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JOÃO FELIPE BEZERRA
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DO GENE IRF6 EM PACIENTES COM
FENDAS ORAIS NÃO-SINDRÔMICAS.
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
para a obtenção do título de Doutor
em Ciências da Saúde
Orientadora: Profa. Dra. Adriana
Augusto de Rezende
NATAL/RN
2017
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Bezerra, Joao Felipe.
Associação de polimorfismos do gene IRF6 em pacientes com
fendas orais não sindrômica / Joao Felipe Bezerra. - Natal, 2017. 49f.: il.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende.
1. Fenda Palatina - Tese. 2. Fendas Orais Não Sindrômicas -
Tese. 3. Polimorfismos - Tese. 4. Gene IRF6 - Tese. 5. Fenda
Labial - Tese. I. Rezende, Adriana Augusto de. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.315-007.254
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
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JOÃO FELIPE BEZERRA
ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DO GENE IRF6 EM PACIENTES COM
FENDAS ORAIS NÃO-SINDRÔMICAS
Aprovada em 03 /04 /2017
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende
Membros da Banca:
Profa. Tirzah Braz Petta Lajus – Membro Interno
Prof. Dr. Leonardo Capistrano Ferreira – Membro Interno
Prof. Dr. Tarsis Antonio Paiva Vieira – Membro Externo
Profa. Dra. Gabriela Ferraz Leal – Membro Externo
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DEDICATÓRIA
À Deus, que em sua infinita bondade me deu a vida e uma família maravilhosa.
Somente Nele por muitas vezes encontrei forças para vencer os desafios dessa
jornada.
À minha família, iniciando pela minha esposa MEIREKARLA SOARES pelo
amor incondicional, pela presença em todos os momentos da minha vida, que
mesmo com todos meus estresses, decepções e vitórias, e pelo apoio em
nossa luta diária pelo nosso ESPECIAL FILHO JOÃO FELIPE BEZERRA
FILHO que veio a esse mundo iluminar nossas vidas e nos fazer crescer a
cada aprendizado e dedicação!!
Minhas Mães: Maria de Fátima Bezerra, Maria Soares de Moura (in memorian)
e Maria das Graças Bezerra que tanto fizeram para eu chegar aonde cheguei.
Minhas irmãs e primos que compõem minha família.
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AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende, que ao longo destes 15
anos de convivência tanto me ajudou, me orientando de tanto no âmbito
profissional quanto pessoal e sempre abrindo caminhos para a realização deste
e de outros trabalhos. Ressaltando sua contribuição, integral e de forma única,
para me tornar um grande e vitorioso profissional.
À Profa. Dra. Maria das Graças Almeida pela disponibilidade e
ensinamentos, contribuindo para a minha formação profissional.
Ao Prof. Dr. André Ducati Luchessi, pela amizade e ensinamentos,
sou muito grato a você meu amigo, sempre apoiando e ensinando com um
único objetivo, meu crescimento e amadurecimento profissional e pessoal.
Ao meus dois grandes irmãos Raul Hernandes Bortolin e Francisco
Paulo Freire Neto, amigos para todos os momentos, presentes nas
dificuldades e nas alegrias. Devo muito desse sucesso a vocês meus amigos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde pela
contribuição na minha formação profissional.
À ao CNPq pelo apoio financeiro para a realização deste estudo.
À família LABMULT, meus amigos e companheiros de pesquisa, Ciele,
Felipe, Gustavo, Heglayne, Raul, Karla, Marcela, Melina, Thamara,
Thaynnan, Vinícius e Yonara.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
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RESUMO
As fendas orais constituem um problema de saúde publica atingindo cerca de 15% de todas as malformações, caracterizando-se pela formação incompleta das estruturas que separam a cavidade nasal e a cavidade oral com fatores genéticos e ambientais que contribuem para sua etiologia. Atualmente, estudos de microarray, utilizando pacientes fissurados identificaram diversas regiões de susceptibilidade para o desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas, dentre essas alguns estudos demonstraram a região do gene Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6) associado ao aumento de risco para o desenvolvimento das fendas. O objetivo do presente trabalho é pesquisar polimorfismos do gene IRF6 e as possíveis associações com o desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas. Para isso, um total de 368 individuos (186 pacientes FL/P e 182 controles) foram selecionados no Serviço de Atendimento ao Paciente Fissurado - HUOL/UFRN. Amostras de sangue foram coletadas para extração do DNA e análise dos polimorfismos do gene IRF6 (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, e rs1044516) por PCR em tempo real. Os pacientes foram classificados nos grupos Fenda Lábio-palatina (CLP), Fenda labial (CL) e Fenda Palatina (CP) e foi observada uma associação significativa de rs2235371 (OR: 11,24, 95% CI: 1.97-64.22, p = 0,016) no grupo com a fendas palatinas isoladas (CP). Além disso, a análise da combinação alélica mostrou um aumento do risco de fendas associado aos polimorfismos rs1044516 e rs2236907, uma vez que estavam presentes em todas as combinações significativas. Assim, a associação do rs2235371 com pacientes do grupo CP mostra-se como um fator de risco para CP em nossa população. A análise das combinações alélicas mostram a influência de polimorfismos do IRF6 combinadas, principalmente (rs1044516 e rs2236907) sugerem que cada polimorfismo pode contribuir minimamente para aumentar o risco de desenvolver fendas orais não-sindrômicas em uma população brasileira de Rio Grande do Norte.
Palavras-chave: fendas orais não-sindrômicas, polimorfismos, gene IRF6, PCR em tempo real.
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ABSTRACT
Orofacial clefts are a public health problem accounting for approximately 15% of all malformations, characterized by the incomplete formation of structures that separate the nasal cavity and oral cavity with genetic and environmental factors that contribute to its etiology. Currently, microarray studies using fissured patients have identified several regions of susceptibility to the development of non-syndromic orofacial clefts among which some studies have demonstrated the region of the Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6) gene associated with increased risk for non-syndromic orofacial clefts development. The aim of the present study is to investigate polymorphisms of the IRF6 gene and the possible correlations with the development of non-syndromic orofacial clefts. For this, a total of 368 individuals (186 FL / P patients and 182 controls) were selected in the Service of the Fissured Patient - HUOL / UFRN. Blood samples were collected for DNA extraction and analysis of the polymorphisms of the IRF6 gene (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and rs1044516) by real-time PCR. Patients were classified into the CLP, CL and CP groups and a significant association of rs2235371 (OR: 11.24, 95% CI: 1.97-64.22, p = 0.016) was observed in the group with isolated palate clefts (CP). In addition, the analysis of the allelic combination showed an increased risk orofacial clefts associated with the polymorphisms rs1044516 and rs2236907, since they were present in all significant combinations. Thus, the association of rs2235371 with patients in the CP group is shown as a risk factor for CP in our population. The analysis of allelic combinations show the influence of combined IRF6 polymorphisms mainly (rs1044516 and rs2236907) suggest that each polymorphism may contribute minimally to increase the risk of developing non-syndromic orofacial clefts in a Brazilian population of Rio Grande do Norte. Keywords: Non-syndromic cleft lip and/or palate, polymorphisms, IRF6 gene, real time PCR.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CB/UFRN – Centro de Biociências da UFRN.
CCS/UFRN – Centro de Ciências da Saúde da UFRN
CLP – Cleft lip and Palate
CL – Cleft Lip
CP – Cleft Palate
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DP – Desvio padrão
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
FLPNS – Fenda Lábio palatina Não-sindrômica
HRAC – Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais
HRM – High Resolution Melting
IRF6 - Interferon Regulatory Factor 6
LABIOMOL/UFRN – Laboratório de Biologia Molecular da UFRN
LABMULT/UFRN – Laboratório Multidisciplinar da UFRN
MSX1 – Muscle Segment Homeobox gene 1
NADH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
PCR – Reação em cadeia da polimerase
TBE – Tris Borato EDTA
TBX22 – T-box Transcription Factor
TGF-B – Transforming Growth Factor Beta
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
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SUMÁRIO
1. Introdução......................................................................................................11
1.1. Fendas Orais..............................................................................................11
1.2. Fendas Orais: fatores etiológicos e aspectos genéticos ...........................13
1.3. Fator Regulador do Interferon 6 (IRF6)......................................................15
2. Justificativa ...................................................................................................16
3. Objetivos.......................................................................................................13
3.1. Objetivo geral.............................................................................................17
3.2. Objetivos específicos.................................................................................18
4. Casuística, Materiais e Métodos ..................................................................18
4.1. Casuística .................................................................................................18
4.1.1. Aspectos Éticos......................................................................................18
4.2. Extração e amplificação do DNA genômico .............................................19
4.3. Pesquisa de polimorfismos no gene IRF6..... ...........................................19
4.4. Análise estatística......................................................................................20
5. Artigo Produzido ..........................................................................................21
6. Comentário, Crítica ou Sugestão.................................................................40
7. Referências Bibliográficas............................................................................45
ANEXO – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido......................49
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1. INTRODUÇÃO
1.1 FENDAS ORAIS
As fendas orais são malformações caracterizadas pela formação
incompleta das estruturas que separam a cavidade nasal e a cavidade oral, tais
como os lábios, os alvéolos e o palato duro e/ou mole, podendo ainda afetar
outras regiões da face tais como as orelhas, as regiões palpebrais, que
poderão estar parcial ou totalmente acometidas (Marazita, 2013).
O desenvolvimento dos lábios e palatos envolve uma complexa série de
eventos de migração, crescimento, adesão, diferenciação e apoptose celular de
forma coordenada, pois uma possível falha nesses eventos culmina com a
formação de um dos diversos tipos de fendas (Knight, 2006).
As fendas são geralmente estabelecidas precocemente, ainda na vida
intrauterina, entre a 4ª e a 12ª semana, fase em que ocorre a fusão dos
diversos processos responsáveis pela formação desta área da face. Nesta
oportunidade, a ação de fatores etiológicos, sejam eles ambientais (álcool,
cigarro, medicamentos) ou genéticos, poderá resultar no desenvolvimento da
má formação do lábio e/ou palato (Shkoukani, 2013).
A formação da face inicia-se na 4ª semana de gestação ao redor da
futura cavidade oral, chamada stomodeum. Ao redor desta, encontramos as
proeminências embriológicas, que são: a proeminência fronto-nasal
(superiormente), as proeminências pares maxilares (lateralmente) e
mandibulares (inferiormente), e os placódios nasais (Requeijo, 2006). A
proeminência fronto-nasal formará o segmento central da face. Lateralmente, a
união das proeminências nasais mediais formará a ponta nasal, a columela, o
filtro labial e o septo nasal e a união das proeminências nasais laterais
formarão as asas do nariz. As proeminências maxilares originarão a maxila, os
arcos zigomáticos, o lábio superior e o palato secundário, já as mandibulares
formarão o lábio inferior e a mandíbula (Requeijo, 2006, Shkoukani, 2013).
Já a formação do palato tem inicio entre a 6ª e a 9ª semanas, e começa
a se desenvolver a partir da maxila, formando o palato primário, até o forame
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incisivo. O palato secundário desenvolve-se a partir de duas projeções das
proeminências maxilares que crescem para dentro da cavidade oral. Durante a
7ª semana, os processos laterais do palato se alongam e assumem orientação
horizontal, fundindo-se no plano médio. A falha na fusão desses processos
resulta na típica fenda palatina em seus variados graus (Requeijo, 2006,
Shkoukani, 2013).
Dispostos a descrever as fendas orais de maneira a facilitar seu estudo
e unificar a nomenclatura acerca dessas anomalias craniofaciais, vários
autores buscaram classificá-las de acordo com seu entendimento Em 1942,
Fogh-Andersen apresentou uma classificação baseada na embriologia e na
genética envolvida na formação das fendas. Nesta, as fendas foram divididas
em três principais grupos: I) Fenda labial (simples ou dupla), II) Fenda lábio-
palatina, que é o maior grupo (abrangendo fendas completas da narina até a
úvula), III) Fenda de palato, sendo sempre mediana e nunca ultrapassando o
forame incisivo (Nunes, 2007).
Além disso, as fendas orais podem ser agrupadas em sindrômicas e
não-sindrômicas. As não-sindrômicas estão presentes isoladamente, sem
outras doenças associadas (Nouri, 2015). Entretanto, as sindrômicas ocorrem
conjuntamente a outras anomalias relevantes, podendo assim ser associadas a
uma variedade de síndromes. Os portadores de fendas com exposição
conhecida à agentes teratogênicos estão incluídos na categoria dos
sindrômicos (Merritt, 2005).
As fendas são a 2ª má-formação mais comum atrás apenas da
Síndrome de Down. Nos EUA nascem em torno de 7.000 crianças com fendas
anualmente afetadas pelas fendas orais assim, ocorrendo em 1:500-2500
nascidos dependendo da ancestralidade, localização, idade materna,
exposições pré-natais e status socioeconômico (Shkoukani, 2013). Esses
pacientes requerem várias cirurgias corretivas, intervenções nutricionais,
odontológicas, fonoaudiológicas e psicológicas, impondo um substancial custo
de tratamento (Wehby, 2012).
No que diz respeito à incidência das fendas orais foi realizado um estudo
no Brasil entre 1975 e 1994 usando como fonte dados do Hospital de
Reabilitação de Anomalias Craniofaciais (HRAC-USP), do Ministério da Saúde
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(DATASUS) e do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). Os
resultados revelaram para a região Sudeste uma prevalência de 0,47 por 1000
nascidos vivos, no período de 1990 a 1995. Nesse estudo, constatou-se que a
prevalência aumentou em 2,58 vezes em 20 anos (Nunes, 2007).
Em 2004, Cunha et al.(2004) realizaram um estudo de caso controle em
cinco hospitais-maternidade da cidade de Pelotas-RS no período de 1990 a
2002. Foram registrados 71.500 nascimentos. Destes, 56 possuíam fenda
labial ou labiopalatal, chegando-se a uma incidência de 0,78 por 1000. Neste
estudo, os autores citam uma correlação importante entre o grau de instrução
materna, além da presença de malformações na família, e a ocorrência das
fendas orais.
No Estado do Rio Grande do Norte, estima-se que a cada ano nascem
cerca de 100 a 120 crianças com fissuras de lábio e/ou palato. Como não
existe até o momento um estudo epidemiológico específico para as fissuras no
Rio Grande do Norte, o número anual de crianças fissuradas deve ser superior
a 100 – 120 casos. Além disso, estima-se que a ocorrência desta malformação
nos estados do Nordeste, especialmente no Rio Grande do Norte, é
consideravelmente superior do que na região Centro-Sul.
1.2 FENDAS ORAIS: FATORES ETIOLÓGICOS E ASPECTOS GENÉTICOS
A etiologia das fendas orais envolve múltiplos fatores ambientais e
genéticos. Na literatura, há o consenso em considerar que a associação dos
fatores socioeconômicos, condições nutricionais na gestação, uso de álcool,
uso de cigarro, uso de drogas, e as predisposições genéticas, constituem
elementos para a alta incidência das fendas orais. Além destes, existem outros
fatores como o sexo, a localização geográfica, ocorrendo variações num
mesmo país onde são encontrados diferentes estilos de vida e condições
ambientais (Carinci, 2005; Kobayashi, 2013; Gil-da-Silva-Lopes, 2014).
Dos fatores ambientais, o consumo materno de álcool durante a gravidez
tem sido um dos mais associados ao aumento da incidência de fendas,
estando relacionado inclusive com um aumento na incidência tanto das fendas
sindrômicas quanto das não-sindrômicas. O mesmo tem sido encontrado para
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o fumo, resultando no dobro de casos de fendas quando comparados com
mães não-fumantes (Eppley, 2005; Shi, 2007; Leslie, 2013).
Diversos estudos observacionais provêm evidências de um efeito
protetor da suplementação de ácido fólico na ocorrência das fendas orais.
Estudos que avaliaram o efeito de doses altas versus doses baixas
demonstram um significante efeito protetor com uso de doses altas com
diminuição de até 50% na recorrência (Wehby et al., 2013).
O uso de medicamentos durante a gravidez tem sido associado a um
aumento na incidência das fendas orais. Este aumento tem sido confirmado por
vários investigadores que estudam as fendas orais não-sindrômicas
(Carmichael, 2000; Park-Wyllie, 2000). Os anticonvulsivantes, incluindo
fenitoína, oxazolidinodionas e ácido valpróico também estão envolvidos como
agentes etiológicos das fendas orais. A fenitoína leva a um aumento da ordem
de 10 vezes na incidência das fendas orais e exerce seu efeito pelo mecanismo
de inibição da enzima NADH desidrogenase na cadeia transportadora de
elétrons. Outros agentes farmacológicos, incluindo o ácido retinóico, têm sido
implicados no desenvolvimento das fendas, mas o mecanismo de ação ainda
não foi determinado (Eppley, 2005). O ácido retinóico, tem sido ainda implicado
no desenvolvimento das fendas orais, embora o mecanismo de ação ainda não
foi determinado (Carmichael, 2000; Park-Wyllie, 2000).
Amplas tentativas para revelar as bases genéticas das fendas orofaciais
estão sendo realizadas através de diferentes abordagens metodológicas como,
triagem de mutações de genes específicos, estudos de associação, triagem de
associação ampla de genomas, mapeamento de quebras cromossômicas,
modelos animais e etc. Como resultado, genes candidatos em todo o genoma
humano foram localizados, alguns deles até em mais de um estudo como
MSX1, TGFB. DHCR, FGFR1, IRF6, MID1, TP73L, TBX22, PVRL1. Aplicação
de modernas técnicas de genotipagem entre elas a discriminação alélica, HRM
(High Resolution Melting), sequenciamento direto, também aumenta a lista de
genes candidatos (Leslie, 2013; Ludwig, 2013; Shkoukani, 2013).
Além disso, os pesquisadores têm falhado em revelar a base molecular
das fendas orofaciais devido a sua complexidade, falha de replicação de
resultados e insignificância estatística dos resultados de vários estudos.
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Achados recentes sugerem que pelo menos alguns genes como MSX1, PVRL1
e IRF6 demonstram uma sobreposição significativa no desenvolvimento tanto
das fendas sindrômicas quanto não-sindrômicas, uma vez que a redução da
atividade das proteínas que eles codificam pode afetar o desenvolvimento
orofacial embrionário (Morkuniene et al., 2006).
1.3 FATOR REGULADOR DE INTERFERON 6 (IRF6)
O gene IRF6 contém 27Kpb, contendo 9 éxons. Pertence a uma família
de fatores de transcrição que compartilham um domínio altamente conservado
e que desempenham importante papel no desenvolvimento facial, sendo
expresso nas extremidades mediais das lâminas palatinas, antes e durante a
fusão palatal (Knight, 2006).
Figura 1. Gene IRF6
Estudos dos genes candidatos têm encontrado forte associação do IRF6
com as fendas orofaciais não-sindrômicas. Localizado no cromossomo 1q32.2-
q41 codifica o fator regulador 6 do interferon, que é um elemento chave no
desenvolvimento oral e maxilofacial (Kwa, et al 2014). É altamente expresso no
ectoderma das placas palatinas antes e durante a formação do palato primário
(Zucchero, 2004; Rahimov, 2008; Mostowska, 2010). É sabido que
camundongos nocautes para o gene IRF6 tem desenvolvimento anormal da
pele, dos membros, e da região craniofacial. Metanálises de 13 triagens de
genoma confirmaram que o IRF6 é um dos principais genes candidatos, com
polimorfismos comuns que aumentam o risco de desenvolvimento de fendas
orofaciais (Wang et al., 2012).
Zucchero et al (2004) foi o primeiro a associar o polimorfismo rs2235371
(C1124T) do gene IRF6 com as fendas não-sindrômicas, polimorfismos este
que atua no domínio de ligação da proteína possuindo uma variante associada
com o fenótipo das fendas orofaciais não-sindrômicas. Foi identificado que o
alelo C1124 é a variante comum nos indivíduos com fenda e que o alelo 1124T
é raro. Resultados de testes de desequilíbrio de ligação revelaram uma
significante transmissão do alelo 1124T em algumas populações,
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particularmente na Ásia e America do Sul, sugerindo-o como alelo de risco para
fendas (Morkuniene, 2006; Brito, 2012).
Um segundo polimorfismo, rs642961 (G>A) localizado na região de
enhancer do IRF6 foi associado como uma das causas das fendas não-
sindrômicas, tendo um efeito mais pronunciado nas fendas de palato isolado.
Genótipos deste polimorfismo modulam a expressão do IRF6 no lábio de
pacientes afetados (Rahimov, 2012).
Em todo o mundo estão sendo realizados estudos para entender a
genética associada ao desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas,
assumindo um modelo de herança multifatorial com uma origem comum para
alelos de risco. No entanto, essas contribuições ainda são desconhecidas e a
associação dos polimorfismos depende da população estudada. Os
polimorfismos rs861019 e rs2236907 foram selecionados em virtude de terem
uma prevalência acima de 5% e por serem Tag SNP para outras variantes
gênicas.
Com o objetivo de contribuir com o conhecimento relativo dos fatores de
risco que influenciam no desenvolvimento das fendas orais, propomos
pesquisar os polimorfismos rs1044516, rs642961, rs2236907, rs2235371 e
rs861019 do gene IRF6 e suas correlações com o desenvolvimento das fendas
orais não-sindrômicas. Os resultados obtidos poderão contribuir com estudos
posteriores das famílias portadoras de mutações características desta doença,
para que assim seja promovida uma diminuição na incidência dessa má-
formação que acarreta grandes problemas psicológicos, financeiros e de saúde
nos pacientes acometidos e suas famílias.
2. JUSTIFICATIVA
Há cerca de 15.000 crianças nascendo por hora com fendas orais no
mundo e aproximadamente a cada 2 minutos e meio nasce uma criança
afetada por essa malformação. Desde o nascimento essas crianças necessitam
de tratamento cirúrgico e não cirúrgico que deve ser realizado por uma equipe
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multidisciplinar. Esse tratamento modifica a vida dessas crianças e suas
famílias, podendo ter como consequências os problemas psicológicos que
interferem na vida social dos afetados (Merritt, 2004).
Estudo de Figueiredo et al., (2011) utilizando dados do Sistema de
Informações de Nascidos Vivos observou uma prevalência de 0,49:1000
nascido vivos no Estado do rio Grande do Norte.
Embora vários episódios de fendas orais ocorram esporadicamente, os
casos dentro de uma mesma família ocorrem em aproximadamente 20-30%,
sugerindo um componente genético na etiologia desta má-formação. O risco de
recorrência familiar é 28-40 vezes maior que o da população geral. Isto leva a
crer que a interação de fatores ambientais com genes envolvidos na
embriogênese apresenta um importante papel na ocorrência de fendas orais.
Contudo, a verdadeira contribuição genética para a etiologia da FLPNS é ainda
pouco investigada (Gaspar, 2002; Lace, 2006). Atualmente, o modelo de
herança mais aceito é o oligogênico o qual propõe que vários genes interagem
participando do desenvolvimento da FLPNS (Suazo, 2005). A biologia
molecular tem contribuído de maneira significativa para a compreensão de
como os genes funcionam, quando normais e por que causam doenças quando
sofrem alterações. Dessa forma, um estudo genético é necessário e importante
para uma melhor compreensão e esclarecimento do envolvimento desses
genes na gênese de fendas não-sindrômicas.
3. OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
3.1.1 Pesquisar a associação dos polimorfismos rs1044516, rs861019,
rs2235371, ts2236907 e rs642961 do gene IRF6 com o
desenvolvimento das fendas orais não-sindrômicas.
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3.2 - Objetivos Específicos
3.2.1. Classificar o paciente quanto ao gênero, tipo de fissura, e histórico
familiar quanto à ocorrência de antecedentes familiares de fissura
labiopalatinas.
3.2.2. Determinar as frequências genotípicas dos polimorfismos do gene
IRF6 (rs1044516, rs2235371, rs2236907, rs861019 e rs642961)
em todos os indivíduos portadores ou não de fendas orais.
3.2.3. Caracterizar esta população acometida pelas fendas orais para
que, no futuro, possamos contribuir para um estudo
epidemiológico do estado e da região.
4. CASUÍSTICA, MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 –Casuistica
Foram estudados 186 pacientes portadoras de fendas orais, com idade a
partir de 2 anos de idade, com diagnóstico baseado em critérios clínicos. O
diagnóstico dos indivíduos, bem como a avaliação quanto a classificação
sindrômica e não-sindrômica, foi realizada pela equipe do Programa de
Atendimento aos Fissurados do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) –
Unidade Pediátrica, constituida pelo neonatologista Dr. Rui Medeiros de
Oliveira, pela pediatra Dra. Maria Edinilma Felinto Brito. Os indivíduos
diagnosticados que apresentaram diagnóstico diferencial com suspeita de
fenda oral sindrômica foram encaminhados a geneticista Dra. Maria Ione
Ferreira da Costa (Geneticista), para avaliar a(s) síndrome(s) associadas. Os
indivíduos diagnosticados com fenda oral não-sindrômica foram incluídos no
presente projeto. Os responsáveis pelas crianças selecionadas foram
informados sobre o protocolo de estudo e assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1).
Os dados foram coletados através de um formulário pré-testado através
do banco de dados CranFlow-brasileiro sobre fendas orofaciais, disponível em:
http://www.fcm.unicamp.br/fcm/sites/default/files/paganex/form_fenda_inicial_fi
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nal.pdf (Monlleó et al., 2013). As 182 crianças do grupo controle fazem parte
do Centro Comunitário do Bairro de Brasília Teimosa/Natal-RN, por possuirem
o mesmo nível sócio-econômico das crianças portadoras de fendas orais.
Foram coletados 6 mL de sangue de todos os pacientes e controles para
realização da extração do DNA genômico.
Critérios de Inclusão:
Ser portador de fissura labial e/ou palatina não-sindrômica.
Critérios de Exclusão:
Presença de fissuras orofaciais associadas a outras malformações congênitas (fenda oral sindrômica).
Presença de outras doenças não relacionadas a presença de fendas.
4.1.1 Aspectos Éticos
O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital Onofre Lopes/UFRN, obedecendo às diretrizes regulamentadas da
pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na Resolução do Conselho
Nacional de Saúde nº 466/12, aprovado sob o parecer nº 328.230.
4.2 - Extração e amplificação do DNA genômico
O DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico, após
lise dos eritrócitos, utilizando kits de extração DNA Blood mini kit da Qiagen®
(Qiagen, Valencia, CA, USA).
A integridade das amostras de DNA foram avaliadas por eletroforese
em gel de agarose a 0,8% utilizando tampão TBE 0,5X [Tris-HCl a 45 mM,
ácido bórico a 45 mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] 48. A separação eletroforética
foi realizada a 100 v, 60mA, por 30 min, em cuba de eletroforese horizontal
(Gibco BRL, Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD, EUA) e fonte modelo
EPS 200 (GE Healthcare, Amersham Biosciences do Brasil, São Paulo, SP).
Como referência foi utilizado um marcador de tamanho molecular de DNA de
1000bp (1Kb) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA).
20
As bandas eletroforéticas foram visualizadas sob luz UV, após
coloração do gel com GelRed® (0,5 mg/mL) e fotodocumentadas em sistema
de captura de imagem ChemiImager 4400 (v5.5) (Alpha Innotech
Corporation, San Leandro, CA, EUA).
A quantificação de DNA foi realizada por espectrofotometria a 260nm, e
a pureza do DNA determinada pela relação A260nm/A280nm 42.
4.3 –Pesquisa dos polimorfismos do Gene IRF6
A pesquisa dos polimorfimos no gene IRF6 (rs642961, rs1044516,
rs2236907, rs2235371 e rs861019) foiá realizada pela técnica da discriminação
alélica (sistema TaqMan®) em um sistema de PCR em tempo real 7500 fast
(Applied BioSystems, Foster City, EUA). Os polimorfismos IRF6 (rs642961,
rs2236907, rs2235371 e rs861019) foram detectados utilizando ensaios
TaqMan® customizados (Applied Biosystems, Foster City, EUA):
C_2238941_10, C_11672849_20, C_15952140_10 e C_2500178_10,
respectivamente. Para o polimorfismo IRF6 rs1044516, os iniciadores e as
sondas foram desenhados utilizando o Primer Express® (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA) e sintetizados pela Integrated DNA Technology
(Coralville, EUA) e Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA),
respectivamente. Os iniciadores e sondas utilizados foram: sense, 5´
GAGGAATGGATGAGTGATTTGTGA 3´; anti-sense, 5´
ATGTACTCTCCCGGCATTCTGA 3´; sonda 1, 5´-FAM-
TCTTAACTAGATACCCCGGTT-MGB- 3´; e sonda 2, 5´-VIC-
TAGATAACCCGGTTTC-MGB-3´. Para validar a genotipagem, 10% das
amostras foram escolhidas aleatoriamente e re-genotipadas.
4.4 - Análises estatísticas
Os resultados foram analisados pelo software SPSS v 20 (SPSS Inc.,
Chicago, M EUA). O nível de significância considerado foi de p<0,05.
Para avaliar a associação dos polimorfismos e a distribuição significativa
da amostragem do estudo foi utilizado o Teste do qui-quadrado e teste de
equibrio de distribuição de Hardy –Weinberg, respectivamente. As análises de
combinação de polimorfismos foram realizadas no Software R versão 2.152
utilizando o pacote SNPassoc.
21
5. ARTIGO PRODUZIDO
O artigo “Association of IRF6 polymorphisms and Non-syndromic
Cleft Lip with or without palate” está submetido para publicação na Clinics
que possui impacto 1,33 e é classificado como B2 na área Medicina II.
Association of IRF6 polymorphisms and Non-syndromic Cleft Lip with or
without palate
Running title: Association of IFR6 SNPs with NSCL/P
João Felipe Bezerra1, Raul Hernandes Bortolin1, André Ducati Luchessi1,
Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira1, Maria Leila Cardoso1, Valéria
Morgiana Gualberto Duarte Moreira Lima2, Marcela Abbott Galvão Ururahy1,
Melina Bezerra Loureiro1, Aglauciele Maria Lima de Oliveira1, Gisele Correia
Pacheco Leite3, Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes4, Maria das Graças Almeida1,
Viviane Souza do Amaral5, Adriana Augusto de Rezende1*
1Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil
2Department of Clinical and Toxicological Analyses, State University of Paraiba,
Campina Grande, Paraiba, Brazil
3Department of Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
Rio Grande do Norte, Brazil
4Department of Medical Genetics, University of Campinas, Campinas, São
Paulo, Brazil
5Department of Cell Biology and Genetics, Federal University of Rio Grande do
Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil
*Corresponding author
Address: Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Faculty of Pharmacy
Petropolis, Natal, RN, Brazil CEP: 59012-570
22
Phone: +55 84 3342-9807Fax: +55 84 3342-9833
e-mail: [email protected]
Conflict of Interest
The authors declare that they have no conflict of interest
Abstract
Objectives: Non-syndromic cleft lip/palate (NSCL/P) etiology is not well
understood, therefore, we aimed to evaluated the association between IRF6
polymorphisms and the development’s risk of NSCL/P. Also, an analysis of
allelic combinations of these polymorphisms was performed to evaluate their
relationship with NSCL/P. Method: Blood samples of 186 NSCL/P patients and
182 controls from Rio Grande do Norte state, Brazil were obtained to analyze
IRF6 polymorphisms (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and
rs1044516) by qPCR. NSCL/P patients were classified in cleft lip and palate
(CLP), cleft palate only (CP) and cleft lip only (CL) groups. Results: A
significant association of rs2235371 (OR: 11.24, CI 95%: 1.97–64.22, p =
0.016) with the CP group was observed. Further, the analysis of the allelic
combination showed an increased risk of rs1044516 and rs2236907 in NSCL/P,
which was present in all the significant combinations. Conclusions: The
association of rs2235371 with CP in patients suggest that it is a risk factor in our
population. The analysis of allelic combinations showing the influence of IRF6
combined polymorphisms, mainly rs1044516 and rs2236907 in NSCL/P, also
suggest that each polymorphism could contribute minimally to increase the risk
of developing NSCL/P in a Brazilian population.
Keywords: Non-syndromic Cleft Lip with or without Palate; Etiology; IRF6; Polymorphisms
23
Introduction
Nonsyndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) is craniofacial birth defect,
with an average prevalence of 1:500 – 1000 live births worldwide, comprising
almost one-half of all craniofacial anomalies(1,2). NSCL/P is characterized by a
lack of complete fusion of upper lip and palate in the absence of other
congenital anomalies (3,4). Individuals with NSCL/P often have multiple health
problems, such as feeding difficulties, speech changes, nutritional deficiency,
developmental delays, orthodontics abnormalities, middle ear infections and
hearing loss, and psychosocial disorders (3,5).
NSCL/P etiology is considered complex because of contributions from
both genetic and environmental risk factors (6,7), such as NSCL/P maternal
exposure to cigarette smoking and alcohol ingestion, medicines (mainly
anticonvulsants), teratogens, viral infection, as well as vitamin deficiencies and
presence of metabolic disorders such as diabetes, obesity and low weight (1,8).
Especially maternal smoking and alcohol consumption during pregnancy are
recognized as the most frequent. According a review performed by Gil-da-Silva-
Lopes and Monlleo (1) the maternal smoking during pregnancy is often
associated with an increased risk of NSCL/P. Also, previous study of our
laboratory showed an increased risk of fetal NSCL/P development in mothers
consuming alcohol during pregnancy (9).
Regarding genetic susceptibility, it has been associated with a major
factor of NSCL/P’s etiology. Studies with monozygotic twin indicated an
accordance rate of 40–60% in NSCL/P, while in dizygotic was observed an
accordance of 3-5% rate (10). However, the identification of target genes
associated with NSCL/P etiology is difficult by many factors, including
heterogeneity, limited sample size and non-Mendelian inheritance patterns (6).
IRF6 was firstly identified by Zucchero et al. (11) as a gene strongly associated
with the genetic etiology of NSCL/P. Previously, the IRF6 was identified as
etiologic for Van der Woude syndrome (VWS), which includes cleft lip and/or
palate (CL/P) as part of the clinical spectrum (12,13). Moretti et al. (14) studying
a possible mechanism that regulates the proliferation-differentiation balance of
keratinocytes involved in palate fusion and skin differentiation, identified the
24
IRF6 gene as a transcription factors that plays an important role in facial
development, including palatal complete development and formation and
maintenance of the oral periderm (15–17). In keratinocytes, the IRF6 represent
a transcriptional target of ΔNp63 (an isoform of p63 gene), and transcription
of IRF6 in turn promotes ΔNp63 degradation, representing a limit to
keratinocyte proliferation and terminal differentiation leading thus to a palate
closure during embryonic development. Also, mutations in p63 or IRF6 could
lead to a defects including as phenotypic features cleft lip/palate(14).
