esterilização industrial
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CAPÍTULO VIII – ESTERILIZAÇÃODiogo B. Andreis
José A. M. de Campos
1. INTRODUÇÃO
Em processos fermentativos é necessário trabalhar com culturas puras,
ou seja, sem contaminantes para se ter uma operação eficaz, do ponto de vista
econômico e bioquímico. Os problemas causados pela contaminação serão
discutidos posteriormente. O fermentador, meio de cultura e os equipamentos
utilizados no processo, devem ser esterilizados para a destruição dos
microrganismos pelos métodos apresentados neste capítulo.
2. CONCEITOS
A palavra esterilização em sua concepção maior é o processo que
promove a eliminação de todas as formas de microrganismos presentes para
um nível aceitável de segurança. Antes de discutirmos a esterilização dos
equipamentos e soluções é necessário conceituarmos e explicarmos.
2.1. Esterilização: processo que consiste na destruição completa dos
microrganismos. Pode ser definida como a inativação e/ou destruição total dos
microrganismos quanto a sua capacidade reprodutiva. Mas não significa,
necessariamente, a destruição de todas suas enzimas, seus produtos
metabólicos e toxinas.
2.2. Desinfecção: o termo denota um processo que reduz o número de
microrganismos a um nível razoável de segurança. Geralmente aplicado ao uso
de agentes químicos. Não implica, necessariamente, na eliminação de todos os
microrganismos viáveis. Há uma grande variação no resultado da desinfecção,
desde a esterilização até a redução mínima do número de microrganismos
viáveis. Os diversos fatores que atuam são: natureza e número dos 1
microrganismos presentes, presença de esporos bacterianos, concentração
dos desinfetantes, duração de aplicação, quantidade de matéria orgânica
presente, tipo de material e temperatura de aplicação.
2.3. Pasteurização: termo comumente utilizado na produção de alimentos.
Processo de destruição de microrganismos patogênicos, não possui ação
sobre os esporos. Consiste em submeter as substâncias a temperaturas
próximas à 100ºC por um tempo adequado. O aquecimento pode ser feito por
meio de vapor, água quente, calor seco ou resistência elétrica. E por final,
resfria-se o produto rapidamente após o tratamento térmico.
2.3.1. Existem três tipos de pasteurização
Pasteurização Lenta: na qual se utiliza temperaturas menores durante maior
intervalo de tempo. Este tipo é melhor para pequenas quantidades de produto,
por exemplo, o leite de cabra. A temperatura utilizada é de 65˚C durante trinta
minutos.
Pasteurização Rápida: na qual se utiliza altas temperaturas durante curtos
intervalos de tempo. É mais utilizada, por exemplo, para leite de saquinho, do
tipo A, B e C. A temperatura utilizada é de 75˚C durantes 15 a 20 segundos, na
literatura, frequentemente encontramos este tipo de pasteurização com a
denominação HTST (High Temperature and Short Time), alta temperatura e
curto tempo.
Pasteurização Muito Rápida: na qual as temperaturas utilizadas vão de 130˚C
a 150˚C, durante três a cinco segundos, este tipo é mais conhecido, por
exemplo, com o leite UHT (Ultra High Temperature) ou longa vida (Potter &
Hotchkiss, 1995).
2.4. Sanitização: é a diminuição do número de microrganismos sobre
superfícies, equipamentos e utensílios até níveis consideráveis de acordo com
as exigências de saúde pública.2
2.5. Assepsia: é a destruição de microrganismos patogênicos ou inibição de
seu crescimento ou atividade por ação de substâncias químicas, sobre tecidos
vivos.
2.6. Tindalização: processo que visa a esterilização realizado pela exposição
do material ao vapor fluente por 30 minutos para destruição das células
vegetativas e posterior incubação para germinação de esporos. Este processo
é repetido por três ou quatro vezes, até que todos os esporos tenham
germinado e as células vegetativas resultantes estejam destruídas pelo calor.
Possui uma série de limitações como tipo de material que pode ser submetido
ao tratamento e baixo índice de segurança de esterilização.
3. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos Físicos:
Calor (seco e úmido);
Filtração;
Radiação (ionizante e não ionizante);
Métodos Químicos (líquidos e gasosos):
Álcoois;
Compostos fenólicos;
Halogênios;
Óxido de etileno;
Ozônio;
Peróxido de hidrogênio;
ETO (Óxido de Etileno).
Métodos Físico-químicos: 3
Vapor a baixa temperatura com formaldeído (VBTF);
Plasma de peróxido de hidrogênio;
A escolha do método de esterilização a ser utilizado dependerá das
características dos produtos a serem esterilizados. Sempre que usarmos
radiação ou agentes químicos o tempo de contato é fundamental para termos
uma esterilização adequada. Quando for empregado o método de calor, o
tempo e a temperatura devem ser controlados para assegurar a esterilização. A
ação da temperatura de aquecimento sobre o tempo necessário para destruir
esporos de bactérias, submetidos ao calor úmido, é demonstrado na TABELA
10.
TABELA 10. Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir
esporos bacterianos de fermentação simples em meio de concentração inicial
de 1,6 X 105 esporos/mL (Farmacopéia Brasileira, 2010).
TEMPERATURA (ºC)
TEMPO(min)
TEMPERATURA (ºC)
TEMPO(min)
100 1200 120 19
105 600 125 7
110 190 130 3
115 70 135 1
3.1. Métodos Físicos
Na esterilização por método físico se utiliza o calor como agente
esterilizante. Segundo a Farmacopeia Brasileira (2010), este processo é
considerado o mais simples, econômico e seguro de que se dispõe. O
documento destaca, no entanto, que a sensibilidade dos diferentes
microrganismos à ação do calor é variada, sendo a eficiência de inativação
4
dependente da temperatura, tempo de exposição e presença de água
(ANVISA, 2010). O mecanismo de esterilização resulta da destruição da
estrutura das cadeias proteicas do microrganismo requer energia e a presença
de água possibilita o emprego de menores tempos de exposição e
temperaturas.
3.1.1. Calor Seco
O método da esterilização por calor seco ocorre devido a processos
oxidativos, e, portanto, necessitam de altas temperaturas e longo tempo de
exposição. É realizado em estufas com distribuição homogênea do calor. Sua
eficácia depende da difusão do calor, da quantidade de calor disponível e dos
níveis de perdas de calor. Existem dois tipos de estufas que operam com este
tipo de método: a estufa de convecção por gravidade e a estufa de convecção
mecânica (circulação de ar forçado). O método tem como desvantagens a
necessidade de altas temperaturas e longo tempo de exposição (TABELA 10a),
além da dificuldade de validação, que pode acelerar o processo de degradação
do instrumental. Deve-se utilizar o método por calor seco quando os materiais a
serem esterilizados não suportarem a ação do vapor dos esterilizadores a
vapor.
TABELA 10a - Relação de valores de temperatura e tempo de exposição necessário para esterilização por calor seco (ANVISA, 2010).
Temperatura (ºC) Tempo de exposição
170 1h
160 2h
150 2,5h
140 3h
121 12h
3.1.2. Calor Úmido
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É considerado o método mais econômico, rápido e sem efeitos
adversos, por não deixar resíduos do agente esterilizante. O processo
empregado vapor saturado é denominado autoclave. O princípio básico de
operação é a substituição do ar da câmara por vapor saturado. Tem a
vantagem de produzir uma elevação da temperatura em forma rápida em
curtos tempos de esterilização e de não deixar resíduos tóxicos no material.
Para a esterilização por calor úmido existe um número de combinações
aceitáveis de tempo e temperatura reconhecidas por algumas farmacopéias.
Exemplos de temperaturas e tempos mínimos estabelecidos para alcançar
níveis adequados de letalidade em processos de esterilização são
demonstrados na Tabela 11. Todas as combinações listadas estão baseadas o
conceito de sobre esterilização com um fator de segurança que se tem
estabelecido para vapor saturado ou água em contato com o microrganismo.
TABELA 11 - Relação de valores de temperatura e tempo de exposição necessário para esterilização por vapor saturado (ANVISA, 2010).
Temperatura (ºC) Tempo de exposição
121 15min
126 10min
134 3min
Se uma substância pura existe como vapor à temperatura de saturação,
ela é chamada vapor saturado. Quando o vapor está a uma temperatura
superior à temperatura de saturação, é chamado vapor superaquecido. A
pressão e temperatura do vapor superaquecido são propriedades, pois a
temperatura pode aumentar, enquanto a pressão permanece constante. As
especificações para temperatura e pressão do vapor saturado para uso na
esterilização por calor úmido são baseadas na normativa publicada em 1997 e
suas atualizações recentes pela IAPWS-IF97 (The International Association for
the Properties of Water and Steam). Substância pura é aquela que tem
composição química invariável e homogênea. Para uma substância pura há
uma relação definida entre a pressão de saturação e a temperatura de 6
saturação. O termo temperatura de saturação designa a temperatura na qual
se dá a vaporização a uma dada pressão, e esta pressão é chamada
depressão de saturação para a dada temperatura.
Na Figura 41, apresenta uma representação esquemática da superfície
termodinâmica. Tradicionalmente são realizadas projeções nos planos pressão
volume especifico (p-v), temperatura volume específico (T-v) e pressão
temperatura (p-T) da curva de saturação.
FIGURA 41 - Representação esquemática da superfície termodinâmica e
projeções nos planos (ANGELO E. e SIMÕES M.J.R., 2011).
A Figura 42 apresenta o valor da pressão de saturação é função
exclusiva da temperatura.
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FIGURA 42 - Relação pressão x temperatura (ANGELO E. e SIMÕES M.J.R.,
2011).
As equações que descrevem as propriedades termodinâmicas da água e
vapor se baseiam na formulação de 1997. Esta formulação é recomendada
para uso industrial, e é chamado de Formulação industrial de 1997 para as
propriedades termodinâmicas da água e de vapor (IAPWS-IF97-International
Associationforthe PropertiesofWater and Steam). O modelo é dividido em cinco
regiões representadas em um gráfico que apresenta as faixas de aplicação
para diferentes estados. Para as cinco regiões do gráfico os autores da
IAPWS-IF97 desenvolveram equações fundamentais de alta precisão. Todas
as propriedades termodinâmicas podem ser calculadas a partir dessas
equações fundamentais utilizando as relações termodinâmicas apropriadas.
Utilizando a relação P x T a temperatura teórica (TP) é calculada a partir
da pressão medida (Pm) no interior da câmara (figura 2). Se (TP) é comparada
com as temperaturas dentro da câmara do esterilizador (Tm), três situações
podem ocorrer:
Tm = TP: vapor saturado 100 % está presente na câmara esterilizadora
Tm< TP: O vapor é supersaturado
Tm> TP: O vapor é superaquecido
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O vapor superaquecido se comporta como um gás seco e tem uma
eficácia microbicida baixa comparado com o vapor saturado. O vapor
superaquecido pode se formar como consequência de uma redução de
pressão e/ou uma compressão termodinâmica de vapor saturado.
A temperatura teórica é calculada a partir da pressão medida segundo
as tabelas padrão ou ele pode ser calculado a partir da equação a seguir:
TP = 42, 677 6 + [−3 892,7 / (lnP- 9,486 54)] - 273,27
Onde:
TP: é a temperatura teórica de vapor de água em graus Celsius;
P: é a pressão medida em megapascais.
1P = 0,0000099 atm
3.1.3. Destruição térmica de microrganismos
Tomando-se por base o fato de que a temperatura ideal para o
desenvolvimento e crescimento de organismos vivos vai de -5 ºC a 80 ºC,
podemos concluir que a exposição a temperaturas além desta faixa resultará,
provavelmente, na morte destes organismos, com exceção dos esporos
resistentes ao calor. Acredita-se que o limite superior desta faixa de
temperatura seja determinado pela instabilidade dos constituintes químicos da
matéria viva, mais precisamente as proteínas e os ácidos nucléicos, sendo
estas substâncias rapidamente destruídas, ou desnaturadas, a temperaturas na
faixa de 50 ºC a 90 ºC.
O mecanismo responsável pela morte dos microrganismos quando
sujeitos ao calor ainda não é claramente entendido. A teoria tradicional prega
que a morte de bactérias a temperaturas elevadas esteja intimamente
relacionada a alterações em proteínas, gerando alterações protoplasmáticas
irreversíveis no interior da célula da bactéria. Alguns pesquisadores afirmam
que a morte está associada à inativação por calor de algumas enzimas ou
9
sistemas enzima-proteína na célula. Os outros mecanismos que atuam quando
a bactéria é destruída a altas temperaturas tiveram avanço graças aos
trabalhos de Chick (1906). As medições quantitativas originais de Chick
contribuíram enormemente para a evolução de uma ferramenta muito útil
conhecida como ordem logarítmica da morte de bactérias
Estudos mais recentes nos levam a crer que o modo de ação do calor
sobre a bactéria é bastante semelhante à coagulação de proteínas pelo calor.
Suportando este ponto de vista, Amaha e Sakagushi concluíram que a causa
da morte dos esporos bacterianos submetidos ao calor úmido possa ser
atribuída à desnaturação de uma molécula proteica essencial à célula do
esporo. Deste modo, é bastante razoável concluirmos que o efeito da umidade
sobre a temperatura de coagulação da proteína precisa guardar alguma
relação com a temperatura na qual a bactéria é destruída. Este ponto de vista
foi investigado por Lewith, que detectou o fato das proteínas serem coaguladas
pelo calor a temperaturas mais baixas quando estas contêm uma quantidade
maior de água . Além disso, quando o vapor encontra-se presente, as bactérias
são destruídas sob temperaturas bem menos elevadas e em períodos bem
mais curtos, diferentemente de quando há ausência de vapor. Este fenômeno
pode ser explicado se levarmos em conta que todas as reações químicas,
incluindo aqui a coagulação de proteínas, são catalisadas pela presença de
água.
Se a frequência de citações na literatura for um critério, é justo dizermos
que hoje é amplamente aceito o conceito de que a morte bacteriana por calor
úmido é causada pela desnaturação e coagulação de uma área proteica crítica
no interior da estrutura genética da célula conforme a figura 43.
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FIGURA 43: a) Bacillus colon típico, em líquido para cultura após 1 hora,
ampliado 28.000X. Verifica-se a uniformidade aparente do protoplasma celular.
b) Bacillus colon após aquecimento em cultura salina por 10 min a 50 ºC,
ampliado 16.000 X. Verifica-se a granulação do protoplasma de forma
irreversível (Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health
Sciences, p. 64).
3.1.4. Desnaturação
As proteínas das células bacterianas, muitas das quais enzimáticas,
existem em um estado coloidal perfeitamente disperso. Quando submetidas a
agentes antimicrobianos tais como: calor úmido, álcoois ou fenóis, a proteína
coagula, se precipita, tornando-se antifuncional, como no caso do enrijecimento
da clara de ovo. Esta transformação envolve uma importante reação
característica de proteínas, conhecida como desnaturação e implica em
mudanças nas propriedades físicas ou químicas da proteína, como a
solubilidade, incluindo ainda algumas alterações na estrutura molecular da
mesma. Se a exposição ao calor não for prolongada, a desnaturação pode ser
revertida, retornando-se às condições nas quais a proteína estava estável.
Desta forma, isto significa que é preciso distinguir-se entre a desnaturação
reversível ou irreversível de proteínas.
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Além do calor, outros agentes capazes de promover a desnaturação das
proteínas são: radiação, ultrassom, congelamento, pressão e uma variedade de
agentes químicos (ácidos, alcaloides, álcoois, ureia e detergentes). As reações
envolvidas no processo de desnaturação são complexas e ainda pouco
entendidas.
A importância da desnaturação de proteínas para a esterilização é a
ação letal do calor sobre os esporos bacterianos a qual foi primeiramente
registrada por Chick e Martin, que caracterizaram a desnaturação protéica
como uma reação mononuclear com água.
3.1.5. Ordem de Mortalidade
Quando uma população de microrganismos é exposta a determinada
influência esterilizante, a taxa ou velocidade na qual os organismos individuais
morrem é diretamente proporcional à concentração ou ao número por unidade
de volume em um dado tempo. Geralmente, a ordem de mortalidade, como
pode ser determinada experimentalmente, segue um curso uniforme e
consistente e é descrita comumente como sendo logarítmica. Isto significa que
quando uma população microbiana está em contato com um meio esterilizante,
o número de células vivas decresce gradualmente, de maneira tal que o
logaritmo do número de células sobreviventes em um dado momento, quando
plotado em relação ao tempo, decresce em uma linha reta como pode ser
verificado na Figura 44. Apesar de haver evidências que suportem ordens de
mortalidade não logarítmicas, os dados coletados desde as medições iniciais
de Chick, até a presente data, mostram que a morte de células vegetativas,
bem como de esporos é essencialmente logarítmica.
12
FIGURA 44: Curva de sobrevivência. O número de sobreviventes é plotado em
relação ao tempo de exposição à temperatura constante. O valor D = 0,666 min
(PERKINS, 2008).
O conhecimento da ordem logarítmica é importantíssimo, pois permite
ao microbiologista computar a taxa de mortalidade constante, designada por K.
Este termo expressa, através de um simples número, a Taxa de Mortalidade,
que apresenta uma relação direta com a eficiência do processo de
esterilização. A constância da taxa de mortalidade significa que o número de
bactérias que são mortas a cada minuto ou unidade de tempo é um percentual
constante do número de bactérias vivas no início de cada novo minuto. É
comum expressarmos K através da equação 1:
K=1tlog No
Nt (1)
Onde, t = tempo em minutos ou tempo de exposição, N0 = Número inicial de
organismos no início do intervalo de tempo e N t = Número de organismos
sobreviventes no final do intervalo de tempo.
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A determinação da taxa de mortalidade possibilita a comparação da
resistência ao calor de diferentes organismos à mesma temperatura, ou a
resistência de um organismo em particular a diferentes temperaturas. Além
disso, possibilita descrever o efeito quantitativo de fatores, como o pH, sobre a
esterilização. É importante perceber que a característica logarítmica da ordem
de mortalidade implica na morte do mesmo percentual de bactérias vivas a
cada minuto. Teoricamente isto significa que a esterilização completa nunca é
obtida. A tabela 13 ilustra o caso teórico baseado na premissa de que quando
uma suspensão de 1 milhão de bactérias por mililitro é submetida a uma
influência esterilizante, 90% dos organismos são mortos a cada minuto de
exposição.
Minuto Bactérias vivas no início do primeiro minuto
Bactérias Mortas em 1 minuto
Bactérias sobreviventes ao final de 1 minuto
Logaritmo de sobreviventes
1º 1.000.000 90%= 900.000 100.000 5
2º 100.000 = 90.000 10.000 4
3º 10.000 = 900 1.000 3
4º 1.000 = 90 100 2
5º 100 = 9 10 1
6º 10 = 0,9 1 0
7º 1 = 0,09 0.1 -1
8º 0,1 = 0,009 0.01 -2
9º 0,01 = 0,0009 0.001 -3
10º 0,001 = 0,00009 0.0001 -4
11º 0,0001 = 0,000009 0.00001 -5
12º 0,0001 = 0,0000009 0.000001 -6
TABELA 13: Exemplo teórico da ordem de mortalidade de uma população
bacteriana (PERKINS, 2008).
Na coluna de sobreviventes, nos casos de 0,1 ou 0,01 bactéria/ ml, nos
dá a informação de que apenas 1 bactéria permanece viva em 10 ml ou em 14
100 ml da suspensão. Ao final de 12 minutos de exposição, teoricamente,
apenas 1 bactéria ainda permaneceria viva em 1.000.000 de ml, equivalente a
1000 L da suspensão.
Como uma medida prática, o exemplo acima mostra a necessidade de
um período proporcionalmente maior de tempo de exposição para a
esterilização de um líquido contendo uma alta concentração de bactérias, do
que um líquido contendo alguns poucos organismos. Esta condição é
verdadeira para a esterilização por calor, desinfecção química ou
pasteurização. A aplicação deste princípio é muitas vezes ultrapassada no
estabelecimento do período de exposição mínimo para a esterilização de
materiais e produtos.
