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Diagnóstico de Trombocitopatías por CF

Dra. Fabiana Alberto

Departamento de Hemostasia y Trombosis

Instituto de Investigaciones Hematológicas

Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires

HEMOSTASIA

Conjunto de mecanismos fisiológicos que aseguran el mantenimiento de la integridad del sistema vascular frente a la injuria.

La hemostasia involucra:

PROTEÍNAS DE LA COAGULACIÓN (PROTEÍNAS PLASMÁTICAS SOLUBLES)

PLAQUETAS (ELEMENTOS FORMES EN SUSPENSIÓN)

ENDOTELIO VASCULAR (SUPERFICIE QUE LIMITA LA VASCULATURA)

Es un proceso dinámico, localizado en el sitio de injuria, gracias al balance entre mecanismos de activación e inactivación que actúan de manera coordinada.

Flujo laminar

Regulación de la presión sanguínea y distribución del flujo.

MICROCIRCULACIÓN

Zona de alta fuerza de cizallamiento (shear stress)

Sección

MICROCIRCULACIÓN

Capilares

Arteriola

Vénula

ESPONTÁNEO

EVALUACIÓN DEL SANGRADO

Cutáneo-mucoso

SITIO

FXIII

Articular o muscular SNC - cordón umbilical

VW

Trombocitopenia

Trombocitopatías

Hemofilia A / B

VW tipo 3

Déficit severos

Coagulograma normal o alterado Coagulograma alterado Coagulograma

normal

POST-QUIRÚRGICO

Borbotones

EVALUACIÓN DEL SANGRADO

TIPO DE SANGRADO

Babeo Plaquetas o VWD

Napa, coágulo deficiente Fibrinolisis

Sutura

MOMENTO

Inmediato o precoz

Tardío

Plaquetas, VWD, factores

FXIII, Fibrinógeno, 2 AP

Plaquetas

-Pequeñas células anucleadas (diámetro 2 m, volumen 7-9 fl)

- Concentración promedio en sangre 150 - 400 x 109 / l

- Derivan de la fragmentación de los megacariocitosde médula ósea

- Circulan en condiciones de reposo con apariencia de una lenteja.

- La integridad funcional del endotelioasegura el estado de reposo graciasa la producción de PGI2 y NO.

Plaquetas

- Producción en condiciones fisiológicas:1011plaquetas / día

- Tiempo de vida media: 12 días

- Trombopoyetina (TPO) regula la producción.

- Síntesis de TPO: hígado, médula y riñón.

- Eliminación de TPO: por unión de alta afinidad sobre receptores plaquetarios y megacariocitos.

- La producción puede aumentar hasta 10 veces si hay aumento de la destruccióno consumo.

Plaquetas jóvenes tienen mayor volumen plaquetario

ESTRUCTURA INTERNASistema canalicular conectado a superficie

Microtúbulos

Gránulos alfa

Gránulos densos

Glicógeno

Mitocondrias

MALLA DE ACTINA

G-Actina (Monomero Globulares)

F-Actina (Filamentos)

Filamina A (ABP-280), talina, K-actina,

miosina I y II

CITOESQUELETO

MICROTÚBULOS

Proteínas Adhesivas : VWF, Fg, Fn Vn, TSP-1, laminina-8

Proteínas-Coagulación : FV/Va, multimerin, FXI, proteína S,

HMWK,antithrombina

Proteínas Fibrinoliticas : Plasminogeno, PAI-I osteonectina, 2-antiplasmina, TAFI

Gránulos alfa

- VEGF- bFGF- EGF- PDGF- EGF- MMPs

Distintas poblaciones de gránulos alfa

PROTEINAS ANGIOGENICAS

PROANGIOGENICA ANTI-ANGIOGENICA

- Endostatina- PF4- Thrombospondin-1-2-macroglobulina- PAI 1- Angiostatina

Kisucka J et al, 2009

FACTORES DE CRECIMIENTO

GRANULOS DENSOS

ADP, ATP, SEROTONINA, HISTAMINA Ca 2+…

GP Ic´-IIa

GP Ic-IIa

GP IIb-IIIa(receptor de fibrinógeno,

vWF)

GP Ia-IIa(receptor de colágeno)

GP Ib-IX-V(receptor de vWF)

GP VI-FcR(receptor de

colágeno)

Receptores de ADP

(P2Y1-P2Y12)

Receptores de ADR

(alfa-beta)

Receptores de tromboxano

Receptores de trombina(PAR1-PAR3)

ACTIVACION

RECEPTORES PLAQUETARIOS DE MEMBRANA. Glicoproteínas . Receptores de siete dominios de transmembrana

INTEGRINAS

GP Ib-IX-VGP VI GP Ia-IIa

Secreción de gránulos

Síntesis de Tx

Cambios en el citoesqueleto

Activación de la integrina

Iniciación: captura, adhesión, activación

Woulfe DS, 2005

Extensión: cohesión y secreción

GP IIb-IIIa

GP IIb-IIIa

“La vía final común: activación de la integrina IIb-IIIa”

Iniciación: captura, adhesión, activación

Respuesta plaquetaria a la injuria

Extensión: cohesión y secreción

Perpetuación: estabilización del trombo

Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo para lograr una respuesta óptima a la injuria

Vo

lum

en d

el t

rom

bo

Crecimiento descontrolado(hipercoagulabilidad)

Hemostasia

Estabilidad insuficiente

Oclusión

Respuesta óptima

Falla para formar un trombo estable

Riesgo de sangrado

Riesgo de trombosis

Tiempo

Regulación del crecimiento del trombo y estabilidad para alcanzar una respuesta óptima frente a la injuria

Journal of Thrombosis and Haemostasispages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f3

FlujoCapa externa, permeable, plaquetas ligeramente adherentes

Zona relativamente permeable, plaquetas con grado variable de activación

Capa interna, impermeable de plaquetas degranuladas

Journal of Thrombosis and Haemostasispages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f2

Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo

IIa

TXA2

ADP

ADR

GP VI

GP Ib-V-IX GP Ia IIa

GP IIb IIIa

Anormalidades plaquetarias (trombocitopatías)

- de los receptores para proteínas adhesivas

- de los receptorespara agonistas solubles

- de los gránulos

- de los mecanismos de transducción de señal

- de los fosfolípidos pro-coagulantes

- de las proteínas del citoesqueleto

- misceláneas, desórdenesno caracterizados

Agonistas de uso común:

ADP (2.5-5.0 µM)

ADR (10.0 µM)

Colágeno (1.0 µg/ml)

Acido araquidónico (0.5 mM)

Ristocetina (0.5 y 1.2 mg/ml)

Agonistas especiales:

TRAP, activador del receptor de IIa (10.0 µM)

U46619, análogo del tromboxano, (1.0 µM)

Ionóforo de calcio (1.0 µM)

Agregometría

% de agregación máxima

ADP

ADR

colágeno

AA

AJUSTES BÁSICOS DEL SOFTWARE

ADQUISICIÓN

ESCALA DE FCS/SSC UMBRAL DE FCS

10000 eventos

CELL-QUEST

ACTIVACIÓN PLAQUETARIA: CAMBIO DE FORMA Y AGREGACIÓN.

Plaquetas sin estimular

Plaquetas agregadas

Ausencia de agregados

Plaquetas estimuladas con ADP

Plaquetas estimuladas en presencia de un antiagregante

CITOMETRÍA DE FLUJO

RECEPTORES DE SUPERFICIE

MARCADORES INTRAPLAQUETARIOS

MARCADORES DE ACTIVACIÓN

FUNCIONALIDAD y …………..

TOMA DE MUESTRA - 5 mL ANTICOAGULANTE (CITRATO DE Na, ACD, EDTA-SO4Mg )

SE PRP PL

TRAZADORES + 45L BUFFER + 5L PLAQ. FLUORESCENTES

FIJACIÓN y DILUCIÓN

DILUCIÓN100.109 PLAQ/L

ESQUEMA BÁSICO DE MARCACIÓN

. GP IIb/IIIa: Tromboastenia de Glanzmann

. GP Ib-V-IX: - Bernard-Soulier

- von Willebrand tipo plaquetario

. GP Ia/IIa

. GP VI

. GP IV

Trombocitopatías hereditarias

Anomalías de los receptores para proteínas adhesivas

ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa

• Ausencia del receptor en superficie

• Disminución del número de receptores

• Incapacidad de fijar Fibrinógeno

• Retracción del Coagulo anómala

GLICOPROTEINA IIb-IIIa• Heterodimero calcio dependiente• Integrina mas abundante en superficie• Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina

TROMBOASTENIA DE GLANZMANN

IIHEMA-ANM

Agregación ADP 5 μM (TG)

Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml (TG)

TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN: MARCACION EN SUPERFICIE

MM MM

KG

KG

RETRACCION DEL COAGULO (TG)

CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA CytoQuantTMGp ( Stago)

Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH

Histogramas de fluorescencia

A

B

C

D

Mo

lécu

las

de

G

p/p

laq

.

IMF

Marker Media Nº GP/esferasM1 (D) 1201 63000M2 (C) 466 19000M3 (B) 112 4500M4 (A) 8 350

Leytin V, 1996

CD 61 (IIIa)densidad de expresión de CD 61

1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.501.5

2.0

2.5

3.0Paciente

Normal

Best-fit values Slope Y-intercept X-intercept 1/slope95% Confidence Intervals Slope Y-intercept when X=0.0 X-intercept when Y=0.0Goodness of Fit r² Sy.x

normal

0.6948 ± 0.018821.204 ± 0.03258-1.7331.439

0.6138 to 0.77571.064 to 1.344-2.186 to -1.374

0.99850.01657

paciente

0.6429 ± 0.028941.285 ± 0.04456-1.9991.555

0.2752 to 1.0110.7189 to 1.851-6.697 to -0.7147

0.99800.01488

log FSH

log F

L1

Relación de densidades

Dn: anti-log 1.204 = 16.0Dp: anti-log 1.285 = 19.3Dp/Dn x 100: 19.3/16.0 x 100 = 120%

NegativeIIb-IIIa controlIIb-IIIa Patient

Negative Patient

1 st

2 nd

3 rd

Before surgery

1 st

2 nd

3 rd

After surgery

13-05-2005-BORDEAUX

Monitoreo terapia de reemplazo con concentrado de plaquetas, previo a cirugía, en paciente con TG.

Plaquetas de tamaño pequeñoPlaquetas de tamaño pequeño

. Síndrome de Wiskot-Aldrich. Síndrome de Wiskot-Aldrich

. Trombocitopenia ligada al cromosoma X. Trombocitopenia ligada al cromosoma X

Plaquetas de tamañoPlaquetas de tamaño normalnormal

. Trombocitopenia amegacariocítica congénita. Trombocitopenia amegacariocítica congénita

. Trombocitopenia autosómica dominante. Trombocitopenia autosómica dominante

Plaquetas de tamañoPlaquetas de tamaño grandegrande

.Síndrome de Bernard Soulier.Síndrome de Bernard Soulier

.Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, .Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)

.Síndrome de plaquetas grises.Síndrome de plaquetas grises

.Macrotrombocitopenia del Mediterráneo.Macrotrombocitopenia del Mediterráneo

.Pseudo von Willebrand o von Willebrand.Pseudo von Willebrand o von Willebrand tipo plaquetariotipo plaquetario

TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIASTROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS

macroplaqueta

plaqueta normal

Macroplaquetas en trombocitopenia

BERNARD SOULIER

•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V

•Autosómico recesivo, infrecuente

•Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3

•Sangrado moderado a importante

•Trombocitopenia

•Plaquetas de mayor tamaño y deformables

•Sobrevida plaquetaria acortada

BERNARD SOULIER

• Tiempo de sangría prolongado

• Adhesividad ausente

• Agregación ausente con Ristocetina, Botrocetina y von Willebrand bovino

GP IX CD42a

• Antígeno CD42 GP Ib CD42b y CD42c

GP V CD42d

Paciente de 6 años, sexo femenino, que consulta por trombocitopenia crónica.Epistaxis desde el año y medio de edad, bilateral, con internación y requerimiento transfusional. Hematomas fáciles. No hubo sangrado con caída del cordón umbilical. Sin antecedentes de consaguinidad.

Dispersión frontal- Tamaño (FSH)P: 202Madre: 65Control: 47

P

P

P

CD42-b (GP Ib)(IFM)P:25Madre: 171Control: 257Relación CD42b/FSHP: 0.12M: 2.6C: 5.5

CD61 (GP IIIa)(IFM)P: 389Madre: 176Control: 167Relación CD61/FSHP: 1.93M: 2.7C: 3.6

Paciente

Madre

Síndrome de BERNARD SOULLIER

CD42-b

CD61

27/05/1987. Paciente de 52 años, sexo masculino, que consulta por hemorragia post extracción dentaria que requirió internación y transfusión en 1960. Presentaba sangrado profuso por heridas. En su familia una hermana presentaba epistaxis. Sus dos hijos no tenían manifestaciones de sangrado.Los estudios mostraron TS cohibido a los 10 minutos, leve trombocitopenia, ausencia de agregación con ristocetina que no corrigió con PN. Debe operarse de vesícula.Diagnóstico: trombocitopatía severa con sospecha de síndrome de Bernard-Soulier.

5/08/2008. El paciente no se operó ni se atendió en ningún centro durante este período.

Recuento de plaquetas: 124.000 mm3

Citometría

Paciente: 114 media FSH

Control normal: 49 media FSH

Citometría

CD42b: dos poblaciones con diferente nivel de expresión de Ib, una que representa 70% del total de las plaquetas del paciente con 22% de densidad respecto del normal. La segunda población (30%), con 4% de densidad respecto del normal

CD61: idéntico nivel de expresión respecto del normal

GP Ib-V-IX:

- von Willebrand tipo plaquetario (PT-VWD)Desordem hemorrágico, raro, autosómico dominante, debido a una mutación en GP Ib que produce una aumento de afinidad por el facotr de von Willebrabd (VWF). Con frecuencia se diagnostica mal como VWD2B por las similitudes entre estas condiciones.

Trombocitopatías hereditarias

Giannini S, 2010

Agregación con ristocetina

Unión de VWF a plaquetas en presencia de concentraciones crecientes de ristocetina.Azul: PRP normal + ristocetina 1.2 mg/mlRojo: PRP de paciente con VWD-PTGris: PRP de pacientes con VWD-2B (n:4)

Ensayos de mezclas para agregación y CF

Unión de VWF a plaquetas en presencia de de ristocetina 1mg/ml en mezclas de plaquetas lavadas y plasma.

Rojo: plaquetas lavadas control + plasma control

Verde: plaquetas lavadas control + plasma paciente

Negro:Plaquetas lavadas paciente + plasma paciente

Azul: plaquetas lavadas paciente + plasma del control

Giannini S, 2010

IIHEMA-ANM

Relacionadas al MYH9 Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)(Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)

TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIASTROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS

Dispersión frontal- Tamaño (FSH)P: 152Control: 66

CD42-b (GP Ib)(IFM)P: 145Control: 63

Relación 42b/FSHP: 0.95C: 0.95

CD61 (GP IIIa)(IFM)P: 463Control: 168

Relación 42b/FSHP: 3.04C: 2.54

P

P

P

MYH9 ?

CD42-b

FSH

CD61

Hipótesis de sangrado en MYH9

Densidad de expresión de glicoproteínas en macrotrombocitopenias

CD41CD61

CD61

Paciente: negroNormal: blancoControl negativo: gris Gresele P et al. Haematologica 2009;94:663-669

El análisis molecular revela una nueva mutación en el gen de β3 que determina una deleción, produciendo la pérdida de los aminoácidos 647-686 del ectodominio de la integrina β3.

. Déficit de gránulos densos: déficit de pool de depósito, Hermansky- Pudlak, Chediak Hygashi, TAR, Wiskott-Aldrich.

. Déficit de gránulos alfa: Gray, White, Quebec, Paris-Trousseau-Jacobsen.

. Déficit combinado alfa y densos

Trombocitopatías hereditarias

Anomalías de los de los gránulos plaquetarios

FgVw

ADPATP

GP

MARCACION INTRAPLAQUETARIA

PRP (300.000/ul) 5 ul en 50 ul de tampón isotónico

PRP, SE (EXTRACCIÓN CON EDTA 2% o CITRATO)

MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mM CF)

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ.

40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.

INCUBACIÓN-40min

LAVADO

CITÓMETROMEPACRINA

NORMAL

MEPACRINA

PACIENTENEGATIVO

SuperficieIIb

SuperficieIIIa

TotalIIb

TotalIIIa

Control depermeabilizaciónCD63

FIJACION PFA 1%10 min

MARCACION INTRAPLAQUETARIA

FgVw

ADPATP

GP FgVw

ADPATP

GP

PERMEABILIZACION SAPONINA 1%

Marcación:

- CN adecuados

- Controles positivos de permeabilización

SÍNDROME DE GRAY

IIHEMA-ANM

Nurden, P. et al. Blood 2004;104:107-114Nurden, P. et al. Blood 2004;104:107-114

a-Fg INTRAPLAQUETARIO

control PACIENTE

Anomalías en las vías de transducción de señales

. Anomalías en la vía del AA/ tromboxano A2

. Defecto en la movilización del Ca 2+

. Deficiencia en proteínas G (GQ)

. Defectos en la fosforilación de

plecstrina y metabolismo

del fosfatidilinositol…

ect, ect, ect

Trombocitopatías hereditarias

Orai 1

Ca 2+

RE

Ca 2+

Ca 2+Ca 2+

IP3-R

PLC

PIP 2

IP 3 DAG+Ca 2+

PKCCALDAG-GEFI

RIAM

Rap1 GDP

Rap1 GTP TALIN

KLENDIN3

AGONISTA

TALINKLENDIN3

MOVILIZACION DE CALCIO

MOVILIZACION DE CALCIO

Sbrana S, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 74B:30–39 (2008)

Adquisición de las muestras

Escala lineal:• para intervalos regulares• apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)

Escala logarítmica:• para intervalos crecientes• cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000)

MOVILIZACION DE CALCIO

MOVILIZACION DE CALCIO METODOLOGÍA:PL en Buffer conCa2+ ( 1mM)Incubación con FURA-2Lavado, Resuspensión

Control positivo: ionóforo de calcio

Evitar el exceso de marca: - disminuye la sensibilidad - puede resultar en compartimentalización del colorante

Sin estímulo

Col 1g/mL

Col 8g / mL

IIHEMA-ANM

Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3

BUFFER + Thr

HT + Thr

BERMEJO E et al, 2003

Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3

MOVILIZACION DE CALCIO

. Receptor de tromboxano A2

. Receptor adrenérgico

. Receptor del ADP, P2Y12

Trombocitopatías hereditarias

Anomalías de los receptores para agonistas solubles

PGE1

AMPc

VASP VASP-P

PLAQ. ACTIVADAS PLAQ. INHIBIDAS

PKA

ACADP P2Y12

REACTIVIDAD DEL RECEPTOR P2Y12KIT-BIOCYTEX-CF

MULLER i, 2003BARRAGAN P, 2003

Anticuerpo anti VASP-P

Flow cytometric analysis of intraplatelet VASP phosphorylation for the detection of clopidogrel resistance in patients with ischemic cardiovascular diseases

( IFM PGE - IFM PGE+ADP )X100 = IRP

IFM PGE.

J Thromb Haemost 2005

J Thromb Haemost 2005

J Thromb Haemost 2010

DIAGNOSTICO: alteraciones en el receptor de P2Y12

TERAPÉUTICA: resistencia al clopidogrel

Placa

Activación plaquetaria asociada a cambios en el flujo

Flujo estenótico

Desaceleración

AceleraciónTurbulencia

Activación plaquetaria asociada a endotelio activado

Marcadores de activación plaquetaria

Michelson AD (Platelets, Second Edition)

Marcadores de activación plaquetaria

Aplicación de la citometría de flujo

Marcadores de activación plaquetaria:

- expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo)

CD62PP-selectina

golll

Condiciones analíticas de difícil estandarización:

- anticoagulantes- tiempo de ensayo- controles negativos adecuados- expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia)- escasas referencias de CV intra einterensayo

IMF

% positivos

Controls Patients Controls Patients Controls Patients0

5

10

15

20

CD62 CD63 B-FG

%p

osi

tive

pla

tele

ts

BERMEJO et al, Blood Coagul Fibrinolysis 2004; 15:1–6

RESULTADOS EN SMP (TE, PV)

CINETICA DE UNIÓN

AGONISTAS: ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP

DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs

DE ACTIVACION: CD62P, CD63

IIHEMA-ANM

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

% d

e p

osi

tivi

dad

IFM PAC-1 (SPD)

IFM PAC-1 (trombocitemia)

IFM PAC-1 (normal)

IFM PAC-1 (aspirina)

Tiempo (minutos)

Marcadores de activación plaquetaria

Activación de las plaquetas in vitro con agonistas en concentraciones sub-umbral para evidenciar hiperreactividad plaquetaria

trombocitemia

normal

SPD

aspirina

Inflamación y hemostasia son procesos íntimamente ligados. Cada uno propaga e intensifica al otro. Cuando fallan los mecanismo de control, se genera el potencial para un círculo vicioso de trombogénesis e inflamación.

Hipercoagulabilidad e inflamación

DNA CD66b CD42

DNA CD66b CD42

AGREGADOS MIXTOS PLAQ-LEUCO

AGREGADOS MIXTOS PLAQ-LEUCO: ACTIVACION CON TRAP

MICROPARTICULAS PLAQUETARIA: <1 μm/Annexin V+

Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,

anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

Tomer A, 1999

- Factor plaquetario 4- Anexina V

Tomer A, 1999Anexina V

Control positivo

Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,

anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

Tomer A, 1999

Especies reactivas del oxígeno (ROS): 2’-7’ diclorofluoresceína diacetato (DCF), liposoluble, pierde los grupos acetato en el interior de la célula, no puede salir, no fluorescente, cuando se oxida por efecto de los ROS emite fluorescencia en canal verde.

Glutatión reducido (GSH): mercury orange, se une de manera covalente a sulfidrilos(grupos(R–SH), emite fluorescencia en canal rojo.

Generación de ROS y contenido de GSH de plaquetas normales y talasémicos

Amer J, 2004

CD41 (IIb)

DETERMINACIÓN DE ROS / GSH

M1

M1

50M1

92 M1

IFM 230

M1

IFM 170IFM 3

ROS- DCF-2-7-DICHLOROFLUORESCIN ACETATE

PROTOCOLO-1 MARCAR CON DCF-2 LAVAR-3 TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)

GSH-MO-MERCURY ORANGE

PROTOCOLO-TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)-MARCAR CON MO-LAVAR

PL+ H2O2 + HON

PL + H2O2 + BUFFER

PL+ H2O2 + HON PL + H2O2 + BUFFER

CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerpos que reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa

TROMBOCITOPENIA INMUNE

2Pool de superficie

(IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas,

unión de anticuerpos naturales que reconocen estructuras

modificadas sobre plaquetas viejas.

IgG

PLAQUETAS NORMALES

1Pool intraplaquetario

(IgG totales plaq.)20.000 moléculas

gránulos plaquetarios,adquiridas por pinocitosis

INMUNOGLOBULINAS

METODOLOGIAS

•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES

•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :

inmuno-radiometría

inmuno-fluorescencia directa

MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)

Apectos metodológicos

-Obtención del plasma rico en plaquetas

- Lavado de plaquetas

-Anticuerpos: marcadores de población CD 41, CD 42,empleo de Ac anti-Igs F(ab)2

-Controles: control negativo de marcación, procesamiento en paralelo de por lo menos dos muestras normales

-Expresión de resultados: -IFM ajustando a región de FSH constante-2-INDICE: IFM / FSCH

-Valores de corte: IgG 11.0 IFM, IgM 6.0 IFM

M1

Media: 36

M1

Media: 92CD41+

Control normal

Paciente

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo

M1

M1

Paciente

Control normal

Negativo3 IFM

IgG10 IFM

IgG34 IFM

IgM3 IFM

IgM31 IFMNegativo

3 IFM

Caso clínico:

Paciente de sexo femenino de 81 años con antecedentes de psoriasis que comienza hace un año con hematomas fáciles en miembros y tronco, sangrado en lesiones descamativas y episodios frecuentes de epistaxis que requieren en varias oportunidades tratamiento con taponamiento y cauterización. Derivada con diagnóstico presuntivo de Tromboastenia de Glanzmann.No tiene antecedentes de hemorragia post parto ni post exodoncia.TAC de cuello, tórax, abdomen y pelvis, proteinograma electroforético pendientes.

FechaFecha PlaquetasPlaquetas TSTS(Ivy)

AdhesAdhes..

LisisLisis TTPATTPA TP VIII vWF:Ag

vWF:RCo

22-11-11 239 x 109/L

2 min 8% 140 min 42 90% 110% 175% 154%

23-02-12 245 x 109/L

- - - - - - - -

05-03-12 237 x 109/L

18 min

(cohibido)- - - - - - -

Laboratorio IIHEMA

Agregación 22-12-2011

Agregación 22-12-2011

Liberación disminuida

Paciente derivada de otro centro que reporta un estudio de agregación tipo Tromboastenia de Glanzmann…

Se convirtió en un SPD ????

Liberación disminuida

Agregación 23-02-2012

Volvimos al Glanzmann ???

Liberación disminuida

Liberación disminuida Cambio de forma

Cambio de forma

Citometría de flujo

Paciente

FSH: 47 (media)CD 41 (GP IIb): 103.2 IMFCD 61 (GP IIIa): 156.3 IMFCD 42b (GP Ib): 198.7 IMF

Control normal

FSH: 56 (media)CD 41 (GP IIb): 100.9 IMFCD 61 (GP IIIa): 173.0 IMFCD 42b (GP Ib): 180.0 IMF

Tromboastenia de Glanzmann

Retracción Retracción coágulocoágulo

GP IIbIIIaGP IIbIIIa Fibrinógeno Fibrinógeno plaquetarioplaquetario

Tipo I ausenteausente ausenteausente ausenteausente

Tipo II disminuidadisminuida > 5%> 5% 30-60%30-60%

Variantes Alt.cualitativasAlt.cualitativas

- Hereditarias

- Adquiridas

Agregación 05-03-2012

Trombastenia de Glanzmann !!!

Agregación 05-03-2012

Estudio de mezclas paradetectar efecto inhibitorio

Partes iguales de PRP normaly PPP paciente.

Partes iguales de PRP normaly PPP normal no autólogo (control).

Plasma control

Plasma paciente

Plasma paciente

Plasma paciente

50%PRP N + 50%PPP paciente

50%PRP N + 50%PPP N (no autólogo)

Inhibición de agregación enPRP normal

0 10 20 30 40 50 600

25

50

75

100

6.25%

12.5%

25%

50%

%PPP paciente en la mezcla

% in

hibi

ción

agr

egac

ión

max

ima

Inhibición dosis-dependiente, No potencia con incubación (1hora 37º)

Agregación 05-03-2012

Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 05-03-2012Marcación directa sobre plaquetas lavadas con anti-IgG humana, anti-IgM humana. Selección de la población que marca para CD42 (GP Ib).

R2R1

Control Paciente

anti Ig-G anti Ig-G

CD42+ CD42+

anti Ig-Manti Ig-M

10.4 IMF176.5 IMF

R1R2

Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 08-03-2012Marcación indirecta: plaquetas normales enfrentadas a plasma del paciente o plasma normal no autólogo, lavadas y resuspendidas medio tamponado. Luego marcación con anti-IgG humano o anti-IgM humana. Selección de la población que marca para CD42 (GP Ib).

anti Ig-G 240 IMFanti Ig-G

23 IMF

anti Ig-Manti Ig-M

Plaq normalesPlasma control

CD42+Plaq normalesPlasma paciente

CD42+