giovana giacomini. introdução trypanosoma cruzi doença de chagas 10 milhões fase aguda fase...

Giovana Giacomini

Introdução

Trypanosoma cruzi

Doença de Chagas

10 milhões

Fase aguda

Fase indeterminada

Fase crônica

Introdução

Trypanosoma cruzi

• Grande diversidade genética classificação

• RAPD (random amplified polymorphic DNA)

• MLEE (multilocus enzyme eletrophoresis)

• DTU (discrete typing unit) conjuntos de unidades populacionais geneticamente mais relacionadas entre si do que qualquer com outra população

6 DTUs

Emergência de DTUs: recombinação IIa e IIc = I + IIbIId e IIe = IIb + IIc

TCITCII IIa, IIb, IIc, IId e IIe

Introdução

Identificação dos DTUs é de alta relevância para estudos clínicos e epidemiológicos

Exploração de possíveis ligações entre diversidade genética

X pleomorfismo na severidade e

sintomas

Rastreamento molecular de populações silvestres

Método discriminatório molecular simples e sensível

Objetivo

Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos

- Genes envolvidos na relação hospedeiro-parasita devido a possível propensão à polimorfismos como uma resposta adaptativa à pressão seletiva imune

- Comparação com resultados obtidos por RAPD (validação taxonômica) e MLEE (aplicações práticas)

- Prova de evidência para aplicabilidade

Materiais e Métodos

20 cepas de T. cruziAmostras de sangue: 10 humanas e 21 outros mamíferosAmostras do conteúdo intestinal: 19 Mepraia spinolai

Materiais e Métodos

12 genesGenBank: sequências correspondentesPrimer Premier

PCR

Avaliar a diferença nas sequências de DNA

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment-Length Polymorfism)

Materiais e Métodos

Microchip (eletroforese

capilar)

Produto da PCRClivagem por enzimas

de restrição(Webcutter)

Separação dos fragmentos

Eletroforese em gel de agarose

Materiais e Métodos

1ª etapa: 6 cepas T. cruzi e T. cruzi marinkellei (“7-strain analysis”)Análise final: 1 enzima por marcador

Resultados

gp72(TaqI)

1f8(Alw21I)

genótipos heterozigotos

Sobreposição dos padrões dos supostos ancestrais

1ª etapa: 7-strain analysis2ª etapa: 20 cepas

Resultados

Fragmentos únicos DTUs específicos

Combinações de características únicas

Polimorfismos entre DTUs

Resultados

gp63(TaiI)

Polimorfismos intra-DTUs

Resultados

Aplicação do PCR-RFLP em amostras de hospedeiros

1f8/Alw21I

IIb IIb IIaIIc

IIdIIe+ IIb

IIdIIe+ I

IIdIIe+ I

IIaIIc+ I

Conclusões

- Concordância dos resultados encontrados com PCR-RFLP com a classificação baseada na MLEE e RAPD.

- Algoritmo para identificação de DTUs T. cruzi.

- Análise MLP representou uma nova alternativa aos métodos moleculares existente.

- Simples, discriminação em vários níveis, aplicado diretamente para amostras dos hospedeiros.

- Ferramenta importante para estudos epidemiológicos e ações de controle.

Fonte: Zingales et al., 2009

Segunda Reunião Satélite – XXXVI Reunião Anual em Pesquisa Básica sobre a Doença de Chagas (Búzio, RJ – 2009)

OBRIGADA!!!