análise microbiológica de água e · pdf fileutilização de...

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA E ALIMENTOSDE ÁGUA E ALIMENTOS

Análise de alimentosAnálise de alimentos

Utilização de técnicas microbiológicas:

Pesquisar presença de microrganismos;

Estimar número de microrganismos;

Identificar os microrganismos.

Microrganismos estressados

A detecção é feita pelo cultivo dos microrganismos em meios seletivos e não seletivos.

Os microrganismos isolados de alimentos geralmente são submetidos a condições de injúria, tais como aquecimento, refrigeração, conservantes, congelamento, desidratação, acidificação, salga, que irão afetar as células presentes.

Efeitos sobre os microrganismos:

aumento da fase LAG maior sensibilidade aos agentes do

meio de cultivo lesão na membrana citoplasmática lesão em enzimas do ciclo de Krebs deterioração de ribossomas lesão do DNA perda de componentes celulares incapacidade de multiplicação

Etapas da análise microbiológica

Amostragem;

Preparação da amostra;

Contagem de microrganismos;

Isolamento e identificação de microrganismos;

Sorologia.

AmostragemAmostragem

Especificação de dados;

Evitar contaminação com outros alimentos;

Transporte: alimentos perecíveis: 0-4ºC;alimentos congelados:

congelados;

Análise no máximo em 36 horas.

Preparação da amostraPreparação da amostra

Homogeneização da amostra;

Cuidado: velocidade e tempo ⇒ evitar aquecimento da amostra e danos aos microrganismos;

Melhor método: Stomacher.

Contagem de MicrorganismosContagem de Microrganismos

MÉTODOS DIRETOS:

1) Contagem em placa; Método de filtração: Método do Número Mais Provável Contagem direta ao microscópio: Contador Coulter:

MÉTODOS INDIRETOS:

1) Peso seco

2) Medida de turbidez

3) Atividade metabólica

4) Microcalorimetria

Contagem de MicrorganismosContagem de Microrganismos

Isolamento e Identificação de Isolamento e Identificação de MicrorganismosMicrorganismos

Características morfológicasCaracterísticas morfológicas

Morfologia bacteriana = diz pouco sobre as células;

Útil na identificação de algumas bactérias = endoesporos, flagelos, cápsula

Coloração diferencialColoração diferencialColoração de Gram;

GP GN

Coloração de Ziehl-Neelsen;

Coloração de esporos.

COLORAÇÃO DE GRAM

Cora em púrpura Cora em púrpura

Cora em vermelhoPermanece púrpura

Contratingir com Safranina

BACTÉRIASGRAM-POSITIVAS

BACTÉRIASGRAM-NEGATIVAS

Células fixadas à lâmina

Corante principal cristal violeta

Mordente:solução de iodo

Permanece púrpura Permanece púrpura

Permanece púrpura

Descorar com:álcool ou acetona

Testes bioquímicosTestes bioquímicosAtividade metabólica = utilizada para diferenciar bactérias;

Bactérias intimamente relacionadas = separadas por testes bioquímicos;

Reduzir o tempo:Uso de técnicas seletivas:Utilização de meios seletivos e diferenciais

e diferentes condições de cultivo;Utilização de testes rápidos.

Meios seletivos e diferenciais

EMB = identificação de E. coli

Ágar sangue = halo de hemólise

Meios seletivos e diferenciais

Ágar Baird Parker = identificação de S. aures

Ágar MYP = identificação de B. cereus

Testes rápidos = API 20E

Testes rápidos = tubos de compartimentos

Testes rápidos

Contagem de Microrganismos Aeróbios Contagem de Microrganismos Aeróbios MesófilosMesófilos

Pesar a amostra;

Fazer as diluições;

Plaqueamento: Superfície; Profundidade;

Meio utilizado: PCA

Preparação da amostra Homogeneização e Diluição

1mL

10-1

225mL H2O peptonada 0,1%

10-2

9mL H2O pept. 0,1%

10-3

9mL H2O pept. 0,1%

1mL25 g

Método de Profundidade

Método de Superfície

Resultados em placas

Contagem de Bactérias Aeróbias Contagem de Bactérias Aeróbias Mesófilas: Mesófilas: Método ProfundidadeMétodo Profundidade10-1 10-2 10-3

Ágar Padrão de Contagem (PCA)

1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Contagem e Identificação de Contagem e Identificação de Staphylococcus aureus: Staphylococcus aureus: Método SuperfícieMétodo Superfície

10-1 10-2 10-3

Ágar Baird Parker (BP)

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

Diluições

AN

Baird-Parker

IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureusTESTE CATALASE

H2O2 H2O + O2

H2O2

AN

CATALASE

BOLHAS

ESFREGAÇO

IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureusTESTE DNase e COAGULASE

DNase

COAGULASE

Protrombina Trombina

Fibrinogênio Fibrina

COAGULASE

Pesquisa de Pesquisa de SalmonellaSalmonella sp. sp.

H2O peptonada 1,0 %

PRÉ-ENRIQUECIMENTO

Rappaport Vassiliadis

Caldo tetrationato

ENRIQUECIMENTO SELETIVO

HE SS XLD HE SS XLD

PLAQUEAMENTODIFERENCIAL

Provas Bioquímicas

35 - 37ºC/24hs

IDENTIFICAÇÃO

Importância da Análise de ÁguaImportância da Análise de Água

Lavagem de matéria-prima;

Lavagem de utensílios;

Lavagem de superfícies;

Lavagem de carcaças;

Resfriamento;

Composição dos alimentos.