Several genetic polymorphism of IRF6, such as rs2235371 (11,16,18),
rs642961 (16,19), and rs1044516 (20), have been studied showing their
association with NSCL/P development in many populations. The IRF6
polymorphism rs2235371 represents one of the first associated with NSCL/P,
which is located in exon 7 of IRF6, especially in South American and Asian
populations (11). This association was also reproduced in other populations,
including those of European ancestry (11,21). However, there are no consensus
in the relationship between rs2235371 and NSCL/P etiology. Wang et al. (22)
showed a decreased risk of rs2235371 associated with NSCL/P and Shi et al.
(23) observed a lack of association of rs2235371 with NSCL/P in Chinese. In
Brazil, a study with 287 NSCL/P patients from Southeastern also observed a
lack of association of rs2235371 (24).
Regarding the SNP rs642961, it is located in a region of enhancer of
IRF6 and was associated with the control of IRF6 expression allele-dose
manner in lip skin adjacent to the lip cleft of affected patients(19). However,
Paranaiba et al. (24) failed to show the association of rs642961 in Brazilian
NSCL/P patients. A study on 326 Chinese case-parent trios showed that the
polymorphisms interacted with environmental factors: smoking interacted with
rs1044516, and multivitamin supplementation showed an association, after
Bonferroni correction, of SNP rs2236907 with NSCL/P (25).
Currently, worldwide studies have been conducted by several
investigators to better understand the genetics association with NSCL/P
development, especially using a multifactorial model of inheritance (9,15,16,26).
Nevertheless, the genetic contributions to NSCL/P are still unknown and the
polymorphisms association depends on the studied population.
25
Therefore, the aim of this study was to investigate the association of
IRF6 polymorphisms (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and
rs1044516) with NSCL/P development in a population from Rio Grande do
Norte/Brazil. In addition, we also performed the analysis of allelic combinations
of IRF6 polymorphisms to evaluate the potential effect of polymorphic
combinations in the development of NSCL/P.
Methods
Subjects
The study sample consisted of 186 NSCL/P patients and 182 control
individuals. NSCL/P patients aged between 2 and 25 years of both genders
were recruited from Pediatric Endocrinology Unit, Hospital Onofre Lopes
(HUOL) of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN) and from the
Pediatric Hospital Varela Santiago, both in Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.
The control group consisted of children above 5 years of age without a family
history of clefts, recruited in public schools in Natal.
NSCL/P patients were classified according to the Fogh-Andersen
scheme (27) in cleft lip and palate (CLP), cleft palate only (CP) and cleft lip only
(CL) groups. A geneticist evaluated the patients, excluding those with
characteristics of any syndrome.
This study is part of Brazil’s CranioFacial project
(http://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/projeto-cranio-face-brasil).
Data were collected using a pre-tested form through the CranFlow-Brazilian
database on Orofacial Clefts, available at :
http://www.fcm.unicamp.br/fcm/sites/default/files/paganex/form_fenda_inicial_fi
nal.pdf (28).
The Ethics Committee on Human Research of the Federal University of
Rio Grande do Norte approved the study under the number 328.230, according
to Declaration of Helsinki and the resolution nº 466/12 of Brazil’s National
Health Council. Written informed consent was first obtained from all of the adult
subjects and parents or legal guardians of the underage patients and controls,
and then peripheral blood was collected in tubes containing EDTA for DNA
extraction.
26
Genetic Analysis
Genomic DNA was isolated from peripheral blood leukocytes using a
QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Genotyping was
carried out by TaqMan® allelic discrimination and performed in a 7500 Fast
Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The
following pre-designed assays were used for genotyping the rs2235371,
rs642961, rs2236907, and rs861019 polymorphisms of IRF6: C_15952140_10,
C_2238941_10, C_11672849_20, and C_2500178_10, respectively. For the
rs1044516 polymorphism, primers and probes were designed using Primer
Express® software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primers were
synthesized by Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA) and
probes by Applied Biosystems. The primers and probes for this assay are as
follows: forward, 5′ GAGGAATGGATGAGTGATTTGTGA 3′; reverse, 5′
ATGTACTCTCCCGGCATTCTGA 3′; probe 1, 5′-FAM-
TCTTAACTAGATACCCCGGTT-MGB- 3′; and probe 2, 5′-VIC-
TAGATAACCCGGTTTC-MGB-3′. To validate the genotyping, 10% of the
samples chosen randomly were re-genotyped.
Analysis of gene and disease network interactions
The genes and diseases interactions were further analyzed using the
software Ingenuity Pathways Analysis v.6 (IPA) (Ingenuity® Systems, Ca.,
Redwood City, EUA), which shows a direct relation of IRF6 and Oral Clefts. IPA
is a web-based software application that enables researchers to analyze data
derived from expression and SNP microarrays, RNA-sequencing, proteomics
and metabolomics experiments, and small-scale experiments (such as PCR)
that generate gene or protein lists. It also allows search for targeted information
on genes, proteins, chemicals, diseases, and drugs, as well as building your
own biological models. IPA’s data analysis and experimental modeling enables
understanding the significance of data or target(s) of interest in relation to larger
biological or chemical systems(29).
27
Statistical analyses
Hardy-Weinberg equilibrium was evaluated using the chi-square test.
The associations between polymorphisms and phenotype groups, as well as the
analysis of combinations were performed by the SNPassoc package (González
et al.., 2007) from the statistical software R version 2.15.2 (R foundation for
statistical Computing, Vienna, Austria; http://cran.r-
project.org/web/packages/SNPassoc/index.html). Tests with p-values <0.05
were considered significant.
Results
Sample characterization
Table 1 shows the clinical characteristics of the case and control groups.
Among the 186 NSCL/P patients, there was a prevalence of males in the case
group. No difference was observed in age distribution between the groups,
showing their homogeneity and allowing a better comparison. A major
prevalence of CLP, followed by CP and CL was observed. Approximately one
third of the patients had family history of clefts.
Genetic analysis
The Table 2 shows the primary information for the polymorphisms
studied. All polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium. For a more
detailed evaluation, the group containing all patients (CL/P – cleft lip with or
without cleft palate) was subdivided in a CL group containing only patients with
an isolated cleft lip and a CP group containing only patients having only an
isolated cleft palate. Table 3 shows the genotypic frequencies of polymorphisms
ofIRF6 (rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and rs1044516) of the
case and control groups according to cleft type. There was a significant
association of rs2235371 (OR: 11.24, CI 95%: 1.97–64.22, p=0.016) with CP
group compared to the controls. The pattern of linkage disequilibrium (LD)
betweenIRF6 polymorphisms is shown in Figure 1. One haplotype block was
constructed in this region between rs861019 and rs642961. In the haplotype
28
analysis, the distribution between cases and controls was compared, however,
no haplotype was found to be associated with NSCL/P (p>0.05).
The potential interactions ofIRF6 polymorphisms were investigated. For
these analyses, models were created combining all of the polymorphisms of
IRF6, similar to a combinatorial analysis (Table 4). The combinations included
five, four, and three polymorphisms and showed significant associations with
NSCL/P. In Model 1, which includes all of the polymorphisms, two combinations
were significantly associated with an increased risk of NSCL/P: AGCAA, in the
sequence rs1044516/rs642961/rs2235371/rs2236907/rs861019, and the
combination of rare genotypes. Two combinations were also significantly
associated with an increased risk of NSCL/P in Model 2: AGCA and rare
genotypes, which includes the same polymorphisms included in Model 1 in the
same sequence, except for rs861019. In Model 3, in which the polymorphism
rs861019 was added back and rs2235371 was excluded, there was just one
significant combination: AAGA in the sequence
rs1044516/rs2236907/rs642961/rs861019. In Model 4, the exclusion of
rs861019of Model 3, led to two significant combinations: AAG in the sequence
rs1044516/rs2236907/rs642961 and rare genotypes. In Model 5, the exchange
of rs642961 in Model 4 for rs861019, led to two significant combinations: AAA in
the sequence rs1044516/rs2236907/rs861019 and rare genotypes.
Interestingly, rs1044516 and rs2236907 were present in all combinations
showing significant associations and the rs642961 was present in four of the
five significant combinations (Table 4).
The IPA interactions between diseases/functions annotation and target
genes are displayed at the Figure 2. Fifteen genes (RYK, TGFA, IRF6, MSX1,
FDFR2, PTCH1, ADAM, TS20, CHD7, BMP4, FGF10, CDH1, FDFR1, FGF18
and FGF8) were selected as target of eight diseases/functions annotation
(differentiation of cells, orofacial cleft, familial non-syndromic cleft lip with or
without cleft palate, differentiation of epidermal cells, congenital malformation of
face, cleft lip, cleft palate syndrome and development of exocrine gland)
associated with orofacial disorders. Interestingly, this integrative analysis
showed that the IRF6 was associated with six diseases/functions annotation
such as differentiation of cells, orofacial cleft, familial non-syndromic cleft lip
29
with or without cleft palate, differentiation of epidermal cells and congenital
malformation of face and cleft lip.
Discussion
NSCL/P has been studied for years looking for its etiology. Among the
findings, the genetic factors has been well recognized to play an important role
in the development of the clefts once there is an increased recurrence risk of
20-40 fold in families with one affected patient (21). Therefore, considering that
Brazil is a continental country with mixed population (28), the identification of
new genetic targets related to NSCL/P development could be relevant to
genetic counseling.
In a recent study of unaffected relatives, Miller et al. (30) investigated the
relationship between distinct facial morphology and the genotypes of genes
previously associated with NSCL/P. Their results showed that polymorphisms in
IRF6 were associated with symmetric shape variation including a more
protrusive forehead, a shorter nose, and a steep mandibular plane (30). In
addition, IRF6 polymorphisms have also been recognized by many authors as
the most associated with NSCL/P risk (1,7,8,13,23).
In our study, firstly, we confirmed by IPA interactions analysis a direct
relation of IRF6 with six of the eight diseases/functions annotation associated
with the fifteen selected target genes (differentiation of cells, orofacial cleft,
familial non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, differentiation of
epidermal cells, congenital malformation of face and cleft lip). Then, we have
chosen to evaluate rs2235371, rs642961, rs2236907, rs861019, and rs1044516
polymorphisms, in order, to contribute to the knowledge about IRF6 association
with NSCL/P of patients in a population of RN. In the CP group the presence of
SNP rs2235371 showed an increased risk for NSCL/P development (OR: 11.24,
CI 95%: 1.97–64.22, p = 0.016). Despite of the limited sample size, this find
represent a result of Northeast State of Brazil. Similar association was obtained
by Letra et al. (13) studying 142 case-parent trios from São Paulo, Brazil.
Although, several studies have reported the associations between rs2235371
and NSCL/P risk, only a few studies have identified the rs2235371 as a risk
factor for isolated CP development. Souza et al. (31) also observed an
association of rs2235371, however, with Cleft lip and palate and Cleft lip only
30
studying 673 individuals form southern, southeastern and northeastern of Brazil.
A study of 236 unrelated patients in China also showed an association of the
IRF6 polymorphism rs2235371 (OR: 0.61, CI 95%: 0.44–0.85, p = 0.03)(18), but
they did not evaluated cleft subtype. The association between rs2235371 and
NSCL/P was also found by Park et al. (32), who showed an increased risk in
Taiwanese trios (OR: 2.75, CI 95%: 1.37–5.52, p< 1 × 10-4). Another study of
192 NSCL/P Thai patients showed an elevated risk associated with the GG
genotype (OR: 1.67, CI 95%: 1.13–2.47, p = 0.02)(33). Paranaiba et al. (24)
studying 228 patients from Minas Gerais-Brazil did not observe association of
rs2235371 with NSCL/P.
Considering that the target genes responsible for the development of
NSCL/P are not well understood, we performed an analysis of allelic
combination of IRF6 polymorphisms. Interestingly, the polymorphisms
rs1044516 and rs2236907 were present in all combinations and the rs642961
was present in four combinations, indicating that they may contribute to the risk
associated with NSCL/P. These results suggest that each polymorphism could
contribute minimally to increase the risk of developing NSCL/P even without
being significantly associated when isolated. Also, it is important to consider
that certain allelic combinations may influence more pronouncedly than the
isolated polymorphism.
The rs1044516 is located in the 3'UTR region, related to messenger RNA
stability that can generate major disruptions and the rs2236907 is an intronic
polymorphism. Wu et al. (25) demonstrated excess maternal transmission of the
minor allele of rs1044516 and they found that heterozygotes that were exposed
to maternal smoke had a high risk of NSCL/P. Regarding the rs2236907, Wu et
al. (25) also observed an association of this SNP with NSCL/P.
For rs642961, that is located in the enhancer region, it binds to RNA
polymerase to initiate gene transcription, what could indicate a great
contribution to the risk of NSCL/P. It is related to the association of the balance
between cellular differentiation and proliferation during fetal development
(14,19). In contrast to other Asian populations, that has significant association
with the rs642961 (23,34), study performed by Nouri et al. (35) in 102 families
from Iran did not observe association of rs642961, which can be a feature of the
regional population.
31
A meta-analysis by Wang et al. (22) was performed in order to evaluate
the conflicts related to the association of polymorphisms in IRF6 with NSCL/P in
various populations. Their findings suggest that ethnic differences in genetic
backgrounds may play a distinct role in the specific polymorphisms associated
with NSCL/P risk. They showed that rs2235371 was associated with NSCL/P in
Chinese and Indian populations, but not in American or Brazilian populations
and that rs642961 was associated with NSCL/P in a Danish population, but not
in a Brazilian population.
In conclusion, the rs2235371 represent a risk factor for CP in our
patients, and also the analysis of allelic combinations showed the influence of
IRF6polymorphism rs1044516 and rs2236907 in NSCL/P suggesting that these
polymorphisms could contribute minimally to increase the risk of developing
NSCL/P in a Brazilian population of Rio Grande do Norte state.
Acknowledgments
Supported by grants from CNPq 477608/2011-6 received by V.S.A. and,
FAPESP 2011/51799-6 and CNPq 304455/2012-1 received by V.L.G.S.L. J.F.B
was recipient of fellowships from CNPq-Brazil. R.H.B is recipient of fellowship
from CAPES-Brazil. G.H.M.O, M.A.G.U, and A.D.L were recipients of
fellowships from CAPES-Brazil. We are also grateful to the students and
technicians from LABMULT/UFRN/RN.
Author Contributions
AAR was the principal investigator and supervised the study. JFB
gathered, analyzed the data and wrote the manuscript. MAGU, GCPL, GHMO,
MLC, VMGDML, MLB, AMLO, RHB, VNS, and ADL gathered and analyzed the
data. AAR, VLGSL, MGA and VSA contributed to conception, planning of the
study, and critically revising the manuscript.
32
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Family-based association analysis between nonsyndromic cleft lip with or
without cleft palate and IRF6 polymorphism in an Iranian population. Clin
Oral Investig. 2015 May;19(4):891–4.
Figure Captions
Figure 1. Pairwise linkage disequilibrium plot of IRF6/rs1044516, rs2235371,
rs2236907, rs861019, and rs642961 in the combined sample (cases & controls)
showing r2 (×100) values. The block is designed according to the internally
developed solid spine of linkage disequilibrium (LD). The value within each
diamond represents the pairwise correlation between pairs of Single-nucleotide
polymorphisms (SNPs) (measured as 100 × r2) defined by the upper left and the
36
upper right sides of the diamond. Below are showed the frequency of each
haplotype.
