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CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararaca – ÊNFASE PARA AS
ATIVIDADES ATPase E ADPase.
ANDRÉ TEIXEIRA DA SILVA FERREIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ
JULHO - 2006
CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararaca – ÊNFASE PARA AS
ATIVIDADES ATPase E ADPase.
ANDRÉ TEIXEIRA DA SILVA FERREIRA
"Tese de Doutorado apresentado ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção de título de Doutor em Biociências e Biotecnologia".
Orientador: Prof. Elias Walter Alves
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ JULHO - 2006
CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararaca – ÊNFASE PARA AS
ATIVIDADES ATPase E ADPase.
ANDRÉ TEIXEIRA DA SILVA FERREIRA
"Tese de Doutorado apresentado ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção de título de Doutor em Biociências e Biotecnologia".
Aprovada em 31 de julho de 2006 Comissão Examinadora: _______________________________________________
Prof. André Lopes Fuly (Doutor em Ciências) - UFF
_______________________________________________
Prof. Marilvia Dansa de Alencar Petretski (Doutora em Ciências) - UENF
_______________________________________________
Prof. Milton Masahiko Kanashiro (Doutor em Ciências) - UENF
_______________________________________________ Prof. Jorge Hudson Petretski (Doutor em Ciências) - UENF
Revisor _______________________________________________
Prof. Elias Walter Alves (Doutor em Ciências) - UENF
Orientador
"Toda a história científica do mundo tem sido realizada através das lutas e das paixões que separam e devoram os homens"
Arthur Neiva
Dedico esta tese a Marcinha, o grande amor da minha vida e um presente de Deus para mim, e também aos frutos dessa união feliz: Juliana, Bruno e Gabriel.
Amo todos vocês, e obrigado por existirem.
AGRADECIMENTOS - Ao Prof. Elias Walter Alves pela orientação, amizade e principalmente por não ter desistido de mim quando eu mesmo já não me acreditava mais. - A Prof. Olga Lima Tavares Machado por tudo que me ensinou nesses anos, pelo convívio maravilhoso no laboratório e principalmente pelo carinho que sempre dedicou a mim e a minha família. - Ao Prof. José Xavier Filho meu "Mestre" que sempre acreditou em mim, meu muito obrigado. - Aos membros da Banca examinadora, por aceitarem participar desta defesa de Tese. - Ao Prof. Jorge Petretski por ter revisado minha tese, mas principalmente pela amizade de sempre, pelos "Papos Cabeça" e é claro pelos puxões de orelha que sempre me deu. - Aos amigos de toda hora que se tornaram minha família em Campos, Leonardo (Cogu) e Elenir, Beto e Michele, Marco Antônio e Gilliana e Thiago Venâncio (Cabeção), pela força, respeito, amor e carinho que sempre me dedicaram dentro e fora do laboratório. - Aos irmãos de coração que vieram comigo do Rio para essa incrível aventura que tem sido a UENF, Francisco Gomes Neto (Chico) e André Lopes Fuly, amo vocês. - Ao Cristóvão (Cris) e Dona Laci, pela colaboração e principalmente pela paciência de aturar meu temperamento tempestivo. - Aos amigos Adriana (Coisa Ruim), Marcinho, Luciana, Alexandra, Viviane, Fabinho pelos bons momentos que tivemos no dia a dia de trabalho. - A todos os amigos da UENF que não foram aqui citados por não haver espaço para listá-los, muito obrigado. - Aos amigos da UFRJ, Fred, Mário, Júlio, Cameron, Georgia, Ana Cláudia, Antônio Pereira, Celso Caruso, Adilson (negão) e muitos outros, muito obrigado. Sinto falta de vocês... - A todos os Professores que contribuíram para minha formação profissional como aprendiz de "Feiticeiro" na UERJ e na UFRJ, Prof. Ubatuba, José Roberto, Mauro Velho, Fatinha, Vera, Jaime, Adalberto Ramon Vieyra, Martha Sorenson, Hector Barrabin, Masuda, Orlando, Horácio meu "Gurú", Pedro, Sônia Ubatuba, Célia Carlini, Jorge Guimarães, Jerson Lima, Sérgio Ferreira, Tatiana Coelho, Leopoldo
de Meis e tantos outros que no momento me falha a memória, muito obrigado mesmo. - A todos os Professores da UENF por tudo que me ensinaram e fizeram por mim. - Ao amigo Luiz Machado e seus filhos, Tales, Tiago, Taís e Vinícius pela amizade e carinho (a Olga eu já agradeci). - Aos amigos Jorge e Lea que acolheram a mim e minha família desde que cheguei a Campos. Vocês são especiais. - Aos meus Pais José e Leila, que fizeram de mim o que sou, que me ensinaram o que considero mais importante de tudo, a amar a Deus e ao próximo. Amo vocês e sei que nunca terei como retribuir o presente de tê-los como pais, que Deus os abençoe. - Aos meus irmãos naturais Zezinho, Claudinho e Marcinha, e aos que ganhei pelo casamento Welington e Mauro, pelo amor e amizade de toda hora, não sei o que fiz para merecer vocês. - Aos meus sogros, Francisco e Lourdes que me adotaram como filho, meu muito obrigado por tudo, amo vocês de verdade. - A todos, muito obrigado de coração.
Lista de Abreviaturas e Siglas
- µM - micromolar - Abs - absorvância - ADO - adenosina - ADP - adenosina 5'-difosfato - AMP - adenosina 5'-monofosfato - ATP - adenosina 5'-trifosfato - AxP – Adenosina mono, di ou trifosfatada - B. - Bothrops - C - graus Celsius - Cis - cisteína - D.O. - Densidade ótica - D0,5 - tempo necessário para inibir 50% da atividade a uma temperatura
constante de 65C - DNA - ácido desoxirribonucléico - EDTA - ethylenediamine tetraacetic acid - FPLC - cromatografia líquida rápida de proteínas - HPLC - cromatografia líquida de alta performance - kDa - kilo dalton - KM - constante de Michaelis - mA - milampéres - mg - miligrama - min. - minutos - mL – mililitro - MLV – musculatura vascular lisa - mM - milimolar - PDE - fosfodiesterase - pH - logarítico do inverso da concentração de íons hidrogênio - Pi - fosfato inorgânico - pI - ponto isoelétrico - p-NP - p-nitrofenol - p-NPP - p-nitrofenil fosfato - p-NP-TMP - p-nitrofenil timidina fosfato - PPi - pirofosfato inorgânico - RNA - ácido ribonucléico - rpm - rotações por minuto - SDS - dodecil sulfato de sódio - SDS-PAGE - gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sódio - SH - sulfidrila - TEMED - N,N,N',N',-tetrametilenodiamino - Tris -Tris (hidróxidomeltil) aminometano - UDP - uridina 5'-difosfato - UTP - uridina 5'-trifosfato - V - volt - W - watts
I
ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO 02 1.1. Aspectos Gerais................................................................................................ 02 1.2. Características das serpentes do gênero Bothrops e ação do veneno
botrópico............................................................................................................ 03
1.3. Patogenia do veneno botrópico........................................................................ 04 1.4. Função e composição do veneno..................................................................... 06 1.5. Estratégia de envenenamento.......................................................................... 06 1.6. Mecanismo de ação de venenos...................................................................... 08 1.7. Classificação dos receptores purínicos............................................................. 09 1.7.1. Receptores P1................................................................................................... 09 1.7.2. Receptores P2................................................................................................... 11 1.7.3. Distribuição filogenética dos receptores de purinas.......................................... 13 1.8. Vias de liberação de Purinas............................................................................ 13 1.9. Enzimas com atividade fosfoesterásica presente em venenos de serpentes... 14 1.9.1. Fosfodiesterase................................................................................................. 14 1.9.2. 5’-nucleotidase.................................................................................................. 16 1.9.3. Fosfomonoesterase não-específica (fosfatase)................................................ 17 1.9.4. ADPase/ATPase .............................................................................................. 17
2. OBJETIVO 20 2.1. Objetivo Geral................................................................................................... 20 2.2. Objetivos Específicos........................................................................................ 20
3. MATERIAIS E MÉTODOS 22 3.1. Reagentes......................................................................................................... 22 3.2. Dosagem de proteína........................................................................................ 22 3.3. Hidrólise de ATP, ADP e AMP.......................................................................... 22 3.4. Ensaio de atividade Fosfodiesterase................................................................ 22 3.5. Ensaio de atividade fosfatásica não específica................................................ 23 3.6. Dependência da concentração de Mg-ATP,Mg-ADP e Mg-AMP sobre a
atividade nucleotidásica do veneno.................................................................. 23
3.7. Dependência do pH sobre as atividades fosfatásicas Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE-Sepharose.........................................................
23
3.8. Curva de termoestabilidade.............................................................................. 23 3.9. Fracionamento do veneno em Sephacryl S100 (Exclusão molecular)............. 24 3.10. Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE Sepharose.................... 24 3.11. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC).......................................... 25 3.11.1. Fracionamento de proteínas (troca iônica)....................................................... 25
II
3.11.2. Determinação da hidrólise de nucleotídeos por HPLC..................................... 26 3.12. Cromatografia de afinidade............................................................................... 26 3.13. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).................................................. 27 3.13.1. Em condições não desnaturantes (sem SDS).................................................. 27 3.13.2. Em condições desnaturantes (com SDS e 2-β mercaptoetanol)...................... 27 3.14. Coloração do gel............................................................................................... 28 3.14.1. Coloração por Comassie Brilhant Blue R-250.................................................. 28 3.14.2. Inpregnação por AgNO3.................................................................................... 28 3.14.3. Atividade enzimática em gel............................................................................. 28 3.15. Eletroforese Preparativa................................................................................... 29 3.16. Análises densitométricas................................................................................... 29 3.17. Estatística.......................................................................................................... 30
4. RESULTADOS 32 4.1. Efeito da temperatura sobre as atividades nucleotidásicas presente no
veneno bruto de Bothrops jararaca................................................................... 32
4.1.1. Gráfico de primeira ordem da curva de inativação térmica............................... 32 4.1.2. Gráfico de segunda ordem da curva de inativação térmica.............................. 37 4.2. Efeito de Cisteína e do Fluoreto de sódio sobre as atividades
nucleotidásicas presentes no veneno de Bothrops jararaca............................. 37
4.3. Estudo do metabolismo de nucletídeos catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca.............................................................................................................
40
4.3.1. Influência do pH sobre as atividades hidrolíticas de ATP, ADP ,AMP e p-nitrofenil fosfato catalisadas por veneno bruto de B. jararaca..........................
40
4.3.2. Curso temporal de hidrólise de nucleotídeos.................................................... 44 4.4. Determinação do mecanismo de hidrólise de ATP, por HPLC......................... 47 4.5. Parâmetros cinéticos das atividades fosfatásicas do veneno........................... 53 4.6. Fracionamento do veneno de Bothrops jararaca.............................................. 55 4.6.1. Fracionamento por cromatografia de exclusão molecular................................ 55 4.6.2. Fracionamento por cromatografia de troca iônica (DEAE)............................... 59 4.6.3. Determinação da atividade nucleotidase pelas frações obtidas pela DEAE..... 62 4.6.4. Fracionamento por cromatografia de afinidade HiTrap-Blue (Cibacron Blue).. 66 4.6.5. Fracionamento da fração FI em coluna de afinidade HiTrap-Blue.................... 70 4.6.6. Fracionamento do veneno utilizando coluna de afinidade ADP-sepharose...... 73 4.7. Purificação das nucleotidases em gel de eletroforese não desnaturante......... 76 4.7.1. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante......... 80 4.7.2. Determinação da massa nativa das atividades nucleotidásicas por
eletroforese não desnaturante (Gel de poro transverso).................................. 80
4.8. Análise bidimensional das proteínas presente nas bandas com atividade em gel nativo...........................................................................................................
87
4.9. Purificação das nucleotidases por eletroforese em gel não desnaturante........ 87
III
4.9.1. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa................................... 89 4.9.2. Determinação das atividades nucleotidásicas das frações eluídas da PAGE
preparativa (PREPCELL).................................................................................. 92
5. DISCUSSÃO 97 5.1. Discussão geral dos resultados........................................................................ 97 5.2. Hipótese de participação das nucleotidases no envenenamento..................... 100
6. CONCLUSÕES 106
7. REFERÊNCIAS 108
RESUMO
As enzimas envolvidas na liberação de purinas estão presentes em todos
os venenos. A presença ubíqua dessas proteínas as coloca em posição de
destaque tanto em termos evolutivos quanto em termos fisiológicos,
principalmente quando relacionamos os diversos efeitos farmacológicos
desenvolvidos pelas purinas com alguns dos efeitos fisiopatológicos observados
durante o envenenamento. Nossos estudos demonstram que o veneno de
Bothrops jararaca se apresenta como um complexo protéico formado por quatro
subunidades de aproximadamente 30 kDa, firmemente ligadas. Cada subunidade
parece apresentar uma atividade catalítica diferente: Fosfodiesterase, ATPase,
ADPase e 5'-Nucleotidase. Esse complexo permite um perfeito acoplamento entre
as reações podendo metabolizar o ATP por duas vias diferentes: uma rápida que
conta com apenas duas enzimas, a Fosfodiesterase e a 5'-Nucleotidase e que
apresenta como produtos ADO, PPi e Pi ;e uma outra mais lenta que promoveria
a retirada seqüencial de Pi do ATP contando com a participação de uma ATPase,
uma ADPase e da 5'-Nuclotidase, apresentando como produtos ADO e 3Pi.
Devido a ação pró-inflamatória da adenosina aumentando a permeabilidade
vascular e inibindo a agregação plaquetária ns concluímos que o aumento na
concentração de adenosina com conseqüente diminuição das concentrações de
ATP e ADP, promovido pelo sistema de nucleotidases, está relacionado com o
desenvolvimento de edema e disfunção plaquetária observada na região da
picada durante o envenenamento, levando a um aumento de difusão dos
componentes do veneno causado pelo aumento na permeabilidade vascular e
efeito anti-plaquetário. O extravasamento de fluído para o meio intersticial irá
promover a ativação de componentes tóxicos do veneno e difusão para os tecidos
da presa resultando em sua morte e digestão.
ABSTRACT
The enzymes involved in the purines liberation are present in all the poisons. The
ubiquitous presence of those proteins places them in position of so much prominence in
evolutionary terms as in physiologic terms, mainly when we related the several
pharmacological effects developed by the purines with some of the effects physiopathology
observed during the envenomation. Our studies demonstrate that the poison of Bothrops
jararaca comes as a complex proteic formed by four sub-unidades of approximately 30
kDa, firmly tied up. Each sub unit seems to present a different catalytic activity:
Fosfodiesterase, ATPase, ADPase and 5'-Nucleotidase. That complex one allows a perfect
joining among the reactions being able to metabolize ATP for two different roads: a fast
one that counts with just two enzymes, Fosfodiesterase and for 5'-Nucleotidase and that
presents as products ADO, PPi and Pi; e another one slower than it would promote the
retreat sequential of Pi of ATP counting with the participation of an ATPase, an ADPase
and of 5'-Nuclotidase o'clock, presenting as products ADO and 3Pi. Due to pro-
inflammatory action of the adenosine increasing the vascular permeability and inhibiting
the aggregation platelet us concluded that the increase in the adenosine concentration with
consequent decrease of the concentrations of ATP and ADP, promoted by the nucleotidases
system, is related with the edema development and dysfunction platelet observed in the area
of the pricked during the envenomation, taking to an increase of diffusion of the
components of the poison caused by the increase in the vascular permeability and effect
anti-platelet. The release of having flowed for the middle interstitial will promote the
activation of components toxins of the poison and diffusion for the tissue of the prey
resulting in its death and digestion.
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos Gerais As serpentes venenosas são classificadas de acordo com suas
características morfológicas, compreendendo cinco famílias: Crotalidae, Viperidae,
Elapidae, Hydrophiidae e Colubrinae. Nas Américas as serpentes peçonhentas são
representadas pelas famílias Elapidae, com os gêneros Leptomicrurus e Micrurus e,
pela família Crotalidae, com os gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Sistrurus
(Underwood, 1979 citado por Cavinato, 1995; Varanda e Giannini, 1994).
Os ofídios podem ser classificados quanto ao tipo de dentição que possuem,
estando essa característica relacionada com a capacidade de inoculação de
veneno. Os dentes das serpentes não servem para cortar ou mastigar, eles são
voltados para trás, auxiliando na passagem da presa ingerida. São quatro tipos de
dentições de serpentes em relação à capacidade de inocular veneno em outro
organismo: Áglifas - não apresentam dentes especializados na inoculação de
veneno (ex. Boídeos e alguns Colubrídeos); Opistóglifas - Um par de dentes
sulcados localizados na região posterior da maxila superior (alguns Colubrídeos);
Proteróglifas - um par de dentes sulcados, fixos na região anterior da maxila
superior (ex. Elapídeos); Solenóglifas - um par de dentes móveis localizados na
região anterior da maxila superior, que se deslocam para frente durante o bote (ex.
Viperídeos). A família Crotalidae pertence à série solenóglifa, pois possui um par de
presas inoculadoras de veneno, providas de um canal central que se comunica com
o canal excretor da glândula de veneno (Veronese, 1987).
O gênero Bothrops é composto de várias espécies e na América distribui-se
desde a América do Norte até a Argentina (Hoge e Romano-Hoge, 1978/79 citado
por Cavinato, 1995). A grande maioria das picadas de serpentes na América Latina
é causada por espécies classificadas no gênero Bothrops (Gutiérrez e Lomonte,
1989). No Brasil, em todas as regiões, o gênero Bothrops é o maior representante
da família Crotalidae, possuindo 32 espécies e uma ampla distribuição geográfica.
3
1.2. Características das serpentes do gênero Bothrops
As espécies do gênero Bothrops caracterizam-se morfologicamente pela
presença de fosseta loreal, olhos pequenos com pupilas em fenda, cabeça
triangular e escamada, presas inoculadoras de veneno implantadas no osso maxilar
e o corpo tende a ser grosso e não muito longo. Os membros deste gênero são
chamados também de “lanceheads”, devido ao formato triangular característico da
cabeça que a maioria das espécies possui. São responsáveis por 80% a 90% dos
acidentes ofídicos no Brasil. Habitam preferencialmente ambientes úmidos como
matas, áreas cultivadas e locais de proliferação de roedores, em zonas rurais.
Possuem hábitos noturnos e são consideradas agressivas quando se sentem
ameaçadas, atacando em silêncio. Distribuem-se por todo território nacional e cada
espécie tem sua distribuição geográfica característica. As espécies mais
importantes são B.asper na América Central, B.atrox e B.jararaca na América do
Sul (Campbell e Lamar, 1989; Barraviera e Pereira, 1994).
Bothrops atrox, chamada de “jararaca” ou de “jararacuçu” conforme a área da
Região Norte em que aparece, tem ampla distribuição geográfica e domínio
progressivo. Habita tanto florestas como áreas desmatadas, adaptando-se
facilmente. É a maior responsável por acidentes ofídicos no Norte do Brasil e pode
atingir comprimento superior a 1,5m (Barraviera e Pereira, 1994) Figura 1A.
Figura 1. Distribuição geográfica das duas principais espécies de serpentes do gênero Bothrops de importância médica no Brasil, Bothrops atrox painel A e Bothrops jararaca painel B (Barraviera e Pereira, 1994; Campbell e Lamar, 1989). Em verde local de incidência das serpentes.
B. atrox B. jararacaB. atrox B. jararaca
A B
B. atrox B. jararacaB. atrox B. jararaca
A B
4
Bothrops jararaca, conhecida popularmente por jararaca, é responsável pelo
maior número de acidentes ofídicos por viver no campo e nos lugares comuns ao
homem. Ocorre nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, no Paraguai e na Argentina,
ocupando uma diversidade de habitats, tendo preferência por regiões aberta
próximas à vegetação (Campbell e Lamar, 1989) Figura 1B.
1.3. Patogenia do veneno botrópico
A fisiopatologia do envenenamento botrópico decorre das principais ações
apresentadas pelo veneno: inflamatória, miotóxica, coagulante e hemorrágica. O
acidente botrópico causa manifestações locais e sistêmicas.
Nas lesões locais tem sido observados dor e edema de intensidades
variáveis podendo ocorrer necrose de tecidos e/ou formação de abscessos (Figura
2). A necrose pode ser causada pelo próprio veneno e/ou pela isquemia de vasos
da região afetada (Secretaria Estadual de Saúde, 1993). O edema pode ser
resultado da ação simultânea do veneno na microvasculatura, aumentando a
permeabilidade de capilares e veias ou da ação indireta de mediadores endógenos,
liberados por componentes do veneno, como histamina, prostaglandinas e cininas.
Além do edema, o veneno induz infiltrado de células inflamatórias (Gutiérrez e
Lomonte, 1989).
Quanto às manifestações sistêmicas, as mais freqüentes são a alteração da
coagulação sangüínea, seguida de hemorragia, choque e insuficiência renal. O
choque é causado pela grande hemorragia, seqüestro de líquidos e liberação de
substâncias vasoativas. A patogênese da lesão renal com necrose tubular inclui a
ação indireta do veneno sobre as células dos túbulos renais e sobre
a coagulação intravascular, responsável pela oclusão vascular e isquemia (Amaral
et al., 1986; Secretaria Estadual de Saúde, 1993).
A ação coagulante dos venenos de Bothrops, devido fundamentalmente a
proteases, é feita pela transformação de fibrinogênio em fibrina, conhecida como
ação do tipo trombina. Além disso, o veneno ativa o fator X e a pró-trombina da
cascata de coagulação sanguínea. A ação necrosante decorre do efeito direto de
proteases, fosfolipases, hialuronidases e outras enzimas sobre os tecidos. Pode
haver liponecrose, mionecrose e lise das paredes vasculares. Estas lesões podem
5
Figura 2 - Local da ferida produzida pela picada de Bothrops jararaca, observar a formação de edema, bolhas e tecido necrosado. (de Andrade et al., 1989)
ser agravadas por infecções secundárias. A mionecrose é agravada pela presença
de miotoxinas, enzimas que possuem ação direta no tecido muscular. Algumas
miotoxinas possuem estrutura similar a fosfolipase A2, e já foram purificadas de
vários venenos do gênero Bothrops (Gutierrez et al., 1986; Lomonte et al., 1994;
Arni e Gutierrez, 1993; Angulo et al., 1997). O efeito hemorrágico pode ser local ou
sistêmico afetando pulmões, cérebro e rins, e parece ser originado por
hemorraginas. As toxinas hemorrágicas são metaloproteinases ácidas que agem
sobre vasos capilares, destruindo inicialmente a membrana basal e causando sua
ruptura e extravasamento de sangue. Estas toxinas já foram caracterizadas em
Elapinae, Viperinae e principalmente em Crotalinae (Assakura et al., 1992; Paine et
al., 1992; Sanchez et al., 1995; Chung et al., 1996; Khow et al., 2002; Stroka et al.,
2005). As hemorraginas explicam casos de hemorragias sistêmicas, por vezes
fatais, mesmo na ausência de alterações na coagulação sangüínea. Se a
administração do antiveneno é feita rapidamente após a picada, geralmente
consegue-se com sucesso a neutralização dos efeitos sistêmicos, mas a
neutralização dos efeitos locais é uma tarefa mais difícil, e pode resultar em
seqüelas permanentes, com perda de tecidos (Gutiérrez e Lomonte, 1989;
Secretaria Estadual de Saúde, 1993; Barraviera e Pereira, 1994). A mortalidade
6
sem tratamento chega à cerca de 7%, mas com tratamento é reduzida a 0,5-3%
(Campbell e Lamar, 1989).
1.4. Função e composição do veneno Embora venenos de serpentes também possuam um papel de autodefesa,
isto é de pouca importância considerando sua composição. A função primária é sem
dúvida imobilizar e matar a presa (Karlsson, 1979), enquanto simultaneamente é
disparado o processo de digestão (Thomas e Pough, 1979; Kardong, 1980; 1998).
Venenos de serpentes são misturas complexas de compostos orgânicos e
inorgânicos, muitos dos quais apresentam alta atividade biológica (Berger e Bhatti,
1989). Dos componentes orgânicos dos venenos, destacam-se as proteínas,
muitas delas apresentando atividade enzimática. A fração protéica responde por
cerca de 90% a 95% do peso seco do veneno bruto. Os outros componentes
orgânicos presentes nos venenos são aminoácidos livres, pequenos peptídeos,
nucleotídeos, nucleosídeos, carboidratos sob a forma de glicoproteínas, lipídeos e
aminas biogênicas. Entre os constituintes inorgânicos, os mais freqüentemente
encontrados são íons de cálcio, zinco, magnésio, potássio, sódio, fósforo, ferro,
cobalto e manganês, além de fosfatos, sulfatos, citrato e cloretos. Alguns destes
compostos inorgânicos possuem a função de neutralizar as cargas e manter a
estabilidade estrutural de certas proteínas do veneno, como metaloproteinases
(Varanda e Giannini,1994), e ainda inibem determinadas reações enzimáticas
impedindo a degradação do veneno por autólise (Francis et al., 1992; Ownby e
Gutierrez,1998).
1.5. Estratégia de envenenamento
Os estudos comparativos das atividades enzimáticas do veneno de diferentes
serpentes mostraram uma grande heterogeneidade. Alguns componentes são
típicos de venenos de certas famílias de serpentes, enquanto outros são
encontrados em todos os grupos. Dessa forma, os níveis de atividade enzimática
podem diferir quantitativamente de espécie para espécie, inclusive nas que
apresentam um alto grau de parentesco (Iwanaga e Suzuki, 1979). Além disso,
7
parece que a composição dos venenos está sujeita a variações intraespecíficas,
relacionadas à variação geográfica, variação sazonal, tipo de dieta e
comportamento alimentar, idade, sexo, habitat, e até mesmo quanto ao intervalo de
extrações de veneno e condições de armazenamento dos mesmos.
Esta complexidade e a variabilidade na composição dos venenos levaram
alguns autores a buscar relacioná-la com os hábitos alimentares das serpentes
(Chippaux et al, 1991; Jorge da Silva e Aird, 2001), permanecendo, entretanto difícil
de explicar a natureza onipresente de alguns componentes do veneno relativamente
não-tóxicos. A ocorrência quase universal dessas enzimas sugere um papel central
no envenenamento, contudo nenhuma explicação satisfatória foi sugerida para
justificar sua presença em venenos.
Alguns trabalhos (Cousin e Bon, 1999) têm ressaltado que venenos de
serpentes são ricos em proteínas e enzimas os quais não apresentam funções
conhecidas no envenenamento, como exemplo: o fator de crescimento do nervo
(NGF), L-aminoácido oxidase (LAO) e fosfodiesterase (PDE). Francis et al. (1997)
mostraram ainda que veneno da cobra coral brasileira, Micrurus frontalis, contém
quantidades significantes de guanosina. Evidências preliminares sugerem que uma
fração significante desses nucleosideos não está livre em solução, mas
aparentemente ligada fortemente a neurotoxinas pós-sinápticas, fosfolipases, e
possivelmente combinado com outras estruturas. Intrigado por estes resultados Aird
(2002) procurou uma explicação para o papel das purinas em venenos e nessa
busca descobriram relatos da ocorrência de purinas, livres em solução, como
adenosina, guanosina e inosina, desde a década de 50 (Fischer e Dorfel,1954;
Doery, 1956 citados por Aird 2002 e Takasaki et al., 1991; Aird, 2005). Com base
em seus estudos ele postulou que as purinas poderiam estar envolvidas nas três
estratégias fundamentais de envenenamento por ofídios (tópico 1.6.1), que parecem
ser empregadas por todas as serpentes venenosas. Ele sugere que purinas atuem
como toxinas multifuncionais, mostrando efeitos sincrônicos em virtualmente todos
os tipos de células, e que purinas exógenas e/ou liberadas por vias endógenas
possuem um papel central em todas as três estratégias de envenenamento.
Apresentando explicações hipotéticas para a presença de muitas enzimas de
veneno que até então não haviam sido explicados. Embora ainda estejam faltando
evidências experimentais no estudo com venenos para a maioria das hipóteses
8
apresentadas por Aird, as pesquisas farmacológicas em outros campos provêem
ampla evidência para suportá-las.
Para realizar seus objetivos, serpentes empregam uma grande variedade de
mecanismos bioquímicos que necessariamente refletem tanto a biologia da
serpente quanto a natureza de sua presa principal. Estes mecanismos podem se
agrupar em três estratégias fundamentais de envenenamento. Duas delas são
estratégias de imobilização da presa e podem ser denominados como: estratégias
‘hipotensiva' e 'paralisante'. Ambas têm por objetivo impedir a fuga da presa, no
caso de grupos de serpentes que apresentam hábitos de caça que consistem em
golpear e libertar a presa para depois localizá-la e ingeri-la (a maioria dos
Viperidae), ou superar a resistência da presa, no caso de cobras que agarram
fortemente suas presas (muitos Elapidae e todos os Colubridae). A terceira
estratégia é digestiva, a degradação dos tecidos da presa começa a partir da
inoculação do veneno, antes mesmo que a presa tenha sido engolida.
Normalmente, todas as três estratégias operam simultaneamente e os componentes
individuais do veneno freqüentemente participam em mais que um desses
processos.
1.6. Mecanismo de ação de venenos
O envenenamento por serpentes emprega três estratégias bem integradas:
imobilização da presa por hipotensão arterial (efeito vasculotóxico e hemotóxico),
imobilização de presa por paralisia (efeito neurotóxico e miotóxico), e digestão da
presa (Gutiérrez et al., 1990; Daltry et al., 1996). As purinas constituiriam toxinas
multifuncionais perfeitas, uma vez, que com base em seus efeitos farmacológicos
poderiam participar simultaneamente em todas as três estratégias de
envenenamento, apresentando dessa forma um papel central nas estratégias de
envenenamento da maioria das serpentes (Aird, 2002). Purinas aparentemente
ligam-se em outras toxinas que então servem como “acompanhantes” orientando e
depositando-as a um subtipo específico de receptor purinérgico (Aird, 2002 e 2005).
As ações farmacológicas como: supressão passageira de neurotransmissores,
liberação de histamina e analgesia, parecem ser erroneamente atribuídas a uma
9
variedade de proteínas tóxicas. Tais efeitos poderiam estar relacionados a liberação
de purinas por estas toxinas, e/ou presente no próprio veneno.
1.7. Classificação dos receptores purínicos
Atualmente as duas famílias de receptores de purinas originalmente propostas
por Burnstock (1978) ainda são aceitas, embora as subdivisões das classes tenham
sofrido algumas mudanças na nomenclatura (figura 3). Os receptores de adenosina,
ou receptores P1 ligam ao nucleosídeo adenosina, e em alguns casos, inosina,
enquanto receptores de P2 ligam nucleotídeos como: ATP, ADP, UTP e UDP
(Ralevic e Burnstock. 1998).
1.7.1 Receptores P1
Receptores P1, que aparentemente desempenham um papel central no
envenenamento, são divididos em quatro sub-tipos: A1, A2a, A2b e A3. Essa
classificação é baseada em evidências estruturais, bioquímicas e farmacológicas,
uma característica comum a todos é o fato de estarem acoplados a proteína G.
Receptores A1, o mais amplamente estudado da classe, têm uma distribuição quase
onipresente dentro do sistema nervoso central (Reppert et al., 1991; Dixon et al.,
1996; Ralevic e Burnstock, 1998). Apresentam um efeito depressor da atividade do
sistema nervoso suprimindo a liberação de quase todos neurotransmissores.
São achados receptores de A1 em muitos outros tecidos, inclusive coração
(Olsson e Pearson, 1990; Dixon et al., 1996), rim (Olivera et al., 1989; Agmon et al.,
1993; Barrett e Droppleman, 1983; Munger e Jackson, 1994), fígado (Dixon et al.,
1996), aorta (Dixon et al., 1996), baço (Fozard e Milavec-Kiizman, 1993), tubo
deferente (Hourani e Jones, 1994), brônquio (Ali et al., 1994), jejuno (Hancock e
Coupar, 1995), duodeno (Nicholls et al., 1996), e tecido adiposo (Londos et al.,
1985).
Por transcrição reversa usando PCR, Dixon et al. (1996) descobriu mRNA de
receptor A2a em todas as regiões de cérebro, com níveis mais altos no corpo
estriado e tubérculo olfatório. Na periferia, foram descobertos farmacologicamente
10
Figura 3 – Quadro de classificação de receptores purinérgicos (Baseado na classificação proposta por Ralevic e Bunstock, 1998).
receptores de A2a em coração (Martin et al., 1993; Dubey et al., 1998; Belardinelli et
al., 1998), aorta (Conti et al., 1993), retina (McIntosh e Blazynski, 1994), nervo
frênico (Correia-de-Sá e Ribeiro, 1994), baço, pulmão, útero, pele, bexiga e músculo
esquelético (Dixon et al., 1996).
Receptores A2b são os que se apresentam menos estudados. Eles são
essencialmente onipresentes, ocorrendo ao longo do cérebro (Daly et al., 1983) e
em todos os tecidos examinados por Dixon et al. (1996), porém com níveis muito
baixos, quando comparados as anteriores.
Também são distribuídos amplamente receptores A3, mas o papel fisiológico
deles é muito pouco conhecido (Ralevic e Burnstock, 1998). Porém, alguns
trabalhos atribuem a eles um efeito cardio-protetor por prevenir a apoptose (Kohno
et al., 1996 a,b; Yao et al., 1997; Shneyvays et al., 1998; Jacobson, 1998) (Liang e
11
Jacobson, 1998), liberação de histamina por mastócitos (Ramkumar et al., 1993), e
regulação da pressão sanguínea central (Stella et al., 1998) TABELA I.
TABELA I
Receptor de adenosina (P1) Sub-tipo Segundo
mensageiro Principal tecido
A1 Gi (1-3): cAMP
reduzido
Cérebro; terminais nervosos
autônomos; cordão espinhal;
coração; testículos
A2a Gs:aumento de
cAMP Cérebro; coração; pulmão; baço
A2b Gs:aumento de
cAMP Intestino grosso; bexiga
A3
Gi, Go/n: cAMP
reduzido
Aumento de
Ins(1,4,5)P3
Cérebro; Pulmão; Testículos;
Coração; fígado
(Baseado na revisão de Ralevic e Burnstock, 1998)
1.7.2 Receptores P2
São reconhecidas atualmente duas subdivisões da classe de receptores P2.
Receptores P2X controlam canais iônicos ou poros não seletivos enquanto
receptores P2Y são associados a proteína G . A família de receptores P2 também
inclui receptores sensíveis tanto a pirimidinas como a purinas. A nomenclatura de
receptores P2 está agora baseada em estrutura, e substituiu a nomenclatura
anterior que estava baseada na farmacologia. Em tecidos de mamíferos têm sido
definido cinco receptores de P2Y (conhecido como P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, e
P2Y,) e sete receptores P2X (P2X17) (Ralevic e Burnstock, 1998; Di Virgilio et al.,
2001). Receptores P2Y são significativamente mais sensíveis a ATP que receptores
P2X.
12
Todos os receptores P2Y têm sete regiões trans-membrana e transduzem
sinais ativando fosfolipase C, ou ativando ou inibindo a adenilato ciclase. Todos os
receptores P2Y são ativados por ATP, mas alguns sub-tipos da classe também são
ativadas por ADP, UTP, UDP, ou GTP. Os receptores P2Y são amplamente
distribuídos e foram relatados em tecidos cardíacos, vascular, conectivo, imune e
neural (Ralevic e Burnstock, 1998). Eles estão presentes na maioria das células do
sangue e são conhecidos por participarem na resposta de células quimiotácticas
dendríticas humanas (Liu et al. 1999). Eles parecem funcionar nos macrófagos
como detectores extremamente sensíveis ao dano tecidual, respondendo a
concentrações de ATP tão baixas quanto 0.1 mM (Oshimi et al., 1999). Receptores
P2Y presentes no músculo liso e endotélio de vasos sanguíneo produzem
vasodilatação (Burnstock e Warland, 1987; Boeynaems e Pearson 1990; Brizzolara
e Burnstock, 1991; Boarder e Hourani, 1998).
Receptores P2X consistem em subunidades com duas regiões transmembrana.
A transdução do sinal acontece pela entrada rápida de Ca2+ e Na+ e saída de K+. A
estequiometria das subunidades é desconhecida para a maioria dos sub-tipos da
classe, embora se acredita que receptores P2X1 e P2X3 formam trímeros ou
hexameros. De interesse particular para envenenamento são receptores P que têm
um carboxiterminal extenso. Acredita-se que receptores de P2X7 formam um canal
ATP-ativado formado por um número desconhecido de subunidades. Por algum
meio, talvez o recrutamento de subunidades adicionais, os canais P2X7 podem ser
convertidos a poros não-seletivos (Di Virgílio et al., 2001) que resultam em células
necrótica mortas ou apoptóticas, dependendo das concentrações de ATP
extracellular (Di Virgilio, 1998; 2000 citado por Aird, 2002).
Proteínas, incluindo os diferentes tipos de receptores P2X, apresentam uma
distribuição bem difundida entre os tecidos os quais expressam mais de um de seus
subtipos. Receptores P2X são bem conhecidos em tecidos excitáveis como músculo
liso e nervos, embora eles também tenham sido identificados em tecidos
endócrinos, plaquetas, pró-mielócitos células HL6O, e quase todas células do
sangue estudadas até agora (Ralevic e Burnstock, 1998; Di Virgilio et al., 2001).
TABELA II.
13
1.7.3 Distribuição filogenética dos receptores de purinas
A maioria dos estudos sobre receptores de purinas foi executada em
mamíferos, entretanto na literatura vem crescendo e ganhando corpo um grande
número de trabalhos demonstrando a presença de receptores P1 e P2 em todos os
organismos. Eles são extensamente distribuídos em bactérias, plantas superiores,
protozoários, platelmintos, celenterados, anelídeos, moluscos, equinodermos,
artrópodes e todas as classes vertebradas (Burnstock, 1996). Além disso, em todos
os animais, os agonistas, adenosina e ATP, promovem respostas semelhantes às
observadas em mamíferos, sugerindo que os dados farmacológicos obtidos em
mamíferos sejam provavelmente aplicáveis à extensiva gama de organismos
comidos ou envenenados por serpentes. Além disso, organismos inferiores também
empregam receptores de purina de alguns modos modernos. Insetos hematófagos
percebem a presença de ATP no sangue dos hospedeiros, que serve como um fago-
estimulante (Galun et al., 1963; Galun e Kindler, 1968; Galun e Margalit, 1969; Galun
et al., 1985).
1.8. Vias de liberação de Purinas
As purinas envolvidas no envenenamento podem ter sua origem no próprio
veneno fazendo parte de sua composição ou serem geradas a partir de precursores
endógenos da presa por ação conjunta de várias enzimas. Vários trabalhos relatam
a presença de purinas livres em venenos, e em alguns casos elas contribuíam com
até 10% da absorbância a 280 nm desses venenos (Eterovic et al., 1975). A
geração de purinas a partir de precursores endógenos da presa justifica a presença
de muitas atividades enzimáticas até agora não esclarecidas em venenos de
serpentes, tais como: 5'-nucleotidase, endonucleases (inclusive ribonuclease),
fosfodiesterase, ATPase, ADPase, fosfomonoesterase, NAD-nucleotidase,
fosfolipases A2, citotoxinas, miotoxinas e heparinase que também participam na
liberação de purinas, além das suas funções melhor conhecidas.
14
TABELA II
Receptor de ATP (P2)
Sub-tipo Segundo
mensageiro Principal tecido
P2X1
Influxo de Ca2+ & Na+
(Canal de cátion)
Músculo liso; Ganglio sensorial; Cerebelo (pós-sináptico); Coração; plaquetas
P2X2 Influxo de Ca2+
(Canal de cátion) Gânglio autônomo; Cérebro; Pituitária; Gânglio
sensorial; Músculo liso; retina P2X3 Canal iônico Ganglio sensorial; Neurônio simpático
P2X4 Influxo de Ca2+
(Canal de cátion) Cérebro; Pâncreas; Testículos; Colo; Músculo liso
P2X5 Canal iônico Coração; Intestino; Bexiga; Gânglios autônimos; pele; Timo; cordão espinhal
P2X6 Canal iônico Músculo esquelético; cérebro; neurônio motor espinhal; gânglio autônomo
P2X7
Canais de grande poro de ação prolongada
Células apoptóticas; macrófagos; linfócitos; microglia; pele
P2Y1 Gq/Gn
PLC-β ativado Músculo:NMJs; endotélio; epitélio; células de defesa;
plaquetas; osteoclasto
P2Y2 Gq/Gn; ?Gi
PLC-β ativado Epitélio; endotélio; células de defesa; rins;
osteoclastos
P2Y4 Gq/Gn; ?Gi
PLC-β ativado Células endoteliais
P2Y6 Gq/Gn
PLC-β ativado Célula epitelial; timo; células-T; placenta
P2Y11 Gq/Gn &GS
PLC-β ativado Granulócitos; intestino; baço
P2Y12
Gi Inibição da
adenilato ciclase plaquetas
(Baseado na revisão de Ralevic e Burnstock, 1998)
1.9. Enzimas com atividade fosfoesterásica presente em venenos de
serpentes
1.9.1. Fosfodiesterase
Também chamada de exonuclease, é uma das enzimas mais estudadas,
amplamente distribuída entre os venenos das cinco famílias de serpentes
venenosas. Geralmente usada para estudos da degradação de ácidos nucléicos,
removendo 5’-mononucleotídeos sucessivos da cadeia de polinucleotídeos
15
começando pelo terminal 3’-hidroxila. Usando nucleotídeos sintéticos e a enzima
purificada de Crotalus adamanteus, verificou-se que a extremidade 3’-hidroxila livre
é essencial para atividade da enzima (Varanda e Giannini, 1994).
Alguns venenos contêm mais de uma exonuclease, como no caso de
C.adamanteus, que possui três exonucleases com atividades paralelas à
desoxirribonuclease (DNAase) (Iwanaga e Suzuki, 1979). Quatro isoenzimas da
fosfodiesterase foram identificadas no veneno de Trimeresurus flavoviridis (Habu
snake), sendo metaloglicoproteínas com atividade fosfomonoesterásica desprezível
(Kini e Gowda, 1984).
As fosfodiesterases de veneno são termosensíveis, sendo inativadas a 50oC. A
enzima isolada de Bothrops atrox é uma glicoproteína de cadeia única com massa
130.000 kDa, com pI 9.0. Para substratos artificiais, a enzima é ativa em pH 8.0 -
9.9, com pico em pH 8.4 - 9.2, sendo Mg+2 dependente. A atividade é inibida em
50% por agentes redutores como cisteína 7.5mM. EDTA também é um potente
inibidor, mas a inibição é reversível com a adição de excesso de magnésio. Dos
cátions testados, apenas Cu+2 0.1mM inibe a atividade (Iwanaga e Suzuki, 1979).
Uma fosfodiesterase foi purificada do veneno de Cerastes cerastes, tendo atividade
ótima em pH 9.0 e temperatura de 56oC. Cisteína, ADP e AMP são inibidores da
enzima, sendo a cisteína um inibidor não-competitivo e o ADP competitivo. EDTA
na concentração de 0.5mM causa completa inibição que é revertida com adição de
Ca+2 e Mn+2 (Halim et al, 1987).
Pouco se conhece sobre o sítio ativo da enzima, mas foi demonstrado que a
fosfodiesterase de venenos requer, para atividade, resíduos de triptofano e tirosina
intactos, grupos SH e pontes de enxofre. O p-nitrofenil timidina-5’-fosfato é um dos
substratos artificiais mais rapidamente hidrolisados. A fosfodiesterase de venenos
possui também uma atividade endonucleásica. Ocorre cerca de uma clivagem
endonucleásica para cada clivagem exonucleásica. Adenosinatrifosfato (ATP) e
adenosinadifosfato (ADP) são também hidrolisadas pela fosfodiesterase. Em
Bothrops jararaca a relação entre a atividade ATPásica e fosfodiesterásica. é de
42.0, enquanto em Bothrops atrox é de 74.6. A ligação 5’,5’-fosfodiéster parece
corresponder à ligação 5’,3’. Essa observação sugere que o elemento básico para a
atividade hidrolítica da enzima é o grupo “5’-fosforil nucleosídico” (Iwanaga e
Suzuki, 1979).
16
1.9.2. 5’-Nucleotidase
A 5’-nucleotidase é uma fosfomonoesterase específica, que hidrolisa fosfato
monoéster que se liga na posição 5’ de DNA e RNA. Diferentes mononucleotídeos
podem ser hidrolisados, mas 5’-AMP é o substrato mais susceptível. A enzima não
hidrolisa 3’-AMP, p-nitrofenilfosfato e ribose-5’-fosfato, que são substratos de
fosfomonoesterases não-específicas (Iwanaga e Suzuki, 1979).
O pH ótimo varia para o veneno de cada espécie, mas a atividade máxima está
em um pH próximo de 8,0 e a enzima não requer metais para apresentar atividade
máxima sugerindo que hidrolisa os nucleotídeos sem estarem formando complexo
com metais. A atividade é completamente inibida por 1mM de EDTA de maneira
reversível. A enzima presente no veneno de Crotalus é uma zinco metaloproteina. A
remoção total do zinco resulta na perda da atividade AMPásica, que pode ser
restaurada pela re-adição de zinco na concentração de 1.5M. A reativação também
pode ser feita com adição de íons de cobalto ou cobre (Fini et al., 1990). A
necessidade de Zn2+ parece ser estrutural pois altas concentrações podem inibir a
enzima (Iwanaga e Suzuki, 1979). Essa inibição observada por Iwanaga pode ser
resultado da formação de complexo Zn-AMP, já que a hidrólise de AMP não parece
depender de metais.
Recentemente, as 5’-nucleotidases de venenos, como os de Bothrops,
Crotalus, Haemachantus e Vipera, foram classificadas como sendo do tipo de baixo
Km e forma solúvel. Possuem preferência por hidrolisar AMP, são inibidas de
maneira competitiva por ATP e ADP, possuem uma estreita relação com zinco e pH
ótimo entre 7.0 e 8.0 (Zimmermann, 1992).
Uma potente 5’-nucleotidase purificada do veneno de Trimeresurus gramineus
possui a ação de inibir a agregação plaquetária. Esta enzima é uma glicoproteína
com cadeia polipeptídica única de peso molecular de 74kDa. Possui atividade
nucleotidásica também sobre ADP, que resulta na formação de adenosina. A
remoção do ADP liberado pelos indutores de agregação plaquetária e o acúmulo de
adenosina são responsáveis pelo efeito da 5’-nucleotidase do veneno (Ouyang e
Huang, 1983).
17
1.9.3. Fosfomonoesterase não-específica (fosfatase):
Tem sido descrito a presença de duas atividades fosfatásicas em venenos de
serpentes. Essas atividades apresentem diferentes pHs ótimos, uma em torno de
5.0 (ácida) e a outra 8.5 (alcalina). Alguns venenos contêm ambas as fosfatases,
ácida e alcalina, enquanto outros possuem apenas uma delas.
A fosfatase alcalina purificada de Bothrops atrox possui pH ótimo em 9.5, é
instável ao tratamento térmico e ácido. A enzima é ativada por 1mM de Mg+2 ou
Ca+2, e fortemente inibida por 0.1mM de EDTA, 1mM de cisteína ou 1mM de Zn+2.
Esta enzima é responsável pela hidrólise de mononucleosídeos 3’,5’-fosfato, como
5’-AMP e 3’-AMP. Possui massa molecular de aproximadamente 90-100kDa
(Iwanaga e Suzuki, 1979). A fosfatase alcalina possui forte reação em alguns
venenos, mas pode estar ausente em outros, às vezes em venenos da mesma
espécie. A enzima possui pI entre 3.6 e 4.8, é inativada também por 2-
mercaptoetanol (Acosta et al., 1994).
A fosfatase ácida possui atividade ótima em pH entre 4.5 e 5.0, é inibida por
10mM de fluoreto de potássio e 10mM de EDTA, enquanto o zinco não afeta a
atividade. A enzima purificada da serpente marinha Lacticauda semifasciata
hidrolisa p-nitrofenilfosfato, 2’-AMP, 3’-AMP, 5’-AMP e ATP (Iwanaga e Suzuki,
1979). A fosfatase ácida purificada de veneno de abelha é uma glicoproteína e,
existe em duas formas, com pesos moleculares de 96 e 45kDa. Ela é um potente
alérgeno para pacientes alérgicos a veneno de abelha, capaz de induzir liberação
de histamina de basófilos humanos sensibilizados e induzir reações de pústula e
edema (Barboni et al., 1987).
1.9.4. ADPase/ATPase
Há mais de cinqüenta anos, desde que foi descoberta uma atividade
pirofosfatásica, que pesquisadores vem registrando a presença de atividade
ATPásica em venenos de serpentes (Zeller, 1950; Johnson et al., 1953; Schiripa e
Schenberg, 1964; Pereira Lima et al., 1971; Schenberg et al., 1975; Wei et al., 1981
citado por Aird, 2002; Kini e Gowda, 1982a,b; Mukherje et al., 2000). Pereira Lima et
al. (1971) propuseram que a atividade hidrolítica sobre o ATP era catalisada por
18
uma ATPase livre distinta da fosfodiesterase por que observaram níveis
desproporcionais dessas atividades, em diferentes venenos, outros autores no
entanto relatam uma distribuição proporcional (Boman, 1959 citado por Aird, 2002,
Suzuki e Iwanaga, 1960, Pfleiderer e Ortlanderl, 1963 citado por Aird, 2002). Dez
anos após a descoberta da presença de atividade ATPásica em venenos Sugino
(1960) mostrou que ADP e ATP são substratos para fosfodiesterase, e alguns anos
depois Sulkowski et al. (1963) mostraram evidências que aquele ATP era
hidrolisado através de uma fosfomonoesterase presente no veneno (fosfatase). Kini
e Gowda (1982b) observaram que íons Mg2+ eram essenciais para as duas enzimas
com atividade ATPásica isolada de veneno de Daboja russellii, contudo a
dependência de magnésio também é característica de fosfodiesterases e
fosfomonoesterases (Iwanaga e Suzuki, 1979).
Ultimamente tem sido mais fácil entender a considerável confusão existente
entre essas diferentes enzimas, devido ao aparecimento de novas seqüências.
Enzimas que clivam ésteres de fosfato (A superfamília das fosfoesterase) exibem
três diferentes seqüências para seus temas estruturais, estas seqüências são
conhecidas como os temas de assinaturas das fosfoesterases (Koonin, 1994; Zhuo
et al., 1994; Zimmermann, 1996). Estas seqüências conservadas foram descobertas
em vertebrados, invertebrados e 5'-nucleotidases bacterianas (EC 3.1.3.5), ATP-
difosfohidrolase de mosquito (apirase) (EC 3.6.1.5), diadenosina tetrafofatases de
bactérias (EC 3.6.1.14) (Blanchin-Roland et al., 1986), Ser/Thr fosfoproteina
fosfatases (EC 3.1.3.16) e esfingomielina fosfomonoesterases (EC 3.1.3.).
Até hoje não existe registro que qualquer um tenha tido sucesso no isolamento
de uma ATPase ou ADPase de veneno, demonstrando que essas atividades sejam
distintas da fosfodiesterase e da fosfomonoesterase; porém, a capacidade dos
venenos para hidrolisar ATP e ADP apresentando como produtos de reação,
adenosina, pirofosfato e ortofosfato vem sendo documentado a mais de cinqüenta
anos (Johnson et al., 1953).
