avaliação dos efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas sobre agentes...

Avaliação dos efeitos genotóxicos da Avaliação dos efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas exposição ocupacional a pesticidas

sobre agentes sanitários da Fundação sobre agentes sanitários da Fundação Nacional de Saúde do Estado de Nacional de Saúde do Estado de

Minas GeraisMinas Gerais

Fernanda de Souza Gomes KehdyFernanda de Souza Gomes KehdyOrientadora: Profª Maria Cristina Lima de CastroOrientadora: Profª Maria Cristina Lima de CastroCo-orientadora: Profª Cleusa Graça da FonsecaCo-orientadora: Profª Cleusa Graça da Fonseca

IntroduçãoIntrodução

• PesticidasPesticidas

• Seletividade dos pesticidasSeletividade dos pesticidas

Risco tóxico para humanos

IntroduçãoIntrodução

• Tipos de intoxicações:Tipos de intoxicações:

- AgudaAguda

- Sub-crônicaSub-crônica

- CrônicaCrônica

IntroduçãoIntrodução

Potencial genotóxico Potencial genotóxico

CARCINOGÊNESE

• Biomonitoramento genotoxicológico

IntroduçãoIntrodução

• Biomarcadores:Biomarcadores:

- análise de aberrações cromossômicas;- análise de aberrações cromossômicas;

- análise de troca entre cromátides irmãs;- análise de troca entre cromátides irmãs;

- frequência de micronúcleos; - frequência de micronúcleos;

IntroduçãoIntrodução• Micronúcleos:Micronúcleos:

• Efeito aneugênicoEfeito aneugênico

IntroduçãoIntrodução• Micronúcleos:Micronúcleos:

• Efeito clastogênicoEfeito clastogênico

IntroduçãoIntrodução

• Micronúcleosagentes clastogênicos

agentes aneugênicos

- Teste de genotoxicidade in vitro;

- Biomarcador p/ efeito de exposição a genotóxicos;

(Norppa et al.,2003)

IntroduçãoIntrodução

• Vantagens do teste do micronúcleo: Vantagens do teste do micronúcleo:

- Mais simples;- Mais simples;

- Treinamentos mais curtos;- Treinamentos mais curtos;

- Mais rápido;- Mais rápido;

- Requer menos custo;- Requer menos custo;

- Maior poder estatístico;- Maior poder estatístico;

IntroduçãoIntrodução

Inibição do ciclo celular

Reparo do DNA

Apoptose

Danos ao DNA

Ativaçãooncogenes

p53

• Fator de risco p/ câncer p53;Fator de risco p/ câncer p53;

IntroduçãoIntrodução

• p53:p53:

-- Gene TP53; Gene TP53;

-- Cromossomo17p13.1; Cromossomo17p13.1;

- - 393 aminoácidos;393 aminoácidos;

p53 PolimorfismoPro72

Arg72Apoptose

IntroduçãoIntrodução

• Estado de Minas GeraisEstado de Minas Gerais::- ~ 3000 agentes sanitários vinculados à ~ 3000 agentes sanitários vinculados à

FUNASA – aplicam pesticidas para o controle FUNASA – aplicam pesticidas para o controle de vetores de doenças (180 reg. metropolitana) de vetores de doenças (180 reg. metropolitana)

- Sexo masculinoSexo masculino- Idade: 30 a 50 anosIdade: 30 a 50 anos- Pesticidas: piretróides e organofosforadosPesticidas: piretróides e organofosforados- Não foi feita análise dos efeitos genotóxicos Não foi feita análise dos efeitos genotóxicos

dos pesticidas sobre estes trabalhadores;dos pesticidas sobre estes trabalhadores;

IntroduçãoIntroduçãoN ° indiv.N ° indiv.

(exp/cont)(exp/cont)

ExposiçãoExposição DuraçãoDuração

(anos)(anos)

BiomarcadorBiomarcador ResultadoResultado ReferênciaReferência

50/4750/47 Piretróides, Piretróides, DDTDDT

1-251-25 CACA PosPos (Ruppa et (Ruppa et al.,1989)al.,1989)

26/2626/26 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo

radosrados

2-182-18 CACA PosPos (Ruppa et (Ruppa et al.,1991)al.,1991)

48/5048/50 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo

radosrados

4-504-50 SCESCE NegNeg (Pasquini et (Pasquini et al.,1996)al.,1996)

22/1622/16 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo

radosrados

77 MNMN NegNeg (Venegas et (Venegas et al.,1998)al.,1998)

71/7571/75 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo

radosrados

2-552-55 MNMN PosPos (Bolognesi (Bolognesi et al.,1998)et al.,1998)

IntroduçãoIntrodução

• Falta de concordância entre os resultados:Falta de concordância entre os resultados:-- diferentes condições de exposição diferentes condições de exposição (magnitude, (magnitude,

uso de equipamentos de proteção);uso de equipamentos de proteção);

-- nº de pesticidas utilizados; nº de pesticidas utilizados;-- combinação de pesticidas; combinação de pesticidas;-- tempo e frequência de exposição; tempo e frequência de exposição;-- características do indivíduo características do indivíduo (idade, sexo, hábito de (idade, sexo, hábito de

fumar e ingerir bebidas alcoólicas, estado fumar e ingerir bebidas alcoólicas, estado nutricional); nutricional);

(Bolognesi, 2003)

Objetivo geralObjetivo geral

Avaliar os efeitos genotóxicos da Avaliar os efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas em agentes exposição ocupacional a pesticidas em agentes sanitários vinculados à FUNASA, através do sanitários vinculados à FUNASA, através do biomonitoramento genotoxicológico destes biomonitoramento genotoxicológico destes indivíduos, utilizando como biomarcador a indivíduos, utilizando como biomarcador a frequência de micronúcleos em cultura de frequência de micronúcleos em cultura de linfócitos isolados e estabelecer o genótipo do linfócitos isolados e estabelecer o genótipo do gene TP53 em relação ao polimorfismo do gene TP53 em relação ao polimorfismo do códon 72 para fins prognósticos.códon 72 para fins prognósticos.

