análise de canais para na + ativados por voltagem em neurônios do gânglio da raiz dorsal joão...

Análise de Canais para Na+

Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal

João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado

Antônio Carlos Cassola – orientador

Universidade de São PauloInstituto de Ciências Biomédicas

Depto. de Fisiologia e BiofísicaDoutorado em Fisiologia Humana

Setembro de 2006São Paulo – Brasil

Potencial de ação

tempo (ms)

volta

gem

(m

V) 0

-70

Nav Kv

KvKir/Twik

0 1

+30 mV

Kir/Twik

Superfamília de CanaisAtivados por Voltagem

Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+

Nav 1.1Nav 1.2Nav 1.3Nav 1.7Nav 1.4Nav 1.6Nav 1.5Nav 1.8Nav 1.9

75 80 85 90 95 100% de identidade na seqüência de aminoácidos


6 TM 2 TM

KcsaKv

Estrutura terciária de canais iônicos

Doyle et al, 1998

Filtro de seletividade

Doyle et al, 1998

em solução

no filtro

Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem

MacKinnon et al, 2005

Kv1.2

Ativação e inativação doscanais para Na+

Kcsa

Farmacologia dos Nav


Bloqueio do poro


batrachotoxin, ciguatoxin

Alteram a dependência de voltagem por efeito alostéricoSítios em segmentos transmembrana

Farmacologia dos NavAlteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana

Sítios em alças extracelulares

-scorpion toxinssea-anemone toxinsspider toxins

-scorpion toxins

Farmacologia dos NavAnestésicos locais

Expressão de canais para Na+ ativados por voltagem em células de mamíferos

Expressão de canais para Na+ em mamíferos

Células não neuronais

Neurônios


75 80 85 90 95 100

Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD)

% de identidade

TTX-R

TTX-S

Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela técnica de “voltage clamp”

xIm = Vm Gm

fixa

Fixação de voltagem“Voltage clamping” tradicional

10m

Vc

Vm

i

célula

Fixação de voltagem“Voltage clamping” / “Patch Clamping”

Vc

Ra

Rm

Cm

CpIcp

Ip

Ic

Im

Rf

Vc

Rf

Hamill et al, 1981

ENa= +41,5 mV

INa+ ativadas por voltagem

5 nA

5 ms

0

-110 mV

-20

-25

-15

-10

-5

5

10

15

20

I m (

nA

)

40-80 -60 -40 -20 20 60 80 100

Vm (mV)

+80 mV

Extracelular - banhoNaCl 50 mMCloreto de colina 82CaCl2 1,8CoCl2 1KCl 4Hepes 10Glicose 5pH 7,4 (NaOH)

Sol. Intracelular - pipetaNaCl 10 mMCsF 150TEA 10EGTA 9Hepes 10ATP 2pH 7,4 (CsOH)

Vr

-3

-2

-1

0

1

2

-80 -40 0 40 80

Vm (mV)

Y/Y

máx

Vm-Vr

GNav

INav

INav = (Vm-Vr) x GNav

k

VVexp1

GVVI

m2/1

maxrmm

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades

biofísicas

Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas

RELAÇÃO I-V

-80 -60 -40 -20 20 40 60

-10

-8

-6

-4

-2

2

4

6

8

10

Ipic

o (n

A)

Vm (mV)

0

k

VVexp1

GVVI

m2/1

maxrmm

2k

V2Vexp1

2G

1k

V1Vexp1

1GVVI

m2/1

max

m2/1

maxrmm

Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para se ajustar à relação IV


RELAÇÃO I-V

-80 -60 -40 -20 20 40 60

-10

-8

-6

-4

-2

2

4

6

8

10

Ipic

o (n

A)

Vm (mV)

0

0

10

20

30

40

50

60

num

ber

of c

ells

V1/2 classes (mV)

LV conductance HV conductance Gaussian fitting of data

-50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 5

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

-90 -70 -50 -30 -10 10 30 50

Vm (mV)

INa

- p

ico

(n

A)Componente 1

Componente 2

soma

n=200


INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA

-180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0

0

-5000

-10000

-15000

Pic

o de

cor

rent

e (p

A)

Vpré-pulso (mV)

dado1 equação

0

1 ms2 nA

-160 mV

-5 mV 0 mV

-110 mV

k

VVexp1

GG

m2/1

maxm

Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar àcurva de inativação estacionária

2k

V2Vexp1

2G

1k

V1Vexp1

1GG

m2/1

max

m2/1

maxm


INATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA

-180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0

0

-5000

-10000

-15000

Pic

o de

cor

rent

e (p

A)

Vpré-pulso (mV)

dado1 equação2 equações

-18000

-16000

-14000

-12000

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

-180 -130 -80 -30

Vprépulso (mV)

INa

(pA

)

total

componente 1

componente 2


CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO

dado1 equação

5 ms

20 nS0

1 nA1 ms

0 mV-110 mV

h

3

mmaxt t

texp

texp1GG

rm

mm VV

IG

Hodgkin and Huxley, 1952c

Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são necessários para se ajustar à

curva de ativação e inativação da condutância no tempo

2

texp

2

texp12G

1

texp

1

texp11GG

h

3

mmax

h

3

mmaxt


CINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO


5 ms

20 nS

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

-5 5 15 25 35

tempo (ms)

fraç

ão

de

co

nd

utâ

nc

ia

componente 1

componente 2

total


CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO

0 20 40 60 80 100 120

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

fraç

ão d

e co

rren

tere

cupe

rada

da

inat

ivaç

ão

intervalo entre pulsos (ms)

20 ms

1 nA

0 mV

-110 mV

0

Ct

expAY t

Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à cinética de recuperação da inativação das condutâncias

ativadas por voltagem

C2

texp2A

1

texp1AY t


CINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO

0 20 40 60 80 100 120

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

fraç

ão d

e co

rren

tere

cupe

rada

da

inat

ivaç

ão

intervalo entre pulsos (ms)


CONTROLE

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

0 20 40 60 80 100 120

tempo

fraç

ão r

ecu

per

ada

da

inat

iva

ção

EXP1

EXP2

SOMA

Conclusões

Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades biofísicas.

Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de canais.

Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola

Agradecimentos

0 x

f(x)

f(x) = mx + b

m=

b=

1

2

3

4

5

-1-2-3-4-5

2

1,3

-1,3

0

f(x) = 1,3x – 1,3

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