Qualidade da águaQualidade da água

Garantida do mesmo modo que a matéria-prima ou ingrediente;

Programa de garantia de qualidade = fonte, tratamento, distribuição e armazenamento dentro da fábrica;

Inspeção = padrões internos e legais = Portaria 518 de 2004

Frasco limpo e estéril;Sistema de distribuição = esperar 2 a 3 minutos, abrir o frasco, coleta a água e fechar o frasco;Rios, lagos, fontes = cuidado com água parada e material flutuante;Água com cloro = tiossulfato de sódio;Análise = máximo 30 horas após coleta.

Coleta de Água

Análise da água

Não deve ser baseada no isolamento e identificação de MOs patogênicos;

Microrganismos indicadores:Contagem em placas;Coliformes totais;Coliformes fecais.

Análise Microbiológica

Contagem de Coliformes totais e fecais:

Técnica do Número Mais Provável (NMP);

Técnica da membrana filtrante;Técnica do Collilert (Teste do ONPG e

MUG).

COLIFORMES TOTAIS

COLIFORMES TERMOTOLERANTES

IDENTIFICAÇÃO DE E. coli

Técnica do NMP

Número Mais Provável de Coliformes Totais Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais)e Termotolerantes (Fecais)

Lauril Sulfato Triptose (LST)

10mL

10mL LST

1mL

9mL LST

0,1mL

9,9mL LST

35-37ºC/24hs

Coliformes Totais

Caldo Verde Brilhante

Coliformes Termotolerantes

Caldo Escherichia coli

Provas Bioquímicas

Agar Eosina Azul de Metileno

44,5-45,5ºC/24hs

Membrana Filtrante

Vantagem de cada método

Filtração:Rápido;Exato;Método de esterilização a frio;

NMP:Recupera microrganismos injuriados;Mais barato;Evita falso negativo.

Desvantagem de cada Método

Filtração:Maior custo;Risco de perda de microrganismos, meio

seletivo;Só pode ser utilizado para água e

alimentos líquidos;

NMP:Demorado;Trabalhoso;

Colilert

Método Rápido – MUG e ONPG

MUG e ONPG - Resultado

Meios utilizados – CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS

PCA (ÁGAR PADRÃO DE CONTAGEM)Triptona 5,0gExtrato de levedura 2,5gDextrose 1,0gÁgar15,0gÁgua destilada 1,0L

CALDO RAPPAPORT - VASSILIADISTriptonaCloreto de magnésioCloreto de sódioVerde malaquitaFosfato de potássio

PESQUISA DE Salmonella sp.

CALDO TETRATIONATOProteose peptonaCarbonato de cálcioSais biliaresTiossulfato de sódioÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

AGAR Hectoen Enterico

Proteose peptona, Extrato de levedura Salicina, Sais biliares Lactose, Sacarose Tiossulfato de sódio Citrato férrico Cloreto de sódio Azul de bromotimol Fuccina ácida Ágar Água destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

AGAR SS (Salmonella/ Shigella)

Extrato de carne, Proteose peptona Citrato de sódioSais biliaresTiossulfato de sódioCitrato férricoVermelho neutroLactoseÁgarÁgua destilada1,0L

PESQUISA DE Salmonella sp.

ÁGAR CITRATO DE SIMMONSCitrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de manganêsAzul de bromotimolCloreto de sódioFosfato dipotássioÁgarÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

TSI (TRIPLE SUGAR IRON ÁGAR) Extrato de carne, Extrato de levedura Peptona, Proteose peptona Dextrose Lactose Sacarose Sulfato ferroso Tiossulfato de sódio Cloreto de sódio Vermelho de fenol Ágar Água destilada1,0L

PESQUISA DE Salmonella sp.

CALDO LISINAPeptona de gelatinaGlicoseExtrato de leveduraLisinaPúrpura de bromocresolÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

ÁGAR URÉIAPeptonaUréiaDextroseCloreto de sódioFosfato monopotássioVermelho de fenolÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

ÁGAR MIO (MOTILIDADE, INDOL, ORNITINA)Extrato de leveduraOrnitinaPeptonaPúrpura de bromocresolDextroseTriptonaAgarÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

CALDO VERMELHO DE FENOL Proteose peptona Extrato de carneCloreto de sódioVermelho de fenolÁgua destilada

PESQUISA DE Salmonella sp.

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

BP - BAIRD PARKER AGAR BASE Triptona, Extrato de carne, Extrato de levedura Cloreto de lítio Piruvato de sódio Glicina Ágar Água destilada

Após esterilização, adicionar: Emulsão de gema de ovo, salina Telurito de sódio

ÁGAR DNASEPeptona caseínaÁcido desoxirribonucléicoCloreto de sódioAgarÁgua destilada

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

Teste de Catalase

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST)TriptoseCloreto de sódioLactoseLauril sulfato de sódioFosfato de potássio dibásicoFosfato de potássio monobásicoÁgua destilada

CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2%PeptonaBile de boiLactose Verde brilhanteÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

CALDO Escherichia coli (EC)TriptoseCloreto de sódioLactoseSais biliaresFosfato de potássio dibásicoFosfato de potássio monobásicoÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)PeptonaLactose SacaroseFosfato de potássio dibásicoAzul de MetilenoEosina amarelaÁgarÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

ÁGAR CITRATO DE SIMMONSCitrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de magnésioAzul de bromotimolCloreto de sódioFosfato dipotássioÁgarÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

CALDO TRIPTONA

TriptonaÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

ÁGAR MOTILIDADE TripticaseFosfato dissódicoGlucoseExtrato de leveduraÁgarÁgua destilada

CALDO VM/VPPeptonaFosfato dipotásicoGlicoseÁgua destilada

EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA

Interpretação dos resultadosProdutos em condições sanitárias satisfatórias:

b. PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES.Produtos em condições sanitárias insatisfatórias:

d. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR.....

e. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR....