também foram descritos 8

exons (exons de 2 a 9) responsáveis pela expressão das proteínas estruturais do receptor VDR.

Posteriormente a esta região, existe uma larga sequência de aproximadamente de 3,2 Kb que

compõe a extremidade 3’ não codificante, responsável pela regulação gênica (Miyamoto et al.,

1997; Crofts et al., 1998).

Figura. 4- Estrutura básica do gene do receptor VDR. Adaptada de Uitterlinden et al.

(2004).

70,49 Kb

24

Assim, o início da codificação do produto gênico ocorre a partir do exon 2 com a

síntese do domínio regulador N-terminal. A transcrição do domínio de ligação ao DNA se

processa no exon 2 e termina no exon 3, enquanto que os exons 4 e 5 codificam o domínio de

ligação do ligante e o exon 6 a região de dobradiça. Os exons de 7 a 9 participam da

transcrição da região C-terminal do receptor VDR. (Whitfield et al., 2001). O gene contém

áreas com baixo e alto desequilíbrio de ligação e a análise de 15 blocos haplotípicos para 37

SNPs apontam diferenças quanto ao padrão de distribuição dessas estruturas nos diferentes

grupos étnicos. Em populações de Africano-Americanas o mapa de desequilíbrio de ligação

é muito fragmentado e substancialmente diferente em relação ao grupo de Asiáticos e

Caucasoides (Fang et al., 2005).

1.2.7. Polimorfismo do gene VDR

Dos 62 polimorfismos que foram descritos até o presente momento no gene VDR, 57

são nucleotídeos de polimorfismo único (SNP) e 5 do tipo VNTR (número variável de

repetição em tandem), dos quais 15% estão presentes nas regiões não codificantes do gene

(Fang et al., 2005).

Os principais SNP utilizados atualmente no gene VDR em estudos de associação

genética (Oh et al., 2013; Liu et al., 2013; Maalmi et al., 2013, Mao et al.,2014) incluem os

marcadores de fragmentos de restrição (RFLP) FokI (Gross et al.,1998), BsmI (Morrison et

al.,1992), ApaI (Faraco et al., 1989) e TaqI (Morrison et al., 1994). O FokI está situado no

exon 2, próximo a região central do gene, enquanto os demais polimorfismos citados estão

localizados na extremidade 3’ UTR, cuja variação alélica é observada no intron 8 para o BsmI,

intron 9 para o ApaI e no exon 9 para o TaqI (Whitfield et al., 2001).

A variante polimórfica FokI é caracterizada pela transição de timina por citosina (ATG

para ACG). Essa mudança de nucleotídeo muda o quadro de leitura de tradução gênica para a

próxima trinca ATG, o que resulta na síntese de uma proteína estruturalmente mais curta

(figura 5). Deste modo, a proteína predita de 427 aminoácidos é resultado da localização da

metionina no primeiro códon ATG, na presença do alelo T (designado como alelo f), ao passo

que a metionina transcrita no ATG seguinte pela presença do alelo C (designado como alelo

F) produz uma estrutura protéica de 424 aminoácidos (Arai et al., 1997; Jurutka et al., 2000).

25

Um estudo in vitro foi realizado com o objetivo de esclarecer o significado funcional

dessa mutação. Assim, foi relatado que o SNP FokI-f promove uma atividade transcricional

reduzida do fator TFIIB em relação ao SNP FokI-F (Jurutka et al., 2000). Além disso, tem-se

especulado que a isoforma protéica contendo 424 aminoácidos apresenta uma atividade mais

responsiva para 1,25(OH)2D3 (Colin et al., 2000).

Figura 5- Representação esquemática da mutação que ocorre na posição 30.920 no gene

VDR.

Diferentemente do que acontece com a variante alélica do exon 2, as mutações situadas

na extremidade 3’ estão em desequilíbrio de ligação (Ingles et al.,1997; Oh et al., 2014) e a

extensão desse desequilíbrio é diferente nos diversos grupos étnicos (Fang et al., 2005).

Conforme disponível no banco de dados de polimorfimos de nucleotídeo único do NCBI

(National Center for Biotechnology Information), os polimorfismos observados em regiões

intrônicas para os marcadores BsmI (rs1544410) e ApaI (rs7975232) estão localizados nas

posições 63.980 e 64.978 do gene VDR, respectivamente. Estas mutações são definidas pela

transição de guanina (GCG) por adenina (GCA) para o marcador BsmI e pela transversão de

citosina (GCC) por adenina (GCA) para o marcador ApaI. Para o polimorfismo detectado pela

enzima de restrição TaqI (rs731236), observa-se uma substituição de timina (ATT) por citosina

(ATC) na posição 65.058 no exon 9 do gene VDR, porém, a troca de bases nitrogenadas não

altera o aminoácido isoleucina para este códon (National Center for Biotechnology

Information).

Para Morrison et al. (1994) as variações polimórficas presentes na região 3’ não

traduzida podem interferir em sua estabilidade molecular, e assim alterar os níveis de expressão

26

do RNA mensageiro. No entanto, os resultados apresentados por Durrin et al (1999) levaram

estes autores a concluírem que os polimorfismos da porção 3’ do gene VDR não alteram a

estabilidade do RNA mensageiro. Segundo eles, tem-se conjecturado de que as variantes do

gene VDR estejam em desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos verdadeiramente

funcionais presentes em genes adjacentes. Outra hipótese sustentada é que sequências

próximas ao gene VDR interagem na transcrição, tradução e processamento do mRNA.

1.2.8. Variação étnica dos polimorfismos do gene VDR

Em uma análise desenvolvida por Uitterlinden et al. (2004), foi observado diferenças

substanciais nos padrões de distribuição das frequências alélicas associadas aos polimorfismos

do gene VDR em três grupos étnicos. O estudo mostrou que o alelo “f” do SNP FokI, ocorreu

com menor frequência em africanos, quando comparados com europeus e asiáticos. Para o

alelo B do SNP BsmI, a distribuição é muito mais baixa na população asiática em relação ao

grupo de europeus e africanos. Um padrão similar é identificado para o alelo T do marcador

TaqI, com uma frequência menor em asiáticos (figura 6).

Figura 6- Comparação das frequências alélicas do gene VDR entre os

grupos de origem européia, africana e asiática. Adaptado de Uitterlinden

et al. (2004).

A determinação da frequência alélica para estas variantes nas populações advindas do

Projeto Internacional HapMap (Internacional HapMap Project), ressaltam as diferenças

observadas em grupos provenientes da Ásia, África e Europa. O alelo “f” do SNP BsmI

apresentou uma distribuição relativamente inferior na população de ascendência africana

34%

42% 44% 43%

24%

36%31% 31%

51%

7%

74%

8%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

FokI (alelo f) BsmI (alelo B) ApaI (alelo A) TaqI (alelo T)

Europeu Africano Asiático

27

(YRI). No conjunto de indivíduos de origem asiática (CHB), a frequência do alelo “t” para o

SNP TaqI foi expressivamente menor em relação aos demais grupos (quadro 1).

A distribuição destes polimorfismos na população brasileira, baseado na declaração da

cor da pele, foram comparadas com os resultados obtidos na base de dados do projeto HapMap

(The Internacional HapMap Project) por Rezende et al. (2007) para os grupos de brancos e

negros. Estes autores observaram que no grupo de indivíduos categorizados como negros, foi

observado uma diferença significativa na frequência dos genótipos para o polimorfismo ApaI

em relação ao grupo de brancos do projeto HapMap. O mesmo ocorreu para as frequências

genotípicas e alélicas do marcador FokI. Os genótipos BsmI, ApaI e FokI não apresentaram

desvios significativos quanto ao teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Por se tratar de uma população com um alto grau de miscigenação e heterogeneidade

genética, originários de Europeus, ameríndios e Africanos, há de se considerar que o padrão de

distribuição destes polimorfismos pode variar nas diferentes regiões brasileiras. Com base

nesta premissa, Lins e et al. (2011) analisaram as frequências alélicas dos polimorfismos do

gene VDR na população brasileira (figura 7), e identificaram que, nas cincos regiões

geopolíticas do território brasileiro, a frequência dos alelos do gene VDR não apresentou

diferença estatística entre as amostras regionais e consequentemente para a população

brasileira como um todo. Ao se comparar as amostras brasileiras com os grupos étnicos do

Alelos Frequência dos polimorfismos

*Europeu **Africano ***Asiático

rs1035810(Fok I)

C (F) 0,558 0,805 0,588

T (f) 0,442 0,195 0,412

rs1544410 (BsmI)

A (B) 0,036 0,272 0,438

G (b) 0,964 0,728 0,562

rs7975232(ApaI)

A (A) 0,270 0,600 0,571

C (a) 0,730 0,400 0,429

rs731236 (TaqI)

T (T) 0,971 0,718 0,562

C (t) 0,029 0,282 0,438

Quadro 1- Distribuição das frequências alélicas dos

polimorfimos no gene VDR provenientes de grupos étnicos do

projeto Hapmap.

*População residente em Utah com ascendência do norte e oeste

europeu (CEU); **Grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria

(YRI); *** Chineses Han de Pequim, China (CHB).

28

projeto HapMap, os autores deste estudo observaram que a população brasileira foi

geneticamente mais distante da população de africanos em relação ao grupo de europeus.

Figura 7- Distribuição dos polimorfismos do gene VDR na população

brasileira. Adaptado de Lins et al. (2011).

1.3. VITAMINA D e Helicobacter. pylori

Com o objetivo de elucidar o papel do receptor de vitamina D (VDR) e de seus genes

alvos na mucosa gástrica de pacientes infectados com Helicobacter pylori, Guo et al. (2014)

encontraram uma correlação positiva entre a expressão de RNA mensageiros (mRNA) do VDR

e a infecção por este patógeno. Os resultados desse trabalho também apontaram uma

associação significativa para o score de inflamação no epitélio gástrico, níveis de catelicidinas

antimicrobianas e interleucinas (IL-6 e IL-8/CXCL8).

No trato gastrointestinal, as catelicidinas humanas LL-37 são ativamente produzidas

por células epiteliais do estomago, principalmente durante a infecção e inflamação (Wong et

al., 2011). A interação desse peptídeo antimicrobiano na infecção por H. pylori ainda não está

completamente esclarecida, mas um trabalho preliminar realizado com camundongos mostrou

que ablação do gene responsável pela síntese de catelicidinas aumentou significativamente a

suscetibilidade de colonização pela H. pylori associada com gastrite, quando comparada com

o controle, uma linhagem de camundongos do tipo selvagem (Zhang et al., 2013). Neste

aspecto, os efeitos da vitamina D, no sentido de limitar a atividade bacteriana, podem ser

essenciais para evitar um potencial dano inflamatório que surge a partir de uma resposta inata.

A ativação da 1α,25(OH)2D3 tem-se mostrado importante em subpopulações de células

linfocitárias, atuando na modulação dos receptores de células T (TCR) e diminuindo a

proliferação de linfócitos auxiliares do tipo T CD4+, especialmente as subpopulações Th1 e

67%

40%

54%

63%

33%

61%

46%

37%

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

FokI

BsmI

ApaI

TaqI

T t

A a

B b

F f

29

Th17 e de imunoglobulinas G (IgG), além de inibir a diferenciação de células dendríticas (Lang

et al., 2012). Em contraste, a elevada expressão de linfócitos Th1 e Th17 em decorrência da

colonização pela H. pylori contribuem para a patogênese persistente da infecção e para o

desenvolvimento e manutenção da inflamação crônica da mucosa gástrica (Shi et al., 2010).

Esses achados podem indicar que as análises sobre a variação do status da vitamina D

sejam importantes na avaliação da suscetibilidade da infecção causada pela H. pylori. Assim,

a investigação das variantes alélicas presente no gene VDR humano é uma outra abordagem

que tem sido extensivamente explorada nos últimos anos (Oh et al.,2014; Wang et al.,2013;

Wang et al.,2012; Li et al.,2013; Torres et al.,2010; Serrano et al., 2013) e que pode estar

relacionado com a epidemiologia da infecção pela H. pylori e com os fatores indutores da

resposta inflamatória para este patógeno.

30

2.OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

Investigar a associação dos SNPs de RFLP do gene receptor de vitamina D humano (VDR)

com a presença de infecção pela Helicobacter pylori em pacientes atendidos na seção de

endoscopia do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB) /UFPA, em Belém-PA.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Estimar as frequências genotípicas e haplotípicas das variantes polimórficas TaqI (rs731236),

ApaI (rs7975232), BsmI (rs15444101) e FokI (rs228570) presentes no gene do receptor de

vitamina D (VDR) na população de estudo.

- Verificar a associação da distribuição de frequências dos polimorfismos de RFLP estudados

em indivíduos infectados e não infectados com cepas virulentas de H. pylori.

-Correlacionar as variantes dos polimorfimos RFLP no gene VDR com as alterações

histopatológicas na mucosa gástrica.

- Comparar a distribuição das frequências alélicas e haplotípicas dos SNPs de RFLP no gene

VDR entre indivíduos não infectados e infectados com a H. pylori e destes com as frequências

já descritas para outras populações brasileiras e de diferentes grupos étnicos provenientes do

Projeto Internacional HapMap.

31

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. CASUÍSTICA

A linha de investigação da pesquisa tem como base o estudo transversal, analítico-

descritivo, que incluiu dados epidemiológicos e amostras de DNA genômico obtidos de

pacientes atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto da Universidade Federal

do Pará (HUJBB-UFPA), coletadas no período compreendido entre abril de 2011 a março de

2012.

3.2. CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS

A população de estudo foi composta por 208 indivíduos residentes na região

metropolitana de Belém, de ambos os sexos, com idade igual ou superior a 18 anos. Os sujeitos

da pesquisa foram avaliados previamente quanto aos sinais e sintomatologias gástricas através

da aplicação de um questionário semi-estruturado, sendo incluídos na pesquisa os indivíduos

que referiram queixas referentes ao aparelho digestivo superior, que não fizeram tratamento

regular específico para infecção pela H. pylori nos últimos seis meses e os que declararam não

utilizar inibidor de bomba de prótons como subcitrato de bismuto, citrato de ranitidina bismuto

e/ou antibióticos nos últimos 30 dias. Aqueles que apresentaram histórico de gastrectomia

parcial ou total ou risco de sangramento gastrointestinal foram excluídos da pesquisa.

Os pacientes foram admitidos na seção de Endoscopia Digestiva do HUJBB e daqueles

sintomáticos, coletou-se seis fragmentos de biópsias da região do estomago (antro e corpo

gástrico) para a detecção da infecção pelo Helicobacter pylori e determinação dos

polimorfismos FokI, BsmI, ApaI e TaqI do gene VDR humano, através da técnica de Reação

em Cadeia da Polimerase (PCR).

Os fragmentos de biópsia gástrica foram estocados em solução de formalina a 10%, e,

posteriormente, corados na técnica de coloração Hematoxilina- Eosina (HE). Para a

classificação histológica da mucosa gástrica, empregou-se os critérios adotados pelo Sistema

de Sydney (Dixon et al., 1996), atribuindo uma escala de graduação de 0 a 3 (normal, leve,

moderada e acentuada, respectivamente).

Para a detecção de cepas de H. pylori nas lâminas histológicas foi utilizado o método

de coloração Gram modificado com auxílio de microscopia óptica convencional, tendo como

critério diagnóstico, as características deste microrganismo, ou seja, a forma espiralada e

encurvada e a presença da coloração azul intensa.

32

3.3. INQUÉRITO EPIDEMIOLÓGICO

Para o levantamento das informações epidemiológicas foi utilizado um questionário

semi-estruturado, contendo questões referentes ao perfil sócio-demográfico e estilo de vida dos

participantes. Na avaliação sobre o consumo de cigarro foi adotado o Questionário de

Tolerância de Fagerström (Heatherton et al., 1991), que apresenta perguntas relacionadas ao

hábito tabágico e nível de dependência de nicotina através das quantidades de cigarros

consumidos e tempo de tabagismo. A investigação quanto ao etilismo foi delineada a partir de

um questionário de frequência quanto ao uso de bebidas alcoólicas, conforme informações

relatadas pelo público alvo.

3.4. ASPECTOS ÉTICOS

As amostras biológicas do presente estudo foram colhidas com permissão do sujeito da

pesquisa para serem utilizadas e armazenadas a posteriori em outros estudos científicos

relacionados com a infecção pela H. pylori, conforme foi submetido à avaliação e aprovação

pelo Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Universitário João de Barros

Barreto (Parecer nº 1820/2010). Todos os participantes envolvidos na pesquisa concordaram

em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, assegurando-lhes a preservação do

anonimato e sigilo no tratamento dos dados.

3.5. DESCRIÇÃO DAS TÉCNICAS LABORATORIAIS

3.5.1. Extração do DNA bacteriano e humano

A extração do DNA das amostras foi realizada através da técnica do fenol-clorofórmio

descrita por Miller et al. (1988). Após a coleta do material biológico, amostras de sangue total

e de biopsias gástricas foram submetidas ao tratamento com proteinase K e etapas subsequentes

de centrifugação e sedimentação, para retirada do DNA do sobrenadante por precipitação em

etanol à 99,5%. As alíquotas de DNA foram devidamente estocadas de acordo com as normas

de biosseguranças e mantidas sobre temperatura de congelamento (-20ºC) no Laboratório de

Imunogenética do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará.

3.5.2 Detecção da Helicobacter pylori por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

As análises das biópsias gástricas de antro e corpo para o diagnostico clinico-

laboratorial referente à infecção pelo Helicobacter pylori foram baseadas a partir de ensaios

33

histopatológicos e amplificação de DNA bacteriano pela técnica PCR, usando os iniciadores

P1 e P2 para determinar a sequência de 298 pares de bases presentes em todas as cepas de

Helicobacter pylori (Hammar et al., 1992). As amostras positivas para H. pylori foram

identificadas quanto a presença dos marcadores de virulência do tipo cagA e vacA s1m1

através da técnica molecular de PCR Multiplex, cujo protocolo foi adaptado de Chattopadhay

et al. (2004).

3.5.3. Amplificação e detecção dos polimorfismos do gene do receptor humano de

vitamina D (VDR) por RFLP-PCR

A genotipagem dos polimorfismos TaqI (rs731236), ApaI (rs7975232), BsmI

(rs15444101) e FokI (rs228570) foi conduzida utilizando oligonucleotídeos iniciadores (direto

e reverso) específicos para cada marcador gênico (quadro 2). Assim, as alíquotas de DNA

foram amplificadas por reação em cadeia de polimerase (PCR) e o produto obtido foi

submetido à digestão com endonucleases de restrição. As concentrações dos reagentes e as

condições de tempo e temperatura para cada etapa das PCRs foram determinadas conforme

informações extraídas de Pani et al. (2000).

Para a amplificação de 1µL de DNA genômico em uma mistura contendo um volume

final de 25 µL foram empregadas 0,5 µL da enzima Taq DNA polimerase (2,5 U/ µL), 2,5 µL

de tampão 10 X (200 mM Tris-HCl 500 mM KCl, pH de 8,4), 2,5 mM de cada DNTP, 1,5 mM

de MgCl2. Os oligonucleotídeos iniciadores foram utilizados na concentração de 2,4 µM.A

ciclagem da reação foi conduzida a uma temperatura inicial de desnaturação de 95ºC por 5

minutos, seguida de 30 ciclos contendo as seguintes especificações para cada etapa: 94ºC por

30s, temperatura de anelamento por 45s, 72º C por 1 minuto e extensão final por 7 minutos.

SNP Sequência (5’ -3’) Anelamento Produtos

(PCR)

rs2228570 F: AGCTGGCCCTGGCACTGA

65.6ºC FokI (265pb) R: ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC

rs1544410

F:CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA 64ºC BsmI (825pb)

R:AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG

rs7975232

F:CAGAGCATGGACAGGGAGCAA 68º C ApaI (740 pb)

R:GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC

rs731236

F:CAGAGCATGGACAGGGAGCAA 68º C TaqI (740 pb)

R:GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC

Quadro 2- Identificação dos oligonucleotídeos iniciadores (primer), temperaturas (anelamento) e

seus respectivos produtos utilizados para a genotipagem dos polimorfismos do gene VDR.

Adaptado de Pani et al. (2000).

34

Os produtos da PCR foram monitorados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com

brometo de etídio e visualizados sobre luz ultravioleta.

Os fragmentos amplificados foram diluídos em tampão apropriado e digeridos com

aproximadamente 5U de enzima (quadro 3). As soluções enzimáticas foram armazenadas em

tubos de microcentrífuga e incubadas em banho maria para que ocorra a digestão enzimática

de acordo com período estipulado pelo fabricante. Após essa etapa, o produto digerido foi

visualizado por eletroforese em gel de agarose a 2

A representação genotípica e alélica das variantes polimórficas do gene VDR foi

baseada de acordo com a presença (letra minúscula) ou ausência (letra maiúscula) do sítio de

restrição enzimático (quadro 3). Para o FokI, os genótipos CC, CT e TT, corresponde a FF, Ff

e ff, respectivamente. Os genótipos AA, AG e GG do BsmI foi representado por BB, Bb e bb,

respectivamente. As variantes AA, AC e CC do ApaI foi identificado por AA, Aa e aa,

respectivamente. As formas genotípicas TT, TC e CC do TaqI é simbolizado pelas letras TT,

Tt e tt, respectivamente.

3.5.4. Análise estatística dos dados

Os dados da pesquisa foram tabulados através do programa Microsoft Excel® 2013 e

para aplicação dos testes estatísticos foi adotado o nível de significância de 5% (p-valor <

0,005).

Quadro 3 - Identificação das endonucleases de restrição, temperaturas de

incubação (digestão enzimática) e seus respectivos produtos utilizados para a

genotipagem dos polimorfismos do gene VDR. Adaptado de Pani et al. (2000).

Endonucleases

de restrição

Temperatura

de incubação Sítio de restrição Produtos RFLP (pb)

FokI

37ºC

5’-GGATG N9 -3’ 3’-CCTAC N13 -3’

FF: 265 Ff:265,196 e 69 ff:196 e 69

BsmI

65ºC

5’- GAATGCN -3’ 3’- CTTAC GN-5’

BB: 825 Bb:825,650 e175 bb:650 e175

TaqI

65ºC 5’- T CG A-3’ 3’- A GC T-5’

TT:245 e 495 Tt:495,290,245 e 205 tt:290,245 e 205

ApaI

37ºC 5’- G GGCC C-3’ 3’- C CCGG G-5’

AA:740 Aa:740,530 e 210 aa:530 e 210

35

Os parâmetros epidemiológicos e demográficos foram analisados quanto ao possível

risco de infecção pela H. pylori usando a função Odds Ratio (OR), assumindo um limite de

intervalo de confiança de 95%. As frequências alélicas e genotípicas foram comparadas entre

os grupos de infectados e não infectados pela H. pylori através do teste χ2 de Mantel-Haenszel,

com o Odds Ratio ajustado para as covariáveis sexo e idade, sendo que estas distribuições de

frequências ainda foram avaliadas quanto ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Aplicou-se o teste

binomial nas comparações efetuadas entre as proporções genotípicas do marcador BsmI do

gene VDR com os diferentes grupos de estudo e também para as análises desse marcador

quanto aos aspectos histológicos da mucosa gástrica. Os cálculos estatísticos foram realizados

com o auxílio do programa Bioestat ® versão 5.0 (Ayres et al., 2007).

O padrão do desequilíbrio de ligação par-a-par entre os marcadores do gene VDR da

população estudada foi inferido pelo programa Haploview® 4.2 (Barret et al., 2005), tendo

como parâmetro estatístico o coeficiente de desvio padronizado (D’) de Lewontin (1988) e o

quadrado do coeficiente de correlação (r2). Desse modo, o desequilíbrio de ligação dos blocos

haplotípicos foi analisado de acordo com os critérios estabelecidos por Gabriel et al. (2002),

os quais consideram um par de SNP em forte desequilíbrio de ligação com um valor de D’

dentro de um intervalo de confiança de 95%, limite inferior maior que 0,70 e limite superior

acima de 0,98 e valor de r2≥ 0,8, sendo excluído da análise marcadores que apresentaram menor

frequência alélica (MAF) inferior a 5%.

A distribuição e análise estatística das frequências haplotípicas foram determinadas

pelo programa SHEsis® (Shi et al., 2005) para os blocos formados com os polimorfimos FokI,

BsmI, ApaI e TaqI e para os haplótipos da região 3’UTR do gene VDR (BsmI, ApaI e TaqI).

As frequências alélicas e haplotípicas da população investigada foram comparadas com

os grupos populacionais estudados pelo Consórcio Internacional de Mapa de Haplótipos (The

Internacional HapMap Project). Assim, para representar a população de origem asiática foram

incluídas em um único grupo as amostras provenientes de chineses Han da cidade de Pequim

(CHB) e de japoneses da cidade de Tóquio (JPT), categorizados pela sigla ASN. Para as

populações de origem européia e africana, foram escolhidos os grupos amostrais de residentes

em Utah, nos Estados Unidos, com ancestralidade do norte e oeste da Europa (CEU) e do grupo

étnico africano Yoruba de Ibadan, Nigéria (YRI). As estimativas de distância genética entre os

polimorfismos do gene VDR foram calculadas pela estatística Fst de Wright através do

programa Alerquin® versão 3.01 (Excoffer et al., 2005).

36

4. RESULTADOS

Dos 208 pacientes incluídos no estudo, a média geral de idade foi de 53,04 ± 15,20 anos,

sendo de 51,38 ± 15,22 anos para o grupo diagnosticado com H. pylori positivo e de 55,18 ±

14,98 anos para os indivíduos com resultado negativo para este patógeno. Desse total de

amostras, 60,58% (126/208) pertenciam ao sexo feminino e 90,86% (189/208) foram

categorizados quanto à cor da pele como negróides.

A infecção pela H. pylori foi detectada em 56,25% (117/208) dos pacientes pesquisados.

Em relação aos aspectos demográficos e epidemiológicos, que podem ser considerados fatores

de risco ao desenvolvimento da infecção pela H. pylori, não foram observadas diferenças

significativas entre as amostras positivas e negativas para H. pylori quanto as variáveis: sexo,

faixa etária e estilo de vida (tabagismo, elitismo e consumo de frutas). No grupo de indivíduos

infectados pela H. pylori, 66,67% eram mulheres e entre os não infectados o percentual para

este gênero correspondeu a 52,75% (tabela 1).

Tabela 1- Características demográficas e epidemiológicas dos grupos investigados.

Variáveis Infecção pela H. pylori

Positivo Negativo OR (IC 95%) P-valor

N=117 (%) N=91(%) Gênero

Feminino 78 (66,67) 48 (52,75) 1,79 (1,02-3,15) 0,0581

Masculino 39 (33,33) 43 (47,25) *1,00

Faixa etária

< 45 anos 39 (33,33) 21 (23,08) 1,67 (0,89-3,10) 0,1428

≥ 45 anos 78 (66,67) 70 (76,92) *1,00

Cor da pele

Caucasóides 16 (13,68) 3 (3,30) 4,65 (1,31-16,48) 0,0196

Negróides 101 (86,32) 88 (96,70) *1,00

Tabagismo

Fumante 18 (15,38) 9 (9,89) 1,66 (0,70-3,88) 0,3362

Não fumante 99 (84,62) 82 (90,11) *1,00

Elitismo

Elitista 54 (46,15) 29 (31,87) 1,83 (1,03-3,24) 0,0518

Não elitista 63 (53,85) 62 (68,13) *1,00

Consumo de frutas

Ocasionalmente 93 (79,49) 62 (68,13) 1,81 (0,97-3,40) 0,0884

Diariamente 24 (20,51) 29 (31,87) *1,00

Ancestralidade

Europeu 49 (41,88) 37 (40,66) 0,98 (0,48-2,01) 0,8958

Indígena 41 (35,04) 34 (37,36) 0,89 (0,43-1,86) 0,9096

Africano 27 (23,08) 20 (21,98) *1,00

*1,00: Grupos de referência utilizados na análise.

37

Quanto à faixa etária dos grupos estudados, verificou-se um predomínio de indivíduos

com 45 anos ou mais de idade (67% no grupo de infectados versus 77% nos não infectados).

Entre os hábitos de vida, como tabagismo e consumo de frutas não foi observado diferenças

entre os grupos estudados, sendo que 85% no grupo de infectados e 90% no grupo de não

infectados eram fumantes e apenas 20% e 30% dos indivíduos de cada um destes grupos

estudados, respectivamente, declararam o consumo diário de frutas. Contudo, o elitismo

mostrou uma tendência a diferir na proporção de indivíduos elitistas no grupo de pacientes

infectados comparado aos não infectados (46% infectados e 32% não infectados).

Em relação à cor da pele, aproximadamente 86% e 96% dos indivíduos foram

categorizados como negróides, incluindo aqueles de cor parda e negra, nos grupos de pacientes

infectados e não infectados pela H. pylori, respectivamente. Para esta variável, constatou-se que

entre os caucasoides a probabilidade de infecção pela H. pylori foi de 4,6 vezes superior à dos

negróides, sendo esta diferença estatisticamente significativa.

A estimativa da proporção de ancestralidade genética de origem africana, europeia e de

indígenas nativos mostrou-se similar entre o grupo de infectados e não infectados pela H. pylori,

levando em consideração a autodeclaração dos pacientes relativo ao seu histórico familiar de

etnicidade. Neste aspecto, nota-se uma contribuição expressiva das diferentes etnias na

composição das amostras analisadas, sobretudo das etnias europeias e indígenas (tabela1).

Esta análise demonstrou que algumas variáveis como gênero, idade, cor da pele,

elitismo e consumo de frutas (considerando p ≤ 0,20) são diferentes entre os dois grupos de

infectados e não infectados, indicando necessidade de empregá-las como fatores de

confundimento (interferência) nas análises de associação entre os marcadores genéticos

investigados no risco de desenvolver infecção pela H. pylori.

Quando se considera a distribuição dos polimorfismos do gene VDR (tabela 2),

verifica-se que as frequências alélicas e genotípicas observadas para as variantes FokI, ApaI e

TaqI não apresentaram diferenças significativas entre as amostras positivas e negativas.

Entretanto, em relação ao SNP BsmI, foi detectada uma prevalência aumentada do genótipo

bb entre indivíduos com H. pylori comparados com aqueles sem a infecção (63,25% versus

50,55%, respectivamente) e a frequência do genótipo heterozigoto Bb estava aumentada no

grupo H. pylori negativo se comparado com o grupo de infectados (37,26% versus 17,09%,

respectivamente).

38

Tabela 2- Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos do gene VDR em grupo de

infectados e não infectados pela H. pylori na região metropolitana de Belém-PA.

*Odds Ratio ajustado para as covariáveis sexo e idade; **1,00= grupos de referência utilizados na

análise.

Deste modo, foi verificada a existência de associação entre a infecção pela H. pylori e

cada um dos polimorfismos de RFLP do gene VDR (FokI, BsmI, ApaI e TaqI), mediante a

obtenção das estimativas de Odds Ratio (OR), além do valor da estatística 2 de Mantel-

Haenszel, conforme os resultados dispostos na tabela 2, sendo que com relação às frequências

VDR/SNPs

Infecção pela H. pylori

χ2 (p-valor)

OR (IC 95%)

*OR (IC 95%) Positivo Negativo

n=117 (%) n=91 (%)

FokI

Genótipos

FF 56 (47,86) 41 (45,05) 0,2061 (0,9021) **1,00 **1,00

Ff 45 (38,46) 36 (39,56) 0,92 (0,50-1,66) 0,81 (0,44-1,52)

Ff 16 (13,68) 14 (15,38) 0,18(0,37-1,90) 1,04 (0,44-2,42)

Alelos

F 157 (67,09) 118 (64,84) 0,2331 (0,6292)

**1,00

F 77 (32,91) 64 (35,16) 0,90(0,60-1,36)

BsmI

Genótipos

BB 23 (19,66) 11 (12,09) 11,325 (0,0034) **1,00 **1,00

Bb 20 (17,09) 34 (37,36) 0,28 (0,11-0,70) 0,2 (0,11-0,72)

Bb 74 (63,25) 46 (50,55) 0,77 (0,34-1,72) 0,70 (0,31-1,59)

Alelos

B 66 (28,21) 56 (30,77) 0,3247 (0,5687)

**1,00

b 168 (71,79) 126 (69,23) 1,13(0,74-1,73)

ApaI

Genótipos

AA 47 (40,17) 37 (40,66) 0,4525 (0,7974) **1,00 **1,00

Aa 48 (41,03) 40 (43,96) 0,94 (0,52-1,72) 0,91(0,49-1,68)

Aa 22 (18,80) 14 (15,38) 1,24 (0,56-2,74) 1,23(0,53-2,83)

Alelos

A 142 (60,68) 114 (62,64) 0,1650 (0,2331)

**1,00

A 92 (39,32) 68 (37,36) 1,09 (0,73-1,62)

TaqI

Genótipos

TT 70 (59,83) 53 (58,24) 0,0766 (0,9624) **1,00 **1,00

Tt 39 (33,33) 32 (35,16) 0,92 (0,51-1,66) 0,95 (0,52-1,73)

Tt 8 (6,84) 6 (6,59) 1,01 (0,33-3,09) 1,00 (0,52-1,73)

Alelos

T 179 (76,50) 138 (75,82) 0,0254 (0,8732)

1,00

T 55 (23,50) 44 (24,18) 0,96 (0,61-1,52)

39

genotípicas do BsmI entre infectados e não infectados, confirmou-se o efeito de Odds Ratio

(0,28), indicativo de proteção para o heterozigoto Bb.

Adicionalmente, fez-se o teste de homogeneidade dos grupos, e ao comparar as

frequências gênicas destas amostras a fim de verificar se elas diferem significativamente ou não

entre si, pode-se concluir que estas duas amostras estudadas de indivíduos infectados e não

infectados pela H. pylori não diferem significativamente entre si (χ2yates= 0,3247, GL=1,

p=0,5687) quanto às frequências dos alelos B e b do BsmI e podem ser consideradas

homogêneas, isto é, como extraídas de uma única população. Então, uma análise estratificada

foi utilizada na obtenção da estimativa do Odds Ratio ajustado para os polimorfismos

averiguados, controlando-se o efeito das variáveis idade e sexo. Os resultados desta análise

encontram-se dispostos na tabela 2.

A avaliação da amostra global para as proporções genotípicas observadas no estudo,

comparada de acordo com o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), apontou valores

concordantes com este teste para os polimorfismos FokI (χ2=3,5688, p=0,0589), ApaI

(χ2=2,3481, p=0,1254) e TaqI (χ2=0,7205, p=0,3960). Entretanto, para o marcador BsmI

(χ2=29.048, p < 0,001), as proporções genotípicas observadas diferiram significativamente das

esperadas, revelando-se em desequilíbrio de Hardy-Weinberg.

Do mesmo modo, quando a amostra foi subestratificada no grupo de infectados pela H.

pylori, os polimorfismos FokI (χ2= 1,9458, p=0,1630), ApaI (χ2= 2,3008, p=0, 1254) e TaqI

(χ2=0,6240, p=0,4296) também apresentaram distribuições genotípicas compatíveis com o

modelo de equilíbrio de Hardy- Weinberg, o que não ocorreu para as frequências genotípicas

observadas para o marcador BsmI (χ2=39,0777, p < 0,0001). No grupo de indivíduos não

infectados pela H. pylori, não foram observados desvios estatisticamente significativos das

frequências genotípicas observadas em relação às esperadas em nenhum destes polimorfismos

do gene VDR.

Neste sentido, os resultados mostrados na figura 8 evidenciam diferenças altamente

significativas em relação à distribuição de frequências genotípicas entre os indivíduos não

infectados e aqueles infectados com cepas virulentas e não virulentas da H. pylori. Entre estes

grupos, percebe-se nitidamente que entre os H. pylori negativo e H. pylori positivo não

virulento, a proporção de indivíduos com o genótipo BB é menor no grupo não infectado.

Entretanto, quando se compara as proporções genotípicas dos não infectados com os infectados

com cepas virulentas, constata-se uma maior proporção do genótipo bb no grupo de positivos

virulentos e do genótipo Bb nos indivíduos H. pylori negativos. Por outro lado, quando se

compara este grupo de positivos virulentos, estas diferenças observadas nas proporções

40

genotípicas se mantem idênticas quando relacionadas ao grupo de indivíduos infectados com

cepas não virulentas, ou seja, também ocorre uma maior proporção do tipo Bb no grupo de

positivo não virulento e do genótipo bb no grupo de indivíduos positivos virulentos.

Figura 8 – Frequência (%) genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR

nos grupos de infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA.

Considerando que a distribuição genotípica do RFLP BsmI apresentou uma

associação significativa com grupo de pacientes infectados pela H. pylori, foi realizado um

teste binomial na comparação entre os indivíduos dos genótipos do tipo bb versus BB/Bb, a

fim de avaliar a relação de dependência entre estes genótipos com o grau de intensidade do

infiltrado neutrofílico na mucosa gástrica destes indivíduos.

Tabela 3- Distribuição genotípica do polimorfismo BsmI do gene VDR em relação com a

fraca intensidade de atividade neutrofílica no grupo de infectados e não infectados pela H.

pylori, Belém-PA.

E como demonstrado na tabela 3, a proporção de indivíduos infectados pelas cepas

virulentas da H. pylori, que apresentavam uma intensidade fraca de atividade neutrofílica, foi

maior nos indivíduos portadores do genótipo bb em relação aos genótipos BB/Bb, enquanto que

Infecção pela

H. pylori Genótipos

Mucosa gástrica

p-valor Z-valor Fraca atividade neutrofílica

N %

Cepas virulentas

Bb 33/60 55,00 0,0552 1,5964

BB+Bb 9/25 36,00

Cepas não

virulentas

Bb 8/14 57,14 0,1865 0,8909

BB+Bb 13/18 77,22

Negativo bb 43/46 93,48

0,2198 0,7730 BB+Bb 40/45 88,89

BB

Bb

bb

41

não foi observada diferença entre a proporção de indivíduos com os genótipos bb ou BB/Bb e

os níveis de atividade neutrofílica na mucosa gástrica dos infectados com cepas não virulentas,

e ainda, ocorreu um efeito similar, sem diferenças significativas, entre os grupos genotipados

bb ou BB/Bb nas amostras dos não infectados pela H. pylori.

Após a avaliação dos genótipos isolados, foram também calculadas as frequências dos

blocos haplotípicos para os quatros polimorfismos (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) analisados no

gene VDR como descritas na tabela 4. De forma geral, observou-se que o padrão dos blocos

haplotípicos gerados para estes marcadores nas amostras positivas foi equivalente às proporções

encontradas naqueles diagnosticados sem a infecção. Os haplótipos “FbAT” (21,22% nos casos

positivos versus 23,32% para os negativos) e “FbaT” (19,55% nos casos positivos versus

18,61% para os negativos) foram os mais frequentes em ambos os grupos estudados. Os padrões

haplotípicos “fBat” e “fbat” não foram detectados nas amostras de infectados.

Tabela 4- Distribuição das frequências haplotípicas (FokI, BsmI, ApaI e TaqI) do gene VDR

nos grupos de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-PA.

Haplótipo FokI-BsmI-ApaI-TaqI

Infecção pela H. pylori χ2

p-valor

OR (IC 95%)

Positivo Negativo

N=234 (%) N=182 (%)

FBAt (CAAC) 23,14 (9,89) 20,11 (11,05) 0,262 0,6087 0,85 (0,45-1,60)

FBAT (CAAT) 15,40 (6,58) 14,36 (7,89) 0,381 0,5372 0,79 (0,37-1,67)

Fbat (CACC) 4,57 (1,95) 3,16 (1,74) - - -

FbaT (CACT) 1,36 (0,58) 0,01 (0,01) - - -

FBAt (CGAC) 9,63 (4,12) 2,75 (1,51) 2,218 0,1364 2,69 (0,70-10,44)

FbAT (CGAT) 49,66 (21,22) 42,44 (23,32) 0,507 0,4763 0,84 (0,53-1,35)

Fbat (CGCC) 7,50 (3,21) 1,30 (0,71) 2,903 0,0884 4,45 (0,68-28,94)

FbaT (CGCT) 45,74 (19,55) 33,87 (18,61) 0,004 0,9480 1,02 (0,62-1,67)

fBAt (TAAC) 10,13 (4,33) 9,14 (5,02) 0,171 0,6792 0,82 (0,33-2,06)

fBAT (TAAT) 9,27 (3,96) 5,83 (3,20) 0,116 0,7339 1,20 (0,42-3,45)

fBat (TACC) 0,00 (0,00) 1,60 (0,88) - - -

fBaT (TACT) 2,12 (0,91) 1,80 (0,99) - - -

fbAt (TGAC) 0,03 (0,01) 3,82 (2,10) - - -

fbAT (TGAT) 24,75 (10,58) 15,54 (8,54) 0,337 0,5617 1,22 (0,62-2,38)

Fbat (TGCC) 0,00 (0,00) 2,12 (1,16) - - -

fbaT (TGCT) 30,70 (13,12) 24,15 (13,27) 0,035 0,8510 0,95 (0,53-1,68)

42

Na determinação da distribuição haplotípica no conjunto de indivíduos positivos e

negativos para H. pylori, referente apenas aos polimorfismos (BsmI, ApaI e TaqI) presentes na

região 3’ não traduzida (3’UTR) do gene VDR (figura 8), percebeu-se que, em termos

percentuais, não houve diferenças nas frequências haplotípicas observadas entre estes

conjuntos, sendo que os haplótipos bAT e baT apresentaram as maiores proporções nas

amostras de indivíduos infectados e não infectados pela H. pylori. Os haplótipos BAt e BAT

não foram tão frequentes quanto aos haplótipos previamente mencionados, porém, estavam

presentes em ambos os grupos (14% e 10,7% nos infectados versus 16% e 11,3% nos não

infectados, respectivamente). A frequência dos quatros haplótipos remanescentes (Bat,

BaT,bat,bat) foi menor do que 5%.

Figura 8 - Frequência (%) estimada de haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) no

gene VDR nos grupos de infectados e não infectados pela H. pylori, Belém-

PA.

A partir dos coeficientes de desvio padronizado (D’) e de determinação (r2) foi estimada

a extensão do desequilíbrio de ligação entre os alelos de pares de locus analisados no presente

estudo, conforme expresso na tabela 5. Assim, a avaliação destes resultados indica que as

relações observadas para os pares formados com o polimorfismo FokI estão em equilíbrio de

ligação tanto na amostra global, quanto nas amostras de indivíduos positivos e negativos para

H. pylori.

Por sua vez, para as combinações de pares entre os marcadores da região 3’UTR (BsmI,

ApaI e TaqI), nota-se que apesar destes SNPs exibirem uma proximidade física entre eles no

gene VDR, não foi evidenciado um significante desequilíbrio de ligação entre os pares

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

BAt BAT Bat BaT bAt bAT bat baT

Fre

qu

ênci

a h

ap

lotí

pic

a

Haplótipo

Positivo Negativo

43

haplotípicos observados para estes marcadores nos grupos amostrais estudados. As correlações

mais baixas foram identificadas para os pares formados entre o ApaI e TaqI, variando de 0,037

a 0,049; enquanto que as combinações entre o BsmI e TaqI apresentaram os valores mais altos

de correlação, porém, sem atingir uma significância estatística.

Tabela 5- Testes do desequilíbrio de ligação entre os 4 SNPs no gene VDR nos grupos

estudados. Belém-PA.

A tabela 6 exibe as frequências alélicas e haplotípicas dos RFLP FokI, BsmI, ApaI e

TaqI do gene VDR nos grupos de indivíduos infectados e não infectados por H. pylori e também

quando estes grupos foram combinados formando um único grupo da população de Belém. E

para fins comparativos foram usados dados da literatura referentes a uma população brasileira

publicada por Lins et al. (2011) e de grupos populacionais do projeto HapMap (Internacional

HapMap Project) derivados de diferentes etnias como europeia, africana e asiática. Os achados

revelaram que a distribuição alélica de FokI estimadas no presente estudo diferiu das

populações usadas como referência de origens européia e africana. De fato, constatou-se que a

frequência do alelo F para o polimorfismo FokI foi mais comum entre africanos do que entre

os grupos estudados da população de Belém.

Tabela 6- Comparação entre as distribuições de frequências dos SNPs genotipados e dos

haplótipos (BsmI-ApaI-TaqI) nos grupos estudados entre diferentes populações.

VDR SNPs Distância (Kb) Geral H. pylori

positivo

H. pylori negativo

D' r2 D' r2 D' r2 FokI-BsmI 33,0 0,012 0,000 0,008 0,000 0,058 0,001

FokI- ApaI 34,0 0,099 0,008 0,049 0,002 0,154 0,022

FokI-TaqI 34,1 0,084 0,001 0,311 0,015 0,097 0,005

BsmI-ApaI 0,9 0,691 0,124 0,688 0,120 0,696 0,128

BsmI-TaqI 1,0 0,608 0,278 0,565 0,250 0,667 0,319

ApaI-TaqI 0,0 0,475 0,044 0,495 0,049 0,440 0,037

População

SNP (Alelos) Haplótipos (BsmI- ApaI-TaqI)

FokI

(F)

BsmI

(b)

ApaI

(a)

TaqI

(T)

baT

(GCT)

Bat

(AAC)

bAT

(GAT)

BAT

(AAT) H*

Hp+ 0,671 0,718 0,393 0,765 0,326 0,140 0,319 0,107 0,108

Hp - 0,648 0,692 0,374 0,758 0,320 0,160 0,317 0,113 0,090

Belém 0,661 0,707 0,385 0,762 0,323 0,148 0,318 0,110 0,101

Brasil 0,674 0,605 0,460 0,627 0,418 0,332 0,175 0,022 0,053

CEU 0,525 0,525 0,424 0,526 0,429 0,438 0,133 0,000 0,000

YRI 0,833 0,712 0,375 0,750 0,397 0,249 0,307 0,018 0,028

ASN 0,646 0,921 0,645 0,933 0,660 0,062 0,258 0,020 0,000 Hp+: H. pylori positivo; Hp-: H.pylori negativo; Belém: total de pacientes pesquisados; Brasil: população

brasileira de Lins et al. (2011) CEU: população residente em Utah com ascendência do norte e oeste europeu;

YRI: grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria; ASN: população asiática proveniente da China e Japão;

H*: somatório dos haplótipos < 5%.

44

Paralelamente, comparações similares em relação às distribuições de frequências

alélicas dos outros SNPs genotipados (BsmI/ApaI/TaqI) do gene VDR também indicaram

diferenças nos grupos estudados da população de Belém, sendo geneticamente mais distante

das populações de grupos étnicos de origem européia e asiática e também se diferenciando da

outra população brasileira em relação as frequências alélicas inerentes apenas ao SNP TaqI.

Adicionalmente, esta diferenciação também pode ser observada considerando as frequências

haplotípicas nos grupos avaliados da população de Belém comparadas com as de populações

étnicas ancestrais.

Assim, na tabela 7 estão detalhados os achados desta análise comparativa entre pares

interpopulacionais, englobando as frequências dos quatro SNPs no gene VDR, estimadas no

presente estudo e daquelas disponíveis na literatura para populações como referenciadas acima.

No geral, os valores do teste Fst que foram significativamente diferentes, indicam o nível de

diferenciação genética resultante desta comparação entre os pares testados das populações,

evidenciando não apenas as influências étnicas no processo de miscigenação da população

estudada, como poderia também potencialmente ser reflexo das diferenças seletivas detectadas

em decorrência da infecção pela H. pylori.

Tabela 7- Os valores do teste de diferenciação entre pares de população (Fst) na comparação

de frequências locus a locus de amostras brasileiras e referências étnicas do HAPMAP.

Hp+: H. pylori positivo; Hp-: H.pylori negativo; Belém: total de pacientes pesquisados; Brasil: população brasileira de Lins et al. (2011); CEU: população residente em Utah com ascendência do norte

e oeste europeu; YRI: grupo étnico africano iorubá de Ibadan, Nigéria; ASN: população asiática proveniente da China e Japão.

Pares de

população FokI BsmI ApaI TaqI BsmI/ApaI/TaqI

Fst p Fst p Fst p Fst p Fst p

Hp+/ Hp- -0,009 0,782 -0,008 0,709 -0,009 0,754 -0,009 0,718

-0,009 1,000

Hp+/BRZ -0,007 0,909 0,021 0,045 0,002 0,218 0,040 0,009

0,046 0,000

Hp+/CEU 0,039 0,009 0,070 0,000 -0,007 0,754 0,118 0,000

0,097 0,000

Hp+/YRI 0,062 0,000 0,008 1,000 -0,007 0,800 -0,006 0,636

0,015 0,027

Hp+/ASN -0,006 0,545 0,125 0,000 0,112 0,000 0,096 0,000

0,088 0,000

Hp-/BRZ -0,007 0,645 -0,008 0,182 0,007 0,264 0,031 0,018

0,038 0,000

Hp-/CEU 0,026 0,045 0,049 0,018 -0,004 0,527 0,103 0,000

0,086 0,000

Hp-/YRI 0,078 0,000 -0,008 0,709 -0,009 1,000 -0,009 0,836

0,008 0,082

Hp-/ASN -0,009 0,727 0,158 0,000 0,129 0,000 0,112 0,000

0,092 0,000

45

5. DISCUSSÃO

A infecção pela H. pylori envolve complexos mecanismos de interação entre o

ambiente, o sistema imunológico do hospedeiro e a diversidade genética das estirpes

bacterianas, os quais têm importantes implicações clínicas e epidemiológicas e que

determinam à permanência deste patógeno na mucosa gástrica (Cadamuro et al., 2014).

Neste contexto, a análise efetuada neste estudo buscou avaliar a relação dos

polimorfismos do gene VDR humano na infecção pela H. pylori, tendo como base os aspectos

epidemiológicos da infecção, as alterações histológicas da mucosa gástrica e estilo de vida da

população estudada. Assim, em nossas análises não foi encontrada nenhuma correlação dos

polimorfismos de RFLP FokI, ApaI e TaqI do gene VDR com a infecção pela H. pylori.

Contudo, foi observada uma diferença significativa na distribuição genotípica do SNP BsmI

entre as amostras positivas e negativas para H. pylori.

Esta diferença foi notada principalmente para o heterozigoto Bb, cuja frequência foi

cerca de 20,7% maior nas amostras negativas em relação as amostras positivas. Da mesma

forma, o genótipo bb apresentou uma frequência de 12,7% a mais nas amostras positivas. No

entanto, apesar de ser observada essa diferença nas proporções genotípicas, o mesmo não

ocorreu para as frequências alélicas. E basicamente, estes achados mostram um desvio

significativo das frequências genotípicas do SNP BsmI do gene VDR, determinado por uma

baixa frequência do genótipo Bb no grupo de pacientes com positividade para a H. pylori e

colonizado por cepas virulentas do tipo CagA/VacA s1m1. Em contrapartida, a frequência do

genótipo variante bb estava elevada neste grupo de pacientes, sugerindo ser este mais um fator

aditivo na interação com cepas virulentas da H. pylori, em favorecer o desenvolvimento e a

persistência bacteriana na mucosa gástrica, a ponto de modular uma intensidade mais fraca de

atividade neutrofílica em relação àquela observada em pacientes portadores de outros

genótipos (BB/Bb).

É um fato que, as propriedades imunomoduladoras da forma ativa de vitamina D são

mediadas pelo menos em parte pelo VDR (Deluca & Cantorna, 2001; White , 2013; Vojinovic,

2014), estando os metabólitos da vitamina D envolvidos tanto na indução da atividade

antimicrobiana como tem efeitos anti-inflamatórios. O mecanismo identificado pelo qual a

1α,25(OH)2D3 provavelmente atua no controle inato de uma infecção microbiana envolve a

indução de óxido nítrico, oxidases dependentes de NADPH e fusão do fagolisossoma (Rockett

et al., 1998 ; Sly et al., 2001; Hmama et al., 2004), que após suas ativações levam a produção

de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio em resposta dos fagócitos ao estimulo

46

infeccioso (Geiszt et al., 2003). E do mesmo modo, também está associada com a indução de

expressão do complexo antimicrobiano peptídeo-catelicidina (CAMP) (Martineau et al.,

2007), o produto do qual é enzimaticamente clivado para produzir o agente antimicrobiano

ativo catelicidina (LL-37) (Sorensen et al., 2001). Sendo que tem sido detectado que estes

peptídeos são mais abundantes em neutrófilos e células epiteliais (Risso, 2000; van Wetering

et al., 2005). E ainda o estudo de Sorensen et al. (2001) mostrou que proteinase 3, a qual é

requerida para a clivagem da catelicidina e do peptídeo é predominantemente expressa em

neutrófilos. Esta atividade bactericida da catelicidina é mediada pela sua habilidade para ligar-

se a monocamada de fosfatidilglicerol e assim romper a parede celular bacteriana (Neville et

al., 2006).

Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios da vitamina D ainda não estão

completamente esclarecidos. Acredita-se ser decorrente de sua própria intensificada atividade

antimicrobiana e pela indução da expressão de um mediador fundamental, a interleucina 37

(IL-37), que é um inibidor natural da ativação de células fagocitárias infectadas com o bacilo

Mycobacterium tuberculosis, com amplos efeitos anti-inflamatórios (Coussens et al., 2014).

Em geral, o receptor da vitamina D (VDR) é encontrado em muitos tipos de células do

sistema imune, como células T, células B, monócitos, macrófagos, células dendríticas e células

natural killer (NK). E nesses tipos de células, os complexos 1,25(OH)2D3–VDR regulam a

inibição da expressão de citocinas como IL-2, TNF- α, IFN-γ e GM-CFS nas células

neutrofílicas (Muller & Bendtzen, 1996; D'Ambrosio et al., 1998; Hewison, 2011). De modo

geral, a vitamina D parece favorecer a diferenciação de clones de células Th2 em detrimento

de Th1 (Rigby et al., 1987; Bikle, 2008), e com intensificada expressão da citocina anti-

inflamatória IL-10 (Piemonti et al., 2000). Além disso, o VDR atua também na supressão da

produção de imunoglobulinas (Ig) e da proliferação de linfócitos B (Macdonalds et al., 1994),

bem como desempenha um importante papel tanto no desenvolvimento e diferenciação quanto

na função efetora de células T (Canning et al., 2001).

Assim sendo, é importante tentar determinar se os SNPs de RFLP (FokI, BsmI, ApaI e

TaqI) do gene VDR estão associados à infecção pela H. pylori. Porém, é possível que os efeitos

genotípicos sejam somente evidenciados em determinadas condições ambientais. O estudo de

Levin et al. (2012) mostrou que a combinação de baixos níveis circulantes de 25-

hidroxivitamina D3 e alguns genótipos aumentam o risco de doenças. Sendo bem documentado

que os polimorfimos do gene VDR estão associados com o risco de fratura de quadril, diabete

mellitus, artrite reumatoide, infarto do miocárdio e alguns tipos de câncer (Revisado em

Berlanga-Taylor & Knight, 2014).

47

No presente estudo o achado mais importante refere-se ao polimorfismo RFLP BsmI

no gene VDR no grupo de indivíduos infectados com cepas virulentas tipo 1 da H. pylori.

Nestes casos, foi observado que as distribuições genotípicas BB/Bb/bb entre não infectados e

infectados com cepas virulentas e não virulentas apresentaram uma inesperada associação, pois

os genótipos BB/Bb estão em baixa percentagem nos infectados com cepas tipo 1 da H. pylori,

enquanto inversamente o genótipo bb representa a maior proporção dos predispostos com esta

infecção, sugerindo que variações genotípicas dos polimorfismos VDR pode ser um dos fatores

de risco a influenciar na patogênese desta infecção. Similarmente, entre os diferentes genótipos

foi detectado variações na intensidade de atividade neutrofílica, com uma tendência estatística

de uma elevada proporção entre os portadores do genótipo bb de expressarem fraca intensidade

de atividade neutrofílica, em relação aos demais genótipos, na presença de infecção com cepas

virulentas da H. pylori e até mesmo entre aqueles infectados com cepas não virulentas.

Deste modo, estes achados nos levam a supor que esta variante genotípica bb poderia

atuar na redução da expressão de VDR, e, consequentemente, em suas funções imunes na

defesa do hospedeiro contra esta infecção. Logo, constatou-se que os escores de atividade

neutrofílica apresentam uma relação de dependência com as variações genotípicas no gene

VDR, deduzindo-se como verdadeira a afirmação de que deve existir também uma atividade

diferencial de proteínas VDR, o que confirmaria o estudo prévio de Guo et al. (2014), que

observou uma correlação positiva entre os escores de inflamação crônica e a expressão de

mRNA do VDR e catelicidina na mucosa gástrica de pacientes infectados com a H. pylori.

Portanto, a regulação positiva da expressão do mRNA do VDR na infecção pela H. pylori,

conforme descrito por Guo et al. (2014), também pode ser um ponto de partida importante para

análises mais profundas sobre os possíveis efeitos dos polimorfismos do gene VDR na

patogênese da H. pylori.

No que tange a literatura relata-se discordâncias entre os estudos de associação

referentes aos polimorfismos presentes no gene VDR, que podem ser atribuídas às variações

no padrão do desequilíbrio de ligação destes marcadores entre os diversos grupos étnicos (Fang

et al., 2005).Adicionalmente, tem sido hipotetizado que as interações do gene VDR com outros

genes, assim como as interações gênicas com os fatores ambientais, atuem de maneira

importante na determinação dos níveis de expressão do receptor VDR nos diferentes grupos

populacionais (Uitterlinder et al., 2004).

Neste aspecto, vale mencionar que no presente estudo a infecção pela H. pylori

diagnosticada pelo método da biologia molecular (PCR) apresentou uma prevalência de 58%

nos pacientes com gastrite crônica. Outros estudos (Martins et al., 2005; Vinagre et al., 2011;

48

da Silva et al., 2013) na mesma população também obtiveram resultados similares com esse

método. Estudos prévios desenvolvidos no Brasil em adultos com sintomatologias gástricas

também apontaram uma prevalência elevada da infecção pela H. pylori, identificando uma

positividade de 78% em São Paulo (Menoni et al., 2013), 76% no Rio Grande do Sul (Muller

et al., 2007) e de 51,9% no Paraná (Cogo et al., 2011).

Em geral, nos países em desenvolvimento a prevalência de infecção pela H. pylori pode

alcançar proporções acima de 50% em algumas populações, como observado em estudos

conduzidos na Índia (Adlekha et al., 2013; Pandey et al., 2014), Etiópia (Mathewos et al.,

2013), Geórgia (Tarkhashvili et al., 2012) e Venezuela (Contreras et al., 2015). Em contraste,

em outros trabalhos realizados em populações provenientes de países desenvolvidos, tais como

Canadá (Sethi et al.,2013), Estados Unidos (Patterson et al., 2012), Itália (Dore et al., 2015),

Austrália (Moujaber et al.,2008) e Japão (Ueda et al., 2014), é possível notar uma tendência

de declínio mais expressiva das taxas de infecção pela H. pylori nos indivíduos adultos,

apresentando frequências que oscilam próximo ou abaixo de 40%. Estes estudos acima

mencionados e relacionados com diferentes características socioeconômicas sugerem que a

transmissão da infecção pela H. pylori pode ser facilitada pelas precárias condições de higiene

e saneamento, com evidências de um maior risco para infecção intrafamiliar, mediante os

contatos pessoa-pessoa (Barile et al., 2009).

Em nossas análises os testes moleculares utilizados para verificar a presença de cepas

virulentas (CagA+/VacAs1m1) mostrou um predomínio dessas cepas entre os pacientes,

atingindo uma proporção de 50% nos infectados. Nesta mesma população dados similares

também foram relatados por Vinagre et al. (2013), que encontraram uma prevalência de

infecção de 85% nos pacientes com gastrite, sendo que em 59% dos casos positivos foram

detectadas cepas virulentas de H. pylori.

Neste trabalho foi também observado que a distribuição da infecção pela H. pylori

quanto aos aspectos epidemiológicos e demográficos investigados não atingiu uma

significância estatística para a maioria das variáveis estudadas, mostrando que a infecção

independe do sexo, idade, hábito tabágico, comorbidade e consumo de frutas. E apesar de não

ter sido detectada uma relação da infecção com o elitismo nas amostras estudadas, houve uma

tendência estatística de uma maior proporção de infectados no grupo de elitista. No entanto, as

análises referentes sobre o consumo de álcool como possível fator de risco para o aumento das

taxas de infecção pela H. pylori não são conclusivas, sendo que alguns estudos relataram não

encontrar nenhuma associação do elitismo com a infecção pela H. pylori (Santos et al., 2005;

Zaterka et al., 2007).

49

Durante a infecção, a H. pylori pode persistir na mucosa gástrica por longos períodos

de tempo, pois ela é capaz de neutralizar a acidez gástrica pela forte atividade de sua enzima

urease que hidrolisa a uréia com produção de grande quantidade de amônia e dióxido de

carbono, elevando o pH intragástrico (Hazell & Lee, 1986) e ainda possui a enzima ɣ-

glutamiltranspeptidase, importante para o seu crescimento e sobrevivência na mucosa gástrica

(Chevalier et al., 1999). Assim, tem sido observado que estes dois mecanismos podem ser

inibidos pela administração da vitamina D (Kawaura et al., 2006).

Outro aspecto relevante é que cepas virulentas de H. pylori são capazes de induzir um

grau maior de inflamação da mucosa gástrica. Estudos prévios têm demonstrado que elas

aumentam a secreção de citocinas pró-inflamatórias, quimiotáticas para neutrófilos e células

mononucleares, gerando a formação de um intenso infiltrado. E, portanto, elas estão

relacionadas com a ocorrência de patologias mais severas, como úlcera e câncer gástrico

(Montecucco et al., 1999; Nogueira et al., 2001; Rieder et al., 2005).

Entre os mecanismos de patogênese destaca-se a exacerbação de estresse oxidativo pelo

neutrófilo, que é ainda maior na presença de cagA como demonstrado em estudos in vitro

(Zhang et al., 1996) e in vivo (Suzuki et al., 1998; Danese et al., 2001), reforçando a função

carcinogênica da H. pylori. A exposição ao CagA resulta na elevação do nível de estresse

oxidativo, que é representativo de um severo dano ao DNA, e pode ser neutralizado pela ação

de enzimas antioxidantes produzidas pelas células epiteliais gástricas a fim de manter um

balanço entre os fatores oxidantes e antioxidantes (Papa et al., 2002).

Neste sentido, a possível interação molecular da vitamina D3 com este microrganismo

foi inicialmente abordado a partir de um estudo realizado com mulheres idosas, no qual foi

observada uma maior redução das taxas de infecção pela H. pylori no grupo de mulheres que

tinha sido suplementado com vitamina D por prolongados períodos de tempo, quando

comparadas com aquelas que não receberam tratamento para este composto. Contudo, ainda

não foi confirmado se a suplementação de vitamina em longo prazo pode prevenir ou erradicar

a infecção pela H. pylori (Kawaura et al., 2006).

A atividade antibacteriana da vitamina D3 e de seus metabólitos foi investigada

recentemente em culturas de H. pylori. Neste experimento, os autores identificaram que as

formas intactas da 25-hidroxivitamina D3 e a 1,25-di-hidroxivitamina D3 inibiram

significativamente a proliferação bacteriana in vitro da H. pylori (Hosoda et al., 2015). Estes

autores sugerem que os baixos níveis séricos da 25-hidroxivitamina D3 poderiam estar

correlacionados com a incidência da infecção pela H. pylori na infância, no qual são

evidenciadas as maiores taxas de aquisição da infecção.

