espectrometria de massa
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Identificao de protenas
atravs de espectrometria de
massamassa
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Proteomica
Durante o curso vimos que possvel realizar medidas de presena e abundancia de molculas de mRNA e deste modo realizar inferncias
sobre a presena de protenas que so os verdadeiros efetores da maioria
dos processos celulares.
Entretanto existem mecanismos ps-transcrionais que podem afetar o Entretanto existem mecanismos ps-transcrionais que podem afetar o nvel de protenas e que no so levados em conta quando medimos o
nvel de mRNAs
Os dados de mRNA do indicao de presena de uma protena, mas no do nenhuma informao sobre a localizao da protena dentro da celula.
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Proteomica
Existem metodologias utilizando espectrometria de massa que permitem a identificao de seqncias proticas a partir da medida de sua massa
A conjuno desta metodologia com tcnicas de separao de protenas permitem o estudo do contedo protico de um organismo, constituindo
assim a chamada proteomicaassim a chamada proteomica
Tcnicas de fracionamento celular permitem que diferentes pores da clula sejam separadas e que seu contedo seja determinado
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Proteomica
A separao de protenas pode ser
realizada atravs de mtodos
eletroforeticos ou cromatogrficos
Tratamento com proteases permitem
com que peptdeos de pequeno
tamanho sejam formadostamanho sejam formados
Analises com espectrometria de
massa permitem com que estes
peptdeos (e no a protena inteira)
sejam identificados
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Eletroforese em duas dimenses
Protenas podem ser separadas pelo seu ponto isoeltrico atravs de um
procedimento inicial de isoeletrofocalizao e depois separados em uma segunda
dimenso pelo seu peso molecular atravs de SDS-PAGE
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Eletroforese em duas dimenses
Exemplo de separao em eletroforese em duas dimenses.
Cada ponto representa uma diferente protena que possui PI e
peso molecular determinados
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Analise de gis 2D
Programas de reconhecimento de imagem detectam os pontos presente no gel e realizam analises densitomtricas, permitindo a comparao
entre diferentes amostras
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Espectrometria de massa
Molculas dos peptdeos so ionizadas utilizando
diferentes mtodos
Molculas ionizadas so aceleradas e diferentes aceleradas e diferentes
mtodos
espectrometricos podem
ser utilizados para
medida da sua massa
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Espectrometria de massa
Cada peptdeo gerar diversos picos devido a presena de istopos na
molcula. De modo geral, considera-se a massa monoisotopica como medida
da massa da molcula para analises posteriores
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Espectrometria de massa
No entanto para molculas muito grandes muito difcil detectar molculas com a
massa isotopica e por isso a massa mdia passa a ser considerada
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Analise de dados de MS
0
20
40
60
80
100
m/z
%T
IC
0
20
40
60
80
100
m/z
%T
IC
MRNSYRFLASSL
SVVVSLLLIPED
VCEKIIGGNEVT
PHSRPYMVLLSL
DRKTICAGALIA
KDWVLTAAHCNL
NKRSQVILGAHS
ITYEEPTKQIML
VKKEFPYPCYDP
ATREGDLKLLQL
LASSLSVVVSLLLIPEDVCEK
IIGGNEVTPHSR
PYMVLLSLDR
TICAGALIAK
DWVLTAAHCNLNKR
ITTTYEEPTK
QIMLVK
EFPYPCYDPATR
A partir dos dados experimentais das massas detectadas para os peptdeos possvel realizar analises comparando o espectro obtido com
os espectros tericos de protenas depositadas em bancos de dados
Apesar deste tipo de analise se til na identificao de protenas ainda podem existir casos muito ambiguos
m/zEGDLKLL
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Espectroscopia MS/MS
A espectrometria MS/MS permite a aquisio de maiores informaes sobre o
peptdeo pois inclui uma etapa adicional de coliso do fragmento que permite a
deteco de novos fragmentos formados a partir deste primeiro
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Espectroscopia MS/MS
a fragmentao dos peptdeos tende a ocorrer na ligao peptdica fazendo que se formem ons das series b e y.
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Espectroscopia MS/MS
Realiza seleo de
fragmento de tamanho
desejado
Cmara de coliso Deteco de fragmento
formados
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Espectroscopia MS/MS
Espectro inicial de massa passa a ter
espectros associados
ao resultado da
fragmentao do on
detectadodetectado
-
Espectro de fragmentao permite seqenciamento do peptdeo
Seqncia obtida muito curta para atribuio de funo- necessidade de
comparao com bases de protenas
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Shotgun proteomics
Abordagem que realiza uma tripsinizao de todas as protenas de um extrato protico e realiza posterior separao dos peptdeos gerados
atravs de tcnicas cromatogrficas
Tcnica muito mais simples que separao por eletroforese 2D, mas fornece menos informaes sobre a protena
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Busca em banco de dados
Uma analise em larga escala do proteoma de um organismo pode gerar entre centenas e milhares de espectros de massa.
Deste modo so necessrias ferramentas que permitam a interpretao e integrao destes dados
Programas do espectrmetro de massa j analisam o espectro e fornecem uma lista de valores que correspondem a massa apurada para cada on
Programas adicionais iro utilizar estas listas para procurar padres semelhantes em bancos de espectros tericos formados a partir de
bancos de dados de protenas
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Programa de busca em bases de dados a partir de um
conjunto de espectros de massa(verso web somente em
bases de dados predefinidas, verso local (Paga) tem
possibilidade de utilizar bases prprias)
MASCOT
Fornece escores de modo que possvel realizar uma
avaliao da significncia do resultado
Permite a integrao de dados em casos de buscas em
experimento de shotgun proteomics
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MASCOT
Modificaes existentes
Banco de dados a ser
procurado
Modificaes existentes
nos aminocidos
Taxa de tolerncia de erro
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MASCOT
Grfico de escore indica a probabilidade de que as protenas identificadas no so um
evento randmico na seo hachurada
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MASCOT
Resultado apresenta todos os espectros que podem ser associados a um peptdeo da sequencia descrita
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MASCOT
Seqncias em preto so aquelas que tem um rank maior que 1. Isto existe um peptdeo diferente no banco de dados que possui um escore
melhor em relao a esse espectro do que o mostrado aqui. Deste modo,
improvvel que este predio esteja correta
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