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Aula de Bioquímica I

Tema:

Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática

Prof. Dr. Júlio César Borges

Depto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Enzimas Proteolíticas: Proteases

Renovação de proteínas

- Reciclagem de Aminoácidos novas proteínas

- Energia Livre a partir de aminoácidos

- Digestão

Regulação celular

- Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação

Hidrólise de ligações peptídicas

- Adição de uma molécula de água

- t1/2 para hidrólise em pH neutro 10 a 1000 anos

Ressonância

Carbono da Carbonila é menos eletrófilo

Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo

SERINA-PROTEASES

Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa

- Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica

- Catálise covalente formação de um intermediário ligado à Enzima

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina

- Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos

Nomenclatura de especificidade para

interações Proteases-substrato

Pn= posição dos radicais Amino-cidível

Pn’= posição dos radicais Carboxi-cidível

Sn= Local na enzima para o radical Amino

Sn’= Local na enzima para o radical Carboxi

Sequência substrato da Quimotripsina

Marcação covalente com DIFP

(diisopropylphosphofluoridate)

Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP

- 1 de 20 Ser na Quimotripsina

Estudos de Cinética enzimática

Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo

SERINA-PROTEASES

Identificação do sítio ativo

SERINA-PROTEASES

Identificação do sítio ativo

Estudos de Cinética enzimática

Stopeed-flow (fluxo interropido)

Reação em 2 fases

SERINA-PROTEASES

Identificação do sítio ativo

Reação em 2 fases

Reação em duas etapas

1º) Acilação Formação de

Acil-Enzima

2º) Desacilação Saída do

grupo abandonador

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina

Quimotripsinogênio produzido no pâncreas e

ativado no estômago Ativação proteolítica

SERINA-PROTEASES

Sítio ativo é formado pela Tríade catalítica

- Asp, His e Ser forma rede de H-bound que reduz pKa da Ser catalítica

Hiper-polarização da OH da Ser

- Formação de um íon alcóxido

reativo poderoso nucleófilo

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina Estrutura protéica

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina Estrutura protéica

Mecanismo envolve:

- Catálise ácido-base

- Catálise nucleofílica

+

SERINA-PROTEASES

SERINA-PROTEASES

Sistema de revezamento de cargas

SERINA-PROTEASES

Mecanismo envolve:

- Catálise eletrostática

- Catálise por tensionamento ajuda a formar a estrutura tetraédrica

- Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo “Buraco Oxi-ânion”

1

Subtilisina

Carboxipeptidase II

SERINA-PROTEASES

Tríade catalítica

- Importância foi estudada por mutagênese sítio específica

- Atividade analisada por Cinética Enzimática

Subtilisina

Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante Menor atividade catalítica em 106 x

Mantém KM constante Afinidade E + S inalterada

Triplo mutante é ainda 103 vezes mais ativo do que Tampão

Explicação O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV Evolução Divergente

Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência

Estrutura terciária similar

Mecanismo de catálise similar

Diferem na especificidade por substratos

Superposição da

Quimotripsina e Tripsina

Alta similaridade estrutural

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina, Tripsina e Elastase Evolução Divergente

Bolsão S1

Principal fator de

especificidade destas

enzimas

SERINA-PROTEASES

Tripsina Bovina

- Tríade catalítica

- Substrato Arg no bolsão

- Asp enterrado no cerne da Estrutura

- 5 Pontes dissulfeto

SERINA-PROTEASES

- Quimotripsina – Subtilisina – Carboxipeptidase

II e ClpP protease

Sem correlação na estrutura primária e terciária

Evolução convergente

A Natureza parece ter descoberto de maneira

independente o mesmo mecanismo catalítico pelo

menos Quatro vezes

Outras PROTEASES

1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica

3- estabilização do intermediário tetraédrico

Cisteino-proteasesSerino-proteases

Metalo-proteasesAspartato-proteases

INIBIDORES DE PROTEASES

Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Ex: Captopril:

Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos

INIBIDORES DE PROTEASES

Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Aspartato proteases

INIBIDORES DE PROTEASES

Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Inibidores da aspartil protease do HIV

ANIDRASE CARBÔNICA

“Tornando mais rápida uma reação rápida”

Não-catalisada V = 1,3 x 10-1 (s-1)

Catalisada V = 1,0 x 10+6 (s-1)

Catálise depende da

presença de 1 íon Zn2+,

coordenado por 3 His,

localizado no fundo do

Sítio Ativo à 15 Angstrons

da superfície da enzima

ANIDRASE CARBÔNICA

Catálise por Zn2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H2O

Dependência da V em função do pH

- Catálise Básica

Zn2+ reduz o pKa da H2O de 15,7

para 7,0

- Aumento da [HO—] local mesmo em

pH = 7,0

- Íon HO— é um nucleófilo mais

poderoso do que a H2O

15,7Efeito do pH na Atividade da

Anidrase carbônica

ANIDRASE CARBÔNICA

Catálise ocorre em 4 etapas

- Catálise por Orientação - Catálise base geral

Próton liberado é captado pela His64

ANIDRASE CARBÔNICA

Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn2+

- Em pH 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO2 100 x maior

O Análogo sintético reduz o pKa da H2O = 8,7

ANIDRASE CARBÔNICA

Regeneração da Enzima depende da liberação do próton passo limitante

V da hidratação do CO2

= 1,3 x 10+6 (s-1)

-1-111

1

-1-1-11 sM10sM10 é H do difusão a Se

k

)sM(1x10M)1x10(M1x10 1-1-117-

1

7-

1

1

kk

kK

?

-14

1 s1x10k

- A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação

O meio celular é tamponado!!!! buffer com pKa = 7.0

- A Keq será = 1

ANIDRASE CARBÔNICA

A Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons

liberados da H2O para formar o nucleófilo OH—

-1-19

11 sM10 a' e' limita meio do difusãoA

kk

’.[B]kpor dada será prótons de retirada de A taxa 1

-163-1-19

1 s10)10(*)sM(10 ]'.[ MBk

Concentração de Tampão da ordem de mM

(1.10-3 M) são suficientes para alcançar

Velocidades de 1.10+6 s-1

ANIDRASE CARBÔNICA

O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima

Sem contato com o meio externo

O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial

His64 “LANÇADEIRA DE PRÓTONS”

na estrutura da proteína

ANIDRASE CARBÔNICA

O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima

Sem contato com o meio externo

O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

Enzimas de Restrição

Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias

- Mecanismo de defesa contra infecção viral

Endonucleases de Restrição tipo II

Clivam dentro da seqüência de

reconhecimento

Grande importância na

Engenharia Genética, Biologia

Molecular e Biotecnologia

Permitem a construção de

moléculas de DNA específicas

- Clonagem de DNA

Emprego em testes de

paternidade

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

Especificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima

- Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno

Reconhecem sequências específicas – Sítios de restrição

- Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos

Reconhecem apenas o DNA Exógeno

Metilases

Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento

Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente

- Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

Mecanismo da Hidrólise

Presença de Intermediários ligados à enzima?

Mecanismo 1 Catálise covalente

2 Passos sem inversão da configuração do P.

Mecanismo 2 Hidrólise direta

1 Passo Inversão da configuração do P.

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO

Mecanismo da Hidrólise

1 Passo com inversão da configuração do P

Sem intermediários reacionais

Sem catálise covalente

Envolve hidrólise direta

Uso de fosfotiatos marcador de

estereoisomeria

EcoRV

Dependência de Magnésio – Co-fator

- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado

1º DNA

2º H20

Íon Magnésio (Co-fator)

Coordenado por 6 ligantes

- 3 H2O

- 2 Asp

- 1 O do Pi

Ativa uma H2O para Ataque

Nucleofílico no grupo fosfato

Catálise por íon Metálico

- Posicionamento

- Catálise Eletrostática

- Catálise ácido-baseOrdem de ligação à EcoRV

1º: DNA

2º: Co-fator Mg2+

3º: H20 reativa

EcoRV

Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral

Sequência de reconhecimento é uma

sequência invertida

Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA

Interação EcoRV-DNA

A Enzima envolve o DNA

Metilação no DNA endógeno

EcoRV

Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar

- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico

EcoRV

Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar

- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico

Distorção do DNA tem um grande custo entrópico

que é compensado pelas interações produtivas

com DNA específico

Catálise por tencionamento

Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi

próximos aos grupos Asp reativos

EcoRV

Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a

especificidade da interação Enzima-DNA Distorção do DNA

- Reação só progride se a especificidade for garantida

- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado

A Enzima usa a Energia livre de ligação

com o DNA para deformar o Substrato e

preparar o complexo catalítico para a

reação.

Mg2+ é coordenado pelo Pi a ser clivado e

Asp posicionados próximos na conformação

distorcida

DNA cognato = específico

DNA não-cognato = inespecífico

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO II

Sem identidade Sequencial

Com identidade Estrutural

São proteínas homólogas transferência gênica horizontal

O gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias