elisa: quantificação de proteínas e moléculas

Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

Sistema Duplo-Híbrido de Levedura

Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA

Sistema Híbrido-Simples

Sistema Híbrido-Simples

Sistema Híbrido-Simples

Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe 103675 chloramphenicol: [active] 100mM, Sigmaanisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789

2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM,

1. Reagents interacting with DNA*(a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards(b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes

Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide(c) Intertwining agents Distamycin, Netropsin2. Analogues of bases, Acyclovir ,Adenine /3‑1‑D‑arabinoside, Amethopterin

Aminopterin, 2‑aminopurine, Aphidicolin, 8‑azaguanine, Azaserine6‑azauracil, 2'azido‑2'‑deoxynucleosides, 5‑bromodeoxycytidineCytosine /3‑1‑D‑arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides5‑fluorodeoxycytidine, 5‑fluorodeoxyuridine, 5‑fluorouracil, Hydroxyurea6‑mercaptopurine

3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid

4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine

GFP: green fluorescent protein

Microscopia confocal: estudo das células vivas

Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizandoA actina fundida a proteína gfp

Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo

Invaginações e dinâmica do núcleo

Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmáticoNas plantas transgênicas expressando gfp

Luciferinas

Luciferinas

Luciferinas

Luciferinas

Luciferinas

Promotor da GA20 ox fundido

ao gene da luciferina

Pulverização comluciferina

Planta transgênica

Câmera CCDpara fluorescencia:::superimposição de

imagens

Luciferinas: uso simultâneo de diferentes

Luciferinas: Uso

Luciferinas: Uso

Luciferinas: Uso

Aequoporina:

Estudo das alterações na Concentração de cálcioIn vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo

Frio: “manchas” de aumento de calcioem resposta a baixas temperaturas

Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular

Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a tera fluorescência no mesmo comprimento de onda

2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados

Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+:

Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)

Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+:

Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano)

Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo apósadição do fluoróforo

Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômatoFluoróforo indo-1

Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade

Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastosda camada de aleurona da cevada

Estudo da expressão diferencial dos genes:

Confecção de Bibliotecas de Subtração

Checando a eficiênciada subtração

Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico

Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)

Mapeamento de genesEstudo da estrutura do cromossomaEstudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.

Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged)

NucleotídeosQueladoresMensageiros secundáriosPeptídeos

Canais de Ca2+ queRespondem ao IP3 no estômato, pólem, etc.

Manipulação de cálcioEnjaulado: calcio controla

a orientação de crescimentodo tubo polínico

(crescimento só no ápice)

Efeito da liberação do ABA “enjaulado” após microinjeção em células-guarda

Formas de enjaular um peptídeo ou proteína

Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis

Phiscomitrella

Phiscomitrella

Phiscomitrella

Phiscomitrella

GFP-talina

Estudo da Estrutura de um promotor

1) Análise por deleção

Estudo da Estrutura de um promotor

2) Análise por mutagênese

Estudo da Estrutura de um promotor

3) Análise por transativação