50

Em outro estudo experimental desenvolvido em mulheres brasileiras idosas foi

demonstrado que a suplementação como doses elevadas de vitamina D3 produziu um efeito

positivo nas concentrações séricas da 25-hidroxivitamina D3 e na capacidade total de

antioxidante, além de reduzir os níveis dos marcadores inflamatórios. Particularmente, estes

efeitos foram significativos apenas para o grupo de pacientes que exibiam o genótipo BB/Bb

para o polimorfismo BsmI (Cavalcante et al., 2015).

Da mesma forma dados provenientes de estudos de meta-análise, levando em

consideração o polimorfismo BsmI, apontaram uma possível redução do risco de câncer

associado aos genótipos “BB” e “Bb” quando comparado com o homozigoto “bb”. (Raimondi

et al., 2014; Xu et al., 2014). Diferentemente destes trabalhos, uma meta-análise realizada por

Chen et al. (2013) sugeriu que o homozigoto “BB” esteja relacionado com um aumento de

risco de tuberculose em populações de origem européia, embora este resultado não pode ser

comprovado com outras populações. Outro estudo in vitro conduzido por Torres et al. (2010)

relatou que o homozigoto “BB” contribuiu significativamente para o aumento da

suscetibilidade à infecção pelo HIV.

Além disso, o presente estudo testou se as frequências haplotípicas das variantes do

gene VDR com a infecção pela H. pylori. Assim, quando se considerou as análises dos blocos

haplotípicos gerados para o grupo de infectados e não infectados para H. pylori, verificou-se

que as proporções encontradas não diferiram significativamente entre estes grupos amostrais

em nenhum dos modelos haplotípicos analisados, sendo encontrado um predomínio do

haplótipo “FbAT” nas amostras positivas e negativas para H. pylori, seguido dos haplótipos

“FbaT” e “fbaT”.

Entre as estimativas do padrão de desequilíbrio de ligação foi observado que o FokI

não estava associado com nenhum dos polimorfismos analisados para o gene VDR. Esse

resultado é compatível com outras investigações efetuadas em populações da Índia (Alagarasu

et al.,2012), Arábia Saudita (Al-Daghri et al., 2014) e Alemanha (Heine et al., 2012). E em

uma abordagem mais ampla da estrutura do gene VDR, o marcador FokI mostrou-se

independente de qualquer SNP ou bloco haplotípico, definido para os grupos étnicos de origem

caucasóide, asiática e afro-americana (Fang et al., 2005), estando localizado em uma área do

gene considerada como um ponto quente de recombinação (Nejentsev et al., 2004).

Paralelamente, na análise dos blocos da região 3’UTR do gene VDR verificou-se uma

diversidade de haplótipos na população estudada, com uma maior contribuição dos blocos baT,

bAT e BAt. Similarmente, o estudo realizado por Thakkinstian et al (2004) descreve o

haplótipo baT como o mais comum em caucasianos, seguido do bloco BAt e bAT. Assim

51

como, Uitterlinden et al. (2004) também identificou o haplótipo baT como o mais prevalente

em caucasianos, enquanto que em populações de origem africana, o haplótipo bAT foi o mais

frequente.

No que diz respeito aos pares haplotípicos formados apenas com os polimorfismos da

região 3’UTR, a análise comparativa desses haplótipos revelou baixos valores de correlação

entre eles. Sendo que, esta análise é essencial frente às evidências (Morrison et al., 1994;

Carling et al., 1998) de que todos os conhecidos polimorfismos VDR interagiriam entre si,

como resultado de combinações haplotípicas particulares, modulando a expressão e a atividade

do VDR (Whitfield et al., 2001; Uitterlinden et al., 2004). E de acordo com os polimorfismos

desta região 3’UTR ainda tem sido reconhecido efeito tipo célula-específica quanto a uma

estabilidade diferenciada do mRNA do VDR, a ponto de existir uma tendência do haplótipo

BAt exibir de alguma forma, níveis totais mais elevados do mRNA VDR do que o haplótipo

baT, apesar destes achados não terem sido comprovados em outros trabalhos experimentais

(Gross et al., 1997; Durrin et al., 1999; Whitfield et al., 2001). Outra hipótese sustentada por

Durrin et al. (1999) é que as variantes do gene VDR estejam em desequilíbrio de ligação com

outros polimorfismos em genes adjacentes verdadeiramente funcionais.

Estas divergências reforçam a necessidade de caracterizar o perfil imunogenético de

pacientes com um conjunto de variantes que poderia influenciar na predisposição da doença

investigada. Portanto, em particular pela origem miscigenada da população de Belém e pela

sua elevada prevalência para a infecção pela H. pylori, é oportuno avaliar as variações

genotípicas dos polimorfismos do gene VDR em relação a distribuição de suas frequências nos

diferentes grupos étnicos. Neste aspecto, os valores de Fst revelaram diferenças significativas

entre as frequências alélicas dos SNPs VDR da população estudada com aquelas disponíveis

na literatura (Internacional HapMap Project) para os grupos étnicos ancestrais europeus,

africanos e asiáticos.

Deste modo, estas distâncias podem ser um resultado do processo de miscigenação,

dado que a população de Belém é altamente distinta em termos genéticos das populações das

quais ela derivou (Guerreiro & Chautard-Freire-Maia, 1988; Santos et al., 2009). Por outro

lado, deve ser ressaltado que doenças infecciosas, a exemplo da infecção pela H. pylori

resultam da interação entre gene e ambiente e fatores sociais, os quais são cruciais para os

processos evolutivos e comportamento genético da população, o que provavelmente contribui

junto com as influências étnicas para uma diferenciação das frequências alélicas nos grupos

amostrais da população investigada.

52

Neste contexto, os resultados globais apresentados neste estudo ainda precisam de uma

melhor compreensão, em razão de limitações inerentes aos possíveis efeitos da subestrutura da

população entre ambos os grupos amostrados, que pode levar a resultados de associação falsos

positivos, devido a diferenças nas frequências alélicas de grupos parentais que contribuem

diferencialmente nas subpopulações investigadas, visto que a etnicidade foi definida com base

na autodeclaração da história familiar de ancestralidade dos pacientes. Outro ponto crítico é o

moderado tamanho amostral, que interfere no poder dos testes estatísticos, e que dificultou

analisar a interação entre os polimorfismos gênicos (haplótipos). Além disso, como o material

biológico disponível já havia sido previamente colhido e estava mantido em estoque,

inviabilizou as análises referentes aos níveis séricos de vitamina D, bem como a quantificação

da expressão de mRNA do VDR nos pacientes pesquisados. E também deve ser salientado que

dados contraditórios nos estudos de associação podem ainda ser resultados de diferentes

padrões de exposição aos fatores de riscos ambientais e de uma combinação diversa de

variantes de suscetibilidade, como anteriormente já abordado no estudo de Batar et al. (2008).

Assim, a partir de tais limitações, estes achados merecem uma abordagem cautelosa,

esperando que investigações mais extensivas a nível molecular possam melhor esclarecer a

relação dos polimorfismos do gene VDR com a etiopatogênese da infecção pela H. pylori,

principalmente porque existe uma carência de dados na literatura sobre este assunto,

impossibilitando, assim, efetivar análises comparativas com este estudo. Além do que são

desejáveis estudos de replicação independentes para validar a relação genótipo/fenótipo,

buscando ampliar em especial o entendimento das funções imunes do VDR na defesa contra a

infecção pela H. pylori.

53

6. CONCLUSÃO

A distribuição das frequências genotípicas e alélicas para os polimorfimos FokI, ApaI e

TaqI no gene VDR estão de acordo com o modelo de equilíbrio de Hardy- Weinberg na

população de estudo, sendo que estas frequências não diferiram entre os que

apresentavam ou não a infecção pela H. pylori. Enquanto que, para o polimorfismo

BsmI foi verificado um desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo

de positivos para a H. pylori

O padrão de distribuição haplotípica dos polimorfimos presente no gene VDR foram

similares entre o conjunto de infectados e não infectados para a H. pylori para os grupos

formados com os marcadores FokI, BsmI, ApaI e TaqI e para os polimorfimos da região

3’UTR (BsmI, ApaI e TaqI).

As frequências genotípicas do polimorfismo BsmI diferiram entre os grupos de

infectados e não infectados pela H. pylori, com uma maior proporção de heterozigotos

no grupo dos não infectados e do homozigoto bb para o grupo de infectados,

particularmente naqueles positivos para cepas virulentas de H. pylori.

Em relação ao grupo de positivos virulentos, observou-se uma tendência estatística de

níveis mais fracos de atividade neutrofílica na mucosa gástrica entre os indivíduos com

o genótipo bb do polimorfismo BsmI quando comparados com os outros genótipos

(Bb+BB).

De um modo geral, as frequências das variantes polimórficas estudadas no gene VDR

apresentaram uma distribuição diferenciada para a população de Belém em relação aos

grupos étnicos de origem europeia, africana e asiática do projeto HapMap.

Similarmente, apenas com o marcador TaqI detectou-se uma distância genética entre

esta população estudada e a outra população brasileira utilizada como referência.

54

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APÊNDICE

polimorfismos do gene receptor humano de … · contribuem de forma significativa no...

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