biotecnologia prof. priscilla russo métodos para a quantificação de proteínas

BiotecnologiaProf. Priscilla Russo

Métodos para a quantificação de

proteínas

Como estudar uma proteína?

1. Separá-la e purificá-la.

2. Determinar a sua massa molecular.

3. Determinar a sua composição e seqüência de aminoácidos.

4. Elucidar a sua estrutura tridimensional.

5. Caracterizá-la funcionalmente.

Proteínas

Para separar proteínas• Utilizam-se diferenças nas

propriedades físico-químicas das proteínas, resultantes das diferentes sequências de aa:– Tamanho– Solubilidade– Carga– Afinidade de ligação

Técnicas de separação e purificação de proteínas:

• Diálise, ultrafiltração, centrifugação, precipitação

• Cromatografia de exclusão molecular• Cromatografia de troca iônica e da fase

reversa• Cromatografia de afinidade• Eletroforese

Princípio: diferente dimensão e forma molecular

• Diálise• A solução contendo a proteína é colocada no

interior do saco de diálise, que é imerso em um grande volume de solvente

• Chega-se ao equilíbrio entre as concentrações dos dois meios, sendo que as proteínas continuam no interior do saco de diálise e as outras moléculas no exterior.

Ultracentrifugação Zonal• A solução contendo as proteínas é

colocada no topo de um gradiente de densidade.

• Durante a centrifugação, cada proteína se move de acordo com seu coeficiente de sedimentação.

• Após a centrifugação, as zonas individuais são recolhidas com auxílio de uma seringa.

Centrifugação Diferencial

• A centrifugação separa os componentes celulares por tamanho e densidade

• Componentes maiores e mais densos sedimentam (pellet) e os componentes menores e menos densos permanecem suspensos (sobrenadante).

Gradiente de Densidade

Princípio: diferença de solubilidade (precipitação)

• A solubilidade das proteínas varia com:– pH– Temperatura– Força iônica– Constante dielétrica do solvente

Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade

• Precipitação isoelétrica (variação de pH)

• Salting in / salting out (variação da força iônica)

• Precipitação por solventes orgânicos

• Salificação (salting in): a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da concentração de sal

• Dessalificação (salting out): os sais com concentração muito elevada retiram a água de hidratação da proteína, então as suas moléculas precipitam

• É uma série de processos de separação de misturas.

• Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.

• A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.

Cromatografia

Métodos cromatográficos de separação de proteínas

• Diferentes tipos:– Exclusão

molecular– Troca iônica– Afinidade– Fase reversa

Cromatografia de exclusão molecular

• Utilizado para a determinação do peso molecular de diferentes proteínas

• Após o empacotamento da coluna, aplica-se a amostra e é feita a eluição

• As moléculas maiores, que não são capazes de penetrar nos poros do gel, serão eluídas antes das moléculas menores.

Cromatografia de troca iônica

• As colunas são carregadas com grânulos de carga oposta, retendo as proteínas– Ex: moléculas de carga

negativa ficam retidas, enquanto as de carga positiva passam pela coluna

Cromatografia de Troca iônica

Cromatografia de afinidade• A fase estacionária consiste geralmente de

agarose ligada a brometo de cianogênio, formando uma ligação covalente.

• A amostra é aplicada e a proteína que possui afinidade pelo ligante se liga a ele enquanto as demais são eluídas da coluna.

• A proteína de interesse é então liberada da coluna, com o uso de uma substância que tenha mais afinidade pela proteína do que o ligante

Determinação da composição dos aminoácidos de uma proteína

• Ex: determinação da composição de aa do fragmento

Ala-gly-asp-phe-arg-gly1.Hidrolise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24h)2.Reação de revelação dos aa (ex ninidrina)3.Separação e quantificação dos aa (ex.

cromatografia)

Separação e quantificação dos aa por cromatografia HPLC

• High Pressure Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)

• Matriz de separação: utilizando diferentes propriedades físicas de cada um dos aa, ex carga, forma, hidrofobicidade

• Eluente: variação controlada das condições do meio

• Detecção: após sua derivação

Resultado de uma cromatografia de aa

Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa de cada aa, mas não a sequência

Uso da cromatografia no diagnóstico clínico

• Leucinose • Ex.: aumento de

leucina, isoleucina e valina

• Defeito da desidrogenase dos alfa-cetoacidos ramificados