fundamentos de extração de dna e rna
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MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Extração de DNA e RNA
Importância
Uso de DNA para estudos de natureza variada:
• diagnóstico (sensível e específico);
• medicina (estudo do câncer; identificação doenças);
• processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais);
• genoma
• investigações de perícia, paternidade...
Uso de RNA para estudos de natureza variada:
• Transcrição Reversa do RNA (cDNA);
• Análises de expressão gênica
• Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA
Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
A extração e a purificação de ácidos nucléicos é uma etapa fundamental para
se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em
cadeia da polimerase (PCR).
Organismosbactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais
Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Eucariontes (núcleo individualizado)
• DNA nuclear;
• DNA mitocondrial;
• DNA cloroplasto;
Tipos de DNA
Procariontes (sem núcleo)
• DNA circular;
• DNA plasmidial;
Fator adicional: parede celular
Extração de DNA/RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
• degradação proteínas;
• purificação do DNA/RNA.
Para cada tipo de amostra, vários protocolospodem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise das membranas plasmáticas e nucleares;
solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica.
detergentes
micelas
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentes
Proteinase k
A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album;
É capaz de digerir a queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”.
Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• lise + degradação proteínas;
detergentesDigestão em banho-maria com
temperatura próxima a 50°C Proteinase k
O tempo de incubação pode variar. Importante é que a amostra se apresente totalmente digerida
Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas Aviso: O fenol é um produto altamente tóxico, irritante para a pele e
mucosas
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa.
Clorofórmio: retira resíduos de fenol
Extração de DNA/RNA
Extração de DNA/RNA
Passos principais:
• purificação do DNA/RNA (eliminação de resíduos orgânicos)
A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico.
Uso de álcool para a precipitação
formação do Pellet
• A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.);
• DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes;
• Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas...
Notas - Extração de RNA
• Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos;
• DNAse;
• O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas.
Quantificação DNA/RNA
Espectrofotômetro
• Qualidade da extração
• Determinação da quantidade de
DNA/RNA extraído
260 e 280 nm
razão 260/280 =
nucleotídeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm
280 nm para estimar a contaminação com proteínas
1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada
Um valor inferior indica contaminação com proteínas e um valor superior indica contaminação com RNA.
Conservação da amostra
• Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em álcool
absoluto imediatamente após a coleta, e trocado após 24h.
• Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com sílica.
• Para todas amostras congeladas em estoque, é preferível o fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofradescongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA.
• O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados
Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório
tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos
procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte:
a) Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos
b) Capelas de exaustão.
c) Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura.
d) Microtubos de polipropileno.
e) Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras).
Material Necessário
MSc. Ana Liedke
Fundamentos de Eletroforese Agarose (AGE) e
Poliacrilamida (PAGE)
• É um método simples e muito eficiente para separar, para identificar e
para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas.
• Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua
carga elétrica e seu peso molecular.
• Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e
moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo).
Eletroforese
A migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é chamada de eletroforese.
Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Eletroforese
AGE
+-
Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-AGE
+-
Existem dois modelos básicos de eletroforese:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Eletroforese
PAGE
+-AGE
+-
Fonte
Eletroforese
Pólo +
Pólo -
Equipamento - Agarose
• Ágar-ágar (ágar ou agarose)
• É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta;
• insolúvel em água fria
• dissolve em água quente (absorve uma quantidade de água de cerca de vinte vezes o seu próprio peso) formando um gel não-absorvível, não-fermentável e com importante característica de ser atóxico.
• Concentrações de 0,5 – 2,5% Diluídos no tampão TBE ou TAE.(Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA)
Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
•Tamanho do DNADiferentes tamanhos de moléculas, diferentes taxasde migração no gel de agarose
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNA
Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
•Tamanho do DNA
•Concentração da agarose
•Conformação do DNAem ≠ formas ou conformação do DNA,a migração ≠ velocidades
DNA superenrolado mais lentoDNA linear mais rápida
Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose
Equipamento - Agarose
Agarose tampão aquece
Despeja na formacom o pente
Cuba com Tampão TBE ou TAE
Equipamento
DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)
marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra
High...)
(+)
DNA com fragmentos de tamanho conhecido
aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida
Equipamento
DNA + marcador migração(Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol)
Coloração com brometo de Etídio (EtBr) (0,0001%).
marcador de tamanho molecular(Low mass, High e Ultra High...)
(+)
Depois de migrar o suficiente.....
Transiluminador (caixa de luz UV)
aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço)adicionar cor às amostrasPermite acompanhar a corrida
Brometo de Etídio
AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório.
Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos
Fluorescente na luz ultravioleta
Equipamento - Poliacrilamida
Utilizado tanto para Proteínas quanto para DNA/RNA
Composto por Acrilamida e Bis-AcrilamidaAVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou
absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.
Concentrações diferentes – quanto mais acrilamida, menores os poros
Proteínas: a carga e a forma devem ser excluídas, com adição de SDS (dodecilssulfato de sódio) que possui carga negativa
– converte proteínas em estrutura linear
Equipamento - Poliacrilamida
Coloração com:
Brometo de Etídio (EtBr),
prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e
análise de amostra diluída)
SYBR Green (menos mutagênico)
Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. É menos sensível que corar com a pratamas efetivo também, além de ser fácil de corar
Fotodocumentação
Transluminador
Caixa acoplada máquina fotográfica
Computador
AGE X PAGE
É mais difícil de ser preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução.
menor capacidade de resolução, porém apresenta maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)
Fácil preparo, não-tóxico.
tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base).
podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença.
também usados para separação de proteínas
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