análise de canais para na + ativados por voltagem em neurônios do gânglio da raiz dorsal joão...
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Análise de Canais para Na+
Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal
João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado
Antônio Carlos Cassola – orientador
Universidade de São PauloInstituto de Ciências Biomédicas
Depto. de Fisiologia e BiofísicaDoutorado em Fisiologia Humana
Setembro de 2006São Paulo – Brasil
Potencial de ação
tempo (ms)
volta
gem
(m
V) 0
-70
Nav Kv
KvKir/Twik
0 1
+30 mV
Kir/Twik
Superfamília de CanaisAtivados por Voltagem
Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+
Nav 1.1Nav 1.2Nav 1.3Nav 1.7Nav 1.4Nav 1.6Nav 1.5Nav 1.8Nav 1.9
75 80 85 90 95 100% de identidade na seqüência de aminoácidos
Nav 1.1Nav 1.2Nav 1.3Nav 1.4Nav 1.5Nav 1.6Nav 1.7Nav 1.8Nav 1.9
6 TM 2 TM
KcsaKv
Estrutura terciária de canais iônicos
Doyle et al, 1998
Filtro de seletividade
Doyle et al, 1998
em solução
no filtro
Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem
MacKinnon et al, 2005
Kv1.2
Ativação e inativação doscanais para Na+
Kcsa
Farmacologia dos Nav
Farmacologia dos Nav
Bloqueio do poro
Farmacologia dos Nav
batrachotoxin, ciguatoxin
Alteram a dependência de voltagem por efeito alostéricoSítios em segmentos transmembrana
Farmacologia dos NavAlteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana
Sítios em alças extracelulares
-scorpion toxinssea-anemone toxinsspider toxins
-scorpion toxins
Farmacologia dos NavAnestésicos locais
Expressão de canais para Na+ ativados por voltagem em células de mamíferos
Expressão de canais para Na+ em mamíferos
Células não neuronais
Neurônios
Nav 1.1Nav 1.2Nav 1.3Nav 1.7Nav 1.4Nav 1.6Nav 1.5Nav 1.8Nav 1.9
75 80 85 90 95 100
Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD)
% de identidade
TTX-R
TTX-S
Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela técnica de “voltage clamp”
xIm = Vm Gm
fixa
Fixação de voltagem“Voltage clamping” tradicional
10m
Vc
Vm
i
célula
Fixação de voltagem“Voltage clamping” / “Patch Clamping”
Vc
Ra
Rm
Cm
CpIcp
Ip
Ic
Im
Rf
Vc
Rf
Hamill et al, 1981
ENa= +41,5 mV
INa+ ativadas por voltagem
5 nA
5 ms
0
-110 mV
-20
-25
-15
-10
-5
5
10
15
20
I m (
nA
)
40-80 -60 -40 -20 20 60 80 100
Vm (mV)
+80 mV
Extracelular - banhoNaCl 50 mMCloreto de colina 82CaCl2 1,8CoCl2 1KCl 4Hepes 10Glicose 5pH 7,4 (NaOH)
Sol. Intracelular - pipetaNaCl 10 mMCsF 150TEA 10EGTA 9Hepes 10ATP 2pH 7,4 (CsOH)
Vr
-3
-2
-1
0
1
2
-80 -40 0 40 80
Vm (mV)
Y/Y
máx
Vm-Vr
GNav
INav
INav = (Vm-Vr) x GNav
k
VVexp1
GVVI
m2/1
maxrmm
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades
biofísicas
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
RELAÇÃO I-V
-80 -60 -40 -20 20 40 60
-10
-8
-6
-4
-2
2
4
6
8
10
Ipic
o (n
A)
Vm (mV)
0
k
VVexp1
GVVI
m2/1
maxrmm
2k
V2Vexp1
2G
1k
V1Vexp1
1GVVI
m2/1
max
m2/1
maxrmm
Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para se ajustar à relação IV
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
RELAÇÃO I-V
-80 -60 -40 -20 20 40 60
-10
-8
-6
-4
-2
2
4
6
8
10
Ipic
o (n
A)
Vm (mV)
0
0
10
20
30
40
50
60
num
ber
of c
ells
V1/2 classes (mV)
LV conductance HV conductance Gaussian fitting of data
-50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 5
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
-90 -70 -50 -30 -10 10 30 50
Vm (mV)
INa
- p
ico
(n
A)Componente 1
Componente 2
soma
n=200
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA
-180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0
0
-5000
-10000
-15000
Pic
o de
cor
rent
e (p
A)
Vpré-pulso (mV)
dado1 equação
0
1 ms2 nA
-160 mV
-5 mV 0 mV
-110 mV
k
VVexp1
GG
m2/1
maxm
Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar àcurva de inativação estacionária
2k
V2Vexp1
2G
1k
V1Vexp1
1GG
m2/1
max
m2/1
maxm
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA
-180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0
0
-5000
-10000
-15000
Pic
o de
cor
rent
e (p
A)
Vpré-pulso (mV)
dado1 equação2 equações
-18000
-16000
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
-180 -130 -80 -30
Vprépulso (mV)
INa
(pA
)
total
componente 1
componente 2
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO
dado1 equação
5 ms
20 nS0
1 nA1 ms
0 mV-110 mV
h
3
mmaxt t
texp
texp1GG
rm
mm VV
IG
Hodgkin and Huxley, 1952c
Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são necessários para se ajustar à
curva de ativação e inativação da condutância no tempo
2
texp
2
texp12G
1
texp
1
texp11GG
h
3
mmax
h
3
mmaxt
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO
dado1 equação2 equações
5 ms
20 nS
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
-5 5 15 25 35
tempo (ms)
fraç
ão
de
co
nd
utâ
nc
ia
componente 1
componente 2
total
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fraç
ão d
e co
rren
tere
cupe
rada
da
inat
ivaç
ão
intervalo entre pulsos (ms)
20 ms
1 nA
0 mV
-110 mV
0
Ct
expAY t
Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à cinética de recuperação da inativação das condutâncias
ativadas por voltagem
C2
texp2A
1
texp1AY t
Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas
CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fraç
ão d
e co
rren
tere
cupe
rada
da
inat
ivaç
ão
intervalo entre pulsos (ms)
dado1 equação2 equações
CONTROLE
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
0 20 40 60 80 100 120
tempo
fraç
ão r
ecu
per
ada
da
inat
iva
ção
EXP1
EXP2
SOMA
Conclusões
Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades biofísicas.
Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de canais.
Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola
Agradecimentos
FIM
0 x
f(x)
f(x) = mx + b
m=
b=
1
2
3
4
5
-1-2-3-4-5
2
1,3
-1,3
0
f(x) = 1,3x – 1,3
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