Por exemplo, da figura anterior, N0 = 1milhão, ou 106 organismos, t = 2 minutos
e Nt = 1.000 ou 103 organismos. Desta forma na equação 2 temos:
K=12
(106−103 )=6−32
=1,50 (2)
Várias tentativas de explicação da característica logarítmica da ordem de
mortalidade têm sido feitas. Uma das mais plausíveis é a proposta por Rahn,
onde o processo de morte remonta uma reação unimolecular ou bimolecular de
primeira ordem. Com isso em mente, a característica logarítmica da ordem de
mortalidade é matematicamente possível apenas quando a morte é devida a
destruição (desnaturação) de uma simples molécula da célula. A ordem
logarítmica é inteiramente impossível se mais do que uma molécula precisar
ser inativada para gerar a morte da célula.
A taxa de mortalidade também pode ser expressa através do valor D ou
Tempo de Redução Decimal. Este princípio, introduzido por Katzin é baseado
na aplicação da reação unimolecular constante à morte microbiana sob
condições uniformes. Por definição, o valor D é o tempo necessário, a uma
dada temperatura, para destruir 90% dos microrganismos. Da figura anterior,
podemos perceber também que o valor D representa o tempo necessário para
que a curva de sobrevivência atravesse um ciclo de log.
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Quando a taxa de mortalidade é exponencial, o valor D torna-se o
recíproco da taxa de mortalidade constante, K, e ambos D e K representam a
inclinação da curva de sobreviventes. É importante expressarmos a relação
entre estes termos como:
D= 2.303K (3)
Uma vez que o valor D pode ser determinado para qualquer
temperatura, um subescrito é normalmente utilizado para designar a
temperatura empregada, como D250 ou D150.
O Tempo de Redução Decimal (D) é muito importante para a indústria
de processamento de alimentos, especialmente na avaliação dos métodos para
a preservação de alimentos pelo processamento térmico e em estudos de
pesquisa sobre a microbiologia de alimentos enlatados.
3.1.6. Ponto de Destruição Térmica e Tempo de Destruição Térmica
Há alguns anos, dentre os bacteriologistas, surgiu o conceito de que se
uma suspensão com bactérias fosse gradualmente aquecida, seria alcançado
um ponto na escala crescente de temperatura no qual todas as células na
suspensão seriam mortas instantaneamente. Este conceito deu origem ao
termo Ponto de Destruição Térmica, sendo este definido como a menor
temperatura na qual uma solução aquosa de bactérias é morta em 10 min. Este
foi o primeiro padrão de comparação de tolerância ao calor entre organismos
de diferentes espécies. O uso deste termo tem sido bastante criticado, tendo
em vista o fato de implicar em uma falta de entendimento, pois nos leva a
acreditar na existência de uma determinada temperatura que, uma vez
alcançada, causaria a morte instantânea de todas as bactérias, sem levar-se
em conta o período de exposição, o número de organismos, o ambiente a redor
dos organismos e seu estado fisiológico.
16
Em vista da evidência de que a morte de microrganismos sob a
influência de o calor ser um processo ordenado, uma vez que a coagulação da
proteína celular é um processo irreversível, precisamos admitir que não existe
uma temperatura na qual todas as células em suspensão seriam mortas
instantaneamente.
O processo ocorre como uma função do tempo dentro de uma
determinada faixa de temperatura. Se a temperatura é aumentada, o tempo
pode ser reduzido, ou se a temperatura for reduzida, o tempo precisa ser
prolongado. Em outras palavras, a morte de microrganismos pelo calor é uma
função dependente da relação tempo-temperatura empregada. Por estas
razões, a expressão Ponto de mortalidade térmica tem dado caminho a uma
medição de cunho mais prática conhecida como Tempo de Morte Térmica.
Este tempo se refere à determinação do menor período de tempo necessário
para matar toda uma população conhecida de microrganismos em uma
suspensão a uma dada temperatura.
A natureza do meio nos quais os organismos estão suspensos tem uma
importante ligação com o Tempo de Destruição Térmica. Substâncias tóxicas,
se presentes, tornam-se crescentemente germicidas com leves aumentos de
temperatura. Além disso, os produtos do metabolismo mostram toxidade
aumentada em altas temperaturas. Um pH ácido ou alcalino diminui o Tempo
de Mortalidade Térmica, bem como a presença de óleos e gorduras retardam a
penetração de calor aumentando o tempo.
3.1.7. Curva do Tempo de Destruição Térmica
Em última análise, a curva do Tempo de Morte Térmica mostra a resistência
relativa dos organismos a diferentes temperaturas letais. Esta curva pode ser
construída através da plotagem dos Tempos de Destruição Térmica,
determinados experimentalmente, sobre uma escala logarítmica e as
temperaturas correspondentes em uma escala linear. Tal curva é mostrada na
figura 45.
17
FIGURA 45: Curva de TMT com tempos de destruição e sobrevivência
plotados em relação à temperatura do calor úmido. Z = 20ºF (11,2ºC) (Perkins,
John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.72).
É importante percebermos que qualquer valor de Tempo de Morte
Térmica não apresenta sentido, a menos que o número de organismos
originais seja conhecido, tendo em vista o fato de diferentes populações
resultarem em diferentes curvas.
A inclinação da curva na figura 45, simbolizada por Z, é definida como o
número de graus necessários para a curva atravessar um ciclo de log. Este
número é equivalente ao número de graus de temperatura que precisam ser
aumentados ou diminuídos a uma dada temperatura de referência para gerar
um decréscimo ou aumento no tempo de destruição. Com uma inspeção mais
detalhada na curva podemos perceber que o valor de Z é a medida de como o
Tempo de Morte Térmica varia com a temperatura, seguindo daí que, se Z for
um valor elevado, a temperatura influirá menos sobre o TMT do que nos casos
onde Z é um número pequeno. A maioria dos esporos bacterianos resistentes
exibe um valor de Z dentro da faixa de 10 a 15 ºC. Na confecção da curva de
Tempo de Morte Térmica certas condições precisam ser observadas. Estas
condições, como estipuladas por Townsend e Col são:
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a) Um Ponto de Sobrevivência é considerado um dado positivo e a curva
precisa estar acima (temperatura mais elevado ou tempo mais prolongado) de
cada um dos pontos de sobrevivência;
b) Pontos de Destruição são indicativos, mas não positivos devido ao
fenômeno de “saltos” (sobrevivência de organismos após decorrido um tempo
além do prescrito para a obtenção de esterilidade). Em geral, uma curva de
Morte Térmica deve estar abaixo de tantos pontos de destruição quanto
possíveis e acima de todos os pontos de sobrevivência;
c) A inclinação da curva de morte térmica deve ser paralela à tendência geral
dos pontos de sobrevivência e de destruição.
Estudos do Tempo de Morte Térmica são de suma importância para os
estudos no campo da bacteriologia aplicada, como por exemplo, na indústria de
enlatados. Deve-se lembrar que os Tempos de Morte Térmica são valores
falsamente considerados constantes e imprecisos.
Todas as informações a respeito dos Tempos de Morte Térmica
apresentam certo erro associado, cuja magnitude depende dos intervalos de
tempo considerados. O número de sobreviventes nunca é zero, podendo
tornar-se muito pequeno, da ordem de 1 em 100 ou 1 em 1000 l.
3.1.8. Resistência de Microrganismos ao Calor
A resistência de microrganismos a agentes destrutivos externos, tais
como: calor, produtos químicos e radiações ionizantes formam a base para
todos os processos de esterilização e desinfecção. O que precisa ficar claro é
que, hoje em dia, nosso conhecimento do “porquê” e de “como” certas espécies
são mais resistentes do que outras é muito limitado. Esta situação nos leva ao
fato das células bacterianas serem compostas por um sistema altamente
complexo, responsável pela habilidade de sobreviver em um ambiente
desfavorável. De acordo com Wyss, “quando o estresse é levado ao sistema,
três possibilidades se revelam: 1) O sistema entra em colapso e o organismo
19
morre ou deixa de ser viável para a continuação de sua linhagem; 2) O sistema
desenvolve mecanismos de resistência; 3) O sistema se altera, acomodando-
se temporária ou permanentemente à presença da influência indesejável.”
(Wyss, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F.
Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed.
Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210).
3.1.9. Filtração
Essencialmente é um método que não destrói, porém remove
microrganismos, quando outras metodologias não podem ser empregadas seja
pela característica dos produtos ou por sua termo estabilidade. A esterilização
por filtração ocorre por remoção física dos microrganismos presente na solução
testada, com retenção dos mesmos em membranas filtrantes.
As membranas filtrantes disponíveis no mercado podem ser de: acetato
de celulose, nitrato de celulose, fluorcarbonato, polímeros acrílicos, poliesteres,
policarbonato, cloreto de polivinila, vinil, nylon, com porosidade de diâmetro de
0,2 micras removem os microrganismos das soluções e do ar.
Contudo, a maior parte dos vírus é suficientemente pequena para
atravessarem os poros destas membranas filtrantes, pelo que esta técnica não
assegura a esterilidade total das soluções ou gases filtrados.
3.1.10. Radiação Ionizante
A ação antimicrobiana da radiação ionizante se dá através de alteração
da composição molecular das células, modificando seu DNA. As células sofrem
perda ou adição de cargas elétricas.
Existem fatores ambientais, físicos e alguns compostos que influenciam
na resposta celular à radiação, aumentando ou diminuindo sua sensibilidade a
20
esta. Há também microrganismos que são mais resistentes à radiação, como
os esporos bacterianos; as leveduras e fungos têm resistência considerada
média e os Gram negativos têm baixa resistência à radiação.
A esterilização por radiação ionizante é realizada por emissões de alta
energia de ondas eletromagnéticas ou de partículas que se chocam com os
átomos do material irradiado, alterando sua carga elétrica por deslocamento de
elétrons transformando os átomos irradiados em íons positivos ou negativos
podendo gerar hidrogênio livre, radicais hidroxilas e alguns peróxidos,
causando lesões intracelulares. As principais fontes de radiação são raios: alfa,
beta, gama e raios X.
Particularmente na indústria farmacêutica a esterilização por radiação
ionizante apresenta vantagens que são consideradas prioritárias como, por
exemplo: os produtos esterilizados já na sua embalagem final, tornando o
processo um dos mais seguros quanto ao aspecto de recontaminação, o alto
poder de penetração da radiação assegura esterilização de todo o volume do
produto, seja líquido, sólido ou gel, principalmente para produtos que
apresentem cavidades de difícil acesso e uma série de materiais são
compatíveis com este tipo de radiação (termoplásticos, borrachas, metais,
papéis, vidros, etc.).
3.2. Métodos Químicos
Os métodos químicos utilizados para esterilização podem ser líquidos ou
gasosos e se caracterizam pelas interações entre compostos químicos.
3.2.1. Químicos líquidos
Os métodos químicos líquidos utilizam glutaraldeído, peróxido de
hidrogênio, formaldeído ou ácido peracético.
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Esterilização por glutaraldeído: O glutaraldeído é um biocida utilizado em
processos de desinfecção na concentração de 2 % (p/v), por um período de
tempo de 30 minutos. Seu mecanismo de ação é a alquilação de grupos
hidroxila, carboxila e amino dos microrganismos, alterando seu DNA, seu RNA
e sua síntese de proteínas. Esse método de esterilização é recomendado para
esterilizações de materiais sensíveis ao calor. É um produto extremamente
tóxico para o operador sendo o seu uso restrito. O glutaraldeído tem potente
ação biocida, sendo bactericida, virucida, fungicida e esporocida. O mecanismo
de ação do glutaraldeído sobre esporos é causar reação com a superfície do
esporo provocando endurecimento das camadas externas e morte.
Esterilização por formaldeído: Na esterilização pelo formaldeído o
mecanismo de ação ocorre na alquilaçãode radicais amino, carboxil, oxidril e
sulfidrilde proteínas e ácidos nucléicos microbianos, formando pontes
metilênicas ou etilênicas, o que impedem que esses compostos celulares
realizem suas funções no microrganismo. Existem vários fatores que impede o
seu uso: o efeito carcinogênico no homem, ação lenta sobre esporos podendo
levar 18 horas para destruição total das formas esporuladas, perda de atividade
quando os microrganismos estão envoltos com matéria orgânica, odor forte e
irritante para olhos e mucosas e presença de resíduo tóxico após o uso.
Esterilização por ácido peracético: O ácido peracético é uma mistura entre
água, ácido acético e peróxido de hidrogênio que atua oxidando a parede
celular dos microrganismos e oxidando elementos do interior dos mesmos,
danificando o sistema enzimático levando a morte. Possui como vantagem a
ação esporocida mesmo em temperaturas baixas e sua ação não é impedida
em presença de matéria orgânica.
Esterilização por peróxido de hidrogênio: O peróxido de hidrogênio possui
como registro de sua primeira comercialização no ano de 1800, desde essa
época, sua produção mundial aumenta a cada ano. Sendo utilizado na forma
isolada ou na forma combinada com outras substâncias, é um dos reagentes
mais empregados nos últimos tempos. Seu mecanismo de ação sobre os
microrganismos é causar desnaturação de proteínas e ruptura da
permeabilidade da membrana celular. A ação letal do peróxido de hidrogênio
22
depende: do tempo de exposição, da temperatura e da concentração do
mesmo. Em comparação com glutaraldeído, o peróxido de hidrogênio é
superior. O glutaraldeído possui: dificuldade de validação é um agente que
produz carcinogenicidade ao homem, requer alta umidade na área de
descontaminação, têm baixo poder de ação e necessita de tempo de ciclo de
descontaminação maior que o peróxido de hidrogênio, além de possuir poder
de aderência o que dificulta a sua retirada da área de trabalho. O peróxido de
hidrogênio é um agente oxidante superior ao cloro, dióxido de cloro e
permanganato de potássio. Através da catálise, o peróxido de hidrogênio pode
ser convertido em radical hidroxila (OH), com reatividade inferior apenas ao
flúor. Quando a ação desinfetante do peróxido de hidrogênio é comparada com
a ação do glutaraldeído, o peróxido é o que fornece melhores resultados,
sendo capaz de eliminar maior número de esporos de Clostridium
sporogenesem dispositivos médicos reutilizáveis. Os príons são um desafio nos
processos de descontaminação, mas estudos recentes demonstram a eficácia
do vapor de peróxido de hidrogênio contra os mesmos.
3.2.2. Métodos Químicos gasosos
O agente ativo geralmente utilizado no método de esterilização por gás é
o óxido de etileno (ETO- Ethylene Oxide). A vantagem do ETO é ser uma
sustância com grande poder de difusão e penetração, o que permite uma
ampla versatilidade na esterilização de materiais sensíveis ao calor. A
desvantagem do método é seu elevado custo e toxicidade, podendo provocar
reações locais em pele e mucosas, além de efeitos sistêmicos com
manifestações clínicas como dispnéia, cianoses, transtornos gastrointestinais,
hemólises, necroses e fenômenos mutagênicos. Devido aos efeitos adversos é
considerada uma substância de grande periculosidade, estando restrita ao uso
de operador habilitado. É um processo lento, que requer controle ambiental e
controle residual dos materiais. Não há indicadores químicos que passam
monitorar a concentração do ETO durante o ciclo de esterilização.
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3.3. Métodos Físico-Químicos
O método físico-químico consiste na associação de dois métodos, que
de modo geral são realizados a baixa temperatura. Podem ser por vapora baixa
temperatura com formaldeído ou por plasma de peróxido de hidrogênio.
3.3.1. Vapor a baixa temperatura com formaldeído (VBTF) ou gás de vapor de formaldeído (FO)
É uma alternativa à esterilização por ETO para a esterilização de
equipamentos e materiais que não resistem a altas temperaturas. As vantagens
são sua rapidez, ausência de resíduos tóxicos e fácil instalação. As
desvantagens são a incompatibilidade com materiais sensíveis a umidade e
sua toxicidade, sendo considerado potencialmente cancerígeno e mutagênico.
3.3.2. Plasma de peróxido de hidrogênio
Esse método usa peróxido de hidrogênio como precursor de plasma. O
plasma, que é considerado como um quarto estado da matéria, diferente do
líquido, sólido e gasoso, é composto por íons reativos, elétrons e partículas
atômicas neutras. As vantagens do método são a ausência de resíduos tóxicos,
fácil instalação, rapidez do processo e compatibilidade com materiais sensíveis
a umidade. As desvantagens são o reduzido poder de penetração, a
impossibilidade de esterilizar materiais derivados da celulose, e a necessidade
de emprego de pacotes especiais sem celulose em sua composição.
4. ESTERILIZAÇÃO NA INDÚSTRIA FERMENTATIVA
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4.1. Esterilização do Meio de Cultura
De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a
operação que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida,
animal ou vegetal, macro ou microscópicas, saprófita ou não, existentes no
meio considerado. O grau de esterilização dos meios de fermentação varia
conforme o processo a que se destina. Algumas vezes é totalmente
dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento biológicos
de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de
leveduras para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com
alto grau de exigência (produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona,
butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário (devido ao uso de
culturas puras).
Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a
esterilização. Pode ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação
(processo descontínuo) ou em separado (processo contínuo).
4.2. Esterilização em batelada:
Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para
destruir esporos), o tempo é calculado em função dos constituintes do mosto
(pH, material em suspensão, etc) e do tamanho do fermentador. Também é
necessário esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que
entram em contato direto com o fermentador.
• Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da
serpentina;
• Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve
estar livre de aditivos químicos.
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OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias
potencialmente tóxicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos
utilizados no processo de geração de vapor. Com injeção direta de vapor no
meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se
condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados.
Vantagem:
a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente,
evitando perigos de contaminações.
Desvantagem:
a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo
possíveis alterações no meio;
b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento;
c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido.
d) Elevado tempo ocioso do equipamento;
e) interações químicas com nutrientes
4.3. Esterilização Contínua
As principais desvantagens apresentadas podem ser evitadas pela
esterilização contínua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais
elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio esterilizados para
fermentadores de vários tamanhos. Uma etapa preliminar obrigatória nos
processos fermentativos contínuos, também tem valor nos processos em
batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para
o processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura
tomando bem menor o tempo necessário para a destruição de todos os
microrganismos quando temperaturas maiores são utilizadas.
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Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC
e na esterilização contínua normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a
140 ºC. O meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor
aumenta o volume do líquido, para resolver este problema o meio aquecido é
bombeado através de uma válvula de expansão e o condensado é removido
por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma
concentração de antes da esterilização. Pode se feita pela injeção direta de
vapor ou por meio de trocadores de calor.
Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande
parte da comunidade microbiana. É uma operação rápida utilizando
temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento. Para pequenas
quantidades de meio pode-se lançar mão da tindalização.
FIGURA 46: Esquema de esterilização contínua em trocadores de calor.
4.4. Destruição de Nutrientes
A esterilização do meio pelo calor pode acarretar alterações na sua
composição química. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a
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temperatura necessária para esterilização de um dado meio, menor será a
destruição de nutrientes e, consequentemente, melhores serão os resultados
da fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma
consequência de fato – observada experimentalmente – de ser a energia de
ativação de destruição térmica dos microrganismos maior do que a de
destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática,
tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de
alimentos.
4.5. Esterilização do Ar
As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão,
constituem os processos fermentativos de maior importância industrial
atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar introduzida no sistema é
grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a
esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser
tomados principalmente nas horas iniciais da fermentação.
A maior parte dos processos fermentativos é conduzida com agitação
vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estéril. O número de
partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do
movimento do ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido.
4.5.1. Métodos de Esterilização do Ar
Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização.
Radiações - Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém
pouco usada devido ao grande tempo de exposição. Pode ser usada em
pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua mais como desinfetante.
Filtração - É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior
aplicação na indústria. Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc.
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Os filtros podem ser de dois tipos principais:
Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos
(cartuchos de membranas de ésteres de celulose, nylon);
Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro) - Atua na combinação de
vários efeitos físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e
atração eletrostática.
REFERÊNCIAS:
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ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada – RDC 17/2010 : Seção VII - Tecnologia de isoladores.
CHICK, H., E MARTIN, C. J.: On the “Heat Coagulation of proteins. J. Phisiol, London, 40:404-430, 1910.
Farmacopéia Brasileira. Processo asséptico: Tecnologias alternativas para processo asséptico. Brasília: ANVISA; 2010, 5 ed.
PERKINS, JOHN J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, 2008.
PINTO TJA, KANEKO TM, PINTO AF. Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos: Controle de produtos estéreis ênfase nos processos assépticos tecnologia de isoladores. 3 ed. São Paulo: Atheneu; 2010.
POTTER, N.N.; HOTCHIKISS, J.H. Food Science. 5.ed. New York: Chapman & Hall, 1995. 608 p
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WYSS, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F. Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed. Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210
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