Tables
Table 1. Clinical characteristics of studied groups
a = Chi-square test, b = T-test
Characteristics Case
(n = 186) Control
(n = 182) p value
Gendera Male 119 (64.1%) 90 (49.4%)
< 0.001 Female 67 (35.9%) 92 (50.6%) Ageb Range 1–25 years 5–23 years
0.175 Mean 8.1 years 11.7 years Cleft types Cleft lip and palate 111 (60.0%) - Cleft palate only 45 (24.0%) - - Cleft lip only 30 (16.0%) - Family history Yes 65 (35.1%) 00 (0.0%)
- No 121 (64.9%) 182 (100.0%)
37
Table 2. Primary information of SNPs
Gene SNP ID Genomic location
Base change
MAF (1000 genomes)
HWE
IRF6 rs2235371 Exon-7 C>T 0.138 0.109 rs642961 Enhancer G>A 0.174 0.124 rs2236907 Intron C>A 0.403 1.000 rs861019 5′-UTR A>G 0.398 0.667 rs1044516 3′-UTR C>A 0.297 0.771
HWE were calculated by Chi-square test HWE: Hardy-Weinberg equilibrium MAF: minor allele frequency SNP: single nucleotide polymorphism
38
ii
Table 3. Genotypic frequencies of polymorphisms of IRF6 of patients
*Significant association, p < 0.05. #CLP: group that include all patients. CL, Cleft lip only; CP, Cleft palate only
Polymorphism Genotypes
#CLP CL CP
Case Control OR (CI 95%) P
value Case Control OR (CI 95%)
P value
Case Control OR (CI 95%) P
value
rs2235371 CC 146 (83.7%) 163 (89.6%) 1.00
0.247
23 (95.8%) 163 (89.6%) 1.00
0.767
29 (76.3%) 163 (89.6%) 1.00
0.016* CT 21 (14.0%) 17 (9.3%) 1.61 [0.84–3.10] 01 (4.2%) 17 (9.3%) 0.42 [0.05–3.28] 05 (13.2%) 17 (9.3%) 1.65 [0.57–4.83]
TT 03 (2.2%) 02 (1.1%) 2.19 [0.39–12.12] 0 (0.0%) 02 (1.1%) 0.0 [0.00–0.00] 04 (10.5%) 02 (1.1%) 11.24[1.97–64.22]
rs642961
GG 136 (76.0%) 133 (73.5%) 1.00
0.754
19 (82.6%) 133 (73.5%) 1.00
0.454
30 (76.9%) 133 (73.5%) 1.00
0.590 GA 37 (20.7%) 43 (23.8%) 0.84 [0.51–1.39] 03 (13.0%) 43 (23.8%) 0.49 [014–1.73] 07 (17.9%) 43 (23.8%) 0.72 [0.30–1.76]
AA 06 (3.4%) 05 (2.8%) 1.17 [0.35–3.94] 01 (4.3%) 05 (2.8%) 1.40 [0.16–12.64] 02 (5.1%) 05 (2.8%) 1.77 [0.33–9.58]
rs2236907
CC 64 (35.0%) 59 (32.8%) 1.00
0.216
10 (41.7%) 59 (32.8%) 1.00
0.584
10 (25.6%) 59 (32.8%) 1.00
0.384 CA 82 (44.8%) 95 (52.8%) 0.80 [0.50–1.26] 10 (41.7%) 95 (52.8%) 0.62 [0.24–1.58] 20 (51.3%) 95 (52.8%) 1.24 [0.54–2.84]
AA 37 (20.2%) 26 (14.4%) 1.31 [0.71–2.42] 04 (16.7%) 26 (14.4%) 0.91 [0.26–3.16] 09 (23.1%) 26 (14.4%) 2.04 [0.74–5.62]
rs861019
AA 63 (34.2%) 63 (35.0%) 1.00
0.827
07 (28.0%) 63 (35.0%) 1.00
0.554
15 (38.5%) 63 (35.0%) 1.00
0.396 AG 90 (48.9%) 83 (46.1%) 1.08 [0.69–1.72] 11 (44.0%) 83 (46.1%) 1.19 [0.44–3.25] 20 (51.3%) 83 (46.1%) 1.01 [0.48–2.13]
GG 31 (16.8%) 34 (18.9%) 0.91 [0.50–1.66] 07 (28.0%) 34 (18.9%) 1.85 [0.60–5.72] 04 (10.3%) 34 (18.9%) 0.49 [0.15–1.61]
rs1044516
AA 106 (59.9%) 99 (55.0%) 1.00
0.645
12 (48.0%) 99 (55.0%) 1.00
0.374
20 (51.3%) 99 (55.0%) 1.00
0.893 AC 62 (35.0%) 71 (39.4%) 0.82 [0.53–1.26] 13 (52.0%) 71 (39.4%) 1.51 [0.65–3.51] 17 (43.6%) 71 (39.4%) 1.19 [0.58–2.42]
CC 09 (5.1%) 10 (5.6%) 0.84 [0.33–2.15] 0 (0.0%) 10 (5.6%) 0.0 [0.00–0.00] 02 (5.1%) 10 (5.6%) 0.99 [0.20–4.87]
39
ii
Table 4. Interaction of alleles of IRF6 polymorphisms in cleft patients
*Significant association Model 1: rs1044516 + rs642961 + rs2235371 + rs2236907 + rs861019 Model 2: rs1044516 + rs642961 + rs2235371 + rs2236907 Model 3: rs1044516 + rs2236907 + rs642961 + 861019 Model 4: rs1044516 + rs2236907 + rs642961 Model 5: rs1044516 + rs2236907+ rs861019
Polymorphisms Genotype
combination Frequency
(%) OR [CI 95%] P value
Model 1
AGCCG 37.5 1.00 AACCA 12.7 1.05 [0.66–1.67] 0.835 AGTAA 19.3 1.78 [1.14–2.79] 0.011* CGCAA 15.2 0.75 [0.47–1.19] 0.222 CGTAA 5.5 1.22 [0.63–2.39] 0.554
geno.rare 9.5 1.95 [1.07–3.53] 0.028*
Model 2
AGCC 41.0 1.00 AACC 13.5 1.01 [0.64–1.60] 0.959 AGTA 19.7 1.79 [1.16–2.78] 0.008* CGCA 15.3 0.79 [0.50–1.25] 0.310 CGTA 5.4 1.02 [0.51–2.07] 0.949
geno.rare 4.9 9.88 [2.82–34.55] < 0.001*
Model 3
ACGG 38.4 1.00 AAGA 20.0 1.81 [1.71–2.81] 0.007* ACAA 12.8 1.04 [0.66–1.65] 0.854 CAGA 20.7 0.84 [0.56–1.26] 0.407
geno.rare 08.0 1.48 [0.81–2.72] 0.204
Model 4
ACG 41.8 1.00 AAG 20.3 1.80 [1.17–2.77] 0.007* ACA 13.6 1.01 [0.64–1.59] 0.979 CAG 20.7 0.85 [0.57–1.27] 0.420
geno.rare 3.4 5.48 [1.53–19.63] 0.009*
Model 5
ACG 38.5 1.00 AAA 20.3 1.85 [1.20–2.85] 0.005* ACA 17.0 0.97 [0.64–1.49] 0.895 CAA 20.9 0.85 [0.57–1.27] 0.428
geno.rare 3.2 4.10 [1.29–13.00] 0.016*
40
6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
O Projeto intitulado “Pesquisa de Polimorfismos no gene IRF6 (Interferon
Regulatory Factor 6) em pacientes portadores da fendas orais” foi desenvolvido
após os resultados do Projeto anterior intitulado pesquisa de mutações nos
genes RARA e BCL-3 não ter fornecido resultados considerados de impacto
para publicação. Foi realizado através de uma parceria com a Profa Dra.
Viviane Souza do Amaral do Departamento de Genética e biologia Molecular
do Centro de Biociências e pelo financiamento de um Edital Universal.
Como o estudo foi iniciado já com o prazo do doutorado em curso, a
realização do manuscrito a ser submetido para publicação teve atrasos,
estando submetido na Revista Clinics. Deste mesmo Projeto tivemos a recente
publicação do Artigo “Analysis of genome instability biomarkers in children with
non-syndromic orofacial clefts” na revista Mutagenesis com fator de impacto
2,29 sendo classificada como B1, o qual fui 2º autor por ter tido participação
ativa no desenvolvimento do Projeto.
O nosso estudo contribuiu de forma importante para o entendimento dos
fatores genéticos que estão associados ao desenvolvimento das fendas orais
em nossa região, visto que em nosso país a miscigenação confere fatores
genéticos diferentes de acordo com as diferentes regiões estudadas.
Em nível pessoal, o doutorado resultou em um aprofundamento científico
e intelectual, adquirido através do aprendizado de novas metodologias de
análise estatística, formatação de Projeto de Pesquisa e redação de artigo
proporcionando um amadurecimento científico e da discussão de artigos em
nosso grupo de pesquisa.
Ainda no âmbito pessoal, quanto à graduação, fui professor substituto na
disciplina de Bioquímica Clínica no Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas da UFRN, o que me permitiu adquirir um pouco de vivência em
sala de aula, no preparo das aulas e de outras atividades relacionadas ao
ensino, com a segurança de ser um professor sempre presente.
Toda essa formação foi refletida em minha aprovação em 3º lugar no
Concurso para Professor Efetivo para a disciplina de Bioquímica Clínica da
UFRN. Ao mesmo tempo demonstrou uma necessidade em melhorar minhas
publicações a fim de obter êxito e o 1º lugar no próximo concurso para
41
professor efetivo em Instituição Pública de Ensino Superior. Toda essa
experiência me ajudou na minha formação e atualmente atuo Coordenador do
Curso de Farmácia de uma instituição privada do RN, onde venho
desenvolvendo Projeto na área de Arboviroses.
Com o objetivo de ampliar os meus conhecimentos e experiência
científica e concorrer ao ingresso em uma instituição de ensino superior, estou
buscando oportunidades de desenvolver novos projetos com o auxílio de
bolsas de pós-doutorado CAPES/PNPD em minha área de atuação.
Segue a produção técnico-científica que foi gerada pelo projeto de
pesquisa:
- Artigos Publicados
1. XAVIER, LUÍZA ARAUJO DA COSTA; BEZERRA, JOÃO FELIPE; DE
REZENDE, ADRIANA AUGUSTO; OLIVEIRA, RAFFAEL AZEVEDO DE
CARVALHO; DALMOLIN, RODRIGO JULIANI SIQUEIRA; DO AMARAL,
VIVIANE SOUZA. Analysis of genomic instability biomarkers in children with
non-syndromic orofacial clefts. Mutagenesis. v.00, P. gew068, 2017.