20
2. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é estudar as enzimas envolvidas na liberação
de purinas e metabolismo de ATP presente no veneno de Bothrops jararaca,
principal serpente envolvida com acidentes ofídicos no Brasil.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Identificar as enzimas responsáveis pela hidrólise de ATP e ADP
catalisada pelo veneno de Bothrops jararaca.
• Caracterizar a cinética de hidrólise desses substratos.
• Purificar a ou as enzimas envolvidas nesse processo.
22
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Reagentes O veneno de Bothrops jararaca foi fornecido pelo Instituto Butantan – São
Paulo. Os demais reagentes possuem grau de pureza analítico e foram adquiridos
na sua maioria na Sigma-Aldrich, Bio-Rad e Pharmacia.
3.2. Dosagem de proteína
Para normalizarmos a concentração de proteínas que foi utilizada nos ensaios
de atividade enzimática, eletroforese e cromatografia, utilizamos o método descrito
por Bradford (1976) ou por determinação espectrofotométrica a 280 nm segundo
Brown (1980). As dosagens de proteínas foram realizadas utilizando Albumina
Bovina (BSA) como padrão.
3.3. Hidrólise de ATP, ADP e AMP
A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi monitorada medindo o fosfato inorgânico
liberado enzimaticamente utilizando o método de Fiske e Subbarow (1925). Os
ensaios foram feitos em um meio de reação contendo: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0; 3
mM de MgCl2; 3 mM de ATP ou ADP ou AMP; as reações foram iniciadas pela
adição de veneno bruto de B. jararaca em concentrações que variaram entre 0,025
à 0,1 mg/mL, dependendo do ensaio.
3.4. Ensaio de atividade fosfodiesterase
A atividade fosfodiesterase (PDE) foi determinada segundo Razzel (1963)
utilizando p-nitrofenil timidina fosfato (p-NP-TMP) como substrato artificial. O ensaio
foi feito diretamente em uma cubeta contendo 50 mM de tampão Tris-HCl pH8,8, 5
mM de MgCl2, 0,5mM de p-NP-TMP e 0,02mg/mL de proteina a 25C e
constantemente monitorado à 400nm em um espectrofotômetro Specord M-500
Zeiss.
23
3.5. Ensaio de atividade fosfatásica não específica
A atividade foi determinada utilizando p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como
substrato artificial (Sulkowski et al.,1963). A mistura de reação foi composta de 25
mM de Tris-HCl pH 6,8 ou 7,2; 5 mM de MgCl2. 10 mM de p-NPP e 0,1 mg/mL de
proteína. O p-nitrofenol (p-NP) liberado foi determinado pela variação da absorvância
a 410 nm.
3.6. Dependência da concentração de Mg-ATP, Mg-ADP e Mg-AMP sobre a atividade nucleotidásica do veneno.
O meio de reação para as atividades ATPase, ADPase e AMPase continha: 20
mM de Tris-HCl pH 8,8; 5-6 mM de MgCl2; para diferentes concentrações de Mg-
ATP (25-200 μM), Mg-ADP (20-2000μM) ou Mg-AMP (10-1300μM), e iniciada pela
adição de 10 μg de veneno. A concentração de Mg2+ (íon livre) Mg-ATP, Mg-ADP e
Mg-AMP foram calculados usando um método interativo que calcula os complexos
envolvidos no equilíbrio entre Mg2+, H+, tampões aniônicos e as diferentes formas de
nucleotideos. As quantidades no equilíbrio foram calculadas como descrito por
Fabiato e Fabiato (1979) com modificações introduzidas por Sorenson et al. (1986).
3.7. Dependência do pH sobre as atividades fosfatásicas.
Os ensaios de dependência de pH foram feitos seguindo os protocolos
previamente descritos para cada substrato, utilizando os tampões a seguir para os
diferentes intervalos de pH: tampão citrato de pH 2,5 a 3,6; tampão acetato de pH
3,6 a 5,6; tampão Tris-maleico de pH 5,2 a 8,4; tampão Tris-HCl de pH 8,0 a 9,2 e
tampão Tris-carbonato de pH 9,2 a 10,6.
3.8. Curva de termoestabilidade
Os ensaios de estabilidade térmica foram feitos de acordo com Perry e Wetzel
(1984). 15mg de veneno bruto foram diluídos em 15 mL de uma solução tampão
contendo 20 mM de Tris-HCl pH 8,0 com 100 mM NaCl e incubados a 65C. Nos
tempos indicados (0; 5; 10; 16; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60 e 124 min) foram
retiradas alíquotas de 1 mL do meio de incubação e rapidamente resfriadas a 4oC,
24
utilizando um banho de gelo. As atividades foram determinadas a temperatura
ambiente para ATP, ADP, AMP, pNTP e pNPP como descrito anteriormente. Os
resultados de inativação, para cada substrato, foram normalizados como percentual
do controle. Para quantificar o efeito da temperatura foram utilizados dois
tratamentos: num deles o decaimento exponencial da atividade enzimática foi
linearizado utilizando uma escala logarítmica e a partir da equação da reta foram
determinados os valores de D0,5 para cada substrato. O valor de D0,5 foi definido
como o tempo necessário para inibir 50% da atividade em função da temperatura, o
segundo tratamento é denominado de gráfico de segunda-ordem construído a partir
logaritmo natural da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no
tempo t (A0/AT) (Matthews et al. 1987).
3.9. Fracionamento do veneno em Sephacryl S100 (exclusão molecular)
100 mg de veneno bruto de bothrops jararaca foram dissolvidos em 3,5 mL de
tampão de eluição contendo: Tris–HCl 2,5 mM; 150 mM de NaCl pH 7,2,
centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos ou filtrado utilizando uma membrana de
nitrocelulose 0,45 μm e aplicado sobre um gel de sephacryl-S100 HR (Pharmacia)
empacotado manualmente em uma coluna com 72,5 cm (h) x 2,6 cm (D) (BioRad).
Foi utilizado um fluxo de 1,3 mL/min e coletadas amostras de 2,6 mL. Em outro
fracionamento 50 mg de veneno foram dissolvidos em 2mL. O sobrenadante foi
aplicado em coluna de gel filtração Sephacryl S100 HR pré-empacotada (HiPrep™
26/60 320 mL) utilizando um fluxo de 1mL/min em sistema FPLC (Pharmacia). As
cromatografias foram executadas em temperatura ambiente e a eluição das
proteínas monitorada pela absorvância a 280nm. Os tubos contendo as amostras
(2,6mL e 2,0 mL cada) foram reunidos em 8 frações, de acordo com o perfil protéico
obtido no cromatograma. Essas frações foram nomeadas de FI a FVIII.
3.10. Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE Sepharose
A fração FI, que apresentou todas as atividades, foi submetida à cromatografia
de troca iônica em DEAE Sepharose (20mL, sistema FPLC -Pharmacia). Um volume
25
de 10 mL da FI (0,3 mg/mL de proteína), da cromatografia de gel filtração, foi diluído
em 50 mL de Tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Este procedimento permitiu diminuir
a concentração de NaCl da amostra para 50 mM, eliminando o processo de diálise e
posterior concentração, que poderiam propiciar a formação de agregados. Os 60 mL
de amostra foram aplicados em dois estágios na coluna de troca iônica DEAE
Sepharose, utilizando um super-loop de 30 mL. Como tampão A foi utilizado Tris 20
mM, NaCl 50mM, pH 8,0 e como tampão B Tris 20 mM, NaCl 1M, pH8,0 em um
fluxo de 2,5 mL/min. Após lavar a coluna com o tampão A para retirar as proteínas
não retidas, foi aplicado um gradiente de NaCl não linear nas seguintes
concentrações: 100, 150, 200, 250,300 e 1000mM. Para cada concentração de NaCl
utilizada, a coluna foi lavada o equivalente a 5 vezes o seu volume (100mL). A
eluição das proteínas foi monitorada através da absorvância a 280nm. Os tubos
contendo 5mL cada foram reunidos em 6 frações de acordo com o perfil protéico. As
frações foram então nomeadas NR (não retido), F100, F150, F200, F250 e F300. Os
números correspondem às concentrações de NaCl no tampão de eluíção.
3.11. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
A cromatografia líquida de alta performance foi adotada como método de
fracionamento com o objetivo de isolar e purificar as proteínas de interesse ou para
medidas de atividade enzimática pela análise do desaparecimento dos substratos e
acúmulo dos produtos formados.
3.11.1. Fracionamento de proteínas (troca iônica)
Foram utilizadas duas resinas trocadoras de ânions, uma DEAE-BioRad
(Dietilaminoetil), e uma Mono-Q PC 1.6/5 (Smart System Pharmacia). As amostras
de veneno bruto ou de frações semi-purificadas, foram previamente centrifugadas
em uma centrífuga eppendorf a 10.000g e filtradas em membrana Millipore de 0,22
μm. A concentração de proteína aplicada foi dosada como descrito anteriormente ou
estimada espectrofotométricamente por leitura a 280nm utilizando BSA como
padrão. As amostras foram diluídas no mesmo tampão utilizado para equilibrar as
colunas. No fracionamento utilizado DEAE a coluna foi equilibrada em tampão Tris-
26
HCl 20 mM pH 8.8 e as proteínas eluídas com concentrações crescentes de Tris-HCl
20 mM pH 8.8 com NaCl 1,5M (Tampão B) conforme os passos a seguir: 0% de B
(de 0 a 10min), 5% de B (de 10,1 a 30 min), 10% de B (de 30,1 a 50 min) , 15% de B
(de 50,1 a 70 min), 20% de B (70,1 a 90 min), 100% de B (90,1 a 100 min), 0% de B
(de 105,1 à 130 min) com um fluxo de 0,5 mL/min; No fracionamento utilizando
Mono-Q, a coluna foi equilibrada em Tris-HCl 20mM pH 8,0 e as proteínas eluídas
por gradiente linear de 0 a 0,3M (23min) e 1 M de NaCl (conforme indicado),
utilizando um fluxo de 0,1 mL/min.
3.11.2.Determinação da hidrólise de nucleotídeos por HPLC
Os nucleotídeos foram analisados utilizando um sistema HPLC Shimadzu. Nos
tempos indicados 100 µl do meio de reação foram imediatamente transferido para
um banho de gelo e depois injetado sobre uma coluna Whatman Partisil 10 SAX
(Phenomenex 250 x 4,6mm) equilibrada com tampão fosfato 20 mM pH 7,0 (Tampão
A). Os nucleotídeos foram eluídos com um gradiente continuo de 20 mM
NaH2PO4/Na2HOP3, pH 7.0 (Tampão A), a 480 mM H3PO4, pH 6.8 (Tampão B), com
um fluxo de 1 mL/min. O tampão B aumentou linearmente para 80% em 8 min e
então imediatamente indo para 0% de B e permanecendo assim nos 7 minutos
seguintes. A identidade de cada nucleotídeos foi calculada a partir do tempo de
retenção usando padrões comerciais monitorando a absorvância a 259 nm. Os
tempos de retenção foram adenosina (ADO) entre 3,63 e 3,83min, AMP entre 7,39 e
7,56 min, ADP entre 10,08 e 10,61 e ATP entre 12,6 e 13,47 min.
3.12. Cromatografia de afinidade
Foram utilizadas duas colunas uma HiTrap-Blue Pharmacia (Cibacron Blue) e
um ADP-sepharose Sigma. No fracionamento pela HiTrap-Blue 20 mg da fração FI
(liofilizado) foram diluídos em 2,2 mL de tampão Tris-HCl 20mM pH 8,0 (Tampão A)
e após centrifugação, a 14000 rpm por 10 min, foi aplicado sobre a coluna
equilibrada no mesmo tampão e as proteínas retidas foram eluídas utilizando um
tampão Tris-HCl 20mM pH 8,0 contendo 1 ou 2M de NaCl (Tampão B), por
gradiente linear ou discreto variando a concentração do tampão B de 5 em 5%.
27
Quando utilizamos a ADP-sepharose (Sigma) 10mg do Pool S-100 (liofilisado)
foram diluídos em tampão de equilíbrio (tampão A) e centrifugados à 14000rpm por
10 min. O tampão A era composto de 20 mM de tampão Tris.HCl pH 8,0 e 100 mM
de NaCl. As proteínas retidas foram eluídas no mesmo tampão contendo variadas
concentrações de ATP ou ADP ou AMP ou p-NP-TMP entre 50 à 1000 μM.
3.13. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
Esse procedimento foi usado com o objetivo de isolar e purificar as proteínas de
interesse, como critério de pureza e como preparação das proteínas para posterior
sequênciamento.
3.13.1. Em condições não desnaturantes (sem SDS) Os géis em condições não-desnaturantes possibilitam separar proteínas sem
perda da atividade enzimática. Para tanto foram utilizados géis de separação com
variadas concentrações de acrilamida (7, 9, 11, 12, 13 e 15%). Sobre o gel de
separação foi utilizado um gel de empacotamento de 4% de acrilamida. As proteínas
no gel foram submetidas a uma corrente constante de 20 mA, em tempos variados
de 4 a 20h de corrida, em ambiente refrigerado (10oC) segundo adaptação do
método descrito por Davis (1964). Os géis foram polimerizados em um sistema de
eletroforese vertical Mini-PROTEIN II, Bio-Rad. A corrida foi executada em um meio
contendo Tris 25 mM, glicina 0,192M em pH 8,8. O tampão de amostra não
desnaturante continha 60 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 10% de glicerol e 0,025% de azul
de bromofenol.
3.13.2. Em condições desnaturantes (com SDS e 2-β mercaptoetanol)
Nessas condições as amostras foram analisadas quanto ao grau de pureza.
Foram utilizados géis na maioria das vezes com 12% de acrilamida, acrescentando-
se 0,1% de SDS e β-mercaptoetanol. As proteínas no gel foram submetidas a uma
voltagem constante de 150 V durante aproximadamente 40 min de corrida, segundo
o método descrito por LaemmLi (1970). Os géis foram polimerizados em um sistema
28
de eletroforese vertical Mini-PROTEIN II, Bio-Rad. O tampão de corrida contém: Tris
0,025 M, glicina 0,192 M e 0,1% de SDS. O tampão de amostra contém 0,06 M de
Tris-HCl, pH 6,8, 2% de SDS, 5% de 2-β mercaptoetanol, 10% de glicerol e 0,025%
de azul de bromofenol. As amostras foram diluídas em 3:1 de tampão de amostra
(4X concentrado).
3.14. Coloração do gel 3.14.1. Coloração por Comassie Brilhant Blue R-250
Para visualização do perfil total de proteínas, os géis foram corados com
Comassie Brilhant Blue R-250 durante 2h e descorados com uma solução composta
de ácido acético 10% e metanol 40% (v:v) (Weber e Osborn, 1969).
3.14.2. Impregnação por AgNO3
O perfil de proteínas também foi visualizado por impregnação por prata. Os géis
de acrilamida foram incubados com ácido acético a 10%, sob agitação durante 5
min, seguido de duas lavagens com água por dois minutos. A impregnação com
prata foi desenvolvida em solução contendo 10mg de nitrato de prata; 100 µL de
formamida a 37%, em 200 mL de água por 30 min. Em seguida, os géis foram
lavados com água por 10 s e a coloração desenvolvida em solução contendo 60 g
de carbonato de sódio (Fisher Chemical); 100 µL de formamida e 400 μL tiosulfato
de sódio (Fisher Chemical). O processo de coloração foi interrompido com ácido
acético a 10%, tão logo as bandas foram visualizadas.
3.14.3. Atividade enzimática in gel
Enzimas que produzem fosfato inorgânico são hábeis em corar géis pela
insolubilidade do fosfato de cálcio produzido em meio levemente alcalino (Nimmo e
Nimmo, 1882). As bandas brancas do sal de cálcio precipitado são claramente
visíveis quando observadas sobre um fundo escuro e podem ser fotografadas ou
29
digitalizadas. Após a eletroforese em gel de poliacrilamida as fatias de gel foram
incubadas a 37oC em um meio de reação contendo: 20 mM Tris-HCl pH 7,3; 20 mM
de CaCl2; 3 mM de MgCl2 e 3 mM de substrato (ATP, ADP ou AMP) por 4 horas ou
por 12 horas a 10oC.
3.15. Eletroforese Preparativa
Foi utilizado um sistema preparativo da BioRad (PREPCELL). A eletroforese foi
feita utilizando um gel de empacotamento (3%) sem SDS de 1,5 cm de altura e um
gel de separação de 8% com 5,5 cm. As amostras foram preparadas diluindo-se 100
mg de veneno bruto em 4 mL de tampão de amostra (1x) contendo: 0,06 M de Tris-
HCl, pH 6,8, 10% de glicerol e 0,025% de azul de bromofenol, sem SDS e β-
mercaptoetanol. Antes de aplicar sobre o gel, a amostra foi centrifugada a 10000
rpm por 10min a fim de retirar elementos não solúveis presente no veneno bruto. A
corrida foi feita com potência constante de 12W utilizando um meio contendo: Tris
0,025 M e glicina 0,192M. As amostras que saem do gel por mobilidade
eletroforética são arrastadas por um tampão de eluíção apresentando uma
concentração 10 vezes menor que o tampão de corrida com um fluxo ajustado para
0,75 mL/min sendo coletadas alíquotas de 1,87 mL.
3.16. Análises densitométricas
Essa técnica é utilizada para determinação do peso molecular de proteínas
imobilizadas em gel e na determinação das quantidades relativas das proteínas
presentes na amostra. Para tanto utilizamos o programa de análise de imagens Gel-
Perfect, desenvolvido por Bozzo e Retamal (1991). Os géis corados com Comassie
Brillant Blue ou por precipitação por nitrato de prata, foram digitalizados com auxílio
de um scanner de mesa de 19800 DPI de resolução interpolada. A imagem obtida é
transformada em 256 tons de cinza através do Adobe® PhotoShop 7.0, um programa
comercial de tratamento de imagens. O princípio da análise densitométrica utilizado
pelo programa Gel-Perfect, é a conversão dos diferentes tons de cinza em tons de
cores, mediante um algoritmo matricial. Para o cálculo de área, este programa utiliza
outro algoritmo gaussiano. O fator de Gauss será utilizado para calcular as áreas
30
das projeções laterais, que em última análise seriam reflexos das intensidades dos
tons de cores contidos no diagrama do gel. Dessa forma será determinado o padrão
de mobilidade relativa da proteína de interesse bem como sua percentagem em
relação ao conteúdo protéico (corado com Comassie) total na raia do gel analisado.
3.17. Estatística
Os resultados foram expressos como a média ± S.D.. As médias foram comparadas usando um teste-t padrão e p<0,05 foi considerado como indicativo de uma diferença estatística significativa.
32
4. RESULTADOS
4.1. Efeito da temperatura sobre as atividades nucleotidásicas presente no veneno bruto de Bothrops jararaca.
A estabilidade de uma proteína é determinada pela diferença líquida de energia
livre entre a forma enovelada (nativa) e não enovelada (desnaturada). Portanto as
forças que estabilizam essa estrutura estão relacionadas com interações entre a
estrutura primária da proteína (efeito entrópico) e o meio onde ela se encontra,
interferindo na variação de entalpia (∆H) da estrutura. Dessa forma diferenças na
seqüência de aminoácidos de uma estrutura protéica resultam em diferenças na
cinética de inativação térmica, podendo esse parâmetro se constituir numa
ferramenta importante para caracterização de proteínas (Matthews et al., 1987). Os
perfis de inativação por temperatura das atividades nucleotidásicas foram obtidos
medindo-se a hidrólise de ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-NPP a 25oC após incubar
o veneno a 65oC, por diferentes tempos, em um meio tamponado a pH 7,0 na
presença de 150 mM de NaCl (Figura 1). Os resultados demonstram que as
atividades podem ser divididas em dois grupos: um mais termoestável representado
pelas atividades de hidrólise de AMP (3mM) e ADP (3mM) e outro mais termo
sensível relativo às atividades de hidrólise de ATP (3mM), p-NP-TMP (0,5 mM) e p-
NPP (10mM).
4.1.1. Gráfico de primeira ordem da curva de inativação térmica
Para estimar quantas enzimas estariam presente em cada um dos grupos
definidos acima, calculamos as constantes de inativação térmica, para cada
substrato, a partir das representações dos resultados como gráficos de primeira e de
segunda ordem. Nessa representação as atividades no tempo zero foram normalizadas como
100% (controle) e o gráfico construído em escala logarítmica (Figura 2). As
diferenças observadas nos coeficientes angulares (m) das curvas refletem
diferenças na sensibilidade térmica das estruturas protéicas envolvidas na hidrólise
dos substratos. A partir da equação da reta é possível calcular uma constante que
represente a velocidade de inibição da proteína em função da temperatura. Essa
33
Figura 1. Cinética de inativação térmica das atividades nucleotidásicas. O veneno bruto foi incubado a 65oC em solução salina (150mM NaCl). Nos tempos indicados na figura uma alíquota do meio de reação foi retirada e imediatamente colocada a 4oC. As atividades foram medidas a 25oC para (●) ATP (3 mM), (○) ADP(3 mM), (▼) AMP (3 mM), (∇) p-NP-TMP (0,5mM) e (■) p-NPP (10mM). Todos as atividades foram normalizadas para 100% no tempo zero. Os resultados são a media de três experimentos.
% d
e at
ivid
ade
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
% d
e at
ivid
ade
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
34
Figura 2. Gráfico de primeira ordem dos resultados de inativação térmica. As atividades foram normalizadas como % do controle (tempo zero) e o gráfico construído utilizando uma escala logarítmica. Hidrólise de (●) ATP (3 mM), (○) ADP(3 mM), (▼) AMP (3 mM), ( ) p-NP-TMP (0,5mM) e (■) p-NPP (10mM).
Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60
% d
e at
ivid
ade
1
10
100
35
constante, aqui denominada como valor de D0,5, foi calculada para cada
substrato e representa o tempo necessário para que, a uma temperatura constante
de 65 oC, seja inibida 50% da atividade enzimática.
Com exceção da atividade de hidrólise de ATP, todas as atividades testadas
apresentaram um comportamento monofásico nessas condições de ensaio,
apresentando dessa forma um único valor de D0,5. Para a atividade de hidrólise de
ATP foram calculados um valor de D0,5 para cada fase da curva de inativação
térmica. Na tabela I estão representados os valores de D0,5 obtidos a partir do gráfico
de primeira ordem para todos os substratos. As atividades de hidrólise de ADP e
AMP, que fazem parte do mesmo grupo em relação à estabilidade à temperatura,
apresentam uma diferença de 12 minutos nos valores calculados para suas
constantes de inativação térmica (valores de D0,5). Essa diferença nos permite
assumir que as atividades de hidrólise de ADP e AMP sejam catalisadas por
estruturas protéicas distintas. O segundo grupo analisado, formado pelas as
atividades mais sensíveis a temperatura, que hidrolisam ATP, p-NP-TMP e p-NPP,
se mostrou um pouco mais complexo com relação à interpretação dos seus
resultados. Quando consideramos apenas os primeiros 25 minutos de exposição à
temperatura, as atividades apresentam valores de D0,5 muito próximos: 6,3; 6,8 e 5,0
min respectivamente, indicando que essas atividades podem estar sendo catalisadas
pela mesma estrutura. Depois desse tempo a hidrólise de ATP muda de inclinação
enquanto a de p-NP-TMP permanece constante e a de p-NPP, que já é inicialmente
muito baixa, não pode mais ser monitorada. O comportamento bifásico da curva de
inativação térmica pode ser interpretado de algumas formas: uma delas considera a
existência, em uma mistura, de duas proteínas apresentando diferentes
sensibilidades à temperatura. Esse efeito seria observado tanto em preparações
onde estão presentes duas proteínas totalmente diferentes que utilizem o mesmo
substrato, bem como em preparações purificadas que apresentem mais de uma
isoforma de uma mesma proteína (Perry e Wetzel, 1984); uma segunda
interpretação, que não invalida a primeira, considera que as curvas de inativação
térmica de proteínas sejam bifásicas apresentando uma fase inicial com perda
rápida e reversível da estrutura secundária seguida de uma fase mais lenta, porém
com modificações irreversíveis da estrutura secundária da proteína (Twomey and
Doonan, 1987 e Doonan's Home Page). Nesse caso quando uma proteína apresenta
36
TABELA I. Valores de D0,5 (tempo necessário para inibir 50% da atividade
enzimática para uma temperatura constante de 65C) para a inativação das
atividades nucleotidásicas pela temperatura.
Os resultados apresentados foram média de três experimentos (n=3). Os valores de D0,5 para ATP são correspondentes a cada inclinação da curva de inativação térmica.
0,98736AMP
0,99048ADP
0,9885p-NPP
0,9966,8p-NP-TMP
0,98611,5
0,9986,3ATP
r2Valor de D0,5(min)Nucleotídeo
0,98736AMP
0,99048ADP
0,9885p-NPP
0,9966,8p-NP-TMP
0,98611,5
0,9986,3ATP
r2Valor de D0,5(min)Nucleotídeo
37
um perfil de inativação térmica monofásico, o ponto de inativação irreversível ainda
não teria sido alcançado.
Dessa forma poderíamos explicar o comportamento da curva de inativação
térmica obtida quando ATP foi utilizada como substrato de duas maneiras: a primeira
delas a hidrólise de ATP estaria sendo catalisado por pelo menos duas enzimas
diferentes, uma com a mesma cinética de inativação observada para a hidrólise de
p-NP-TMP, e outra um pouco mais termo resistente; a segunda interpretação seria
que a enzima responsável pela hidrólise de ATP estaria alcançando o ponto de
inativação irreversível em um tempo menor que as demais, deixando claro sua
diferença estrutural em relação às outras. Qualquer que seja a interpretação
adotada, a hidrólise de ATP, catalisada pelo veneno, conta com pelo menos uma
estrutura protéica diferente das envolvidas na catálise dos outros substratos.
4.1.2. Gráfico de segunda ordem da curva de inativação térmica
Para testar se a hidrólise de ATP estaria sendo realmente catalisada por uma
estrutura diferente das demais, os mesmos resultados foram representados agora
como um gráfico de segunda-ordem (Matthews et al. 1987). O gráfico é feito a partir
do logaritmo natural da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no
tempo t (A0/AT). As curvas apresentaram diferentes inclinações confirmando a
existência de diferentes estruturas responsáveis pela hidrólise dos substratos, ATP,
ADP, AMP e p-NP-TMP (Figura 3). Os valores de m obtidos a partir da regressão
linear dos pontos da figura 3 estão apresentados na Tabela II.
4.2. Efeito de Cisteína e do Fluoreto de sódio sobre as atividades nucleotidásicas presentes no veneno de Bothrops jararaca.
Um outro recurso aplicado para auxiliar a caracterização de enzimas foi a
utilização de inibidores específicos. Nós testamos o efeito de dois inibidores
clássicos de atividades tipo fosfoesterhidrolases, o fluoreto de sódio (NaF 10mM)
inibidor de fosfatases ácidas de venenos (Tu e Chua, 1966) e a cisteína (Cys 5mM)
potente inibidor de fosfatases alcalinas (Suzuki e Iwanaga, 1958 a e b) e
fosfodiesterases (Razzell e Khorana, 1959) de venenos. Os inibidores foram
38
Figura 3. Gráfico de segunda-ordem dos resultados de estabilidade térmica das atividades nucleotidásicas. O gráfico de segunda-ordem foi feito a partir da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no tempo t (A0/AT). Painel A perfil de estabilidade térmica para ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-NPP. Painel B detalhe evidenciando a diferença de sensibilidade térmica das estruturas responsáveis pela hidrólise de ADP e AMP.
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
ln (A
0/A
T)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
AMP ADP
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
ln (A
0/A
T)
0
1
2
3
4
5AMPADP ATPp-NTPpNPP
A
B
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
ln (A
0/A
T)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
AMP ADP
Tempo (min)0 10 20 30 40 50
ln (A
0/A
T)
0
1
2
3
4
5AMPADP ATPp-NTPpNPP
A
B
39
TABELA II. Valores de m do gráfico de segunda-ordem. Os valores de m foram obtidos a partir a regressão linear das curvas dos gráficos de segunda-ordem da Figura 3. Os resultados apresentados são a média de três experimentos (n=3).
0,9881,1 x 10-30,1189p-NPP
0,9972109 x 10-20,1047p-NP-TMP
0,98970,4 x 10-20,0832ATP
0,98431,0 x 10-20,0181AMP
0,98413,0 x 10-20,0135ADP
r2Taxa de Inibição(nU/s)
Coef. angular
(m)Nucleotídeo
0,9881,1 x 10-30,1189p-NPP
0,9972109 x 10-20,1047p-NP-TMP
0,98970,4 x 10-20,0832ATP
0,98431,0 x 10-20,0181AMP
0,98413,0 x 10-20,0135ADP
r2Taxa de Inibição(nU/s)
Coef. angular
(m)Nucleotídeo
40
testados sobre as atividades nucleotidásicas utilizando ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP
e p-NPP como substratos. Quando cisteína (5mM) foi adicionada ao meio de reação
praticamente aboliu as atividades de hidrólise de ATP e p-NP-TMP, porém não
apresentou efeito inibitório sobre a hidrólise de ADP, AMP e p-NPP Figura 4A.
Desse grupo de atividades resistentes a cisteína só a 5'-nucleotidase já teve esse
efeito relatado (Björk, 1964 e Campos e Yarleque, 1974). O efeito da cisteína sobre
as atividades de hidrólise de ATP e p-NP-TMP sugere que as enzimas envolvidas na
catálise desses substratos apresentem similaridades estruturais. No entanto quando
trocamos cisteína por fluoreto de sódio (NaF) as atividades alteradas passam a ser
as de hidrólise de AMP, ATP e p-NPP, não sendo observado qualquer efeito
inibitório sobre as atividades de hidrólise de ADP e p-NP-TMP, Figura 4B. A Tabela
III apresenta os percentuais de inibição e os valores de p obtidos para cada
atividade.
O conjunto de resultados apresentados até agora, tanto de inativação térmica
como de efeito de inibidores, demonstra claramente que cada atividade testada é
catalisada por uma enzima diferente, sugerindo portanto que o veneno de Bothrops
jararaca apresenta uma ADPase e uma ATPase independentes como parte do
conjunto de enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos presente no
veneno de Bothrops jararaca.
Assumindo a existência de uma ADPase e de uma ATPase independentes nós
estudamos a cinética de hidrólise de nucleotídeos em diferentes condições
experimentais procurando compreender o papel global dessas enzimas no
envenenamento.
4.3. Estudo do metabolismo de nucleotídeos catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca.
4.3.1. Influência do pH sobre as atividades hidrolíticas de ATP, ADP, AMP,
p-NP-TMP e p-nitrofenil fosfato catalisadas pelo veneno bruto de B.
jararaca
As curvas de variação da atividade enzimática em função do pH do meio
refletem o pH no qual importantes grupos trocadores de prótons presentes no sítio
41
Figura 4. Efeito inibitório de cisteína e Fluoreto de sódio sobre as atividades nucleotidásicas. Os meios de reação e a metodologia para cada atividade foram determinadas como descrito nos métodos. As concentrações de inibidores foram (A) 5 mM Cisteína e (B) 10mM de NaF. Os resultados são a média de pelo menos 3 experimentos (p< 0,05).
p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
40
60
80
100
120
p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
40
60
80
100
120
140
160
% o
f con
trol
% o
f con
trol
* *
**
*
*
**
*
A
B
p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
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100
120
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20
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120
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trol
% o
f con
trol
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140
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% d
o co
ntro
le%
do
cont
role
* *
**
*
*
**
*
A
B
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100
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trol
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trol
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*
A
B
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20
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p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
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120
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160
% o
f con
trol
% o
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trol
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*
**
*
p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
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20
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120
p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
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p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0
20
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120
140
160
% d
o co
ntro
le%
do
cont
role
* *
**
*
*
**
*
A
B
42
TABELA III. Efeito de inibidores sobre as atividades nucleotidásicas correspondentes aos dados da figura 4.
NaF (10 mM) Cisteína (5 mM) Substrato % do
controle D.P. n p % do controle D.P. n p
p-NPP-TMP 96,95 0,963 6 0,000003 5,33 1,31 3 0,01789 ATP 39,02 5,8 3 0,010500 1,53 0,388 4 0,00002 ADP 94,46 10,73 3 0,523000 141,87 30,53 6 0,03420 AMP 24,02 1,65 4 0,003000 177,81 47,00 4 0,01790
p-NPP 54,59 4,32 3 0,012300 91,53 9,0 4 0,00260
43
Figura 5. Efeito do pH sobre as atividades nucleotidásicas. Os ensaios foram feitos como descrito nos métodos, para cada atividade, utilizando os seguintes tampões: Citrato (pH 2,5 a 3,6); acetato (pH 3,6 a 5,6); Tris-Maleico (pH 5,2 a 8,4); Tris-HCl (pH 8,0 a 9,2) e Tris-carbonato (9,2 a 10,6). Nos painéis estão representadas as curvas da influência do pH para (A) ATP, (B) ADP, (C) AMP e (D) p-NPP.
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
600
700
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
pH pH
pH pH
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
A B
C D
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
3 4 5 6 7 8 9 10 110,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
pH
pH pH
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
A B
C D
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
600
700
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
600
700
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
pH pH
pH pH
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
A B
C D
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
50
100
150
200
250
300
350
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
3 4 5 6 7 8 9 10 110
100
200
300
400
500
3 4 5 6 7 8 9 10 110,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3 4 5 6 7 8 9 10 110,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
pH
pH pH
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
nmol
/ mg
min-1
A B
C D
44
catalítico estão em seus estados de ionização adequados à catálise. Na Figura 5
observamos as curvas de dependência de pH sobre as atividades de hidrólise de
ATP, ADP, AMP e p-NPP. Com exceção da atividade de hidrólise de p-NPP todas
as atividades apresentaram um pH ótimo muito próximo a pH 8,5. As atividades de
hidrólise de ATP e ADP apresentaram um pH ótimo entre pH 8,5 e 9,2, (Figura 5A e
B); a hidrólise de AMP um pH ótimo entre pH 7,5 e 8,5, (Figura 5C), muito
semelhante aos valores apresentados para diferentes espécies de serpentes entre
pH 7,8 e 9.5, (Iwanaga,1979). A hidrólise de p-NPP apresentou um pH ótimo
próximo de pH 6,8. A dependência do pH para atividade de hidrólise de p-NP-TMP
também foi determinada apresentado pH ótimo semelhante ao das outras atividades
testadas, próximo de pH 8,8 (dados não mostrados). De acordo com esses
resultados todas as atividades, de hidrólise de nucleotídeos, apresentaram um pH
ótimo semelhante (entre pH 8 e 9) sugerindo que essas enzimas possam apresentar
uma atividade proporcional entre elas em qualquer pH no qual estejam inseridas
mantendo assim a eficiência do sistema em transformar ATP em adenosina (ADO).
4.3.2. Curso temporal de hidrólise de nucleotídeos
Com o objetivo de verificar as velocidades iniciais de hidrólise dos substratos
catalisados pelas nucleotidases do veneno de Bothrops jararaca, e estimar a
estequiometria de liberação de fosfato a partir da hidrólise dos nucleotídeos,
acompanhamos o curso temporal de hidrólise de ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-
NPP. Nesse ensaio foram utilizados meios de reação contendo: 20 mM de Tris-HCl
pH 8,8; 5 mM de MgCl2; 3mM de nucleotídeos (ATP ou ADP ou AMP) ou 0,5mM de
p-NP-TMP. Para a atividade de hidrólise de p-NPP utilizamos um meio idêntico
tamponado em pH 6,8 contendo 10 mM de p-NPP (Figura 6). Como podemos
observar o veneno de Bothrops jararaca hidrolisa p-NP-TMP e AMP com uma
velocidade muito superior à observada para a hidrólise de ATP, ADP e p-NPP. A
estequiometria de liberação de fosfato a partir da hidrólise dos nucleotídeos foi
calculada em função da quantidade de fosfato (Pi) liberado no meio após a exaustão
da reação. Esse ponto foi considerado alcançado após decorrer três vezes o tempo
necessário para saturar a curva de hidrólise de substrato em função do tempo.
Nessas condições ATP (3mM) libera um pouco mais de 2 moles de Pi para cada
mol de ATP hidrolisado, diferente dos 3 moles de Pi por mol de ATP esperados já
45
Figura 6. Curso Temporal de hidrólise de nucleotídeos. Os ensaios foram feitos em um meio de reação contendo: 50 mM de tampão MOPS-Tris pH 8,0; 3 mM de MgCl2: 3 mM de substrato (ATP ou ADP ou AMP); 0,08 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. Nos tempos indicados foram retiradas alíquotas de 0,1 mL de meio de reação e o fosfato liberado determinado segundo descrito nos métodos. Nas hidrólises de p-NP-TMP e p-NPP foi determinado o p-nitrofenol liberado no meio de reação a 400 e 410 nm respectivamente. A atividade de hidrólise de p-NPP foi feita em pH 6,8.
Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70
nmol
es/m
g
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
p-NP-TMP p-NPP AMP ATP ADP
46
Pi liberado razão
nmol / mg min-1 AxP / Pi
ATP 29,13 1:2,4
ADP 56,22 1:1,6
AMP 1444 1:1
TABELA IV. Velocidade inicial de hidrólise dos nucleotídeos (mM) e estequiometria de liberação de Pi. As medidas de velocidade de hidrólise de nucleotídeos foram determinadas em um meio de reação contendo: 50 mM de tampão MOPS-Tris pH 8,0; 3 mM de MgCl2; 3 mM de substrato (ATP ou ADP ou AMP); 0,08 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. A proporção AxP/Pi foi determinada após a exaustão do substrato no meio reacional.
47
que o veneno apresenta a capacidade de hidrolisar ATP, ADP e AMP. A hidrólise de
ADP também produziu menos Pi que o esperado, um pouco mais de 1,5 mol por mol
de ADP, Tabela IV. Em função desse resultado resolvemos investigar as vias de
hidrólise de ATP, ADP e AMP catalisadas pelo veneno de Bothrops jararaca.
Apenas a quantificação da liberação de Pi no meio de reação não representa
um bom método para determinação da seqüência de reações de uma via metabólica
onde todas as enzimas envolvidas atuam liberando Pi a partir da hidrólise dos seus
substratos (ATP ADP e AMP). Dessa forma aplicamos um modelo experimental
onde fosse possível quantificar paralelamente o fluxo de nucleotídeos presente no
meio reacional, utilizando HPLC, enquanto se dosava o fosfato inorgânico liberado
no meio.
4.4. Determinação do mecanismo de hidrólise de ATP por HPLC.
A Figura 7 mostra o fluxo de intermediários formados durante a hidrólise de
ATP. Quando 3 mM de ATP são incubados com veneno de Bothrops jararaca, ATP
tem seus grupamentos fosfatos retirados seqüencialmente até formar adenosina
sendo possível detectar a presença de intermediários como ADP e AMP Figura 7 de
B a D. A Figura 7E mostra o acompanhamento detalhado da hidrólise de ATP. Nos
primeiros minutos de reação todas as enzimas envolvidas estão trabalhando. Após
400 minutos a hidrólise de AMP e ADP sofre retro inibição por Pi ou ADO, sendo
abolidas, enquanto a hidrólise de ATP continua. Esse resultado pode explicar a
estequiometria de liberação de fosfato observadas quando utilizamos altas
concentrações de ATP e ADP como mostrado anteriormente.
A mesma abordagem foi utilizada para baixas concentrações de ATP (100μM)
(Figura 8), nessas condições aparentemente o ATP é diretamente transformado em
adenosina sem que seja possível observar a presença de intermediários no meio. Na
(Figura 8D) podemos observar que a produção de adenosina (ADO) a partir de ATP
é linear com uma proporção de 1:1 ATP/ADO. A dosagem de fosfato revelou que
apenas 200 nmoles de Pi são produzidos a partir dos 200 nmoles de ATP
adicionados ao meio de reação, apresentando uma estequiometria de 1:1 ATP/Pi
(Figura 9). O método usado detecta somente fosfato inorgânico livre (Pi), não
detectando PPi ou PPPi. Esse resultado nos leva a uma única interpretação que a
hidrólise de ATP catalisada pelo veneno em baixas concentrações de substrato
48
Figura 7. Análise dos produtos de hidrólise de ATP (3mM) por HPLC. Os nucleotídeos foram analisados usando um sistema HPLC equipado com uma coluna de troca aniônica. Nos tempos indicados foram retiradas alíquotas de meio de incubação (50 μl) e imediatamente colocadas em nitrogênio liquido. As amostras foram posteriormente descongelas, por um minuto a temperatura ambiente, e imediatamente injetadas na coluna equilibrada com tampão A. Os nucleotídeos foram eluídos com um gradiente contínuo dos tampões A e B, sob um fluxo de 1 mL/min. A identidade de cada nucleotídeo foi determinada a partir dos tempos de retenção utilizando padrões autênticos monitorando a absorbância a 259nm (painel A). Painéis de B a D perfil cromatográfico após a hidrólise de ATP (3mM em condições iniciais). Painel E curso temporal de liberação dos produtos de hidrólise de ATP.
A
B
C
1016 min
50
0
50
0100
50
0100 570 min
100
0 5 10
0 200 400 600 800 1000 12000
10
20
30
40
50
0 200 400 600 800 1000 12000
50
100
150
mAb
s25
9 nm
( ●) A
DP
(○) A
MP(
▼) A
DO
(nm
ol)
(□) ATP(nm
ol)
Time (min)
Time (min)
0100
50
D
EA
13.015
13.015
ATP13.015
10.09
10.09
10.09
7.39
7.39
7.39
3.67
3.67
3.67
ADP10.09
AMP7.039
ADO3.67
0 min13.015
A
B
C
1016 min
50
0
50
0100
50
0100 570 min
100
0 5 10
0 200 400 600 800 1000 12000
10
20
30
40
50
0 200 400 600 800 1000 12000
50
100
150
mAb
s25
9 nm
( ●) A
DP
(○) A
MP(
▼) A
DO
(nm
ol)
(□) ATP(nm
ol)
Time (min)
Time (min)
0100
50
D
EA
13.015
13.015
ATP13.015
10.09
10.09
10.09
7.39
7.39
7.39
3.67
3.67
3.67
ADP10.09
AMP7.039
ADO3.67
0 min13.015
49
Figura 8. Análise dos produtos de hidrólise de ATP (100μM) por HPLC. Os nucleotídeos foram analisados usando um sistema HPLC conforme descrito na figura. Nos Painéis de A a C perfil cromatográfico após a hidrólise de ATP (100μM em condições iniciais). Painel D apresenta o gráfico das concentrações de purinas no meio de reação em função do tempo. (●) ATP, (○) ADO e (■) purinas totais.
50
100
0100
min
mAb
s
50
0
A B
DC
Purine(μM
)
13.015
13.015
3.67
3.67
3.67
50
100
0100
min
mAb
s
50
0
A B
DC
Purine(μM
)
13.015
13.015
3.67
3.67
3.67
50
Figura 9. Análise estequiométrica dos produtos de hidrólise de ATP por HPLC. 200 nmoles de ATP foram incubados a 37 C em um meio contendo: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0; 5 mM de MgCl2; e 100 μg/mL de veneno. Na figura estão representados as quantidades de substratos presente no meio de reação (●)ATP; (○) ADO e (▼) Pi. O fosfato inorgânico foi determinado colorimetricamente como descrito em métodos.
0 10 20 30 40 50
0
50
100
150
200
250ATPADOPi
mm
oles
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50
0
50
100
150
200
250ATPADOPi
mm
oles
Tempo (min)
51
TABELA V. Velocidade inicial de hidrólise dos nucleotídeos (μM)
e estequiometria de liberação de Pi.
Pi liberado razão
nmol / mg min-1 AxP/ Pi
ATP 58,5 1:1
ADP 164,5 1:2
AMP 1342,8 1:1
As medidas de velocidade de hidrólise de nucleotídeos foram determinadas por HPLC utilizando um meio de reação contendo: 50 mM de tampão Tris pH 7,2; 3 mM de MgCl2: 22,5 mM de NaCl; 200 μM de ATP ou ADP ou AMP; 0,025 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. A proporção AxP/Pi foi determinada após a exaustão do substrato no meio reacional.
52
Figura 10 - Esquema proposto para o metabolismo de ATP catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca. A rota utilizada quando ATP esta em baixas concentrações (100μM) é 2 vezes mais rápida que a observada para altas concentrações (3mM)
ADP
AMP
ADO
Pi
Pi
Pi
PPi
ATP-pirofosfatase/PDE
ATPase
ADPase
5'-nucleotidase
ATP
ADP
AMP
ADO
Pi
Pi
Pi
PPi
ATP-pirofosfatase/PDE
ATPase
ADPase
5'-nucleotidase
ATPBaixo ATP
[100μM]Alto ATP
[3mM]
ADP
AMP
ADO
Pi
Pi
Pi
PPi
ATP-pirofosfatase/PDE
ATPase
ADPase
5'-nucleotidase
ATP
ADP
AMP
ADO
Pi
Pi
Pi
PPi
ATP-pirofosfatase/PDE
ATPase
ADPase
5'-nucleotidase
ATPBaixo ATP
[100μM]Alto ATP
[3mM]
53
apresenta como produtos adenosina, fosfato inorgânico e pirofosfato como
representada pelo esquema de reação abaixo.
ATP → ADO + PPi + Pi
Na Tabela IV observamos a estequiometria de liberação de fosfato a partir de
ATP, ADP e AMP utilizando a mesma metodologia acima. A partir desse conjunto de
resultados, propomos os seguintes esquemas de reação para o metabolismo de ATP
e ADP catalisado pelo veneno (Esquema I).
4.5. Parâmetros cinéticos das atividades fosfatásicas do veneno.
Uma vez conhecida a estequiometria de liberação de fosfato para ATP, ADP e
AMP os parâmetros cinéticos para hidrólise desses substratos a partir do fosfato
liberado no meio de reação foram determinados, mesmo utilizando veneno bruto.
Isso foi possível uma vez que as atividades se comportam como um sistema
acoplado de degradação de ATP onde o último passo, de hidrólise de AMP, não
limita a velocidade dos passos anteriores apresentando uma velocidade bem mais
alta. A Figura 11(Figura 11 de A a C) mostra a representação de Michaelis-Menten
para o gráfico de concentração de substrato versus velocidade de formação de
produto para as três atividades e o gráfico recíproco de Lineweaver-Burk (Figura
11D). A velocidade de formação de produto aumenta com o aumento da
concentração de substrato de acordo com uma hipérbole retangular. O valor de KM
para atividades ATPase/PDE calculado a partir de três experimentos foi de 93,18 ±
5,91 μM e sua VMáx. 373,71 ± 18,38 nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11A). A atividade
ADPase tem um valor de KM de 336,56 ± 14,89 μM e de VMáx. de 311,56 ± 5,65
nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11B) (n=3). O valor de KM para a atividade AMPase foi
472,0 ± 9,73μM VMáx. 2056,75 ± 241,34 nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11C) (n=3). Os
valores de KM foram obtidos a partir das velocidades iniciais considerando as
velocidades abaixo de 80% da velocidade na saturação. A razão VMax/KM revela que
a AMPase apresenta uma eficiência catalítica ligeiramente maior que a ATPase e
mais de quatro vezes superior a da ADPase. A razão das velocidades máxima da
ATPase/ADPase foi de 1:1 e da AMPase/ATPase de 5.5:1.
54
Figura 11. Determinação dos parâmetros cinéticos de hidrólise dos nucleotídeos. Os painéis de A à C representam os gráficos de Michaelis-Menten para as hidrólise de (A) ATP, (B) ADP e (C) AMP. 100 μg de veneno foram incubados a 37oC com diferentes concentrações indicadas em um meio de reação contendo: ≥ 5mM Mg2+(livre) e 20 mM de Tris-HCl pH 8,8. Após 10 min as reações foram paralisadas e as concentrações de ortofosfato inorgânico medidas. Painel D gráfico de Lineweaver-Burk para as atividades de hidrólise de ATP (●), (○) ADP e (▲) AMP. Os dados representados foram média de três experimentos e as concentrações de Pi e Mg-AxP foram calculados como descrito em métodos.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
50
100
150
200
250
-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
2x10-3
4x10-3
6x10-3
8x10-3
10x10-3
12x10-3
14x10-3
16x10-3
18x10-3
ATPADPAMP
0 100 200 300 400 5000
200
400
600
800
1000
1/V
1/[S]
nmol
Pi /
mg
min
-1nm
olPi
/ m
g m
in-1
[Mg-ATP] (μM)
[Mg-AMP] (μM)
A B
C
nmol
Pi /
mg
min
-1
[Mg-ADP] (μM)D
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
50
100
150
200
250
-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
2x10-3
4x10-3
6x10-3
8x10-3
10x10-3
12x10-3
14x10-3
16x10-3
18x10-3
ATPADPAMP
0 100 200 300 400 5000
200
400
600
800
1000
1/V
1/[S]
nmol
Pi /
mg
min
-1nm
olPi
/ m
g m
in-1
[Mg-ATP] (μM)
[Mg-AMP] (μM)
A B
C
nmol
Pi /
mg
min
-1
[Mg-ADP] (μM)D
55
4.6. Fracionamento do veneno de Bothrops jararaca Nos últimos cinqüenta anos nenhum grupo teve sucesso no isolamento das
enzimas envolvidas na hidrólise de ATP e ADP (Aird, 2002) presente em venenos, e
praticamente todas as preparações purificadas de fosfodiesterase e 5'-nucleotidase
são contaminadas com atividade de hidrólise de ATP e/ou ADP, freqüentemente
atribuída a fosfatases não específicas. Na tentativa de entender melhor essa
realidade, aliado ao fato de que pelo menos em termos cinéticos as atividades
ADPase e a ATPase sejam catalisadas por enzimas distintas da outras atividades
fosfoesterásicas, como a 5´-nucleotidase e fosfodiesterase, repetimos alguns passos
percorridos por esses grupos, que buscaram o isolamento dessas enzimas, na
tentativa de obter respostas que possam esclarecer esse fato.
Na tentativa e isolar e purificar a atividade ADPase foram utilizadas técnicas
cromatográficas e eletroforéticas, tais como: cromatografia por exclusão molecular
(sephacryl-S100); cromatografia de troca iônica (DEAE), cromatografia por afinidade
(Hi-Trap Blue) e eletroforese não desnaturante.
4.6.1 Fracionamento por cromatografia de exclusão molecular Como primeira abordagem de isolamento das atividades nucleotidásicas do
veneno, utilizamos cromatografia por exclusão molecular objetivando obter uma
preparação enriquecida com as atividades de interesse, uma vez que os dados
literários, pelo menos para outras serpentes, indicavam que todas as enzimas com
atividade nucleotidásica apresentavam uma faixa muito próxima de massas
moleculares, entre 100 e 130 kDa (Iwanaga e Suzuki, 1979). Na Figura 12
observamos o perfil cromatográfico quando utilizamos uma coluna de exclusão
molecular Sephacryl-S100 empacotada manualmente. 30 mg de amostra de veneno
foram diluídos em meio contendo 20 mM deTris-HCl pH 7,2 com 150mM NaCl e
após centrifugação à 15000 rpm por 10 min, o sobrenadante (limpo e transparente)
foi aplicado sobre a coluna. Os picos protéicos foram agrupados e nomeados de FI,
FII, FIII, FIV, FV, FVI, FVII e FVIII. Como esperado as atividades eluíram todas
juntas, no entanto estavam dentro do volume de exclusão da coluna (V0 = 130mL)
entre 60 e 96mL (Figura 12ª). A fração FI apresentou um incremento das atividades
na ordem de 20 vezes quando comparado com o veneno bruto (Figura 12B). A
56
Figura 12. Cromatografia de gel filtração. Painel A 30 mg de veneno bruto de Bothrops jararaca foram diluídos em 2,5 mL do tampão de eluição, Tris-HCl 2,5 mM 150 mM de NaCl pH 7,2, centrifugado e filtrado e aplicado sobre uma coluna de exclusão sephacryl-S100 de 72,5 cm x 2,5 (BioRad), utilizado um fluxo de 1,3 mL/min e coletadas amostras de 2,6 mL e monitoradas espectrofotométricamente a 280 nm, a barra horizontal delimita a região onde estão presentes todas as atividades. Painel B determinação da atividade AMPase no veneno bruto e na fração FI.
Número da Fração0 20 40 60 80 100
AB
S 2
80 n
m
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tempo min0 20 40 60 80 100 120 140
nmol
es d
e P
i / m
g P
TN
0
100
200
300
400
500
V. Bruto
Pool S-100
nmol
es p
NP/
mg
ptn
0
100
200
300
400
500
600
V.B.
S-100
A
B
Número da Fração0 20 40 60 80 100
AB
S 2
80 n
m
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Tempo min0 20 40 60 80 100 120 140
nmol
es d
e P
i / m
g P
TN
0
100
200
300
400
500
V. Bruto
Pool S-100
nmol
es p
NP/
mg
ptn
0
100
200
300
400
500
600
V.B.
S-100
A
B
FI
FII FIII
FV
FIV FVI
FVII
FVIII
57
Figura 13. SDS-PAGE 12% do veneno bruto e do Pool S100 com β-mercaptoetanol. Foram aplicados 50μg de VB e fração FI sobre o gel e para "corrida" foi aplicada uma voltagem constante de 150V durante 2h a temperatura ambiente.
PM VB FI
66.000
45.000
18.000
14.000
Da
21.000
58
Figura 14 - Cromatografia gel filtração. Amostra de 50 mg de veneno foi aplicada na coluna e eluída com Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 em um fluxo de 1 mL/min. O perfil de eluíção das proteínas foi monitorado a 280 nm. Os tubos, contendo 2 mL cada, foram agrupados de acordo com os picos protéicos e as frações nomeadas FI a FVIII.
VoVo
59
análise por eletroforese apresentou um resultado bastante surpreendente, o pool S-
100 apresentou uma grande quantidade de proteínas de baixo peso sugerindo que
as proteínas do veneno mostram uma grande tendência de formar complexos
(agregados solúveis), mesmo na presença de 150 mM de NaCl no tampão de
eluíção, (Figura 13). Para diminuir a interação proteína-proteína repetimos o
fracionamento equilibrando a coluna com uma força iônica mais alta (300mM de
NaCl), (Figura 14). Como podemos observar além da coluna resolver melhor o
fracionamento, isolando o pico com atividade (FI), todas as proteínas foram incluídas
dentro do volume de retenção da coluna (> 100mL). Embora o aumento da força
iônica tenha diminuido bastante a interação proteína-proteína, a análise por
eletroforese das frações de alto peso (FI, FII, FIII e FIV) revela ainda a presença de
proteínas de baixo peso eluindo na fração FI, (Figura 15). Essa fração apresentou
proteínas com massas entre 50 e 250kDa, o que sugere a existência de uma grande
força de atração estabilizando esses complexos protéicos. Um outro aspecto
interessante nesse fracionamento está na presença da proteína de 133 kDa que elui
nas frações FI e FII e dentro do volume de retenção dessa coluna, que exclui
proteínas acima de 100 kDa. Esse resultado pode ser interpretado de duas
maneiras: as proteínas de alto peso presente nessas frações poderiam estar
interagindo diretamente com a matriz da coluna, retardando sua saída e
aumentando assim o volume de eluíção, para isso teríamos que assumir que essas
proteínas apresentem uma afinidade muito alta por açúcares, já que essa matriz foi
especialmente desenvolvida visando diminuir a interação de glicoproteínas com a
fase estacionária (matriz formada por esferas de alil dextran e N,N’-
metilenobisacrilamida); uma segunda interpretação seria que a etapa de
concentração das amostras, envolvendo diálise e liofilização, que propiciaria a
interação entre as proteínas formando agregados, solúveis, que são detectados na
eletroforese como proteínas de alto peso. A interação proteína-proteína presente
nessa fração parece bastante forte uma vez que esses oligômeros protéicos de alto
peso se mostram estáveis mesmo na presença de 0,1% de SDS.
4.6.2. Fracionamento por cromatografia de troca iônica (DEAE) A fração FI obtida a partir do fracionamento do veneno em Sephacryl S100 foi
recromatografada em coluna de troca aniônica DEAE. Para minimizar a formação
60
Figura 15 - Perfil eletroforético de algumas frações da Sephacryl S-100. Gel de poliacrilamida (12%) em condições desnaturantes sem β-mercaptoetanol. PM - Marcadores de peso molecular; VB - veneno bruto; FI, FII, FIII e FIV - Frações obtidas na cromatografia em Sephacryl S-100. Para VB,FI,FII e FIII foram aplicados 15 μg fr proteína e para FIV foram aplicados 10μg de proteina. Gel corado com Coomassie.
61
Figura 16 - Perfil eletroforético de algumas frações da DEAE. Um total de 3,0 mg de proteína da fração FI foi aplicada em DEAE Sepharose e eluída com um gradiente não linear, com concentrações de NaCl de 100, 150, 200, 250, 300, e 1000 mM. Tampão A: Tris 20 mM, NaCl 50mM, pH8,0. Tampão B: Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0. Fluxo de eluição 2,5 mL/min. As frações foram nomeadas de acordo com a concentração de sal em que foram eluídas.
62
de agregados a fração FI obtida da Sephacryl S100 foi diretamente diluída em
tampão Tris 20 mM pH 8,0 ajustando a concentração de NaCl para 50 mM. Os 60
mL dessa amostra foram aplicados à coluna em duas etapas utilizando um super-
loop de 30 mL. Na (Figura 16) observamos o perfil de eluíção utilizando um
gradiente descontínuo de NaCl monitorando a presença de proteínas a 280 nm. As
amostras obtidas na DEAE foram agrupadas em frações nomeadas de acordo com
a concentração de NaCl, F100, F150, F200, F250, F300. Para a análise
eletroforética foram retiradas alíquotas de 50 μL das frações e aplicadas sobre um
gel SDS-PAGE 12%. Podemos observar uma grande complexidade protéica, nas
frações F100, F150, F200 e apenas uma proteína majoritária na fração F250 (Figura
17). Mesmo sem a etapa de concentração podemos observar a presença de
proteínas acima de 100kDa. Quando comparamos o perfil protéico das frações
DEAE obtidos em condições desnaturantes com o perfil obtido em condições não
desnaturante, (Figura 18 A), observamos que as proteínas que compõe as frações,
apesar de possuírem as mesmas faixas de massas moleculares, formam agregados
com diferentes padrões de mobilizações eletroforética. Essa diferença também
ocorre na região onde se concentram as bandas com atividades nucleotidásicas
observadas no veneno bruto, (Figura 18C).
4.6.3. Determinação da atividade nucleotidase pelas frações obtidas pela DEAE.
As frações obtidas a partir do fracionamento de FI em DEAE Sepharose
tiveram sua atividade nucleotidásica determinada para a hidrólise de ATP e AMP.
As frações F100, F150, F200 foram capazes de hidrolisar os dois nucleotídeos,
porém apresentando diferenças na capacidade de utilização desses substratos,
enquanto a fração F250, que apresentou uma única banda de 68kDa, só foi capaz
de hidrolisar AMP (Figura 19). As frações que apresentam as duas atividades
(F100, F150 e F200) aparentemente apresentam a mesma composição de
proteínas, levando em consideração a distribuição de massas, contudo existem
diferenças nas quantidades relativas de cada banda, (Figura 17). O padrão de
migração eletroforética das proteínas em gel nativo apresentou diferenças ainda
mais marcantes no padrão de distribuição de bandas entre as frações, (Figura 18).
Essas diferenças de composição protéica, e de comportamento em relação à
63
Figura 17 - Eletroforese em gel das frações da DEAE Sepharose. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína para FI. Para as frações foram aplicados 50 μl de amostra. Total de proteínas: NR = 3 μg ; F100 = 5 μg; F150 = 6,7 μg; F200 = 10 μg; F250 = 2 μg; F300 não determinada. PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata.
kDa PMkDa PM
64
Figura 18 - Eletroforese em gel não desnaturante das frações da DEAE Sepharose. A PAGE 12% correu por 16h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína para FI. Para as frações foram aplicados 50 μl de amostra. Total de proteínas: NR = 3 μg ; F100 = 5 μg; F150 = 6,7 μg; F200 = 10 μg; F250 = 2 μg; F300 não determinada. (A) A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata. (B) 50μg da Fração FI foram corridas nas mesmas condições anteriores e a presença de proteínas determinada por coomassie blue ou (C) incubada com meio de reação contendo 20mM de Tris-HCl pH 7,0; 3mM de AMP; 3mM de MgCl2 e 20 mM de CaCl2, as bandas com atividade identificadas pela formação de precipitado branco de fosfato de cálcio.
FI FI
A B CFI FIFI FI
A B C
65
Figura 19 - Atividade nucleotidásica das frações da DEAE Sepharose. A atividade nucleotidásica foi feita utilizando um meio de reação contendo: 50 mM de Tris pH 8,8; 5mM de MgCl2; 5 mM de ATP ou AMP; 100μl das frações. O fostato liberado determinado pelo método de Fiske e Subarrow.
Fração0 5 10 15 20 25 30 35 40
nmol
es d
e P
i
0
5
10
15
20
25
30AMP ATP
NaC
l mM
0
200
400
600
800
1000
1200
66
formação dos complexos, provavelmente estão relacionados com a utilização
diferenciada dos substratos. Um outro aspecto interessante é que as frações que
apresentaram as duas atividades apresentaram também bandas de alto peso, entre
120 e 130 kDa. Como foram omitidas, nesses experimentos, as etapas de
concentração (diálise e liofização) que poderiam estar favorecendo a formação de
agregados gerando bandas de alto peso nas análises eletroforéticas, as proteínas
de alto peso (acima de 100kDa) presentes na fração devem então apresentar uma
alta afinidade por açúcares, explicando sua presença dentro do volume de retenção
da Sephacryl S100. Essa mesma propriedade poderia também estar relacionada
com a formação e estabilização dos complexos observados na análise por
eletroforese no gel nativo da Figura 18.
Como as frações com atividades obtidas na DEAE apresentaram variações
nas quantidades de proteínas de mesma massa e diferenças significativas no
padrão de migração eletroforética em gel não desnaturante é possível que essas
variações estejam interferindo na estrutura do complexo regulando as atividades
enzimáticas provocando as diferenças nas proporções de atividades ATPase e 5'-
nucleotidase das frações. Essa capacidade de formar complexos certamente deve
estar relacionada também com a freqüente dificuldade observada no isolamento
dessas proteínas. As mudanças na estrutura do complexo durante as etapas de
purificação poderiam estar envolvidas na perda ou diminuição do níveis dessas
atividades dificultando seu isolamento.
4.6.4. Fracionamento por cromatografia de afinidade HiTrap-Blue (Cibacron Blue)
Como nas condições aplicadas no fracionamento pela troca iônica as
atividades co-eluíram, resolvemos utilizar uma coluna de afinidade HiTrap-Blue HP
(5mL) da Pharmacia para FPLC. A coluna foi equilibrada com 20mM de Tris-HCl pH
6,8 (tampão A). 22mg de veneno bruto de Bothrops jararaca foram diluídos em
tampão A, centrifugados a 14000 rpm por 10 min e o sobrenadante aplicado à
coluna utilizando um fluxo de 1mL/min. As proteínas foram eluídas utilizando um
gradiente discreto com tampão B contendo 20mM de Tris-HCl pH 8,8 com 2M e
NaCl nas concentrações de 100, 200, 300, 400, 500 600 e 2000 mM (Figura 20).
Em cada etapa foram passados 3 vezes o volume da
67
Figura 20. Cromatografia de afinidade HiTrap Blue. Um total de 22 mg de veneno foram aplicados em HiTrap Blue HP e eluída com um gradiente não linear, com concentrações de NaCl de 100, 200, 300, 400, 500, 600 e 2000 mM. Tampão A: Tris-HCl 20 mM pH 6,8. Tampão B: Tris-HCl 20 mM, NaCl 2 M, pH 8,8. Fluxo de eluição 1 mL/min. As frações foram nomeadas de acordo com a concentração de sal em que foram eluídas.
Fração0 20 40 60 80 100 120 140 160
280
nm
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% N
aCl 2
M
0
20
40
60
80
100
120
P100
NR
P200
P300P400
P500
P600
P2000
Fração0 20 40 60 80 100 120 140 160
280
nm
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% N
aCl 2
M
0
20
40
60
80
100
120
P100
NR
P200
P300P400
P500
P600
P2000
68
Figura 21. Determinação da atividade nucleotidásica das frações HiTrap-Blue. Para as atividades de hidrólise de ATP, ADP e AMP foi utilizando um meio
de reação contendo: Tris-HCl 20 mM pH 8,8; 5mM de MgCl2; 5mM de substrato
(ATP,ADP ou AMP) e 0,2 mL das frações. As atividades foram determinadas a
partir do fosfato liberado no meio de reação pelo método de Fiske e Subarrow.
Para a atividade p-NP-TMP o meio de reação continha: 50 mM de Tris-HCl pH
8,8; 5 mM de MgCl2; 10 μL das frações HiTrap Blue. A atividade foi monitorada a
410nm.
NaCl mM
0 100 200 300 400 500 600 700
nmol
Pi/m
g m
in-1
(ATP
)
0
50
100
150
200
250
nmol
PN
P / m
g m
in-1
0,0
5,0e+5
1,0e+6
1,5e+6
2,0e+6
2,5e+6
nmol
Pi /
mg
min
-1 (A
DP
)
0
200
400
600
800
1000
nmol
Pi /
mg
min
-1(A
MP)
0
2000
4000
6000
8000
69
Figura 22. Eletroforese em gel das frações da HiTrap-Blue HP. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 10 μg de proteína de cada fração: VB (veneno bruto); NR (não retido); P100; P200; P300. PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata.
PM VB NR P100 P200 P300
66
4529
1814
kDa PM VB NR P100 P200 P300PM VB NR P100 P200 P300
66
4529
1814
kDa
70
coluna. As frações obtidas foram agrupadas e nomeadas de acordo com a
concentração de NaCl: NR (não retido), P100, P200, P300, P400, P500, P600 e
P2000. As frações eluídas foram concentradas, em um concentrador Speed Vac. e
a atividade nucleotidásica determinada utilizando ATP, ADP, AMP e p-NP-TMP
como substratos, (Figura 21). As atividades fosfodiesterase (p-NP-TMPase) e 5'-
nucleotidase (AMPase) estão separadas uma da outra porém ambas as frações são
contaminadas com atividade ATPase. A atividade 5'-nucleotidase também co-elui
com a atividade ADPase. Esse resultado reproduz exatamente o panorama das
preparações purificadas de 5'-nucleotidase e fosfodiesterase de venenos obtidas
por outros grupos (Iwanaga e Suzuki, 1979). As amostras com atividade obtidas na
HiTrap Blue foram analisadas por eletroforese (Figura 22). Embora tenhamos
conseguido separar parcialmente as atividades de interesse todas as frações
apresentaram uma grande quantidade de proteínas entre 23 e 45 kDa com massas
moleculares menores que os 100 kDa esperados para essas atividades.
4.6.5. Fracionamento da fração FI em coluna de afinidade HiTrap-Blue. Como as atividades ADPase e 5'-nucleotidase co-eluíram nas condições
anteriores modificamos o protocolo e aplicamos a fração FI (Sephacryl S-100)
enriquecida com as atividades nucleotidásicas na coluna HiTrap-Blue. 20 mg de
fração FI foram diluídos em 2,2 mL de tampão A contendo 20mM de Tris-HCl, pH
8,0. A amostra foi centrifugada e 2mL do sobrenadante foram aplicados a coluna
utilizando um fluxo de 2mL/min. Após passar 5 vezes o volume da coluna de
tampão A (25 mL) as proteínas retidas foram eluídas por gradiente linear de NaCl
de 0 a 100% de tampão B, contendo: 20mM de Tris pH8,0 e NaCl 1M, em 27 min. A
presença de proteínas foi monitorada a 280nm. Após o fracionamento foram
determinadas as atividades de hidrólise de ADP e AMP pelas frações. 50 μL das
frações foram adicionados a um meio de reação contendo 20mM de Tris-HCl, pH
8,8; 3 mM de MgCl2; 3 mM de ADP ou AMP, (Figura 23). Nessas condições foi
possível separar parcialmente as atividades, confirmando os resultados obtidos a
partir dos estudos da cinética de utilização de substratos pelo veneno bruto.
71
Figura 23. Cromatografia de afinidade HiTrap-Blue em gradiente. Um total de 20 mg de FI foram aplicados em coluna HiTrap-Blue HP e eluída com um gradiente linear de 0 a 100% de tampão B: Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0. Fluxo de eluição 2 mL/min. As atividades de hidrólise de ADP e AMP foram determinada utilizando um meio de reação contendo: 20mM de Tris-HCl, pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 3 mM de ADP ou AMP e 50 μL das frações. A atividade foi determinada quantificando o Pi liberado no meio.
Fração
0 10 20 30 40 50
Abs
660
nm
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00ADPAMP
% N
aCl 1M
0
20
40
60
80
100
120
Fração
0 10 20 30 40 50
Abs
660
nm
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00ADPAMP
% N
aCl 1M
0
20
40
60
80
100
120
72
Figura 24 - Fracionamento do veneno em coluna ADP-Sepharose. 33 mg de veneno foram diluídos em tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0 com 100 mM de NaCl. As setas indicam a mudança de tampão primeiro com 0,5 mM de p-NP-TMP, depois com 1 mM de ADP. A proteína foi determinada pelo método de Bradford. O fosfato foi determinado utilizando reagente de Fiske e Subarrow e o p-nitrofenol liberado determinado à 410 nm.
p-NP-TMP
ADP
p-NP-TMP
ADP
73
4.6.6. Fracionamento do veneno utilizando coluna de afinidade ADP-Sepharose
Na tentativa de isolar completamente a atividade ADPase das outras
atividades, o veneno foi fracionado utilizando agora uma coluna de afinidade ADP-
Sepharose Sigma(2mL). 33 mg de veneno foram diluído, em Tampão A contendo
20 mM de Tris, pH 8,0; 100 mM de NaCl, centrifugado e aplicado a coluna de
afinidade. Para que houvesse um maior carregamento de proteínas na coluna a
amostra foi passada 5 vezes pela coluna. Após a aplicação a coluna foi lavada com
50mL de tampão A. As proteínas retidas foram eluídas em tampão contendo 20 mM
de Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM de NaCl com substrato (0,5 mM de p-NP-TMP ou 1mM
de ADP), (Figura 24). Uma vez que todas as enzimas de interesse apresentam
diferentes afinidade por nucleotídeos tentamos eluílas utilizando seu substrato
preferencial. Após o carregamento das proteínas na coluna tentamos eluír a
fosfodiesterase (PDE) com p-NP-TMP. Ao passar pela coluna esse substrato foi
imediatamente hidrolisado liberando p-nitrofenol (produto de cor amarela), no
entanto quando dosamos proteína nessas frações por Bradford nenhuma proteína
foi detectada. A coluna foi então lavada com tampão A e em seguida adicionado
tampão de eluíção contendo 1 mM de ADP. A fração obtida continha proteína e foi
capaz de hidrolisar todos os substratos (ATP, ADP, AMP e p-NP-TMP). A análise
por eletroforese revelou a presença de uma única banda protéica com massa de
110kDa, (Figura 25A). A massa obtida nessa fração está de acordo com as massas
obtidas em trabalhos de isolamento e caracterização dessas enzimas utilizando gel
filtração: a fosfatase não-específica entre 90 e 100kDa (Sulkowski et. al., 1963;
Suzuki e Iwanaga, 1960); a fosfodiesterase entre 115 e 130 kDa (Frischauf e
Ecksntein, 1973; Philipps, 1975); e a 5'nucleotidase uma massa próxima a 100kDa
(Chen e Lo, 1968, Sulkowski et al. 1963, Suzuki e Iwanaga, 1960). Nos nossos
resultados, também utilizando gel filtração, a fração com atividade elui próximo do
volume morto (V0) da coluna, região esperada para proteínas de massa próxima a
100 kDa. O fato de p-NP-TMP não eluir nenhuma proteína, mas ser hidrolisado ao
passar pela coluna indica que a PDE não esteja ligada à coluna pelo sítio ativo,
permitindo assim que o substrato possa ser hidrolisado. Como ADP eluiu todas as
atividades juntas propomos o seguinte modelo representado na (Figura 26).
74
Figura 25. Eletroforese da fração eluída por ADP da ADP-Sepharose. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína da fração FADP: PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por Commassie Blue. Painel A na ausência de agente redutor. Painel B na presença de agente redutor na amostra e durante a corrida no tampão do compartimento superior do sistema de eletroforese.
50
30
35
75
105
160250
50
30
35
75
105
160250
A BPM PMkDa kDa
FADP FADP
kDa34333229
50
30
35
75
105
160250
50
30
35
75
105
160250
A BPM PMkDa kDa
FADP FADP
kDa34333229
75
Figura 26. Representação esquemática da eluição das nucleotidases da ADP-Sepharose.
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
p-NP-TMP
p-NPTMP+
Tampão de eluição com p-NP-TMP
Eluíção
Complexo de nucleotidases
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
p-NP-TMP
p-NPTMP+
Tampão de eluição com p-NP-TMP
Eluíção
Complexo de nucleotidases
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Tampão de eluição com ADP
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidasesMatriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Tampão de eluição com ADP
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Eluíção
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Eluíção
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
p-NP-TMP
p-NPTMP+
Tampão de eluição com p-NP-TMP
Eluíção
Complexo de nucleotidases
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
p-NP-TMP
p-NPTMP+
Tampão de eluição com p-NP-TMP
Eluíção
Complexo de nucleotidases
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Tampão de eluição com ADP
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidasesMatriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Tampão de eluição com ADP
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Eluíção
Matriz(Sepharose) ADP
ADP
ADP
ADP
ADPADP
ADP
ADP
ADP
ADPase
ATPase
5'-nucleotidase
PDE
ADP
Complexo de nucleotidases
Eluíção
76
Nesse esquema as proteínas estariam ligadas uma a outra formando um complexo
que se fixaria à coluna pela ADPase deixando livre o sítio da fosfodiesterase (PDE)
para hidrolisar p-NP-TMP, eluíndo apenas os produtos, timidina-fosfato e p-
nitrofenol (amarelo a pH alcalino). A troca de tampão, contendo ADP removeria o
complexo, explicando a presença de todas as atividades na fração eluída. No
entanto, quando a mesma amostra é corrida na presença de agente redutor (β-
mercaptoetanol), tanto no tampão de amostra como no tampão de corrida, a banda
de 110 kDa origina quatro bandas com massas menores, 34kDa, 33kDa, 32kD e
29kDa, sendo que as duas últimas são mais intensas. Esse resultado sugere que a
proteína de 110kDa é na verdade um oligômero formado por quatro sub-unidades
de massa aproximada de 30kDa. Proteínas apresentando a mesma massa
molecular também aparecem no fracionamento do veneno pela HiTrap-Blue, que
também teve β-mercaptoetanol no tampão de amostra na sua análise eletroforética,
contudo naquele ensaio não foi adicionado agente redutor no tampão de corrida,
podendo ser notada a presença, ainda que em baixa quantidade, de proteínas de
alto peso nessas frações, (Figura 22). A presença de quatro cadeias peptídicas na
presença de agente redutor, coincidindo com quatro atividades presentes na fração,
nos permite especular que cada cadeia presente nessa proteína possa apresentar
um sítio catalítico específico para cada substrato. Esse fato poderia explicar não só
a contaminação das atividades em preparações purificadas de 5´-nucleotidase e
fosfodiesterase por outros grupos, mas também pode explicar de certa forma a
perda de atividade à medida que avançamos no fracionamento durante as etapas
de purificação, retirando algum peptídeo regulador no controle dessas atividades.
4.7. Purificação das nucleotidases em gel de eletroforese não desnaturante.
Em paralelo ao fracionamento por técnicas cromatográficas utilizamos também
eletroforese em condições não desnaturantes com o objetivo de isolar a atividade
ADPase das demais. Em uma primeira abordagem padronizamos as condições de
corrida. Em uma corrida "piloto" utilizamos gel 12%, idêntico ao utilizado nas
análises eletroforéticas das frações obtidas por cromatografia, sem
77
Figura 27. Atividade nucleotidásica em gel de eletroforese em condições não desnaturantes. A PAGE 12% correu por 4h a uma voltagem constante de 100V a 15oC. (A) 50μg de veneno bruto foram aplicadas por poço, as bandas nomeadas B1, B2 e B3 foram cortadas e suas proteínas extraídas por sonicação (B) 50μg do veneno bruto (VB) e da Fração FI foram corridas nas mesmas condições anteriores. As proteínas extraídas de B1, B2 e B3 foram reaplicadas. Os géis foram incubados com meio de reação contendo 20mM de Tris-HCL pH 7,0; 3mM de AMP; 3mM de MgCl2 e 20 mM de CaCl2, as bandas com atividade identificadas pela formação de precipitado branco de fosfato de cálcio.
VB FI B1 B2 B3B1B2B3
B
B1B2
B3
A
VB VB FI B1 B2 B3B1B2B3
B
B1B2
B3
A
VB
78
no entanto adicionar SDS a nenhum dos tampões, (Figura 27). As bandas com
atividade foram identificadas incubando-se os géis com meio de reação contendo:
20mM de Tris pH7,0; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2; 3mM de substrato (ATP ou
ADP ou AMP) ou para atividade fosfodiesterase um meio contento 20mM de Tris-
HCl pH 8,8, 3 mM de MgCl2; 0,5 mM de p-NP-TMP. Nesse pH, o fosfato proveniente
da hidrólise dos nucleotídeos forma facilmente um precipitado insolúvel de fosfato
de cálcio de cor branca, possibilitando a identificação das bandas protéicas com
atividade. A atividade fosfodiesterase também pode ser identificada pela formação
de uma banda amarela, pela hidrólise de p-NP-TMP. Contudo cuidados adicionais
devem ser tomados uma vez que o p-NP (produto de cor amarela) formado é
solúvel, devendo, portanto a marcação ser imediatamente registrada por foto ou por
digitalização antes que o produto se difunda no gel e para o meio de reação. No
painel A vemos o padrão de bandas formadas quando utilizamos AMP como
substrato. Nessas condições podemos observar três bandas no gel, nomeadas de
B1, B2 e B3. B1 praticamente não entra no gel, podendo ser um agregado protéico,
B2 é a banda mais intensa e B3 é a banda de maior mobilidade eletroforética,
porém com uma baixa atividade. O mesmo padrão de bandas pode ser observado
quando comparamos o veneno bruto com a fração FI da Sephacryl S-100, (Figura
27B). As bandas com atividades obtidas no primeiro gel foram cortadas e eluídas
por maceração e sonicação de acordo com método descrito por Retamal et al.
(1999) e novamente submetida a eletroforese não desnaturante, (Figura 27B). O
procedimento permite retirar as proteínas do gel preservando ainda a atividade e o
padrão de mobilidade eletroforética. A banda B1 é formada por um agregado de
proteínas que se desfaz parcialmente após a extração e sonicação sendo possível
observar a presença da banda B2 após o procedimento. Como as bandas se
separaram pouco, buscamos uma melhor condição de corrida utilizando várias
concentrações de acrilamida e em diferentes tempos de corrida. Utilizando um
sistema de eletroforese de placa (Sigma) montamos transversalmente um gel
descontínuo de 7%, 9%, 11%, 13% e 15% e depois corremos no sentido normal
utilizando um gel de empacotamento de 4% e pH 6,8. Os poços para aplicar as
amostras foram ajustados exatamente sobre os diferentes percentuais de
79
Figura 28. Determinação das condições de corrida para a separação das bandas com atividade em gel eletroforese não desnaturante. No painel A, o gel em gradiente descontínuo de concentração de acrilamida, correu a uma voltagem constante de 100V por 4h a temperatura ambiente e as proteínas foram coradas por commassie blue. Ainda no painel A à direita gel 15% com 16 horas de corrida sob refrigeração. No Painel B observamos as bandas com atividade obtidas utilizando géis com diferentes concentrações de acrilamida. As corridas ocorreram a voltagem constante de 100V por 4 horas nos géis de 7, 9, 11, 13 e 15% ou como indicado nas figuras utilizando gel a 15% com tempo de corrida de 9, 12 ou 16h.
7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h
7% 9% 11% 13% 15% 15% 16hA
B7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h
7% 9% 11% 13% 15% 15% 16hA
B
80
acrilamida e a corrida executada a voltagem constante de 100V por 4h, (Figura 28). É possível observar que ocorre aumento de resolução das bandas protéicas
diretamente relacionado ao aumento do percentual de acrilamida, (Figura 28A).
Esse aumento de resolução é também acompanhado pela melhor separação das
bandas com atividade (Figura 28B), no entanto apesar de bem definidas as bandas
ficam muito próximas dificultando o corte do gel, para posterior purificação das
proteínas. Esse problema foi parcialmente resolvido aumentando o tempo de
corrida, onde obtivemos um aumento da separação das bandas de atividade a
partir de 12h de corrida. Nessas condições são perdidas algumas proteínas de
maior mobilidade eletroforética (na parte inferior do gel), mas são preservadas todas
as proteínas de interesse que apresentam uma baixa mobilidade eletroforética,
(Figura 28A e B) gel 15% 16h de corrida.
4.7.1. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante.
Uma vez padronizadas as condições de corrida preparamos um gel 15% e
corremos a uma voltagem constante de 100V por 20h sob refrigeração. Após a
corrida o gel foi cortado no sentido dos poços e as fatias obtidas incubadas em meio
de reação contendo: 20 mM de Tris pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2; 3mM
de ATP ou ADP ou AMP ou 0,5mM de p-NP-TMP (figura 29). Nesse gel podemos
observar que todas as atividades se concentram na banda B2, e em menor
intensidade na banda B1. A banda B3 só esta presente quando o meio de reação
tem ATP ou AMP como substratos.
4.7.2. Determinação da massa nativa das atividades nucleotidásicas por eletroforese não desnaturante (Gel de poro transverso).
A fim de confirmar as massas moleculares das nucleotidases determinadas por
gel filtração e por SDS-PAGE, resolvemos utilizar uma técnica de eletroforese em
gradiente de poro transverso não desnaturante desenvolvida por Retamal e Babul
(1988). Dessa forma foi montado um gel em gradiente de 6% a 18% de acrilamida e
a corrida executada aplicando a amostra no sentido transversal ao sentido do
gradiente. A partir da variação da mobilidade eletroforética das proteínas em
81
Figura 29. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante. 50 μg de veneno bruto foram aplicados em cada poço da PAGE não desnaturante que correu a 100V por 20h sob refrigeração. As fatias de gel foram incubadas em meio de reação e as bandas visualizadas por precipitação de fosfato de cálcio (ATP, ADP e AMP) ou por acúmulo de p-NP (p-NP-TMP). As setas indicam a localização de B1, B2 e B3.
ATPADP
AMPp-N
P-TMP
B1
B2
B3
ATPADP
AMPp-N
P-TMP
B1
B2
B3
82
Figura 30. Gel não desnaturante em gradiente de 6 a 18% de acrilamida. 25μg de veneno bruto foram aplicados em cada poço e a corrida feita a voltagem constante de 100V por 16h sob refrigeração. O gel foi incubado em meio de reação contendo: 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20mM de CaCl2 e 3mM de AMP. As bandas de atividade foram identificadas pela precipitação de fosfato de cálcio. Painel A imagem capturada utilizando um fundo escuro. Painel B determinação da presença de proteínas por commassie blue. Painel C A imagem capturada utilizando um fundo claro. Painel D o meio de reação foi trocado por um meio contento p-NP-TMP, formando uma marcação amarela na banda B2.
A B
C
B1
B2B3
B1
B2
B3
D
A B
C
B1
B2B3
B1
B2
B3
D
83
função da concentração de acrilamida utilizando a formula 100log (Rf x 100)
construímos um gráfico de Fergunson (1964) e calculamos as pendentes negativas
das curva de migração eletroforética das atividades (m). As massas moleculares
das proteínas foram determinadas utilizando uma curva padrão, obtida nas mesmas
condições, construída a partir das pendentes (m) extraídas da tese de Retamal
(1988) com os seguintes valores: 2,44 (α-lactoalbumina, 14kDa) ; 3,88 (anidrase
carbônica, 29 kDa); 5,68 (ovoalbumina, 45 kDa); 6,58 (albumina bovina
(monômero), 66 kDa); 9,6 (albumina bovina (dímero), 132 kDa); 14,7 urease
(trímero), 272 kDa); 24,2 (urease (hexâmero), 545 kDa) apresentada na (Figura
31C). Na figura 30 observamos a variação de mobilidade das bandas de atividade
utilizando um gel em gradiente de 6 à 18% de acrilamida, a corrida ocorreu a
voltagem constante de 100V por 16h sob refrigeração. O gel foi incubado em meio
de reação contendo: 20 mM de Tris pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 20mM de CaCl2 e 3mM
de AMP. Figura 30A as bandas com atividade apresentando precipitação de fosfato
de cálcio foram contrastadas utilizando um fundo escuro. A distribuição de proteínas
no gel revelado por commassie blue, Figura 30B. Figura 30C precipitação de fosfato
de cálcio utilizando um fundo claro. Figura 30D o gel após a marcação, por
precipitação de fosfato de cálcio, teve o meio de reação trocado por um meio
contendo p-NP-TMP como substrato, marcando a banda B2 de amarelo. Como a
marcação da porção superior da banda B2 parece ter migrado diferente da
marcação da porção inferior, determinamos as massas a partir dos Rfs dividindo a
banda B2 em B2a e B2b segundo diagrama da (Figura 31A). A banda B1 não teve
sua massa determinada por que não entra no gel mesmo em baixas concentrações
de acrilamida. A partir dos gráficos de Fergunson obtivemos os seguintes valores de
m: Banda B2a m= 9,2 correspondendo a uma massa de 120 kDa, B2b m=8,0
correspondendo a uma massa de 93 kDa e B3 m=6,1 correspondendo a uma
massa de 68 kDa. A determinação da massa nativa, das proteínas com atividade
nucleotidásica, também foi feita a partir das bandas purificadas de B2 e B3. Nesse
segundo ensaio reproduzimos exatamente as condições utilizadas na construção da
curva padrão descrita por Retamal (1988), gel em gradiente de 6% a 18% 100V e
tempo de corrida de corrida de 4h. Nesse ensaio fizemos uma corrida preparativa
em gel 15% por 20h e 100V sob refrigeração. As bandas com atividade, B2 e B3
84
Figura 31. Determinação da massa molecular das bandas de atividade em gel de poro transverso não desnaturante do gel da figura 30. Painel A diagrama identificando os pontos de onde foram determinados os Rfs das bandas com atividade. Painel B Gráfico de Fergunson das bandas B2a, B2b e B3. Painel D tabela com os valores das pendentes negativas (m) e a massa estimada para cada banda.
% Acrilamida
6 8 10 12 14 16 18
100
log
(Rfx
100)
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Banda 2 Banda 3 Banda 4
Molecular Weight14000 29000 45000 66000 132000 272000 545000
Neg
ativ
e Pe
nden
t
2
4
67
10
15
24
B2aB2bB3
686,3Banda 3
928,0Banda 2b
1239,3Banda 2a
KDam
A
B
C
D
♦ Banda 2a◊ Banda 2b
Banda 3
Massa Molecular
Pend
ente
neg
ativ
a
B1
6% 18%
% Acrilamida
6 8 10 12 14 16 18
100
log
(Rfx
100)
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Banda 2 Banda 3 Banda 4
Molecular Weight14000 29000 45000 66000 132000 272000 545000
Neg
ativ
e Pe
nden
t
2
4
67
10
15
24
B2aB2bB3
686,3Banda 3
928,0Banda 2b
1239,3Banda 2a
KDam
A
B
C
D
♦ Banda 2a◊ Banda 2b
Banda 3
Massa Molecular
Pend
ente
neg
ativ
a
B1
6% 18%
85
Figura 32. Determinação da massa das bandas isoladas com atividade em gel nativo. 50μg de veneno/poço foram aplicados em Gel preparativo 15% a 100V por 20h sob refrigeração. (A) Fatia de gel incubada com p-NP-TMP, (B) gel incubado com AMP e Cálcio, as setas indicam direção do corte para a purificação das bandas B2 e B3. (C) Gel em poro transverso da banda B2, proteínas identificadas por commassie blue. (D) Gel em poro transverso da banda B3, proteínas identificadas por precipitação com prata. (E) Gráfico de Fergunson das bandas B2 e B3.
6 % 18%
% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20
100
log
(Rfx
100)
60
80
100
120
140
160
180
200
Banda 3 m = 9,23 117 kDa Banda 4 m = 6,3 68 kDa
15%A B C
D
15%
E
Banda 2
6 % 18%Banda 3
B2
B3
Δ Banda 2 m=9,2 117kDa
●Banda 3 m=6,3 68kDa
6 % 18%
% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20
100
log
(Rfx
100)
60
80
100
120
140
160
180
200
Banda 3 m = 9,23 117 kDa Banda 4 m = 6,3 68 kDa
15%A B C
D
15%
E
Banda 2
6 % 18%Banda 3
B2
B3
6 % 18%
% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20
100
log
(Rfx
100)
60
80
100
120
140
160
180
200
Banda 3 m = 9,23 117 kDa Banda 4 m = 6,3 68 kDa
15%A B C
D
15%
E
Banda 2
6 % 18%Banda 3
B2
B3
Δ Banda 2 m=9,2 117kDa
●Banda 3 m=6,3 68kDa
86
foram cortadas e as fatias de gel pré-incubadas por 40 min em tampão de amostra
sem SDS. As fatias com as bandas foram montadas em sistema de placa sobre um
gel descontínuo (de empacotamento) polimerizado sobre um gel de separação em
poro transverso de 6 a 18% de acrilamida, (Figura 32). Os Rfs foram então
determinados utilizando um programa de análise densitométricas Gel-Perfect
(Bozzo e Retamal, 1991) e construído um gráfico de Fergunson e determinas as
pendentes negativas para B2 e B3, que apresentaram um valor de m de -9,2 e -6,3,
correspondendo a uma massa de 117kDa e 68kDa, respectivamente. As massas
das bandas purificadas foram muito próximas às observadas utilizando veneno
bruto, mesmo tendo sido utilizados diferentes tempos de corrida. Esse resultado
mostra que o aumento do tempo de corrida não interferiu na inclinação da curva
obtida pelo gráfico de Fergunson. A banda B2 que contém todas as atividades
apresentou a massa molecular que havia sido determinada por gel filtração ou por
eletroforese da fração obtida pela ADP-Sepharose, (110kDa). A banda B3 que
apresenta marcação na presença de AMP possui uma massa igual a da proteína
presente na fração F250 obtida na DEAE que coincidentemente também hidrolisa
AMP.
Os resultados em gel nativo se tornam bastante interessantes quando
comparamos com os resultados obtidos utilizando a coluna de afinidade ADP-
Sepharose. A fração obtida na ADP-Sepharose apresentava uma massa
aproximada de 110kDa e todas as atividades. Essa banda (110kDa) dava origem a
quatro proteínas de baixo peso, sendo duas de maior intensidade com massa
aproximada de 30kDa (33kDa, 29kDa), quando tratada com agente redutor. A
banda de 68kDa (B3) em gel nativo não apresenta todas as atividades, como
podemos observar na figura 29, onde não é possível observar marcação dessa
banda na presença de ADP e nem de p-NP-TMP no meio de reação. Esse resultado
a princípio poderia sugerir que a banda B3 fosse um segundo complexo de
nucleotidases menos ativo e que apresenta somente as atividades ATPase e 5`-
nucleotidase. Dessa forma B3 seria na verdade um pedaço do complexo presente
em B2 que perdeu duas cadeias de 30 kDa. A perda desses dois fragmentos
coincide com a perda das atividades ADPase e p-NP-TMP pelo complexo e
diminuição das atividades remanescentes. O fato do complexo presente em B3 ser
menos ativo que o presente em B2 sugere que a integridade do complexo seja
importante para manter a atividade catalítica do sistema com um todo, explicando a
87
sucessiva perda de atividade observada durante as etapas de fracionamento
dessas atividades. Dessa forma o complexo de nucleotidases do veneno Bothrops
jararaca seria um tetrâmero de 120kDa. As diferentes bandas observadas em gel
nativo seriam formadas por diferentes estados de agregação, a banda de massa
aproximada de 68kDa (B3) seria um dímero, B2b um trímero com 92 kDa e B2a um
tetrâmero de 120kDa
4.8. Análise bidimensional das proteínas presente nas bandas com atividade em gel nativo
Com o objetivo de conhecer melhor a distribuição de proteínas nas bandas
com atividade, foi feita uma eletroforese bidimensional. Na primeira dimensão
aplicamos 60μg de veneno bruto por poço e corremos um gel não desnaturante com
15% de acrilamida a voltagem constante de 100V por 16h. O gel foi cortado em
fatias no sentido dos poços, uma das fatias foi incubada em tampão com meio de
reação contendo AMP, outra fatia teve as proteínas coradas por commassie blue.
Uma terceira fatia foi incubada por 40 min em tampão de amostra com SDS e β-
mercaptoetanol. Após a incubação o gel foi montado sobre um gel descontínuo com
2 cm de gel de empacotamento sobre um gel de separação 12% com SDS. A
corrida foi feita a 150V por 2h a temperatura ambiente (Figura 33 A). As proteínas
presentes nas bandas com atividade se distribuem entre as massas de 15 a 75kDa.
Apenas a proteína de massa aproximada de 30 kDa está presente em toda a
extensão da região das bandas com atividade.
4.9. Purificação das nucleotidases por eletroforese em gel não desnaturante.
Na tentativa de obter material, por eletroforese, em quantidade suficiente para
purificar as atividades corremos 8 géis nativos, todos de mesmo tamanho, nas
mesmas condições. Foram aplicados 50 μg de veneno por poço em géis com 15%
de acrilamida, a corrida ocorreu a 100V por 16h sob refrigeração. Os oitos géis
correram simultaneamente aos pares utilizando quatro sistemas de eletroforese
Mini-protean III da BIORAD. Após a corrida os géis foram mantidos
88
Figura 33. Análise bidimensional das atividades nucleotidasicas do veneno. Painel A - 60 μg de veneno foram aplicados a um gel 15% sem SDS (1D) e a corrida foi feita a 100V por 16h. A 1D teve as bandas identificadas por atividade (precipitação de fosfato de cálcio) (A) ou por Commassie Blue (B). 2D SDS-PAGE 12% a 100V por 2h e as proteínas identificadas por Commassie Blue (C). Painel B - SDS-PAGE 12% da fração B123 extraída do gel nativo 7%, PM - padrão de peso molecular. O gel correu por 1h à 150V e as proteínas identificadas por Commassie Blue.
kDa PM
25016010575
50
25
3530
1510
A
B
C
B123
kDa72
52
32
23
kDa25016010575
50
35
3025
15
PM B123
A B
kDa PM
25016010575
50
25
3530
1510
A
B
C
B123
kDa72
52
32
23
kDa25016010575
50
35
3025
15
PM B123
kDa PM
25016010575
50
25
3530
1510
A
B
C
B123
kDa72
52
32
23
kDa25016010575
50
35
3025
15
PM B123
A B
89
em refrigeração enquanto uma fatia foi incubada em meio de reação contendo: 20
mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2 e 3 mM de AMP por 40 min à
37oC. Essa fatia foi utilizada como gabarito para o corte da região com atividade dos
demais géis, contendo as bands B1, B2 e B3. As proteínas foram extraídas do gel
usando 2 mM de Tris-HCl pH 8,0. Após concentrar utilizando um concentrador
Speed Vac uma amostra contendo 20μg da fração, nomeada B123 (relacionando as
bandas 1, 2 e 3), teve sua complexidade protéica analisada por eletroforese
utilizando um gel SDS-PAGE 12%, (Figura 33B). A fração apresentou o mesmo
padrão de distribuição protéica que o observado na bidimensional na região das
bandas com atividade, (Figura 33A) (proteínas indicadas por setas).
4.9.1. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa Devido à baixa mobilidade eletroforética, das proteínas com atividade, em
relação às demais proteínas presente no veneno, tentamos isolar utilizando um
sistema de eletroforese preparativa PREPCELL da BIORAD. O sistema além de
permitir processar uma grande quantidade de proteínas também possibilita a coleta
das amostras eluídas do gel. Foram aplicados 100mg de veneno bruto diluídos em
4 mL de tampão de amostra sem SDS e aplicados ao gel que correu a uma
potência constante de 12W sob refrigeração. A eluíção foi continuamente
monitorada a 280 nm e as frações protéicas retiradas até o retorno da linha de
base, a primeira corrida teve uma duração de 20 horas, sob tempertura controlada à
10oC. As frações protéicas eluídas do gel não apresentaram atividade
nucleotidásica, (figura 34A). O gel foi então cuidadosamente retirado do sistema e
uma fatia incubada em meio de reação contendo 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de
MgCl2; 20 mM de CaCl2 e 3 mM de AMP por 40 min à 37 oC. As proteínas com
atividade estavam retidas no gel apresentando o mesmo padrão de bandas
observado quando utilizamos o sistema de mini gel, (Figura 34B). Na tentativa de
eluir as proteínas, por eletroforese, repetimos a corrida nas mesmas condições
utilizando um tempo mais longo, 40 horas. Mais uma vez não havia atividade no
eluato e a atividade foi encontrada no gel. Os dois géis foram cortados em quatro
partes no sentido transversal acompanhando a marcação das bandas de atividade.
As proteínas foram extraídas do gel por maceração e sonicação em meio
tamponado. A análise
90
Figura 34. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa não desnaturante. 100 mg de veneno foram aplicados sobre um gel de separação de 8% de acrilamida com potência constante de 12W por 20h a 10C. As proteínas foram eluídas em tampão de corrida 10 vezes diluído utilizando um fluxo de 0,75mL/min. (A) Perfil protéico das proteínas eluídas do gel monitorado a 280nm. As linhas tracejadas mostram atividade nucleotidásica em meio contendo AMP. (B) Determinação da atividade em gel por precipitação de fosfato de cálcio utilizando um meio contendo: 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20mM de CACl2 e 3mM de AMP.
Abs
280
nm
0.10
0.05
Tempo (horas)
160 8
-_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0.00
F4
F3
F1F2
A B
Abs
280
nm
0.10
0.05
Tempo (horas)
160 8
-_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0.00
F4
F3
F1F2
A B
91
Figura 35. SDS-PAGE das frações com atividades extraídas da PAGE preparativa. 50 μg das frações extraídas do gel foram aplicadas em dois géis com 12% acrilamida a 150V por 1h a temperatura ambiente. As amostras foram preparadas sem agente redutor (A) e com agente redutor (B). As proteínas foram identificadas com commassie blue. PM - Padrão de peso molecular.
10
20
30
5060
80
120
250
70
90
PM F1 F2 F3 F4 PM F1 F2 F3 F4
10
20
30
5060
80
120
250
70
90
A B
10
20
30
5060
80
120
250
70
90
PM F1 F2 F3 F4 PM F1 F2 F3 F4
10
20
30
5060
80
120
250
70
90
A B
92
por eletroforese das frações revela que as proteínas estão divididas em dois grupos
um de alto peso com massas entre 120 e 160 kDa, e outro numa faixa próxima a
30kDa, (Figura 35A). No entanto quando utilizamos um tampão de amostra com
agente redutor (β-mercapetanol) as bandas de alto peso desaparecem e se
intensificam as bandas na faixa de 30 kDa. Este resultado confirma que as bandas
com atividade são na verdade oligômeros protéicos formados por cadeias de 30kDa
provavelmente estabilizados por pontes de enxofre. As massas apresentadas para
os complexos nessa preparação estão um pouco acima daquelas determinadas em
estado nativo. Essa variação da massa pode ser atribuída à agregação ao
complexo de peptídeos que estão presentes em grande quantidade na preparação,
podendo ser observados na porção inferior do gel com as amostras tratadas com
agente redutor, (Figura 35B). Esses peptídeos também estavam presentes, em
grande quantidade na análise bidimensional da região com atividade (Figura 33A).
4.9.2. Determinação das atividades nucleotidásicas das frações eluídas da PAGE preparativa (PREPCELL)
As frações extraídas da PAGE preparativa preservavam a capacidade de
hidrolisar os substratos p-NP-TMP, ATP, ADP e AMP. As frações F1 e F3
apresentaram uma atividade global mais intensa que as frações F2 e F4, (Figura
36). No entanto quando expressamos o resultado levando em conta agora a
distribuição relativa das atividades em cada fração, percebemos uma grande
mudança no perfil sugerindo a existência de diferenças na composição das frações
ou diferenças na atividade das enzimas presentes nas frações, (Figura 37). A
análise por eletroforese mostra que todas as frações apresentam bandas de alto
peso. As duas frações de maior atividade, F1 e F3, apresentam uma única banda
de alto peso próximo de 160 kDa. A fração F2 além de apresentar duas bandas de
alto peso uma de 120kDa e outra de 160kDa, essas bandas apresentam uma baixa
concentração de proteína, quando comparadas às bandas de alto peso presente
nas frações F1 e F3. A diminuição da concentração das proteínas de alto peso é
acompanhada pelo aumento da concentração das proteínas de 30kD na fração. A
fração F4 praticamente não possui a banda de 160kDa que parece ter originado a
93
Figura 36 - Determinação das atividades nucleotidásica das frações extraídas do gel preparativo. As atividades de hidrólise de ATP, ADP e AMP foram determinadas pela liberação de Pi no meio de reação utilizando o método de Fiske e Subarrow. O meio de reação continha: 5mM de MgCl2; 50 mM de Tris pH 8,8; 2mM de ATP ou ADP ou AMP e 20 μg/mL das frações. A atividade p-NP-TMP foi determinada pela liberação de fenolato lendo diretamente a 410nm. O meio de reação foi idêntico ao descrito acima substituindo os nucleotídeos por 0,5mM de p-NP-TMP.
F1F2F3F4
F1F2F3F4
94
Figura 37 - Distribuição relativa das atividades nucleotidásicas nas frações obtidas na PAGE preparativa, apresentada na figura 36.
p-NP-TMP AMP ADP ATP
%
0
20
40
60
80F1 F2F3F4
95
banda de 120kDa. Nessa fração também podemos ver um aumento da banda de
baixo peso. Essas mudanças na estrutura do complexo parecem estar relacionadas
com a alteração na capacidade de utilização dos diferentes substratos. Estes
resultados se assemelham bastante com o conjunto de resultados obtidos com gel
nativo, onde observamos que as bandas com atividade diferiam em massa na
ordem de 30 kDa, (120, 92 e 68 kDa) e essas diferenças eram também
acompanhadas de alterações na utilização de substratos (Figuras 25, 27,28).
94
5. Discussão 5.1. Discussão geral dos resultados
Os resultados descritos nesse estudo demonstram que o veneno de Bothrops
jararaca apresenta, como integrantes do grupo de enzimas envolvidas na hidrólise
de nucleotídeos, uma ADPase e uma ATPase independentes. Os dados obtidos a
partir das curvas de inativação térmica, ação de inibidores e dos mecanismos de
metabolização de ATP, dão suporte a essa afirmativa. Com relação à sensibilidade
térmica todas as atividades apresentaram diferenças nos valores de D (Tabela I)
podendo ser divididas em dois grupos, um que desnatura muito rápido com um valor
de D abaixo de 10 minutos onde estão incluídas as atividades de hidrolise de ATP,
p-NPP e p-NP-TMP, e outro mais termo resistente, que hidrolisa ADP e AMP, com
valores de D acima de 35 minutos. As duas atividades termo resistentes apresentam
diferenças quanto à sensibilidade a fluoreto, a hidrólise de AMP é praticamente
abolida enquanto a de ADP não é afetada. A única explicação para este fato é a
existência de uma ADPase distinta das outras quatro atividades. O sistema conta
com pelo menos duas enzimas envolvidas na hidrólise de ATP. Uma ATPase
clássica que requer uma alta concentração de ATP (3 mM) e apresenta ADP e Pi
como produtos (Fig. 7), e a Fosfodiesterase (PDE) que requer baixas concentrações
de ATP (100μM) e apresenta como produtos AMP e PPi (Fig. 8). Embora ambas
atividades sejam bastante sensíveis à temperatura elas apresentam diferenças
significativas quanto aos perfis de inativação térmica, ATP 3mM apresenta menor
sensibilidade à temperatura e uma curva bifásica enquanto a fosfodiesterase,
monitorada pela hidrólise de p-NP-TMP, é mais sensível e apresenta um perfil
monofásico nas mesmas condições (Figuras 2 e 3, Tabela I). Dessa forma o
metabolismo de ATP até adenosina catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca
pode seguir duas rotas, uma rápida e que responde a baixas concentrações de ATP,
na qual estão presentes as enzimas fosfodiesterase e 5'-nucleotidase, e outra mais
lenta e que responde a concentrações mais altas de ATP que promove a retirada
seqüencial dos fosfatos do ATP. Essa via contaria com a ação da ATPase, ADPase
e da 5'-nucleotidase, (Fig. 10). As enzimas da via rápida além de apresentarem a
mesma eficiência catalítica, permitindo um perfeito acoplamento entre as reações
95
não possibilitando que se acumule intermediários durante as reações (Fig. 8 e 11),
são quatro vezes mais eficientes que a rota lenta.
Essas atividades, presentes no veneno de Bothrops jararaca, são eluídas em
um volume que corresponde a uma massa nativa de aproximadamente 100 kDa
determinada por gel filtração (Fig. 14) contudo a análise por eletroforese da fração
com atividade (FI) revelou a presença de proteínas com massas fora da faixa
esperada (entre 50 - 160 kDa), sugerindo uma forte interação entre proteína-proteína
e entre proteína-matriz. Uma fração protéica contendo uma única banda com 110
kDa foi obtida utilizando uma coluna de afinidade ADP-sepharose, essa fração que
foi capaz de hidrolisar todos os substratos, apresentou um comportamento incomum
durante sua eluíção da coluna. Como cada nucleotidase apresenta um substrato
preferencial apresentando diferentes afinidades para cada nucleotídeos, carregamos
a coluna com veneno bruto e tentamos eluir as proteínas utilizando seus substratos
preferenciais. Quando p-NP-TMP foi adicionado ao tampão de eluíção, esse
substrato foi prontamente hidrolisado liberando p-nitrofenol (amarelo em pH
alcalino), no entanto nenhuma proteína foi eluída da coluna nessas condições. As
proteínas só foram eluídas na passagem de ADP. Para que p-NP-TMP fosse
hidrolisado durante sua passagem pela coluna o sítio ativo da fosfodiesterase teria
de estar livre e, portanto não participando da ligação da proteína a coluna. Uma
possível interpretação para esse resultado seria que a proteína estaria se ligando a
coluna não através dos sítios catalíticos, mas sim pela interação com a cadeia
polissacarídica da matriz. Essa explicação foi descartada um vez que todas as
atividades eluíram na presença de ADP. Esse resultado permite uma única
interpretação, que todas as proteínas estivessem ligadas entre si e que a ADPase
estivesse ligada a coluna e portanto a presença de ADP no tampão de eluíção
promoveria a liberação de todo o complexo, conforme ilustrado na figura 26. A fração
eluída apresentou uma única banda com 110 kDa, no entanto quando essa fração
foi tratada com agente redutor a banda de 110kDa da origem a quatro bandas de
baixo peso sendo que duas bandas majoritárias com massa próxima a 30 kDa (29 e
32 kDa). Esse resultado pode explicar por que as atividades sempre eluíam juntas, a
proteína de alto peso (entre 110 a 130kDa) é um oligômero protéico formado por um
conjunto de 3 ou quatro unidades de aproximadamente 29 e/ou 32 kDa. O
fracionamento utilizando gel não desnaturante revelou a presença de três bandas
96
com atividades (Figs. 27, 28 e 29). A determinação das massas das proteínas, por
eletroforese em gel não desnaturante em gradiente de poro transverso, demonstrou
que as bandas com atividade possuíam massas de aproximadamente 120, 92 e 68
kDa (Fig. 31 e 32). Valores muito próximos a estes podem ser obtidos pela
combinação de duas, três ou quatro sub-unidades de 29 e 32 kDa, formando
dímeros, trímeros e tetrâmeros respectivamente. Esse oligômero protéico apresenta
grupamentos SH importantes na sua estabilização, já que ele é totalmente
dissociado na presença de β-mercaptoetanol. Nem todas as subunidades devem ser
estabilizadas por estes grupamentos uma vez que a alta força iônica pode
desorganizá-lo, pelo menos parcialmente, como foi mostrado no fracionamento
utilizando a DEAE (Figs.19), HiTrap-Blue (Figs. 21 e 23) e por eletroforese não
desnaturante (Fig. 29). As bandas de 30 kDa apareceram em todas as análises das
frações semi-purificadas feitas na presença de agente redutor, Figuras 22, 25B, 33 A
e B, 35B.
Esses resultados talvez possam estar relacionados com o fato de nenhum
grupo ter tido sucesso no isolamento das atividades ADPase e ATPase presente em
venenos ao longo desses anos. Um outro fator que talvez tenha dificultado bastante
a interpretação dos resultados de purificação dessas proteínas seja o fato delas
pertencerem a chamada "Superfamília das fosfoesterases". A superfamília apresenta
três seqüências para o mesmo "motivo estrutural" que tem sido coletivamente
conhecido como "motivo estrutural" de assinatura das fosfoesterases (Koonin, 1994;
Zhuo et. al., 1994; Zimmermann, 1996). Essas seqüências conservadas foram
descobertas em vertebrados, invertebrados e bactérias: 5'-nucleotidases (EC
3.1.3.5), ATP-difosfohidrolase de mosquito (Apirase) (EC 3.6.1.5) (Blanchin-Roland
et. al., 1986) Ser/Thr fosfoproteina fosfatase (EC 3.1.3.16) e esfingomielina
fosfomonoesterase (EC 3.1.3.-). Dessa forma como todas essas enzimas
apresentam seqüências comuns fica fácil atribuir a hidrólise de ADP e ATP
catalisada pelo veneno às outras enzimas com maior atividade presente no veneo
como, a fosfodiesterase, a 5'-nucleotidase. No caso especificamente de Bothrops
jararaca esse aspecto se torna um fator ainda mais complicador uma vez que os
resultados apontam para uma única proteína oligomérica multicatalítica que parece
ter a possibilidade de formar, durante as etapas de purificação, diferentes
97
combinações entre as sub-unidades de 29, 32, 34 e 35 kDa que poderiam resultar
em diferentes capacidades de utilização e preferência pelos substratos.
5.2. Hipótese de participação das nucleotidases no envenenamento
As enzimas envolvidas na liberação de purinas estão presentes em todos os
venenos. A presença ubíqua dessas proteínas as coloca em posição de destaque
tanto em termos evolutivos quanto em termos fisiológicos, principalmente quando
relacionamos os diversos efeitos farmacológicos desenvolvidos pelas purinas com
alguns dos efeitos fisiopatológicos observados durante o envenenamento (Aird,
2002). É razoável pensar que cada substância, presente na composição do veneno,
deva estar envolvida em alguma atividade essencial ao processo de
envenenamento. Dentre as muitas funções que esses componentes precisam
desenvolver para que o envenenamento evolua a seu objetivo final, paralisação e
morte da presa, talvez uma das ações mais importantes estejam relacionadas às
ações envolvidas na disseminação dos componentes tóxicos do veneno para todos
os tecidos da vítima. Essa ação recorre sobre o sistema circulatório e envolve
aumento de permeabilidade vascular. O envenenamento botrópico provoca
rapidamente um forte edema local seguido de hemorragia e necrose. O aumento de
permeabilidade que provoca o edema local permite a difusão do veneno para todo o
organismo através do sistema circulatório.
Adenosina é um importante modulador do processo inflamatório (Kowaluk,
1998). A ativação de receptores A3 modula o glicocálix do endotélio capilar
promovendo aumento da permeabilidade vascular provavelmente alterando a trama
formada pelo glicocálix (Platts e Duling, 2004). A modulação de receptores A3
também promove a degranulação de mastócitos que promove um aumentando na
permeabilidade vascular (Shepherd et al., 1996, Tilley et al., 2000).
A modulação do glicocálix por adenosina provavelmente envolve a ação
simultânea sobre receptores A2A e A3 presentes na superfície de células endotéliais,
leucócitos e principalmente mostócitos Figura 38 (Platts e Duling, 2004; Di Virgilio,
et al. 2005).
O glicocálix endotelial é uma dinâmica matriz extracelular na superfície da
célula composta de proteoglicanos, glicoproteínas e proteínas adsorvidas que tem
98
sido envolvido na regulação e modulação do hematócrito do tubo capilar,
permeabilidade e hemostasia. O mecanismo de ação da adenosina esquematizado
na Figura 38 mostra uma potencial ligação entre conhecidos metabólitos teciduais
vasoativos e a adenosina na regulação do glicocálix. Evidências têm se acumulado
indicando que além desses efeitos, adenosina pode modular a resposta das células
endoteliais a estímulos inflamatórios durante o desenvolvimento de lesão
inflamatória. Por exemplo, adenosina suprime a expressão do fator tecidual
estimulado por TNF-β, principal iniciador da coagulação, nas células endoteliais
(Deguchi et al., 1998). Estes efeitos podem estar relacionados com o
desenvolvimento de edema observado durante o envenenamento.
Figura 38. Possível mecanismo envolvido no dano ao glicocálix por adenosina (Platts e Duling, 2004).
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Glicocálix
ROS, cininas, enzimas
MLV
Mudança na tensão da
trama
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Glicocálix
ROS, cininas, enzimas
MLV
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Glicocálix
ROS, cininas, enzimas
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Glicocálix
ROS, cininas, enzimas
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Adenosina
Endotélio Mastócito Leucócito
Adenosina
EndotélioEndotélio MastócitoMastócito LeucócitoLeucócito
Glicocálix
ROS, cininas, enzimas
MLV
Mudança na tensão da
trama
99
Pacientes picados por Bothrops jararaca desenvolvem hemorragia sistêmica e
edema local. Estes efeitos são em parte atribuídos à disfunção de plaquetas
resultando em hipoagregação (Cardoso et al.,1993; Sano-Martins et al., 1997). ADP
e ATP apresentam um papel crucial na ativação de plaquetas, e seus receptores tem
sido considerados potencias alvos para drogas antitrombóticas (Rozalski et al.,
2005), a remoção desses nucleotídeos pode contribuir para efetividade do
envenenamento por Bothrops jararaca (Santoro e Sano-Martins, 2004). O receptor
P2X (1) ATP acoplado aos canais de cátions e dois receptores acoplados a proteína
G P2Y(1) e P2Y(2), seletivamente contribuem para a agregação plaquetária e
formação de trombo (Gachet, 2006). O sistema que controla a sinalização
purinérgica em plaquetária é composto por: uma ecto-nucleosideo trifosfato
difosfohidrolase (apirase), uma ecto-5'-nucleotidase (AMPase) e recentemente
descoberta uma ecto-nucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterase (Furstenau et al.
2006), que é bastante similar em relação as atividades ao sistema presente em
veneno de Bothrops jararaca.
As nucleotidases isoladas de venenos são glicoproteinas (Frischauf e
Eckstein, 1973; Oshima e Iwanaga, 1969), a fração contendo todas as atividades
apresentou uma grande afinidade pela matriz estacionária da Sephacryl S-100
mesmo na presença de alta força iônica (figura 12-15). Isto implica a porção glicídica
dessas enzimas permitiria sua ligação ao glicocálix das células direcionando a ação
dessas enzimas sobre estruturas de membrana, aumentando seus efeitos sobre
receptores purinérgicos, atuando, portanto como ecto-nucleotidases exógenas sobre
diversos sistemas celulares como linfócitos, mastócitos e células do endotélio
vascular, regulando seus sistemas purinérgicos de sinalização (Figura 39).
Nós concluímos que o aumento na concentração de adenosina com
conseqüente diminuição das concentrações de ATP e ADP, promovido pelo sistema
de nucleotidases descrito nesse trabalho, pode estar relacionado com o
desenvolvimento de edema e disfunção plaquetária observada na região da picada
durante o envenenamento, levando a um aumento de difusão dos componentes do
veneno causado pelo aumento na permeabilidade vascular. O extravasamento de
fluído vascular para o meio intersticial pode ser importante também na ativação de
vários componentes tóxicos que se encontram inibidos na peçonha. A atividade 5'-
nucleotidase do veneno tem um aumento na ordem de 2 ou 3 vezes após a diálise,
100
esse efeito foi atribuído a retirada de Zn2+, componente do veneno presente em altas
concentrações e que desenvolve um potente efeito inibidor sobre essa atividade
(Suzuki e Iwanaga, 1958 a,b). Um outro exemplo de inibidor de atividade enzimática
presente no veneno é o citrato, que também esta presente em altas concentrações
na composição do veneno, e exerce potente efeito inibidor sobre as proteases do
veneno (Odell et al.,1998). Esses inibidores exercem um efeito protetor da glândula
de veneno contra danos promovidos pela ação de atividades hidrolíticas e tóxicas.
No entanto esses inibidores precisam ser retirados para que o veneno possa
desenvolver seus efeitos sobre os tecidos da presa.
Dessa forma essas enzimas estariam envolvidas no aumento de
permeabilidade vascular que irá permitir que os componentes tóxicos se ativem e se
difundam para todos os tecidos provocando alterações na homeostasia de diferentes
tecidos alvos resultando na paralisação, morte e posterior digestão da presa.
Figura 2. Esquema hipotético da ação do complexo de nucleotidases sobre o sistema de membranas do endotélio vascular.
PDE
5'-N
ATP
Aumento de permeabilidade do
epitélio vascular
COMPONENTES TÓXICOS DO
VENENOOligossacarídeosde glicoproteínas
NUCLEOTIDASESDO VENENO
(Glicoproteínas)
Glicocálix
LUZ DO VASO
MEIO EXTRACELULAR
EPITÉLIOVASCULAR
Plasma
EDEMAAtivação
ATPaseADPase
ADENOSINA
MastócitosLinfócitos
Componentes vaso ativos
EAO, cininas, enzimas
PDE
5'-N
ATP
Aumento de permeabilidade do
epitélio vascular
COMPONENTES TÓXICOS DO
VENENOOligossacarídeosde glicoproteínas
NUCLEOTIDASESDO VENENO
(Glicoproteínas)
Glicocálix
LUZ DO VASO
MEIO EXTRACELULAR
EPITÉLIOVASCULAR
Plasma
EDEMAAtivação
ATPaseADPase
ADENOSINA
MastócitosLinfócitos
Componentes vaso ativos
cininas, enzimas
PDE
5'-N
ATP
Aumento de permeabilidade do
epitélio vascular
COMPONENTES TÓXICOS DO
VENENOOligossacarídeosde glicoproteínas
NUCLEOTIDASESDO VENENO
(Glicoproteínas)
Glicocálix
LUZ DO VASO
MEIO EXTRACELULAR
EPITÉLIOVASCULAR
Plasma
EDEMAAtivação
ATPaseADPase
ADENOSINA
MastócitosLinfócitos
Componentes vaso ativos
EAO, cininas, enzimas
PDE
5'-N
ATP
Aumento de permeabilidade do
epitélio vascular
COMPONENTES TÓXICOS DO
VENENOOligossacarídeosde glicoproteínas
NUCLEOTIDASESDO VENENO
(Glicoproteínas)
Glicocálix
LUZ DO VASO
MEIO EXTRACELULAR
EPITÉLIOVASCULAR
Plasma
EDEMAAtivação
ATPaseADPase
ADENOSINA
MastócitosLinfócitos
Componentes vaso ativos
cininas, enzimas
106
6. CONCLUSÕES
• Os resultados de purificação revelam uma grande dificuldade no isolamento dessas atividades sugerindo que elas estejam formando um oligômero de massa aproximada de 110kDa que da origem a subunidades de 30 kDa na presença de agente redutor.
• O reagrupamento do oligômero formado por duas, três ou quatro subunidades
catalíticas de 30kDa provoca diferenças na capacidade de utilização de substrato. A forma dimérica parece ser a menor unidade ativa desse sistema.
• Este Complexo apresenta atividades semelhantes às observadas para ecto-
nucleotidases envolvidas na regulação purinérgica de diversos sistemas celulares.
• A ligação desse complexo a sistemas de membranas poderia mimetizar a ação
das ecto-nucleotidases endógenas promovendo alterações na regulação purinérgica pela retirada dos moduladores ATP e ADP, e aumento das concentrações de ADENOSINA.
• O edema decorrente do aumento da permeabilidade vascular induzido por
adenosina permitiria o dreno de vários componentes tóxicos da peçonha, facilitando sua disseminação promovendo um efeito sistêmico do envenenamento.
• A necessidade de disseminação dos componentes tóxicos da peçonha nos
diferentes tecidos da presa é fundamental ao processo de envenenamento de todas as serpentes venenosas, este fato poderia justificar a presença ubíqua das NUCLEOTIDASES em venenos de serpentes.
108
6. REFERÊNCIA ACOSTA, A., RAEL, E.D., MADDUX, N.L., LIEB, C.S. (1994). Detection of alkaline
phosphatase in venom by blotting methods. Toxicon 32(2): 227-231.
AGMON, Y., DINOUR, D., BREZIS, M. (1993) Disparate effects of adenosine A1- and
A2-receptor agonists on intrarenal blood flow. Am J Physiol. 265 (6 Pt 2): F802-
F806.
AIRD, S.D. (2002) Ophidian envenomation strategies and the role of purines.Toxicon
40 (4): 335-393.
AIRD, S.D. (2005) Taxonomic distribution and quantitative analysis of free purine and
pyrimidine nucleosides in snake venoms. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol
Biol. 140 (1): 109-126.
ALI, S., MUSTAFA, S.J., METZGER, W.J. (1994) Adenosine-induced
bronchoconstriction and contraction of airway smooth muscle from allergic rabbits
with late-phase airway obstruction: evidence for an inducible adenosine A1
receptor. J Pharmacol Exp Ther. 268 (3): 1328-1334.
AMARAL, C.F., DA SILVA, O.A., GOODY, P., MIRANDA, D. (1985) Renal cortical
necrosis following Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu snake bite.Toxicon.
23 (6): 877-885.
AMARAL, C.F., DE REZENDE, N.A., DA SILVA, O.A., RIBEIRO, M.M., MAGALHAES,
R.A., DOS REIS, R.J., CARNEIRO, J.G., CASTRO, J.R. (1986) Acute kidney
failure secondary to ophidian bothropic and crotalid accidents. Analysis of 63
cases. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 28 (4): 220-227.
ANGULO, Y., CHAVES, E., ALAPE, A., RUCAVADO, A., GUTIERREZ, J.M.,
LOMONTE, B. (1997) Isolation and characterization of a myotoxic phospholipase
A2 from the venom of the arboreal snake Bothriechis (Bothrops) schlegelii from
Costa Rica. Arch Biochem Biophys. 15, 339 (2): 260-266.
ARNI, R.K., GUTIERREZ, J.M. (1993) Crystallization and preliminary diffraction data of
two myotoxins isolated from the venoms of Bothrops asper (Terciopelo) and
Bothrops nummifer (jumping viper).Toxicon. 31 (8): 1061-1064.
109
ASSAKURA, M.T., SALOMAO, M.G., PUORTO, G., MANDELBAUM, F.R. (1992)
Hemorrhagic, fibrinogenolytic and edema-forming activities of the venom of the
colubrid snake Philodryas olfersii (green snake). Toxicon. 30 (4): 427-438.
BARBONI, E., KEMENY, D.M., CAMPOS, S., VERNON, C.A. (1987) The purification of
acid phosphatase from honey bee venom (Apis mellifica). Toxicon. 25 (10): 1097-
1103.
BARRAVIERA, B., PEREIRA, P.C.M. (1994) Acidentes por Serpentes do Gênero
“Bothrops”. In: Venenos animais. B. BARRAVIERA Ed., Rio de Janeiro: Editora de
Publicações Científicas LTDA. 261-279.
BARRETT, R.J., DROPPLEMAN, D.A. (1993) Interactions of adenosine A1 receptor-
mediated renal vasoconstriction with endogenous nitric oxide and ANG II. Am J
Physiol. 265 (5 Pt 2): F651-F659.
BELARDINELLI, L., SHRYOCK, J.C., SNOWDY, S., ZHANG, Y., MONOPOLI, A.,
LOZZA, G., ONGINI, E., OLSSON, R.A., DENNIS, D.M. (1998) The A2A
adenosine receptor mediates coronary vasodilation. J Pharmacol Exp Ther. 284
(3): 1066-1073.
BERGER, B.J., BHATTI, A.R. (1989) Snake venom components and their cross-
reactivity: a rewiew. Biochem Cell Biol. 67 (9): 597-601.
BJÖERK, W. (1964) Activation and stabilization of snake venom 5`-nucleotidase.
Biochim. Biophys. Acta (Amst.). 89: 483-494.
BLANCHIN-ROLAND, S., BLANQUET, S., SCHMITTER, J.M., FAYAT, G. (1986) The
gene for Escherichia coli diadenosine tetraphosphatase is located immediately
clockwise to folA and forms an operon with ksgA. Mol Gen Genet. 205 (3): 515-
522.
BOARDER, M.R., HOURANI, S.M. (1998) The regulation of vascular function by P2
receptors: multiple sites and multiple receptors. Trends Pharmacol Sci. 19 (3): 99-
107.
BOEYNAEMS, J.M., PEARSON, J.D. (1990) P2 purinoceptors on vascular endothelial
cells: physiological significance and transduction mechanisms. Trends Pharmacol
Sci. 11 (1): 34-37.
BOMAN, H. (1959) On the specificity of snake venom phosphodiesterase. Ann. N.Y.
Acad. Sci. 81: 800-803.
110
BOZZO, S. e RETAMAL, C. (1991) Geles unidimensionales. Un nuevo método
densitométrico para computadores personales. Arch Biol Med Exp. 24, R-181.
BRADFORD, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.
Biochem. 72: 248-254.
BRIZZOLARA, A.L., BURNSTOCK, G. (1991) Endothelium-dependent and
endothelium-independent vasodilatation of the hepatic artery of the rabbit. Br J
Pharmacol. 103(1): 1206-1212.
BROWN S.B. (1980). Ultraviolet and visible spectroscopy. An introduction to
spectroscopy to biochemists. In: Brown SB editor. London: Academic Press; p.14-
69.
BURNSTOCK, G. (1978). A basis for distinguishing two types of purinergic receptors. In:
Straub, R.W., Bolis, S. (Eds). Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones:
A Multidisciplinary Approach. Raven Press, New York. 107-119.
BURNSTOCK, G., WARLAND, J.J. (1987) P2-purinoceptors of two subtypes in the
rabbit mesenteric artery: reactive blue 2 selectively inhibits responses mediated via
the P2y-but not the P2x-purinoceptor. Br J Pharmacol. 90 (2): 383-391.
BURNSTOCK, G., WOOD, J.N. (1996) Purinergic receptors: their role in nociception
and primary afferente transmission. Curr. Opinion Neurobiol. 6: 526-532.
CAMPBELL, J.A. e LAMAR, W.W. (1989) The venomous reptiles of Latin America. New
York: Ithaca.
CAMPOS, S. e Yarleque, A. (1974) 5`-nucleotidasa en el veneno de la serpiente
Lachesis muta 1. Bol. Soc.Química Perú XL. 202-212.
CARDOSO, J.L., FAN, H.W., FRANÇA, F.O.S., JORGE, M.T., LEITE, R.P., NISHIOKA,
S.A., AVILA, A., SANO-MARTINS, I.S., TOMY, S.C., SANTORO, M.L.,
CHUDZINSKI, A.M., CASTRO, S.C.B., KAMIGUTI, A.S., KELEN, E.M.A., HIRATA,
M.H., MIRANDOLA, R.M.S, THEAKSTON, R.D.G., AND WARRELL, D.A. (1993)
Randomized comparative trial of three antivenoms in the treatment of envenoming
by lance-headed vipers (Bothrops jararaca) in Sao Paulo, Brazil. QJ med. 86 (5):
315 -325.
111
CAVINATO, R.A., REMOLD, H & KIPNIS, T.L. (1998) Purification and variability in
thrombin-like activity of Bothrops atrox venom from different geographic regions.
Toxicon, 36: 257-267.
CHIPPAUX, J.P., WILLIANS, V., WHITE, J. (1991) Snake venom variability: methods of
study, results and interpretation. Toxicon 29: 1279-1303.
CHUNG, M.C., PONNUDURAI, G., KATAOKA, M., SHIMIZU, S., TAN, N.H. (1996)
Structural studies of a major hemorrhagin (rhodostoxin) from the venom of
Calloselasma rhodostoma (Malayan pit viper). Arch Biochem Biophys. 15; 325(2):
199-208.
CONTI, A., MONOPOLI, A., GAMBA, M., BOREA, P.A., ONGINI,E. (1993) Effects of
selective A1 and A2 adenosine receptor agonist on cardiovascular tissues, Naunyn-
Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 348, 108-112.
CORREA-DE-SÁ, P., RIBEIRO, J.A. (1994) Tonic adenosine A2A receptor activation
modulates nicotinic autoreceptors function at the rat neuromuscular junction. Eur.
J. Pharmacol. 271, 349-355.
COUSIN X, BON C. (1999) Acetylcholinesterase from snake venom as a model for its
nerve and muscle counterpart. J Nat Toxins. 8(2): 285-294
DALTRY, J.C., WÜSTER, W., THORPE, R.S. (1996) Diet and snake venom evolution.
Nature, 379(6565): 537-540.
DALY, J.W., BUTTS-LAMB, P., PADGETT, W. (1983) Subclasses of adenosine
receptors in the cerebral nervous system. Interaction with caffeine and related
methylxanthines. Cell. Mol. Neurobiol. 3: 69-80.
DAVIS, B. J. (1964) Disc electrophoresis. II. method and application to human serum
proteins. Annals New York Academy of Sciences. 121: 404-427.
DE ANDRADE, J.G., PINTO, R.N., DE ANDRADE, A.L., MARTELLI, C.M., ZICKER, F.
(1989) Bacteriologic study of abscesses caused by bites of snakes of the genus
Bothrops. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 31(6): 363-367.
DEGUCHI, H., TAKEYA, H., URANO, H., GABAZZA, E.C., ZHOU, H. AND SUZUKI, K.
(1998) Adenosine regulates tissue factor expression on endothelial cells.Thromb.
Res. 91: 57-64.
DI VIRGILIO F. (1998) ATP as a death factor. Biofactors.8(3-4): 301-303
112
DI VIRGILIO F. (2000) Dr. Jekyll/Mr. Hyde: the dual role of extracellular ATP. J Auton
Nerv Syst. 81(1-3): 59-63
DI VIRGILIO, F., BARICORDI, O.R., ROMAGNOLI, R., BARALDI, P.G. (2005)
Leukocyte P2 receptors: a novel target for anti-inflammatory and anti-tumor
therapy. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 5 (1): 85-99.
DI VIRGILIO, F., CHIOZZI, P., FERRARI, D., FALZONI, S., SANZ, J.M., MORELLI, A.,
TORBOLI, M., BOLOGNESI, G., BARICORDI, O.R., (2001) Nucleotide receptors:
an emerging family of regulatory molecules in blood cells. Blood 97: 587-600.
DIXON, A.K., GUBITZ, A.K., SIRINATHSINGHJI, D.J., RICHARDSON, P.J., FREEMAN,
T.C. (1996) Tissue distribution of adenosine receptor mRNAs in the rat. Br J
Pharmacol. 118(6): 1461-1468.
DOERY, H.M. (1956) Purine compounds in snake venoms. Nature. 177 (4504): 381-
382.
DOONAN'S HOME PAGE - Thermostability of Proteins - What Does It Depend On and
How Can It Be Modified? http://homepages.uel.ac.uk/S.Doonan/thermo.html
DUBEY, R.K., GILLESPIE, D.G., JACKSON, E.K. (1998) Adenosine inhibits collagen
and protein synthesis in cardiac fibroblast: role of A2B receptors. Hypertension. 31:
943-948.
ETEROVIC, V.A., HERBERT, M.S., HANLEY, M.R., BENNETT, E.L. (1975) The lethality
and spectroscopic properties of toxins from Bungarus multicinctus (Blyth) venom.
Toxicon. 13: 37-48.
FABIATO, A. e FABIATO, F. (1979) Calculator programs for computing the
concentrations of the solutions containing multiple metals and ligands used for
experiments in skinned muscle cells. J. Physio (Paris). 75: 463-505.
FERGUSON, K.A. (1964) Starch Gel Eletrophoresis: Application to the Classification of
Pituitary Proteins and Polypeptides. Metabolism. 13: 985-1002.
FINI, C., PALMERINI, C.A., DAMIANI, P., STOCHAJ, U., MANNHERZ, H.G., FLORIDI,
A. (1990) 5’-nucleotidase from bull seminal plasma, chicken gizzard and snake
venom is a zinc metalloprotein. Biochim Biophys Acta. 1038 (1): 18-22.
FISCHER, F.G., DORFEL, H. (1954) Adenosine in the venom of puffadder Bitis arietans.
Snake venoms I.. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 296 (5-6): 232-238.
113
FISKE, C.H. e SUBBAROW, Y. (1925) The colorimetric determination of phosphorus. J.
Biol. Chem. 66: 375-400.
FOZARD, J.R., MILAVEC-KRIZMAN, M. (1993) Contraction of the rat isolated spleen
mediated by adenosine A1 receptor activation. Br. J. Pharmacol. 109: 1059-1063.
FRANCIS B, SEEBART C, KAISER II. (1992) Citrate is an endogenous inhibitor of
snake venom enzymes by metal-ion chelation. Toxicon. 30 (10): 1239-1246.
FRANCIS, B., JORGE DA SILVA JR, N., CASAIS E SILVA,L.L., SEEBART, C.,
KAISER, I.I. (1997). Toxins isolated from the venom of the brasilian coral snake
(Micrurus frontalis frontalis) include hemorragic type phospholipase A2 and
postsynaptic neurotoxins. Toxicon 35: 1193-1203.
FREITAS MA, GENO PW, SUMNER LW, COOKE ME, HUDIBURG SA, OWNBY CL,
KAISER II, ODELL GV. (1992) Citrate is a major component of snake
venoms.Toxicon. 30(4): 461-464.
FRISCHAUF A.M. e ECKSTEIN, F. (1973) Purification of a phosphodiesterase from
Bothrops atrox venom by affinity chromatography. Eur. J. Biochem. 32 (3): 479-485. FURSTENAU, C.R., TRENTIN, D. DA. S., BARRETO-CHAVES, M.L., SARKIS, J.J.
(2006) Ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase as part of a multiple
system for nucleotide hydrolysis by platelets from rats: kinetic characterization and
biochemical properties. Platelets, 17 (2): 84-91.
GACHET, C. (2006) Regulation of platelet functions by P2 receptors. Annu. Rev.
Pharmacol Toxicol. 46: 277-300.
GALUN, R. e KINDLER, S.H. (1968) Chemical basis of feeding in the tick Ornithodoros
tholozani. J. insect Physiol. 14: 1409-1421.
GALUN, R. e MARGALIT, J. (1969) Adenosine nucleotides as feeding stimulants of the
tsetse fly Glossina austeni Newst. Nature. 222: 583-584.
GALUN, R., AVI-DOR, Y., BAR-ZEEV, M. (1963) Feeding response in Aedes aegypti:
stimulation by adenosine triphosphate. Science 142: 1674-1675.
GALUN, R., KOONTZ, L.C., GWADZ, R.W., RIBEIRO, J.M.C. (1985) Effect of ATP
analogues on the gorging response of Aedes aegypti. Physiol. Entomol. 10: 275-
281.
GUTIÉRREZ, J.M. e LOMONTE, B. (1989) Local tissue damage induced by Bothrops
snake venoms. A review, Mem. Inst. Butantan, 51(4): 211-223.
114
GUTIÉRREZ, J.M., AVILA, C., CAMACHO, Z., LOMONTE, B. (1990) Ontogenetic
changes in venom of the snake Lachesis muta stenophrys (Bushmaster) from
Costa Rica. Toxicon, 28: 419-426.
GUTIÉRREZ, J.M., LOMONTE, B. e CERDAS L. (1986) Isolation and partial
characterization of a myotoxin from the venom of the snake Bothrops nummifer.
Toxicon; 24(9): 885-894.
HALIM, H.Y., SHABAN, E.A., HAGAG, M.M., DAOUD, E.W., el-ASMAR, M.F. (1987)
Purification and characterization of phosphodiesterase (exonuclease) from
Cerastes cerastes (Egyptian sand viper) venom. Toxicon. 25 (11): 1199-1207.
HANCOCK, D.L., COUPAR, I.M. (1995) Functional characterization of the adenosine
receptor mediating inhibition of peristalsis in the rat jejunum. Br. J. Pharmacol. 115:
739-744.
HOURANI, S.M.O., JONES, D.A. (1994) Post-junctional excitatory adenosine A1
receptors in rat vas deferents. Gen Pharmacol. 25: 417-420.
IWANAGA, S. & SUZUKI, T. (1979) Enzymes in snake venom. In: Lee C.Y. (Ed.) Snake
Venoms. Handbook of Exp. Pharmacol., 52. Springer-Verlag, Berlin. 61-158
JACOBSON, K.A. (1998) Adenosine A3 receptors; novel ligands and paradoxical effects.
Trends Pharmacol. Sci. 19: 184-191.
JOHNSON, M. KAYE, M.A.G., HEMS, R. KREBS, H.A., (1953) Enzynatic Hydrolysis of
adenosine phosphates by cobra venom. Biochem. J. 54: 625-629
JORGE DA SILVA JR., N., AIRD, S.D., (2001) Prey specificity, coniparative lethality and
compositional differences of coral snake venoms. K Comp. Biochein. Physiol.
128C: 425-456.
KARDONG, K.V. (1998) Vertebarados-Comparative Anatomy, Function, Evolution.
McGraw-Hill, Boston. 747
KARDONG, K.V., (1980) Evolutionary patterns in advanced snakes. American Zoologist
20: 269-282.
KARLSSON, E. (1979) Chemistry of protein toxins in snake venoms. In: Lee, C.Y. (Ed.).
Snake Venoms, Handbook of exp. Pharm., 52. Springer-Verlag, Berlin. 159-212.
KHOW, O., CHANHOME, L., OMORI-SATOH, T., PUEMPUNPANICH, S., SITPRIJA, V.
(2002) A hemorrhagin as a metalloprotease in the venom of Trimeresurus
purpureomaculatus: purification and characterization.Toxicon. 40(4): 455-461.
115
KINI, R.M. AND GOWDA, T.V. (1982a) Studies on snake venom enzymes: Part I.
Purification of ATPase, a toxic component of Naja naja venom & its inhibition by
potassium gymnemate. Indian J. Biochem. Biophys. 19: 152154.
KINI, R.M. AND GOWDA, T.V. (1982b) Studies on snake venom enzymes: Part II.
Partial characterization of ATPases from Russell’s viper (Vipera russelli) venom &
their interation with potassium gymnemate. Indian J. Biochem. Biophys. 19: 342-
346.
KINI, R.M. e GOWDA, T.V. (1984) Rapid method for separation and purification of four
isoenzymes of phosphodiesterase from Trimeresurus flavoviridis (Habu snake)
venom. J Chromatogr, 29: 299-305.
KOHNO Y, JI X, MAWHORTER SD, KOSHIBA M, JACOBSON KA. (1996a) Activation
of A3 adenosine receptors on human eosinophils elevates intracellular
calcium.Blood. 88(9): 3569-3574.
KOHNO, Y., SEI, Y., KOSHIBA, M. KIM, H.O., JACOBSON, K.A. (1996b) Induction os
apoptosis in HL-60 human promyelocytic leukemia cells by adenosine A3 receptors
agonists. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219: 904-910.
KOONIN, E.V. (1994) Conserved sequence pattern in wide variety of phosphoesterase.
Protein Sci. 3: 356-358.
KOWALUK, E.A. (1998). Adenosine modulation: a novel approach to analgesia and
inflammation. Expert Opin Investig Drugs. 7 (4): 535-543
LAEMMLI, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
LIANG, B.T., JACOBSON, K.A. (1998) A physiogical role of the adenosine A3 receptor:
sustained cardioprotection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6995-6999.
LIU, Q., BOHLEN, H. TITZER, S., CHRISTENSEN, O., DIEHL, V., HESCHELER, J.,
FLEISCHMANN, B.K. (1999) Expression and a role of functionally coupled P2Y
receptorsw in human dendritic cells. FEBS Lett. 445: 402-408.
LOMONTE B, GUTIERREZ JM, BORKOW G, OVADIA M, TARKOWSKI A, HANSON
LA. (1994) Activity of hemorrhagic metalloproteinase BaH-1 and myotoxin II from
Bothrops asper snake venom on capillary endothelial cells in vitro.Toxicon. 32 (4):
505-510.
116
LONDOS, C., HONNER, R.C., DHILLON, G. (1985) cAMP-dependent protein kinase
and lipolysis in rat adipocytes: III-Multiple modes of insulin regulation os lipolysis
and regulation of insulin responses by adenylate cyclase regulators. J. Biol.
Chem.260: 15139-15145.
MARTIN, P.L., UEEDA, M., OLSSON, R.A (1993) 2-PHenylethoxy-9-methyladenine: an
adenosine receptor antagonist that discriminates between A2 adenosine receptors
in the aorta and the coronary vessel from guinea-pig. J. Pharmacol. Exp. Ther.
265: 248-253.
MATTHEWS BW, NICHOLSON H, BECKTEL WJ. (1987) Enhanced protein
thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding.
Proc Natl Acad Sci U S A.;84(19): 6663-6667.
McINTOSH, H.H., BLAZYNSKI, C. (1994) Characterization and localization of adenosine
A2 receptors in bovine rod outer segments. J Neurochem. 62(3): 992-997.
MUKHERJE, A.K., GHOSAL, S.K. AND MAITY, C.R. (2000) Some biochemical
properties of Russell’s viper (Daboia russelli) venom from Eastern India:
correlation with clinico-pathological manifestation in Russell’s viper bite. Toxicon
38: 163-175.
MUNGER, K.A., JACKSON, E.K., (1994) Effects of selective A1 receptor blockade on
glomerular hemodynarnics: Involvement of reninangiotensin system. Am. J.
Physiol. 267: F783-F790.
NICHOLLS, J., BROWNHILL, V.R., HOURANI, S.M. (1996) Characterization of P1-
purinoceptors on rat duodenum longitudinal muscle and muscularis mucose. Br. J.
Pharmacol. 117: 170-174.
NIMMO H. G. e NIMMO G. A. (1982) A general method for the localization of enzymes
that produce phosphate, pyrophosphate, or CO2 after polyacrylamide gel
electrophoresis. Anal. Biochem. 121 (1): 17-22
ODELL GV, FERRY PC, VICK LM, FENTON AW, DECKER LS, COWELL RL, OWNBY
CL, GUTIERREZ JM (1998) Citrate inhibition of snake venom proteases. Toxicon.
36 (12): 1801-1806.
OLIVEIRA, A., LAMAS, S., RODRIGUEZ-PUYOL, D., LOPEZ-NOVOA, J.M. (1989)
Adenosine induces mesangial cell contraction by an A1-type receptor. Kidney Int.
35: 1300-1305.
117
OLSSON, R.A., PEARSON, J.D. (1990) Cardiovascular purinoceptors. Physiol. Rev. 70:
761-845.
OSHIMA, G. e IWANAGA, S. (1969) Occurrence of glycoproteins in various snake
venoms. Toxicon, 7 (3): 235-238.
OSHIMI, Y., MIYAZAKI, S., ODA, S. (1999) ATP-induced Ca2+ response mediated by
P2U and P2Ypurinoceptors in human macrophages: signalling from dying cells to
macrophages. Immunology 98: 220-227.
OUYANG, C., HUANG, T.F. (1983) Inhibition of platelet aggregation by 5’-nucleotidase
purified from Trimeresurus gramineus snake venom. Toxicon, 21 (4): 491-501.
PAINE, M.J., DESMOND, H.P., THEAKSTON, R.D., CRAMPTON, J.M. (1992)
Purification, cloning, and molecular characterization of a high molecular weight
hemorrhagic metalloprotease, jararhagin, from Bothrops jararaca venom. Insights
into the disintegrin gene family. J Biol Chem. 267 (32): 22869-22876.
PEREIRA LIMA, F.A., SCHENBERG, S., SCHIRIPA, L.N., NAGAMORI, A. (1971)
ATPase and phosphodiesterase differentiation in snake venoms. In: de Vries, A.,
Kochva, E. (Eds.) Toxins of Animal and Plant Origin. Gordon and Breach, New
York. 463-470.
PERRY, L.J., WETZEL, R. (1984) Disulfide bond engineered into T4 lysozyme:
stabilization of the protein toward thermal inactivation. Science. 226(4674): 555-
557.
PFLEIDERER G, ORTANDERL F. (1963) Identity of phosphodiesterase and ATP
pyrophosphatase from snake venom. Biochem Z. 337: 431-435.
PHILIPPS, G.R. (1975) Purification and characterization of phosphodiesterase from
Crotalus venom. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 356 (7): 1085-1096.
PLATTS, S.H., DULING, B.R. (2004) Adenosine A3 receptor activation modulates the
capillary endothelial glycocalyx. Circ Res. 94 (1): 77-82.
RALEVIC, V., BURNSTOCK, G., (1998) Receptors for purines and pyramidines.
Pharmacol. Rev. 50: 413-492.
RAMKUMAR, V., STILES, G.L., BEAVEN, M.A., ALI, H. (1993) The A3 adenosine
receptor is the unique adenosine receptors which facilitates release of allergic
mediators in mast cells. J. Biol. Chem. 268: 16887-16890.
118
RAZZELL, W.E. (1963) Phosphodiesterase. In Colowick, S. P., Kaplan, N. O. (Eds.):
Methods in Enzimology – New York-London: Academic Press 6: 236-245.
RAZZELL, W.E. e KHORANA, H.G. (1959) Studies on polypeptides III - Enzymic
degradation. Substrate specificity and properties of snake venom
phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 234: 2105-2113.
REPPERT, S.M., WEAVER, D.R., STEHLE, J.H. RIVKEES, S.A. (1991) Molecular
cloning and characterization of a rat A1-receptor that is widely expressed in brain
and spinal cord. mol. Endocrinol. 5: 1037-1048.
RETAMAL, C. (1988) Caracterizacion estructural de las formas mutada i norma de
fosfofructo quinasa-2 de Escheria coli. Universidad de Chile, Faculdad de Ciencias
(Dissertação de Tese de Mestrado)
RETAMAL, C. e BABUL, J. (1988) Determination of the molecular weight of proteins by
electrophoresis in slab gels with a transverse pore gradient of crosslinked
polyacrylamide in the absence of denaturing agents. Anal Biochem,175 (2): 544-
547.
RETAMAL, C.A., THIEBAUT, P., ALVES, E.W. (1999) Protein purification from
polyacrylamide gels by sonication extraction. Anal Biochem, 268: 15-20.
ROZALSKI, M., NOCUN, M. AND WATALA, C. (2005) Adenosine diphosphate
receptors on blood platelets - potential new targets for antiplatelet therapy. Acta
Biochim. Pol. 52 (2): 411-415.
SANCHEZ, E.F., COSTA, M.I., CHAVEZ-OLORTEGUI, C., ASSAKURA, M.T.,
MANDELBAUM, F.R., DINIZ, C.R. (1995). Characterization of a hemorrhagic
factor, LHF-I, isolated from the bushmaster snake (Lachesis muta muta) venom.
Toxicon. 33 (12): 1653-1667.
SANO-MARTINS, I.S., SANTORO, M.L., CASTRO, S.C., FAN, H.W., CARDOSO, J.L. e
THEAKSTON R.D.(1997). Platelet aggregation in patients bitten by the Brazilian
snake Bothrops jararaca. Thromb. Res., 87 (2): 183-195.
SANTORO, M. L., AND SANO-MARTINS, I.S. (2004) Platelet dysfunction during
Bothrops jararaca snake envenomation in rabbits. Thromb Haemost. 92 (2): 369-
383.
SCHIRIPA L.N., SHENBERG, S. (1964) Estudo da ATPase, ADPase e 5'-Nucleotidase
de venenos ofídicos. Ciência e cultura 16: 194-195.
119
SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE (1993) Acidentes por animais peçonhentos -
Identificação, diagnóstico e tratamento. São Paulo/SP.
SHENBERG, S., PEREIRA LIMA, F.A. SHIRIPA, L.N., NAGAMORI, A. (1975). A Snake
venom ADPase. Toxicon 13: 121-122.
SHEPHERD, R.K., LINDEN, J., DULING, B.R. (1996). Adenosine-induced
vasoconstriction in vivo. Role of the mast cell and A3 adenosine receptor.Circ Res.
78 (4): 627-634.
SHNEYVAYS V, NAWRATH H, JACOBSON KA, SHAINBERG A. (1998). Induction of
apoptosis in cardiac myocytes by an A3 adenosine receptor agonist. Exp Cell Res.
243 (2): 383-397.
SORENSON, M.M., COELHO, H.S., REUBEN, J.P. (1986). Caffeine inhibition of
calcium accumulation by the sarcoplasmic reticulum in mammalian skinned fibers.
J Membr Biol.;90(3):219-230.
STELLA L, DE NOVELLIS V, MARABESE I, BERRINO L, MAIONE S, FILIPPELLI A,
ROSSI F. (1998) The role of A3 adenosine receptors in central regulation of
arterial blood pressure. Br J Pharmacol. 125(3): 437-440.
STROKA, A., DONATO, J.L., BON, C., HYSLOP, S., DE ARAUJO, A.L. (2005)
Purification and characterization of a hemorrhagic metalloproteinase from Bothrops
lanceolatus (Fer-de-lance) snake venom. Toxicon. 45(4): 411-420.
SUGINO, Y. (1960) Studies on deoxynucleosidic compounds. II. Deoxycytidine
diphosphate choline in sea urchin eggs. Biochim. Biophys. Acta. 40: 425-434.
SULKOWSKI, E., BJÖRK, W., LASKOWSKI, M. Sr. (1963) A specific and nonspecific
alkaline monophosphatase in venom of Bothrops atrox and their occurrence in
purified venom phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 238: 2477-2486.
SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1958a) Studies on snake venom. II Some observations on
alkaline phosphatases of Japanese and Formosan sanke venom. J. Pharm. Soc.
Jpn. 78: 354-361.
SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1958b) Studies on snake venom. IV. Purification of
alkaline phosphatases in cobra venoms. J. Pharm. Soc. Jpn. 78: 368-375.
SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1960) Studies on snake venom alkaline phosphatases.
Protein Nucl. Acid Enzymes. 6: 265-279.
120
TAKASAKI, C., YOSHIDA, H., SHIMAZU, T., TERUUCHI, T., TORIBA, M., TAMIYA, N.
(1991). Studies on the venom components of the long-glanded coral snake,
Maticora bivirgata. Toxicon. 29 (2): 191-200.
THOMAS, R.G., POUGH, F.H. (1979). The effect of rattlesnake venom on digestion of
prey. Toxicon. 17: 221-228.
TILLEY, S.L., WAGONER, V.A. SALVATORE, C.A., JACOBSON, M.A. AND KOLLER,
B.H. (2000) Adenosine and inosine increase cutaneous vasopermeability by
activating A(3) receptors on mast cells. J. Clin. Invest. 105: 361-367.
TU, A.T., e CHUA, A. (1966) Acid and alkaline phosphomonoesterase activities in
snake venoms. Comp. Biochem. Physiol. 17: 297-307.
TWOMEY, C.M. e DOONAN, S. (1997) A comparative study of the thermal inactivation
of cytosolic and mitochondrial aspartate aminotransferases. Biochim. Biophys.
Acta. 1342: 37-44.
VARANDA, E.A., GIANNINI, M.J.S.M. (1994) Bioquímica de venenos de serpentes. In:
Venenos animais, B. BARRAVIERA Ed., Rio de Janeiro: Editora de Publicações
Científicas LTDA. 205-223.
VERONESE, R., (1987). Doenças Infecciosas e Parasitárias. cap. 113: 1068.
WEBER, K. AND OSBORN, M. (1969). The reliability of molecular weight
determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol.
Chem. V. 244 n. 16 p. 4406-4412.
WEI, Q., ZHOU, D.Y., XU, Q.Y. (1981) ADPase, ATPase and 5´-nucleotidase of snake
venoms from Guangxi China. Zool. Res. 2: 143-146.
YAO, Y., SEI, Y., ABBRACCHIO, M.P., JIANG, J., (1997) Adenosine A3 receptor
agonists protect HL-60 and U-937 cells from apoptosis induced by A3 antagonists.
Biochem. Biophys. res. commun. 232: 317-322.
ZELLER, E.A. (1950) The formation of pyrophosphate from adenosine triphosphate in
presence of snake venom. Arch. Biochem. 28: 138-139.
ZHUO, S. CLEMNS, J.C., STONE, R.L. e DIXON J.E. (1994) Mutational analysis of
Ser/Thr phosphatase. Identification of residues important in phosphoesterase
substrate binding and catalysis. J. Biol. Chem. 269: 26234-26238
ZIMMERMANN, H. (1992) 5’-nucleotidase: molecular structure and functional aspects.
Biochem. J. 285: 345-366.
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