Objetivos específicosObjetivos específicos

• Delineamento das amostras;Delineamento das amostras;• Padronização das condições de cultura de linfócitos Padronização das condições de cultura de linfócitos

isolados;isolados;• Produção de lâminas;Produção de lâminas;• Determinação da frequência de MN;Determinação da frequência de MN;• Verificação, através de testes estatísticos, de relação Verificação, através de testes estatísticos, de relação

entre a frequência de MN e exposição a pesticidas; entre a frequência de MN e exposição a pesticidas; • Amplificação, través de PCR, de fragmento do TP53 Amplificação, través de PCR, de fragmento do TP53

para detecção do genótipo em relação ao códon 72; para detecção do genótipo em relação ao códon 72;

MetodologiaMetodologia1)1) Grupos amostrais:Grupos amostrais:- Grupo experimental: 30 agentes sanitários Grupo experimental: 30 agentes sanitários

vinculados a FUNASA, do sexo masculino, vinculados a FUNASA, do sexo masculino, idade entre 30 e 50 anos, ocupacionalmente idade entre 30 e 50 anos, ocupacionalmente expostos a pesticidas;expostos a pesticidas;

- Grupo controle: 30 indivíduos do sexo Grupo controle: 30 indivíduos do sexo masculino, idade entre 30 e 50 anos, sem masculino, idade entre 30 e 50 anos, sem história de exposição a pesticidas; história de exposição a pesticidas;

2)2) Entrevista. Entrevista. (idade, hábitos e exposição) (idade, hábitos e exposição)

3)3) Teste do MNTeste do MN Metodologia Metodologia

1 2 3 4 5 6

A

B

C

D

1 2 3 4 5 6

A

B

C

D

MetodologiaMetodologia

(Adaptado de Fenech,2000)

Tempo de cultura (h)Tempo de cultura (h) Substâncias a serem Substâncias a serem acrescentadas na culturaacrescentadas na cultura

00 PHAPHA

2424

4848 Ct-BCt-B

7272

9696 Colher célulasColher células

MetodologiaMetodologia

Célula binucleada

MetodologiaMetodologia• Características do Micronúcleo:Características do Micronúcleo:- Morfologia idêntica a dos núcleos principais;Morfologia idêntica a dos núcleos principais;- Diâmetro entre 1/16 e 1/3 dos núcleos Diâmetro entre 1/16 e 1/3 dos núcleos

principais;principais;- Mesma coloração dos núcleos;Mesma coloração dos núcleos;- Não apresentar refringências;Não apresentar refringências;- Não estar conectado a um dos núcleos;Não estar conectado a um dos núcleos;- Não estar sobreposto a nenhum dos núcleos;Não estar sobreposto a nenhum dos núcleos;

(Fenech, 2000)

MetodologiaMetodologia

• Parâmetros a serem considerados:Parâmetros a serem considerados:

-- Frequência de MN/1000 cél. binucleadas; Frequência de MN/1000 cél. binucleadas;

-- Frequência de células binucleadas Frequência de células binucleadas micronucleadas/1000 cél. binucleadas; micronucleadas/1000 cél. binucleadas;

-- Distribuição de cél. binucleadas com 0, 1, 2, 3 Distribuição de cél. binucleadas com 0, 1, 2, 3 ou mais MN;ou mais MN;

(Fenech, 2000)

MetodologiaMetodologia

Célula binucleada apresentando 1 MN

MetodologiaMetodologia

Célula binucleada apresentando 2 MN

MetodologiaMetodologia

Células binucleadas apresentando 3 MN

MetodologiaMetodologia

Células binucleadas apresentando mais de 3 MN

MetodologiaMetodologia4) Análises estatísticas:

-frequência de MNs

- idade

- hábito de fumar

- ingestão de bebidas alcoólicas

- exposição a pesticidas

(tempo e frequência)

Teste do

qui-quadrado

MetodologiaMetodologia

5)5) Amplificação do TP53: Amplificação do TP53:

MetodologiaMetodologia

PrimersPrimers SequênciaSequência Tamanho do Tamanho do produtoproduto

p53+/p53Arg-p53+/p53Arg- p53+: 5’TCCCCCTTGCCGTCCCAAp53+: 5’TCCCCCTTGCCGTCCCAA

p53Arg-: 5’ CTGGTGCAGGGGCCACGCp53Arg-: 5’ CTGGTGCAGGGGCCACGC

Alelo ArgAlelo Arg

141 pb141 pb

p53Pro+/p53-p53Pro+/p53- p53Pro+: 5’GCCAGAGGCTGCTCCCCCp53Pro+: 5’GCCAGAGGCTGCTCCCCC

p53-: 5’CGTGCAAGTCACAGACTTp53-: 5’CGTGCAAGTCACAGACTT

Alelo ProAlelo Pro

177pb177pb

MetodologiaMetodologia6) Aspectos éticos:

- Consentimento livre e esclarecido;

- Princípios éticos, aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG.

Obrigada!!!Obrigada!!!