diagnóstico das leucemias na infância

Diagnóstico das Leucemias na Infância

Dra. Maria Lúcia de Martino Lee

Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM

Desenvolvimento das Técnicas de Coloração

• EHRLICH - 1877 NEUTRÓFILOS

Descrição morfológica das leucemias

BASÓFILOS

ACIDÓFILOS ( Eo)

SÉCULO XX

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

Técnicas convencionais: morfologia e citoquímicaImunofenótipoCitogenética convencionalGenética molecular.Expressão genética/proteica.

Reconhecimento

da heterogenecidade das leucemias

SECULO XXI

• Reconhecimento subgrupos biologicamente homogeneos

• Identificação fatores prognósticos

• Delineamento de tratamentos mais específicos

Diagnóstico e Classificação

• Diagnóstico + classificação precisos = Essenciais para o estudo biológico e o sucesso terapêutico das leucemias infantis;

• Sistema de classificação ideal deve ser biologicamente relevante;

• Deve ser útil tanto ao onco-hematologista clínico, quanto ao pesquisador;

• Deve ser reproduzível e amplamente utilizável.

Diagnóstico das Leucemias

Morfológico

FAB

Citoquímica

POX/SB

PAS

Esterases

Imunofenotipagem

Linhagem

Sub-linhagem

Citogenética/Genética Molecular

Alterações:- estruturais- numéricas

Sangue PeriféricoSangue Periférico

Mielograma

Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica

Leucemias

SMDPTI

SHF HIVS.Chediak

Higashi

Aplasia Medular

Infiltração MO Tu

Calazar

AnemiaMeg

• Aspiração seca: a avaliação será enfocada apenas no SP e no estudo histológico da BIÓPSIA de MO.

• Cerca de 20 % dos pacientes com leucemia não apresentam blastos circulantes ao diagnóstico.

Diagnóstico das LeucemiasAvaliação morfológica

Diagnóstico e Classificação das Leucemias

• Representam 95 % das leucemias infantis• Proliferação de células imaturas: BLASTOS.• Sua enumeração na MO é fundamental para

a definição diagnóstica de leucemia aguda.

AGUDAS

CRÔNICAS

• Representam 3 a 5 % casos das leucemias infantis.

• Proliferação de células relativamente bem diferenciadas.

Avaliação Morfológica/Citoquímica

• Introduzidas na década de 60, algumas colorações citoquímicas (MPO, SBB, NSE) auxiliam na definição da linhagem e no diagnóstico de alguns subtipos de LMA.

Mieloperoxidase (MPO)

• Cora os grânulos primários dos precurssores granulocíticos e menos intensivamente dos monócitos.

• Ainda é considerada a reação “gold standard” para a diferenciação morfológica entre blastos linfóides (negativos) e mielóides (positivos).

MPO

Negro de Sudan (SBB)

• Coloração não enzimática dos fosfolipídeos das membranas dos grânulos. Interpretação de positividade paralela a MPO, porém mais intensa.

Esterases não Específicas (NSE):Esterases não específicas (NSE):

• alfa naftil acetato ( ANA ) esterase

• alfa naftil butirato (ANB) esterase

• Cruciais para a determinação de monoblastos/monócitos. É descrita em escala de 0 a + 4, e somente em níveis +3 ou +4 é caracterizado o blasto como monocítico.

• Monócitos maduros reagem menos intensamente que monoblastos.

ANB esterase

PAS

• Demais (PAS, Esterase Específica - CAE), Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são atualmente de limitado valor diagnóstico.

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica

Linfóides:– Representam 80 % das leucemias infantis.– Caracterizam -se pela presença na MO de >25 %

de blastos de características linfóides.

MIelóides:– Representam 20% das leucemias infantis.– Blastos constituem no mínimo 30% do total das

cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais de 20% de acordo OMS.

Classificação FAB (1976):• Primeira a unificar a classificação das

leucemias• Permitiu a comparação entre diferentes

protocolos terapêuticos• Atualmente,ainda é a base

citomorfológica para a classificação das LMA e SMD.

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica

FAB

LLA LMA SMD(L1, L2, L3) (M1 – M6)

1985(M7)

(RA, RARS, AREB, AREBt, LMMC)

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica

Classificação MIC (1986): • Classificação das LLA e posteriormente das LMA.• Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos

e citogenéticos.

Classificação da OMS (2001):• Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além

de características imunofenotípicas, genéticas e clínicas específicas.

Outras classificações

Classificação Morfológica FAB LLA

L1 L2 L3

Classificação Morfológica FAB - LLA

Classificação Morfológica FAB - LMA

M3v

M4Eo a/b

LMA - M0

LMA – M1

LMA – M2

LMA - M2

LMA - M3v

LMA – M4Eo

LMA – M5

LMA – M6

LMA – M7

Proporção aproximada de casos LMA na infância por subtipos

M0 M1 M2 M3 M4 / M4Eo M5 M6 M7

2 10

25

1025

22

2 4

Imunofenotipagem das Leucemias Agudas

Dra. Maria Lúcia de Martino Lee

Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM

Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA)

Principais finalidades

Diagnóstico das LA• Definir linhagem/

sublinhagem celular (mieloides,linfoidesB, linfoides T, NK)

• Definir estágio maturativo do blasto

• Detecção DRM

Futuro• Desenvolver e

monitorar novas terapias alvo(enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas

Citometria de Fluxo Metodologia

Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

Citometria de Fluxo Metodologia

Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

Citometria de Fluxo

Vantagens do método

• Mede múltiplos parametros em células individuais

• Grande número de células analisadas com rapidez

• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos

• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Imunofenótipo da LLA

Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

Desenvolvimento da linhagem mielóide

Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

ImunofenotipagemTriagem Inicial – Painel de Marcadores

Linhagem Marcadores Imunológicos

Linfóide B CD19 CD79a CD10 CD22

Linfóide T CD3 CD7

Mielóide Anti-MPO CD13 CD33 CD117

Não específica

CD45 CD34 tdt

Classificação Imunológica das LLA Infantis

IMF

Marcadores monoclonaisCD19/

CD79a CD10 Cy Igs CD3cy%

casos

Pró B + - - - - 1

Comum + + - - - 50-60

Pré B + + + - - 20-25

B + +/- - + - 3

T - +/- - - + 18

MLL,t(4;11)

TEL-AML,Hiperdiploidia

t(1;19)

t(8;14)

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Classificação Imunológica da LLA T

Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.

Classificação Imunológica da LLA T

Marcadores positivos• CD 3c, CD 7 • CD5, CD2, tdt• CD10 (45 %)• CD45

Marcadores positivos/negativos• CD19, CD 13, CD33

Marcadores negativos• CD79a• MPO

• CD1a, CD3, CD4, CD8 <45 % casos

• Subdividida 3 estágios maturativos: Dificíl correlação prognóstica

LLA com co-expressão de antígenos mielóides

• Crianças: 4 -35 %• Sem valor prognóstico

independente

CD22cytdt

CD19

CD10

CD79

CD33 (25%)

CD13 (23%)

CD15 (16%)

CD14 (16%)

Imunofenotipagem na LMA

Essencial:–LMA -MO–LMA - M7

Auxiliar:–LMA -M6–LMA - M3–LMA - 2 v–LMA -M4Eo–LMA - M5

Imunofenotipagem das LMAs

Marcadores negativos

MPO

CD3c

CD 79a c

CD 22 c

LMA minimamente diferenciada

Marcadores positivosCD 13CD 33

CD 117

---------------------------CD34,38,HLA-dr, tdt 1/3 dos casos

----------------------CD 11b,15, as vezes

CD2,7,19 fracos

Leucemia Megacarioblástica Aguda

Marcadores Positivos

• Plaquetários:– CD 41, CD 42,CD 61

Marcadores Negativos ou Positivos:

• Mielóides:– CD13 +, CD 33+,CD 117+

Marcadores Negativos:– anti MPO, CD 34, CD 45,HLA - DR

Eritroleucemia

Marcadores positivos

• Mielóides:

– CD117, CD13

• Eritróides:

– Glicoforina A

Marcadores negativos

• anti MPO

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Leucemia Aguda de Linhagem Ambígua

• Leucemias agudas indiferenciadas

• Leucemias agudas bifenotípicas

• Leucemias agudas bi-linhagem

Leucemias Agudas Indiferenciadas

• 1 - 3% leucemias agudas

• Amplo painel de marcadores negativos

• Em geral: CD34+, HLA-DR+, CD38+, CD7+, tdt+.

Leucemias Agudas Bifenotípicas

• Concomitância de marcadores imunológicos no mesmo blasto– Mielóide + B– Mielóide + T– T + B

• 4-6% das leucemias agudas

CD19

MPO

MPO

CD19CD22

Ro

cha

, M

aria

Hsu

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un

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no

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ge

m e

m L

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cem

ia A

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stitu

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e E

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no

e P

esq

uis

a.

Leucemia aguda bi-linhagem• Duas populações distintas de blastos

expressando marcadores diferentes

CD19

CD19

CD22

CD79a

CD19

CD19

CD22

CD79a

CD33MPO CD33

MPOCD13

CD33

MPO

CD33MPO

CD13

Doença Residual Mínima

• Técnicas moleculares (FISH, RT-PCR)

• Citometria de fluxo:

– fenótipos anômalos

– Assincronismo maturativo

– Infidelidade linhagem

– Anormalidades quantitativas

– Ausência de antígenos

DRM em LLA - SLE

Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.

Recidiva LLA vs DRM

Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.