engenharia genÉtica biologia molecular andré fioravante guerra

ENGENHARIA GENÉTICABIOLOGIA MOLECULAR

André Fioravante Guerra

CONCEITOS

O QUE É DNA?

O QUE ELE FAZ?

PORQUE ELE É VITAL EM SERES VIVOS?

COMO PROMOVER MODIFICAÇÕES NELE?REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)TÉCNICA DE CLONAGEM (DNA RECOMBINANTE)SELEÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES

3

4

Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo

Cada base nitrogenada é ligada à molécula de açúcar formando um nucleosídeo

EXISTE UM ATOMO CENTRAL DE FOSFORO LIGADO A 4 ATOMOS DE OXYGENIO

5

Pirimidinas• Estruturas de anel único contendo 6 átomos C & N

Purinas• Estruturas da cadeias

cíclicas: Anel duplo• 5 e 6 C & N

Bases NitrogenadasQuatro bases de DNA

A= AdeninaT= TiminaG= GuaninaC= Citosina

U = uracil (RNA)

6

Açúcar Deoxiribose

DNA RNA

7

O QUE ELE FAZ???

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O “dogma central” da biologia molecular

Proposto por Francis Crick em 1958. Em 1970 publicado na revista Nature DNA codifica para produção de RNA RNA codifica para produção de proteina. Proteina não codifica para produção de proteina,

RNA ou DNA. O final nas palavras de Francis Crick

“Once information has passed into protein, it cannot get out again”.

Conceitos Básicos

• GENOMA: todo DNA existente num organismo

• GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional – proteínas – ou RNAs

COMO?

TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Dependente de fator protéico

ENVOLVE A PROTEINA rho

LOCALIZAÇÃO DO PROMOTOR

ATG

PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS

tRNA• tRNAs tem cerca de 80 bases, • Existem ao menos 31 no

citoplasma, 22 na mitocôndria. • Todos os tRNAs tem um braço

aceptor com uma sequência 3′ CCA, que é covalentemente ligada ao aminoácido. (A)

• Posuem um triplet anticodon que transientemente se liga ao mRNA. (B)

• A estrutura geral é denominada trevo (cloverleaf )

A

B17

AA

braço doanti-codon

tRNAAtivação dos aminoácidos

Amino acil tRNA sintetases: ligação dos aminoácidos à extremidade 3’ do tRNA de acordo com o anti-códon

AAs

Uma única amino acil tRNA sintetase liga umAminoácido a todos os seus tRNAs

Três passos na Tradução: Iniciação

1. A subunidade menor do rRNA se liga ao mRNA via sequência líder próxima ao start codon (AUG).

19

Código Genético

20

Tradução:

Molécula de mRNA

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

CysMetAla

5’ 3’

AspGlu

Phe His

Direção do avanço do ribossomo

Ribossomo

Proteína

tRNA

aa livre

codon

Gly

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

CysMetAla

5’ 3’

AspGlu

Phe HisGly

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Asp

MetAlaCys

5’ 3’

GluPhe HisGly

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Glu

MetAlaCysAsp

5’ 3’

PheGly

His

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Phe

MetAlaCysAspGlu

5’ 3’

GlyHis

Ile

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Gly

MetAlaCysAspGluPhe

5’ 3’

HisIle

Lys

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

His

MetAlaCysAspGluPheGly

5’ 3’

Ile

Lys

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Ile

MetAlaCysAspGluPheGlyHis

5’ 3’

Lys

G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A

Lys

MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle

5’ 3’

Leu

U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A

Leu

MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle

Lys

5’ 3’

Met

G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G

Met

MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle

LysLeu

5’ 3’

Asn

G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C

Asn

Met AlaCysAspGluPheGlyHisIle

LysLeuMet

5’ 3’

Pro

U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A

Pro

Met Ala CysAspGluPheGlyHisIle

LysLeuMetAsn

5’ 3’

Gln

G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A

Gln

Met Ala Cys AspGluPheGlyHisIle

LysLeuMetAsnPro

5’ 3’

C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A

Met Ala Cys Asp GluPheGlyHisIle

LysLeuMetAsnProGln

5’ 3’STOP

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A A A A

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

HisIle

Lys Leu

Met Asn

Pro Gln

5’ 3’STOP

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

HisIle

Lys Leu

Met Asn

ProGln

5’ 3’STOP

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

His Ile Gln Lys

Pro LeuAsn Met

5’ 3’

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet

Gly His

Ile Gln Lys

Pro LeuAsn Met

5’ 3’

A U A A A A U U A A U G A A C AA A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet

Gly His

Ile Gln Lys

Pro LeuAsn CYS

5’ 3’

Muda aforma e função

VARIAÇÃO GENÉTICA=POLIMORFISMO

A replicação in vivo

• Replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´

• Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’

• Como ocorre então a replicação nos dois sentidos?

Forquilha de replicação do DNA

Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação (rica em A-T) participam da ligação da DNA helicase ao DNA

A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”.

As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper

As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de umas proteínas as Single-strand binding proteins – SSBP’s

História do PCR

Em 1993, Kary Mullis, um químico ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método em 1985 que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA.

Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491

PCR

• Qual é o objetivo?Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima

• Quais os componentes?Mg2+

DNA Polimerase

dNTP

Primers

Termociclador

• Como na técnica de PCR se encontram vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento

Uma reação típica de PCR

Sterile Water 38.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2 (50mM) 2.5 uldNTP’s (10mM each) 1.0 ul PrimerFWD (25 pmol/ul) 1.0 ul PrimerREV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ul

Total Volume 50.0 ul

• Molécula de DNA obtida através da junção de dois ou mais fragmentos de DNA

O que é uma molécula de DNA recombinante?

5’- -3’ 5’- -3’

5’- -3’

• O que é clonagem?• Utilização da reprodução assexuada para obter organismos que

são geneticamente iguais entre si e ao organismo parental

Clonando um gene

Seleção Reprodução assexuadaIsolamento

• O vetor• O DNA inserido não é replicado na célula a menos

que esteja recombinado com DNA cromossômico ou inserido em replicon (elemento genético capaz de replicação autônoma) extracromossômico.

• Replicons são reconhecidos como substratos por enzimas da célula responsáveis pela repli-cação (ou vetores)

• Podem ser usados para carregar DNA recom-binante, permitindo sua replicação• O tipo mais comum de vetor sãoos plasmídeos

Clonando um gene

20min

20min

Após 30 gerações (10h) haverá 1x 109 cels

• Endonucleases altamente específicas, conhecidas como enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios precisamente definidos.

• Fragmentos são gerados por cortes nos sítios de restrição no fragmento de DNA e no vetor

• DNA ligases podem unir os fragmentos acima para obter a molécula de DNA recombinante

Clonando um gene

• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?

Genes estão presentes em regiões contínuas de DNA cromossômico e não aparecem perfeitamente delimitados por sítios de restrição. Como conseguir o fragmento específico contendo o gene de interesse?

• Há basicamente 3 possibilidades:– DNA sintético– PCR (RT-PCR)– Triagem de Bibliotecas genômicas ou de cDNA

Clonando um gene

• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?

Fragmentação mecânicaOu enzimática

Vetores

•Plasmídeos• Sítio de clonagem múltipla (MCS)• Marcadores de seleção• Alfa-Complementação (hospedeiro Lac-)

Tecnologia do DNA recombinante

Gene produtor de toxina