- Participação em congressos
1. Apresentado no 12th International Congress Cleft lip/palate and Related
Craniofacial Anomalies, de 5 a 10 de Maio de 2013, em Lake Buena
Vista, Florida, EUA. “MTHFR, MTR, MTRR and RFC1 polymorphisms
and the susceptibility to nonsyndromic cleft lip/palate in patients of
Rio Grande do Norte, Brazil”
2. Apresentado no V Congresso Norte-Nordeste de Genética Médica, 31
de Outubro a 02 de Novembro de 2015, em Natal, Rio Grande do Norte,
Brasil. “Associação de polimorfismos do gene IRF6 e as fendas
orais não-sindrômicas”.
3. Apresentado no V Congresso Norte-Nordeste de Genética Médica, 31
de Outubro a 02 de Novembro de 2015, em Natal, Rio Grande do Norte,
Brasil. “Alterçãoes cardiovasculares em paciente com fenda oral:
um estudo clínico-ecocardiográfico”.
42
- Lista de trabalhos publicados, aceitos, prontos para submissão e em
preparação
- Artigos prontos para submissão
1. Biodemographic characteristics of patients with oral clefts attending
the University Hospital Onofre Lopes/Federal University of Rio Grande do
Norte
Thaynnan Thomaz Silva Arruda1, João Felipe Bezerra1, Raul Hernandes
Bortolin1, Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira1, Valeria Morgiana Gualberto
Duarte1, Marcela Abbott Galvão Ururahy1, Gisele Correia Pacheco Leite2,
Felipe Braga de Lira1, Vinicius Xavier da Silva1, Andre Ducati Luchessi1, Maria
Edinilma Felinto de Brito2, Vera Lucia Gil-da-Silva-Lopes3, Maria das Graças
Almeida1, Adriana Augusto de Rezende1
1 Department of Clinical and Toxicological Analyses, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
2 Department of Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil
3 Department of Medical Genetics, University of Campinas, Campinas, SP,
Brazil
*Corresponding author:
Adriana Augusto de Rezende
Address: Av. General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Faculty of Pharmacy
Petrópolis, Natal, RN, Brazil CEP: 59012-570
Phone: +55 84 3342-9807
Fax: +55 84 3342-9833
e-mail: [email protected]
43
2. Down regulated mRNA expression of folate metabolism enzymes Clélio D Soares1, André D Luchessi1, Gustavo H M Oliveira1, Maria L Cardoso1, João F Bezerra1, Sandra R Oliveira2, Leandro Vinícius de Morais1, Fabrício M dos Santos1 Vivian N Silbiger1, Joanlise Marco L Andrade3, Cristina M Fajardo4, Rosário D C Hirata4, Maria das Graças Almeida1, Mário H Hirata4, Adriana A de Rezende1*.
1Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2Care Program to Children with Cleft Lip and Palate, Pediatrics Hospital
Professor Heriberto Bezerra, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
Rio Grande do Norte, Brazil.
3Department of Statistical, University of Brasilia, Brasilia, DF, Brazil.
4Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmaceutical
Sciences, University of Sao Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
*Corresponding author:
Dra. Adriana A. Rezende
Federal University of Rio Grande do Norte
Department of Clinical and Toxicological Analysis
Av General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Petropolis
59012-570, Natal-RN, Brazil,
Phone +55 84 3342-9807/ Fax: +55 84 3342-9833
Email: [email protected]
3. Cardiovascular Abnormalities in Patients with Oral Cleft: A Clinical-
Electrocardiographic-Echocardiographic Study
Gisele Correia Pacheco Leite; 1Marcela Abbott Galvão Ururahy ; 1João Felipe
Bezerra · 1André Ducati Luchessi; Sandra Socorro Correia Freire; Maria Ione
Ferreira Costa; Thaynnan Thomaz Silva Arruda; Valeria Morgiana Gualberto
Duarte Moreira Lima; Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira; Jussara Melo
Cerqueira Maia; Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes; 1*Adriana Augusto de Rezende
44
1Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil.
3Radiology Center, Onofre Lopes University Hospital of Federal University of
Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
4Department of Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil.
5Department of Clinical and Toxicological Analysis, University of São Paulo,
São Paulo, SP, Brazil
*Corresponding author:
Avenida General Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, Faculdade de Farmácia
Petrópolis, Natal, RN, Brazil CEP: 59012-570
Tel: +55 84 3207-9807
Fax: +55 84 3342-9833
e-mail: [email protected] and [email protected]
45
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48
ANEXO – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto de pesquisa: PESQUISA DE POLIMORFISMOS NO GENE IRF6 EM
PACIENTES PORTADORES DE FENDAS ORAIS
Meu nome é Adriana Augusto de Rezende, sou professora do Departamento de Análises
Clínicas e toxicólogicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e
estou convidando você para participar do projeto de pesquisa que estou desenvolvendo
com a equipe de Hospital de Pediatria Professor Heriberto Bezerra (HOSPED). Esta
pesquisa visa avaliar a presença de polirmofismos no gene IRF6 e sua correlação com
as fissuras labiais e/ou palatinas em crianças. Se aceitar participar desta pesquisa,
utilizaresmo amostras de DNA armazenadas de um Projeto anterior, o qual você ou seu
filho participaram, e que, para este novo Projeto necessito de sua autorização. Além de
você, outras trezentas e noventa e nove pessoas também participarão da pesquisa. Após
a realização de todos os exames, o paciente poderá ter acesso aos resultados no
Programa de Atendimento aos Pacientes Fissurados do HOSPED-UFRN, com a Dra.
Sandra Regina de Oliveira Caso haja interesse de realizarmos futuras pesquisas
entraremos em contato com você, e somente com sua autorização e aprovação dos
novos projetos no Comitê de Ética em Pesquisa realizaremos os estudos.
Confidencialidade do estudo: Os registros de sua participação no estudo serão
mantidos confidenciais. Eles serão guardados e somente os pesquisadores trabalhando
com a pesquisa terão acesso. Cada pessoa participante receberá um número para ser
utilizado na pesquisa. Se qualquer relatório ou publicação resultar deste trabalho, sua
identificação não será revelada.
Dano decorrente da pesquisa: Em qualquer momento, se o paciente tiver algum
problema de saúde decorrente da pesquisa, será garantido atendimento médico na
instituição.
Riscos inerentes da coleta: O risco a saúde será mínimo, por causa da coleta de sangue
que pode formar uma mancha roxa (hematoma) no local da picada da agulha. Riscos
esses que serão minimizados através de procedimentos de coleta cuidadosos.
Ressarcimento de despesas: O pesquisador será responsável pelo ressarcimento de
eventuais despesas decorrentes da pesquisa.
Participação voluntária: Sua participação neste estudo é totalmente voluntária,
podendo recusar-se fazer parte do mesmo ou interromper se julgar conveniente, sem
prejuízo para o andamento do trabalho de pesquisa. Caso você tenha alguma dúvida em
relação à pesquisa você pode entrar em contato com a Profa. Dra. Adriana Augusto de
Rezende a qualquer hora do dia (telefone: 3342-9807)
49
Perguntas: Estimulamos que você faça perguntas a respeito da pesquisa. Se houver
alguma dúvida, entre em contato com a Profa. Dra. Adriana Augusto pelo telefone
3342-9907 no Laboratório Multidisciplinar da Faculdade de Farmácia da UFRN. Por
quaisquer motivo adequado, independente do seu consentimento, os membros da equipe
de pesquisa podem encerrar sua participação no estudo. O motivo será explicado e
poderá ser devido a alguma alteração médica que pode colocá-lo em risco ou outras
complicações se continuar a participar, como também cancelamento do estudo pela
coordenação caso o sujeito não cumpra as orientações ou outras questões
administrativas.
Comitê de ética: Este projeto foi avaliado pelo Comitê de ética em pesquisa da UFRN
(CEP). Informações adicionais podem ser obtidas pelo telefone 3215-3135.
Consentimento para participação
Estou de acordo com a participação do estudo descrito acima. Fui devidamente
esclarecido (a) quanto aos objetivos da pesquisa, aos procedimentos aos quais serei
submetido (a). Foram garantidos esclarecimentos que eu venha a solicitar durante o
curso da pesquisa e o direito de desistir da participação a qualquer momento, sem que
minha desistência implique em qualquer prejuízo à minha pessoa ou à minha família. A
minha participação na pesquisa não implicará em custos ou prejuízos adicionais, sejam
eles de caráter econômico, social, psicológico ou moral. Foi-me garantido o anonimato,
o sigilo dos dados referentes a minha identificação e o compromisso de que serei
contactado (a) para avaliação de estudo futuro usando as amostras biológicas obtidas
nesse instante.
___________________________
Paciente
____________________________
Responsável Legal
(Polegar Direito)
Compromisso do pesquisador: Eu discuti as questões acima com o (a) participante do
presente estudo ou com seus responsáveis legais. É minha convicção que o paciente
entende os riscos, benefícios e obrigações relacionados com este projeto.
--------------------------------------------------------------------------
Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende