anÁlise citogenÉtica comparativa entre os …livros01.livrosgratis.com.br/cp070061.pdf · - À...
Post on 11-Nov-2018
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
MARCELLA MERGULHÃO TAGLIARINI
ANÁLISE CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE OS REPRESENTANTES DAS FAMILIAS CATHARTIDAE E
ACCIPITRIDAE: INFERÊNCIAS SOBRE SUAS RELAÇÕES FILOGENÉTICAS E EVOLUÇÃO
CARIOTÍPICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Neurociências e Biologia Celular, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética. Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira BELÉM
2007
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
À família que é a chave para tudo!
3
AGRADECIMENTOS: Muitas pessoas fizeram parte da minha jornada até este ponto da minha vida e de alguma forma contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional, a todas elas meus sinceros agradecimentos. No entanto, algumas pessoas foram primordiais para meu aprendizado, participando do meu dia-a-dia, e me dando apoio e suporte para que eu traçasse meu caminho até aqui: - Agradeço à Deus, por me amar profundamente e estar ao meu lado mesmo quando eu não merecia. - Aos meus pais Eduardo Marechal Tagliarini e Rosa Maria Mergulhão Tagliarini por serem tudo pra mim, por terem me dado condições e sempre terem valorizado o conhecimento, superestimando-o e sempre preocupando-se com nossa educação. Obrigada pelo apoio e pelo amor incondicional. Espero conseguir retribuir tudo isso de alguma forma. Meu amor por vocês é infinito! - Aos meus irmãos Denise Mergulhão Tagliarini e Eduardo Mergulhão Tagliarini e ao meu filho Pingo Harrison de Madagascar por serem meu porto seguro, para quem eu volto todos os dias, por me acompanharem independente do caminho a ser trilhado e por me amarem acima de qualquer coisa. Amo muito vocês. - À todos meus amigos, os quais seria impossível listar aqui, por todos os momentos de alegria, descontração e conselhos. E em especial agradeço a três amigas que são irmãs que eu escolhi ter: Luciana Quintana, Caroline Moreira e Denise Costa. Não tenho palavras pra descrever o que vocês significam pra mim. Obrigada por cada sorriso, cada lágrima, cada madrugada, cada explicação, cada conselho, cada demonstração de carinho, cada tarde se empanturrando de comida em um lugar qualquer ou “peruando” no shopping. São momentos como esses que fazem a vida da gente valer a pena. Amo vocês! - Ao meu amigo, companheiro, conselheiro, cúmplice e amado, Rodolfo Santana pelo carinho, suporte e paciência durante todo esse tempo. A sua presença é imprescindível e é o que faz tudo ter sentido. Eu te amo!! - Ao meu orientador Edivaldo Herculano Corrêa de Oliveira por ser pra mim algo difícil de descrever. Você é um anjo na minha vida. Apenas sua forma de falar já torna todas as coisas mais simples. Obrigada por dedicar tanto tempo a mim e apostar na minha capacidade. Não sei o que seria de mim sem você! - À toda equipe do Laboratório de Citogenética da UFPA. Obrigada pela torcida e por tornar o ambiente de trabalho algo tão agradável. - Aos Criadouros e ao PZMPEG que colaboraram cedendo o material biológico; ao CNPq, pela bolsa e à UFPA por toda infra estrutura que me foi fornecida.
4
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1 1.1 OS PROBLEMAS DA CLASSIFICAÇÃO 1 1.2 ORDEM FALCONIFORMES 4 1.3 ORDEM CATHARTIFORMES 10 1.4 CITOGENÉTICA DE AVES 11 1.5 DADOS DE PINTURA CROMOSSÔMICA EM AVES 14 1.6 A APLICAÇÃO DOS ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM
ANÁLISESFILOGENÉTICAS. 18
1.7 DADOS CITOGENÉTICOS DE FALCONIFORMES E CATHARTIFORMES
20
2 OBJETIVOS 24 2.1 OBJETIVO GERAL 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24 3 MATERIAL E MÉTODOS 25 3.1 COLETA DE AMOSTRAS 25 3.2 CULTURA DE LEUCÓCITOS 25 3.3 CULTURA DE FIBROBLASTOS 26 3.4 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 28 3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTOS
CROMOSSÔMICOS 28
3.6 TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)
30
3.6.1 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr 18S/28S 30 3.6.2 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda cromossomo-
específicas de Gallus gallus 31
3.6.3 Desnaturação das Sondas de DNA e dos Cromossomos Metafásicos
32
3.6.4 Hibridação e detecção dos sinais correspondentes 33 3.7 ANÁLISE CARIOTÍPICA 34 3.8 ORGANIZAÇÃO DO CARIÓTIPO 35 4. RESULTADOS 34 4.1. O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE CATHARTIDAE 34 4.2 O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE ACCIPITRIDAE 40 4.3 EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 53 4.3.1 Hibridizações com 18s/28s r-dna 53 4.3.2 Hibridizações com sondas cromossomo-específicas de gallus
gallus 57
5. DISCUSSÃO 59 5.1 SISTEMA INTERNACIONAL PARA PADRONIZAÇÃO DO CARIÓTIPO
DE AVES 59
5.2 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA CATHARTIDAE
60
5.3 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA ACCIPITRIDAE
64
5.4 DADOS CROMOSSÔMICOS E A POSIÇÃO FILOGENÉTICA DE CATHARTIDAE E ACCIPITRIDAE
69
6. CONCLUSÃO 73 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76 ANEXO
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Algumas das propostas de Classificação para a ordem
Falconiformes (Fonte: Griffiths, 1999)................................ 01
Figura 02 Proposta de Sibley & Alhquist (1999) para a classificação de Falconiformes, incluindo esse grupo como uma infra-ordem dentro de Ciconiiformes, e excluindo Cathartidae, que foi incluída na infra-ordem Ciconiidae..........................
03
Figura 03 Proposta das relações filogenéticas dos diferentes gêneros de Accipitridae, de acordo com LERNER & MINDELL (2005).................................................................
07
Figura 04 Estudos baseados em sequenciamento do gene cyt-b e em distâncias de hibridização de DNA, incluindo cegonhas (família Ciconiidae) e alguns gêneros de abutres do Novo Mundo (SLIKAS, 1997)...........................
09
Figura 05 O típico cariótipo das Aves inclui um pequeno número de macrocromossomos (entre oito e dez pares) e um grande número de microcromossomos, como Ara chloroptera (DE OLIVEIRA et al., 2006)
13
Figura 06 Princípio da técnica de pintura cromossômica (uso de sondas cromossomo-específicas marcadas com fluorescência): cromossomos de uma determinada espécie são isolados e marcados com um fluorocromo ou uma molécula repóter. Ao ser hibridizado no cariótipo de outra espécie, essas sondas marcarão o segmento ou cromossomo com o qual apresenta homologia (baseado em DE OLIVEIRA, 2001)....................................................
14
Figura 07 Rearranjos cromossômicos no cariótipo da harpia (Harpia harpyja). Comparado com o cariótipo ancestral hipotético das aves (2n = 80), o cariótipo da harpia passou por uma grande reorganização, com a ocorrência de fusões e fissões cromossômicas envolvendo tanto os macrocromossomos como os microcromossomos. Entre os autossomos, as sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus utilizadas na comparação corresponderiam a 10 pares de macrocromossomos e 20 pares de microcromossomos no cariótipo ancestral. Os pares GGA1-6 foram identificados individualmente. O par sexual não se encontra representado no esquema (baseado em DE OLIVEIRA et al., 2006)..................................................
20
Figura 08 Figura 08 – A: Cariótipo do urubu rei (Sarcoramphus papa) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos de S. papa, mais o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).....................................
35
Figura 09 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 20 do urubu rei (Sarcoramphus papa)...................................................
36
Figura 10 Padrão de bandeamento C de Sarcoramphus papa. O cromossomo W apresenta-se indicado..............................
36
Figura 11 A: Cariótipo do urubu de cabeça vermelha (Cathartes
aura) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B:
Idiograma representando os pares de
macrocromossomos e o par sexual (Legenda:
m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico;
a=acrocêntrico)..................................................................
38
6
Figura 12 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura)................................
39
Figura 13 Padrão de bandeamento C de Cathartes aura. O par 8,
heteromórfico, apresenta-se indicado. 39
Figura 14 A: Cariótipo do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
41
Figura 15 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus).
42
Figura 16 Padrão de bandeamento C de Cathartes burrovianus. O cromossomo W apresenta-se indicado.
42
Figura 17 A: Cariótipo da harpia (Harpia harpyja) em coloração
convencional, com 2n=58 e NF=102; B: Idiograma
representando o cariótipo dessa espécie (Legenda:
m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico;
a=acrocêntrico).
44
Figura 18 Padrão de bandeamento G de Harpia (Harpia harpyja),
fêmea. 45
Figura 19 Padrão de bandeamento C de Harpia harpyja. O cromossomo W apresenta-se indicado.
46
Figura 20 A: Cariótipo do gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus)
em coloração convencional, com 2n=68 e NF=108; B:
Idiograma representando o cariótipo dessa espécie
(Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico;
st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
47
Figura 21 Padrão de bandeamento G do gavião pega macaco (Spyzaetus tyrannus), fêmea.
48
Figura 22 Padrão de bandeamento C de Spizaetus tyrannus. O cromossomo W apresenta-se indicado
49
Figura 23 A: Cariótipo do gavião branco (Leucopternis albicollis) em
coloração convencional, com 2n=66 e NF=104; B:
Idiograma representando o cariótipo dessa espécie
(Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico;
st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
51
Figura 24 Padrão de bandeamento G do gavião branco
(Leucopternis albicollis), fêmea 52
Figura 25 Padrão de bandeamento C de Leucopternis albicollis. O
cromossomo W apresenta-se indicado. 53
Figura 26 Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Cathartidae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. O cromossomo W está indicado no caso das fêmeas. A e B: Sarcoramphus
7
papa; C e D: Cathartes aura; E e F: Cathartes burrovianus.
54
Figura 27 Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em
Accipitridae. A, C e E mostram sinal da sonda em
amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F
mostram padrão de DAPI invertido. A e B: Harpia harpyja;
C e D: Spizaetus tyrannus; E e F: Leucopternis albicollis.
56
Figura 28 Resultado da hibridização de sondas cromossomo-
específicas de Gallus gallus (cromossomos 1 a 4) em
metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é
mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.
57
Figura 29 Resultado da hibridização de sondas cromossomo-
específicas de Gallus gallus (cromossomos 5 a Z) em
metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é
mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul
58
Figura 30 Mapeamento dos cromossomos de Gallus gallus (à direita
dos cromossomos) no cariótipo de Cathartes aura. 58
LISTA DE TABELAS Tabela I Espécies analisadas no presente trabalho 23
LISTA DE ANEXOS
Anexo I Variação cariotípica em Accipitridae (Amaral e Jorge,
2003)
8
RESUMO
Três espécies da família Cathartidae (Sarcoramphus papa, Cathartes aura e Cathartes burrovianus) e três espécies da família Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis) foram analisados citogeneticamente através de técnicas de citogenética clássica e molecular. As espécies de Cathartidae mostraram cariótipos muito semelhantes, com número diplóide igual a 80 e NF=90, dez pares de macrocromossomos, o cromossomo Z sumbetacêntrico e o W metacêntrico. O uso de sondas de R-DNA mostrou a localização de regiões organizadoras de nucléolo em um pequeno par nas três espécies. Houve diferenças na distribuição e quantidade de blocos heterocromáticos, sendo que em S. papa houve apenas marcações pericentroméricas e no cromossomo W, enquanto nas duas espécies de Cathartes observaram-se blocos heterocromáticos no braço longo de um par de acrocêntricos. A hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus em Cathartes aura mostrou total conservação dos cromossomos de 1 a 7 e Z, exceto o cromossomo 4 de Gallus, que corresponde a dois cromossomos em C. aura. As espécies de Accipitridae analisadas mostraram grande variação cariotípica, com números diplóides diferentes. Harpia harpyja apresentou o menor número diplóide, com 54 cromossomos. Spizaetus tyrannus apresentou 2n=68 e Leucopternis albicollis 2n=66. Essas espécies apresentaram cariótipos graduais, sem separação clara entre macro e microcromossomos, e apenas um pequeno número de cromossomos puntiformes. O uso de sondas de R-DNA revelou dois pares portadores de regiões organizadoras de nucléolo em H. harpyja, um pequeno par em S. tyrannus e um cromossomo médio em L. albicollis. Enquanto H. harpyja apresentou segmentos heterocromáticos na região pericentromérica de todos os seus cromossomos, S. tyrannus e L. albicollis apresentaram poucos cromossomos marcados pelo bandeamento C. Em comum, todas elas apresentaram blocos heterocromáticos mais extensos no cromossomo W. A análise cariotípica de Cathartidae e Accipitridae revela duas tendências diferentes, pois enquanto Cathartidae conserva um cariótipo ancestral, Accipitridae apresenta um complemento muito derivado. Isso coloca Cathartidae mais basal em relação a Accipitridae e Falconidae. Entretanto, os dados citogenéticos ainda são muito incompletos para o esclarecimento das relações filogenéticas entre essas famílias e outros grupos, como Ciconiidae.
9
ABSTRACT
Three species of family Cathartidae (Sarcoramphus papa, Cathartes aura and Cathartes burrovianus) and three species of Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis) were analyzed through classical and molecular cytogenetic techniques. Cathartidae species showed very similar karyotypes, with a diploid number of 80 and NF=90, ten pairs of macrochromosomes, the Z chromosome submetacentric and the W metacentric. The use of R-DNA probes showed nucleolar organizer regions on a small pair in all the species species. They showed differences in the amount and distribution of heterochromatic blocks. S. papa showed heterochromatin only on the pericentromeric region and on W chromosome, while both species of Cathartes had heterochromatic blocks also on the long arm of an acrocentric pair. The hybridization of Gallus gallus chromosome specific probes onto Catharte aura chromosomes revealed the conservation of chromosome 1 to 7 and Z, except chromosome 4, which corresponded to two different pairs in C. aura. The species of Accipitridae showed a great chromosomal variation, with different diploid numbers. Harpia harpyja had the lower diploid number, 2n=54. Spizaetus tyrannus had 2n=68 and Leucopternis albicollis 2n=66. These species showed gradual karyotypes, without a clear distinction between macro and microchromosomes, and only a few pairs of tiny chromosomes. The use of R-DNA probes showed two NOR-bearing pairs in H. harpyja, a small pair in S. tyrannus and a medium sized chromosome pair in L. albicollis. While H. harpyja showed heterochromatic segments on the pericentromeric region of all the chromosomes, S. tyrannus and L. albicollis showed few chromosomes with C-positive bands. In common, the three species showed larger blocks on the W chromosome. The karyotypic analysis in Cathartidae and Accipitridae reveals two different tendencies: while Cathartidae retained the Avian ancestral karyotype, Accipitridae showed much derived complements. This fact places Cathartidae in a more basal position in relation to Accipitridae and Falconidae. However, the cytogenetic data are still incomplete to clarify the phylogenetic relationship between these families and other groups, such as Ciconiidae..
10
1. INTRODUÇÃO
1.1 OS PROBLEMAS DA CLASSIFICAÇÃO
A ordem Falconiformes é um grupo de aproximadamente 290 espécies
que inclui aves de rapina exímias caçadoras diurnas e espécies
especializadas na necrofagia. A sistemática dos falconiformes encontra-se
entre as mais problemáticas dentre as Aves, e um grande número de aves de
rapina foi agrupado em uma única ordem porque, historicamente, as
propostas de classificação dependiam principalmente da estrutura das patas
e do bico (FEDUCCIA, 1999) (Fig. 01).
Figura 01 – Algumas das propostas de Classificação para a ordem Falconiformes (Fonte: Griffiths, 1999).
11
Tanto o monofiletismo como as relações das famílias dentro da própria
ordem estão em questão. Não existem registros fósseis indicando que as
diferentes famílias originaram-se de um ancestral comum, sugerindo assim,
que os Falconiformes podem ter resultado de uma convergência evolutiva
entre grupos de origem polifilética, fazendo com que não haja nenhuma
relação estrita entre as espécies fósseis e as espécies viventes (BROWN &
AMADON, 1968; FEDUCCIA, 1980; DEL HOYO et al., 1994).
De acordo com classificações morfológicas tradicionais (BROWN &
AMADON, 1968; STORER, 1971; STRESEMAN & AMADON, 1979;
CRACRAFT, 1981), Sagittaridae, Cathartidae, Acciptridae e Falconidae
pertencem à ordem Falconiformes. No entanto, baseado em detalhados
estudos morfológicos de muitas famílias, JOLLIE (1976,1977) concluiu que os
Falconidaes e Acciptridaes não são proximamente relacionados. De acordo
com essa interpretação, a ordem Falconiformes é polifilética, especialmente
com respeito à inclusão dos abutres do novo mundo (Cathartidae); essa visão
é apoiada por estudos de muitos tratos comportamentais (KÖNIG, 1982) e,
mais recentemente por análises moleculares (SIBLEY & AHLQUIST, 1990;
SEIBOLD & HELBIG, 1995; WINK et al., 1998).
SIBLEY & AHLQUIST (1990) estimaram a similaridade genômica total
por hibridização DNA-DNA e propuseram uma nova classificação das aves,
onde os abutres do novo mundo aparecem proximamente relacionados às
cegonhas (Ciconiidae). Na classificação deles, o táxon falconiforme é
colocado dentro de uma ordem expandida, os Ciconiiformes que inclui a
infraordem Falconides (incluindo Falconidae e Accipitridae) e Ciconiides
12
(incluindo a família Ciconiidae com as subfamílias Cathartinae e Ciconiinae)
(Fig.02).
Figura 02 – Proposta de Sibley & Alhquist (1999) para a classificação de Falconiformes, incluindo esse grupo como uma infra-ordem dentro de Ciconiiformes, e excluindo Cathartidae, que foi incluída na infra-ordem Ciconiidae.
13
Análises de seqüências do gene citocromo b (cyt b) (AVISE et
al.,1994; SEIBOLD & HELBIG, 1995; WINK et al.,1998) apóiam essa posição
taxonômica para os abutre do novo mundo, mas a relação dos Ciconiidae
com respeito aos Acciptridae e Cathartidae ainda não foi resolvida.
A lista de aves do Brasil apresentada pelo Comitê Brasileiro de
Registros Ornitológicos (CBRO) (disponível em http: www.ib.usp.br/cbro) tem
uma estrutura, sobretudo a seqüência, baseada grandemente na lista de
aves do SACC (South American Classification Committee da AOU –
American Ornithologists’ Union), mas há discordâncias diversas. Dessa
forma, levando em consideração a controvérsia da relação entre os abutres
do Novo Mundo, os remanescentes Falconiformes e os Ciconiiformes, a lista
do CBRO inclui esses grupos em três ordens distintas: Cathartiformes,
Falconiformes e Ciconiiformes. A inclusão dos abutres do Novo Mundo na
ordem Cathartiformes já havia anteriormente sido sugerida por alguns
autores, baseados em dados morfológicos (JOLIE, 1977) e citogenéticos (DE
BOER & SINOO, 1984), entre outros.
1.2 FAMILIA ACCIPITRIDAE
Inclui aves de rapina diurnas e os necrófagos do Velho Mundo, unidas
por certos caracteres relacionados à predação, como o bico curto e afiado,
em forma de gancho, com uma massa macia em sua base superior, chamado
de cera, sendo o local por onde passam suas narinas. As patas apresentam-
se fortes e com garras longas e curvadas e com um dedo oposto
(FEDUCCIA, 1999).
14
Os jovens têm um rápido crescimento de sua plumagem primária,
seguido de seis a oito semanas de cuidados no ninho para realizar o seu
primeiro vôo. E no período de um a três anos de idade são considerados
adultos ainda sexualmente imaturos. Os sexos em geral se assemelham
quanto ao colorido. Macho e fêmea distinguem-se geralmente pelo tamanho,
sendo freqüentemente a fêmea maior, podendo chegar a ser um terço maior
que seu companheiro (SICK, 1997).
Esta família inclui aproximadamente 65 gêneros, distribuída por todo o
mundo, com exceção do continente Antártico, e com sua diversidade maior
concentrada nos Neotrópicos (SICK, 1997). Apesar de diversas revisões
taxonômicas, a história evolutiva dessa família ainda não foi suficientemente
explorada usando-se métodos de inferência filogenética, e a maioria das
propostas de classificação são baseadas principalmente na plumagem e
ecologia das espécies (OLSON, 1985). Análises filogenéticas baseadas em
dados morfológicos são de difícil resolução (BROWN & AMADON, 1968;
JOLLIE, 1976, 1977). Dessa forma, em muitos casos essas classificações
dificilmente refletem as verdadeiras relações filogenéticas entre as espécies
(AMARAL, 2006). A diversidade morfológica de Accipitridae tem sido
tradicionalmente representada em subgrupos de espécies similares ou
supostamente próximas, como gaviões, águias, e buteonineos (THIOLLAY,
1994).
Alguns estudos evidenciaram inclusive o polifiletismo de certos
gêneros. Dessa forma, estudos baseados no sequenciamento de quatro
genes mitocondriais sugerem o polifiletismo de Leucopternis e Buteogallus,
ambos neotropicais (AMARAL et al., 2006). Outros estudos tentam desvendar
15
a verdadeira relação entre gêneros agrupados por semelhanças
morfológicas, mas com distribuições geográficas que dificultam o
entendimento de sua biogeografia, como o caso do grupo das águias harpias,
com gêneros na América e nas Ilhas Filipinas, e do gênero Spizaetus, com
representantes neotropicais e na Malásia (HELBIG et al., 2004; LERNER &
MINDELL, 2005)
LERNER & MINDELL (2005), analisaram cerca de 50% das espécies
pertencentes à família Accipitridae através do sequenciamento de genes
mitocondriais e nucleares, e propuseram que a várias das subfamílias
reconhecidas não representam grupos monofiléticos (Fig. 03). A inclusão dos
abutres do Velho Mundo em Accipitridae foi bem apoiada nesse estudo.
1.3 FAMÍLIA CATHARTIDAE
Com suas asas poderosas, os abutres do Novo Mundo são excelentes
planadores. Exibem características morfológicas que facilmente os
distinguem dos abutres do Velho Mundo, incluídos entre os Accipitridae.
Assim, os abutres do Novo Mundo não produzem sons, e apresentam o septo
nasal perfurado. Várias espécies vivem em florestas, onde seu olfato muito
desenvolvido os auxilia na localização de carcaças (BROOKE, 1991).
Existem sete espécies atuais de Cathartidae, incluindo o raro condor
da Califórnia (Gymnogyps californianus) e o condor dos Andes (Vultur
gryphus), que são espécies muito grandes, chegando a pesar 11,5 Kg, com
uma envergadura de aproximadamente três metros. As outras cinco espécies
são: o urubu-rei (Sarcoramphus papa), que ocorre do México até a Argentina;
o urubu-preto (Coragyps atratus) e o urubu de cabeça vermelha (Cathartes
16
aura), ambos bastante comuns também na América do Norte, e duas
espécies de urubus de cabeça amarela (Cathartes melambrotus e Cathartes
burrovianus) (AMADON, 1977, FEDUCCIA, 1999).
Figura 03 – Proposta das relações filogenéticas dos diferentes gêneros de Accipitridae, de acordo com LERNER & MINDELL (2005).
17
Apesar dos abutres do Novo Mundo ainda serem incluídos na ordem
Falconiformes mesmo em algumas classificações tão recentes quanto à
década de 90 (WETMORE, 1960; CRACAFT, 1981; GRIFFITHS, 1994, entre
outras), já havia suspeitas desde 1873 de que essas espécies não seriam
abutres verdadeiros (GARROD, 1873 apud SEIBOLD & HELBIG, 1995). De
fato, HUDSON (1948) sugeriu a inclusão de Cathartidae em uma ordem
separada de outras aves de rapina, baseado em estudo dos músculos
pélvicos, e AMADON (1977) afirmou que os Cathartidae seriam muito
distintos dos abutres do Velho Mundo anatomicamente, e que suas inclusão
na ordem Falconiformes seria duvidosa.
Atualmente, apesar de algumas classificações manterem Cathartidae
dentro da ordem Falconiformes, o fato dos abutres do Novo Mundo não
serem aves de rapina encontra-se bem estabelecido (KÖNIG, 1982; SIBLEY
& AHQUIST, 1990; AVISE et al., 1994; SEIBOLD & HELBIG, 1995).
SIBLEY & AHQUIST (1990), baseados em estudos de DNA, afirmaram
que as espécies de Cathartidae encontram-se proximamente relacionados à
família Ciconiidae. De fato, juntamente com as cegonhas, os abutres do Novo
Mundo são as únicas espécies que se refrescam por uro-hidrose,
derramando seus líquidos urinários em suas patas (KAHL, 1963 apud
FEDUCCIA, 1999). Outros estudos morfológicos, como LIGON (1967) e REA
(1983), também apóiam a estreita relação filogenética entre esses dois
grupos. Entretanto, outros estudos moleculares não obtiveram o mesmo
resultado, sugerindo que Cathartidae não seria um grupo filogeneticamente
mais próximo de Ciconiidae (SLIKAS, 1997) (Fig. 04).
18
Figura 04 – Estudos baseados em sequenciamento do gene cyt-b e em distâncias de hibridização de DNA, incluindo cegonhas (família Ciconiidae) e alguns gêneros de abutres do Novo Mundo (SLIKAS, 1997).
19
1.4 CITOGENÉTICA DE AVES
Existe uma defasagem no estudo do cariótipo das Aves, quando
comparado a outros grupos, como mamíferos e peixes. Isto se deve não só
às características peculiares do cariótipo das aves e às dificuldades técnicas
delas decorrentes, mas também ao pouco investimento pessoal e financeiro
nesta área de estudo (DE OLIVEIRA & JORGE, 2000). Estima-se que apenas
10% das espécies de aves brasileiras tiveram seus cariótipos conhecidos até
a década de 90 (DE LUCCA & ROCHA, 1992). Infelizmente este percentual
ainda não sofreu alteração significativa.
A classe Aves apresenta certa variação no número de cromossomos,
porém há uma uniformidade quanto ao conteúdo de DNA nuclear, que é o
menor e mais uniforme entre os vertebrados (VENTURINI et al., 1987). De
fato, GREGORY (2002) sugere que o baixo valor C pode estar relacionado
com a diminuição do volume celular, diminuindo também seu peso corpóreo.
Os cromossomos sexuais de aves são do tipo ZZ/ZW, o que significa
que a fêmea apresenta o par sexual heteromórfico. Devido ao reduzido
tamanho do genoma das aves, a heterocromatina constitutiva, região rica em
seqüências repetitivas, está localizada principalmente no W e na região
pericentromérica dos macrocromossomos (BLOOM et al., 1993).
As duas principais características do cariótipo das Aves são: um
número diplóide elevado e a presença de muitos cromossomos de tamanho
diminuto, denominados microcromossomos (DE OLIVEIRA & JORGE, 2000).
Um cariótipo típico das aves apresenta 6 a 8 pares de macrocromossomos e
cerca de 32 pares de microcromossomos, totalizando em torno de 80
cromossomos. Entretanto, algumas espécies apresentam número reduzido
20
de cromossomos, como alguns Falconidae, nos quais o número diplóide pode
estar reduzido a 50. No galo (Gallus gallus), aproximadamente 55% do
genoma está contido nos cinco primeiros pares que constituem os
macrocromossomos, 20% nos cromossomos de 6 a 10, e os 25% restantes
nos microcromossomos (BLOOM et al.,1993).
Atualmente, estudos citogenéticos em aves tendem a uma
caracterização mais detalhada do cariótipo, com contagem exata do número
de cromossomos, localização dos genes para RNA ribossômico e uma
melhor compreensão da estrutura cromossômica. A análise citogenética tem
contribuído sobremaneira para o estabelecimento de relações evolutivas
entre vários grupos. Além disso, contribui para que se entenda o papel dos
rearranjos cromossômicos na especiação, e vem esclarecendo acerca da
diferenciação dos cromossomos sexuais e o mecanismo de determinação
sexual nas aves. De forma mais aplicada, tem auxiliado na identificação de
espécies consideradas crípticas, e possibilitando a identificação do sexo em
espécies que não apresentam dimorfismo sexual fenotípico aparente (DE
LUCCA & ROCHA, 1992).
Um número maior de espécies analisadas por técnicas de
bandeamento, tais como bandeamento G, C, NOR, permitirá a análise mais
pormenorizada dos mecanismos envolvidos na diferenciação cromossômica
nessa classe. Além disso, os dados obtidos de tais estudos poderão
contribuir para estudos filogenéticos, e os resultados somariam importantes
contribuições para o entendimento de suas relações filogenéticas (DE
OLIVEIRA et al., 2006)
21
Espécies que apresentam o cariótipo formado por um grupo de
macrocromossomos (aproximadamente 8-10 pares) e muitos pares de
microcromossomos mostram uma grande constância cariotípica, com a
maioria dos grupos sintênicos mantendo-se inalterada (Fig. 05). Esse
cariótipo básico deve ser semelhante ao cariótipo ancestral das Aves, já que
alguns répteis apresentam o cariótipo bimodal e as análises de mapeamento
gênico identificaram uma ordem semelhante àquela observada em Gallus
(RODIONOV, 1997; DERJUSHEVA et al. 2004).
1.5 DADOS DE PINTURA CROMOSSÔMICA EM AVES
As novas técnicas de citogenética molecular, como a pintura
cromossômica (”Chromosome painting”, WIENBERG et al., 1990; 1992;
JAUCH et al., 1992; STANYON et al., 1992) trouxeram um notável progresso
à citogenética comparativa. Desta forma, diferenças que não eram evidentes
por técnicas de bandeamento por incluírem segmentos muito pequenos dos
cromossomos, e a confirmação de homologias baseadas em padrões de
bandeamento podem ser observadas e analisadas a um nível de resolução
muito maior, já que na citogenética molecular as homologias são baseadas
no conteúdo gênico dos cromossomos analisados (DE OLIVEIRA, 2001).
Segundo LYSAK et al (2001), o termo pintura cromossômica, proposto
por PINKEL et al. (1988), denota a marcação in situ de regiões
cromossômicas através de sondas cromossomo-específicas (Fig. 06). Essa
metodologia foi utilizado com muito sucesso em cromossomos de mais de 40
espécies de mamíferos (FERGUSON-SMITH, 1997), em algumas aves
22
(SHETTY et al., 1999; ZIMMER et al., 1997, DE OLIVEIRA et al, 2005),
répteis (MUÈHLMANN-DIAZ et al., 2001) e insetos (FUCHS et al.,1998).
Figura 05 – O típico cariótipo das Aves inclui um pequeno número de macrocromossomos (entre oito e dez pares) e um grande número de microcromossomos, como Ara chloroptera (DE OLIVEIRA et al., 2006).
23
Figura 06 – Princípio da técnica de pintura cromossômica (uso de sondas cromossomo-específicas marcadas com fluorescência): cromossomos de uma determinada espécie são isolados e marcados com um fluorocromo ou uma molécula repóter. Ao ser hibridizado no cariótipo de outra espécie, essas sondas marcarão o segmento ou cromossomo com o qual apresenta homologia (baseado em DE OLIVEIRA, 2001).
HIBRIDIZAÇÃO
24
Poucos artigos com aplicação de sondas cromossomo-específicas em
aves foram publicados, explorando diferentes abordagens evolutivas, tais
como mecanismos de diversificação cromossômica (SHETTY et al., 1999; DE
OLIVEIRA et al., 2005), filogenia (SHIBUSAWA et al., 2004 a, b),
diferenciação dos cromossomos sexuais (GRAVES & SHETTY, 2001), e
mapeamento cromossômico (MASABANDA et al., 2004), entre outros.
Até o momento, foram utilizadas sondas de uma única espécie (Gallus
gallus) nas comparações cromossômicas entre aves. Essa espécie apresenta
o mapeamento gênico bem desenvolvido. A aplicação de sondas
cromossomo-específicas dos macrocromossomos de Gallus em emu
(Dromaius novaehollandiae), duas espécies separadas por 80 milhões de
anos, revelou apenas um rearranjo cromossômico entre as duas espécies: a
sonda específica do cromossomo GGA 4 marcou um macrocromossomo e
um microcromossomo em Dromaius (SHETTY et al. 1999). Posteriormente, o
mesmo resultado foi observado em outras espécies diferentes, como no
condor da Califórnia (Gymnogyps californianus), pombo (Columba livia),
tentilhão (Fringilla coelebs), tordo (Turdus iliacus) e três espécies de faisão
(RAUDSEPP et al. 2002, GUTTENBACH et al. 2003, DERJUSHEVA et al.
2004). Aparentemente, o cromossomo GGA 4 representaria uma condição
apomórfica originada pela fusão dos dois pares marcados pela sonda nas
outras espécies.
25
1.6 A APLICAÇÃO DOS ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM ANÁLISES
FILOGENÉTICAS.
A citogenética desenvolveu-se principalmente a partir da década de 50
e seu progresso acompanhou o aprimoramento de técnicas e equipamentos
de microscopia. É a ciência que estuda os constituintes celulares portadores
da informação genética (cromossomos). Compreende qualquer estudo
relativo ao cromossomo, em suas diferentes formas, tanto ao que diz respeito
à morfologia, organização, função e replicação quanto no tocante à sua
variação e evolução (SACCHET, 1999).
Cromossomos mitóticos oferecem uma oportunidade única de se
observar o genoma nuclear de forma microscópica, além de explorar seus
componentes tanto individualmente como globalmente através da análise
cariotípica. Como o cariótipo representa uma visão fenotípica do genótipo,
não é surpreendente que análises cromossômicas sejam usadas para
entendimento de relações sistemáticas e filogenéticas entre as espécies,
assim como para esclarecer sobre os possíveis mecanismos de especiação
(KOLT’SOB, 1922; GATES, 1925; LEWITSKY, 1925, 1931 apud DOBIGNY et
al., 2004). É possível detectar sinapomorfias (caracteres que são
compartilhados a partir de um ancestral comum), e identificar relações de
grupos irmãos entre os táxons (HENNIG, 1966 apud AMORIM, 2002). De
fato, rearranjos cromossômicos parecem candidatos ideais como marcadores
genéticos em investigações filogenéticas, por serem considerados
modificações genômicas raras (ROKAS & ROKND, 2000), e fornecer
caracteres cladísticos com nível de nomoplasia muito baixo (ex: MURPLY et
al., 2004; WIENBERG, 2004; DE OLIVEIRA et al., 2005).
26
Os bandeamentos cromossômicos, técnicas de coloração diferencial
desenvolvidas nas décadas de 60 – 70 expandiram os horizontes da
citogenética, e a primeira aplicação do bandeamento deu-se no pareamento
cromossômico. Essas técnicas têm possibilitado um melhor entendimento
das alterações cromossômicas que se estabelecem em cada genótipo
(GUERRA, 1988), e são agrupados dentro da citogenética clássica.
O desenvolvimento de novas metodologias em sequenciamento de
DNA, mapeamento gênico e análise cromossômica permitiram um grande
avanço na compreensão da organização, estrutura e evolução do
complemento cromossômico. As técnicas de hibridização in situ permitiram
uma ligação entre os dados moleculares de seqüências de DNA e a
citogenética, podendo ser utilizadas no mapeamento físico dessas
seqüências e na identificação e caracterização de cromossomos ou
segmentos cromossômicos (SCHWAZACHER & HESLOP-HARRISON, 2000;
DE OLIVEIRA et al., 2006)
Nos anos mais recentes, o ZOO-FISH (Pintura cromossômica
comparativa) vem sendo utilizado como um dos mais eficientes métodos para
rápida detecção de similaridades moleculares entre cromossomos de
diferentes espécies (CHOWDHARY et al, 1998; CHOWDHARY &
RAUDSEPP, 2001). Esse método é particularmente útil para transferir
informações genéticas de espécies com mapas gênicos mais desenvolvidos
para aquelas cujos mapas gênicos são pobremente conhecidos, ou
simplesmente não existem. Recentemente, a pintura cromossômica de todos
os macrocromossomos e alguns microcromossomos da galinha foi utilizada
com muito sucesso para detectar homologias entre cromossomos de
27
algumas espécies de aves (SHETTY et al, 1999; SCHMID et al, 2000;
GRÜTZNER et al, 2001; RAUDSEPP et al, 2002).
1.7 DADOS CITOGENÉTICOS DE ACCIPITRIDAE E CATHARTIDAE
As aves de rapina encontram-se entre os grupos de aves com o maior
número de espécies analisada citogeneticamente (BED’HOM, 1999,
AMARAL & JORGE, 2003) (Anexo I), devido principalmente à atraente
diversidade cariotípica observada, incomum para a maioria de ordens de
aves, que conservam um cariótipo muito semelhante entre si, sem grandes
variações no número ou fórmula cromossômica. A análise dessa variação
cromossômica poderá revelar importantes caracteres para análises
filogenéticas (DE OLIVEIRA et al., 2006).
As aves de rapina diurnas apresentam números cromossômicos
relativamente baixos, entre 50-70, e poucos pares de microcromossomos. De
fato, os cromossomos diminuem de tamanho gradativamente, deixando entre
quatro e oito pares de microcromossomos, distintos dos restantes pelo seu
tamanho diminuto (BED’HOM, 1999).
Uma grande expectativa foi criada em relação aos resultados de
pintura cromossômica em aves de rapina: as hipóteses sobre a evolução
cromossômica nesse grupo sempre evocaram a ocorrência de translocações
e fusões envolvendo principalmente os microcromossomos (DE BOER, 1976;
ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM, 1999). Recentemente, foram publicados
os primeiros resultados utilizando sondas cromossomo-específicas de Gallus
em experimentos de hibridização in situ no cariótipo da harpia (Harpia
harpyja) (DE OLIVEIRA et al. 2005). Como outras aves de rapina, a harpia
28
apresenta um número diplóide relativamente baixo, 2n = 58, e poucos pares
de microcromossomos. O experimento revelou uma completa reorganização
genômica na harpia, com a ocorrência de fusões, translocações e fissões
(Fig. 07). Além disso, foi mostrado que os pares cromossômicos maiores de
Gallus apresentam-se fissionados no cariótipo da harpia, originando de 2 a 5
cromossomos distintos. A sonda cromossomo-específica GGA Z marcou não
só o cromossomo Z da harpia, mas também quase a totalidade do
cromossomo W, que se apresenta normalmente de grande tamanho em
algumas aves de rapina. Esses dados mostram a ocorrência de uma drástica
reorganização genômica na harpia, que pode ser estendida para outras aves
de rapina.
Os estudos de NANDA et al. (2006) com pintura cromossômica em
abutres do Velho Mundo também revelaram extensa reorganização
cariotípica. Como observado na harpia, os cromossomos de 1 a 5 de Gallus
também hibridizaram com mais de um par de cromossomos (entre três e
cinco) nas diferentes espécies analisadas, que também apresentam um baixo
número de microcromossomos, e um número diplóide aproximado de 66.
Várias espécies de Cathartiformes tiveram seus cariótipos analisados.
A maioria dos estudos limitou-se à publicação do número diplóide e
morfologia cromossômica (TAKAGI & SASAKI, 1974; DE BOER, 1975, 1976;
WILLIAM & BENIRSCHKE, 1976 apud AMARAL & JORGE, 2003;
RAUDSEPP et al., 2003). Aparentemente, há uma grande conservação
cariotípica nessa família, com todas as espécies apresentando 2n=80, com
exceção de Cathartes aura, com 2n=76. Nada se sabe sobre a distribuição de
29
blocos heterocromáticos e regiões organizadoras de nucléolo, entre outras
características cromossômicas.
Figura 07 - Rearranjos cromossômicos no cariótipo da harpia (Harpia harpyja). Comparado com o cariótipo ancestral hipotético das aves (2n = 80), o cariótipo da harpia passou por uma grande reorganização, com a ocorrência de fusões e fissões cromossômicas envolvendo tanto os macrocromossomos como os microcromossomos. Entre os autossomos, as sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus utilizadas na comparação corresponderiam a 10 pares de macrocromossomos e 20 pares de microcromossomos no cariótipo ancestral. Os pares GGA1-6 foram identificados individualmente. O par sexual não se encontra representado no esquema (baseado em DE OLIVEIRA et al., 2006).
30
O condor da Califórnia é uma exceção, já que o padrão de
bandeamento C e localização de 28 S R-DNA foram analisados juntamente
com estudos de pintura cromossômica (RAUDSEPP et al., 2003).
Seguindo a tendência dos estudos morfológicos e moleculares, os
estudos citogenéticos revelam uma grande diferença entre os Cathartidae e
as aves de rapina tradicionais (Falconidae e Accipitridae). Assim, os abutres
do Novo Mundo conservam o cariótipo típico da classe Aves, com números
diplóides próximos ou iguais a 80, e cerca de nove pares de
macrocromossomos (AMARAL & JORGE, 2003; RAUDSEPP et al., 2003).
Além disso, enquanto os estudos de citogenética molecular na harpia (Harpia
harpyja) (DE OLIVEIRA et al., 2005), e nos abutres do Velho Mundo (NANDA
et al., 2006), revelaram um grande número de rearranjos em relação ao
cariótipo ancestral hipotético das aves, a análise do condor da Califórnia
(Gymnogyps californianus) com a mesma metodologia revelou a retenção
aparentemente total dos grupos sintênicos do cariótipo ancestral
(RAUDSEPP et al., 2003), mostrando que os Cathartiformes parecem
apresentar um cariótipo semelhante ao padrão da maioria das aves, que
poderia ser considerado muito próximo ao cariótipo ancestral hipotético do
grupo, e assim corresponderia a uma característica plesiomórfica.
31
2. OBJETIVOS:
2.1 OBJETIVO GERAL
Os avanços no campo da citogenética, associados à escassez de
estudos cromossômicos em aves e aos problemas relacionados à filogenia
de Cathartiformes e Falconiformes nos levaram a definir, como objetivo geral,
a caracterização citogenética de algumas espécies pertencentes às ordens
Cathartidae (Cathartes aura, Cathartes burrovianus e Sarcoramphus papa) e
Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicolis).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Definir o número diplóide das espécies citada acima;
- Definir a morfologia cromossômica e padronizar de seus cariótipos;
- Apresentar o padrão de bandeamento G
- Definir a distribuição de blocos de heterocromatina constitutiva;
- Definir a distribuição das regiões organizadoras de nucléolo;
- Utilizar pintura cromossômica para analisar as homeologias entre
Cathartes e Gymnogyps, previamente publicado.
- Comparar os resultados obtidos entre Cathartidae e Accipitridae com
dados previamente publicados, inferindo sobre a filogenia e evolução
cromossômica.
32
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 COLETA DE AMOSTRAS
Foram coletadas amostras de diferentes espécies de aves
pertencentes às famílias Cathartidae e Accipitridae, mantidas em cativeiro no
Parque Zoobotânico do Museu Paraense Emílio Goeldi, e em criadouros
particulares, como o Criadouro Gavião Real e Crocodilo Safári (tabela I). De
cada indivíduo, foram coletados entre 1,5 mL e 2,5 mL de sangue periférico
em seringas descartáveis heparinizadas. Quando presentes foram coletados
bulbos de penas jovens, colocados em tubos de centrífuga contendo meio
Iscovi’s com uma dose extra de antibióticos. Esses procedimentos de coleta
foram acompanhados pelos médicos veterinários das instituições
responsáveis pelos animais.
Tabela I – Espécies analisadas no presente trabalho Nome Científico Nome Vulgar Sexo Material
Coletado Procedência
Cathartidae Sarcoramphus papa Urubu-rei Fêmea
Macho Pena, Sangue Pena, Sangue
MPEG MPEG
Cathartes burrovianus Urubu de cabeça amarela
Macho Sangue CGR
Cathartes aura Urubu de cabeça vermelha
Macho Pena, Sangue CGR
Accipitridae Harpia harpyja Harpia Fêmea
Macho Pena, Sangue Pena, Sangue
CGR CGR
Leucopternis albicollis Gavião Branco Fêmea Pena CGR Spizaetus tyrannus Gavião pega
macaco Fêmea Macho
Pena Pena, Sangue
CGR CGR
Legenda: MPEG = Parque Zoobotânico do Museu Paraense Emílio Goeldi; CGR= Criadouro Gavião Real
33
3.2 CULTURA DE LEUCÓCITOS
Foi utilizada a técnica clássica de cultura de leucócitos
(MOORHEAD et al.,1960), com algumas modificações:
- Após a coleta, a seringa foi deixada na posição vertical, para que
haja a separação do anel de linfócitos por precipitação.
- Com a ajuda de uma agulha nova acoplada à seringa, foi retirado
o anel de leucócitos, e as células foram cultivadas adicionando-se o material
em um frasco contendo 5mL de meio de cultura (meio RPMI, enriquecido
com soro bovino fetal, vitaminas, antibióticos e fitohemaglutinina). Os frascos
foram levemente agitados e colocados em estufa à 37ºC, durante 72 horas.
- Com 71 horas completas, os frascos foram retirados da estufa e
adicionou-se ao material, 0,1 mL de colchicina 10-6 M. Novamente os frascos
foram gentilmente agitados e levados à estufa para completar as 72 horas.
- No final desse processo, os frascos foram agitados para
desprender possíveis células que estivessem aderidas ao fundo, e o material
foi transferido para um tubo de centrífuga e centrifugado a 1000 rpm por 10
minutos. O sobrenadante foi desprezado.
- Foram adicionados 10 mL de solução de cloreto de potássio (KCl)
0,075M a 37ºC. O material foi ressuspendido utilizando pipeta Pasteur, e
deixado na estufa por mais 1 hora. Passado esse tempo, foi acrescentado 1
mL de fixador Carnoy (numa proporção de 3:1 de metanol e ácido acético,
respectivamente), ressuspendido mais uma vez e centrifugado por 10
minutos a 1000 rpm.
- O sobrenadante foi descartado, e foram acrescentados 5mL de
fixador Carnoy gelado e recém preparado. O material foi ressuspendido e
34
centrifugado por 10 minutos a 1000 rpm. Esse processo foi repetido por mais
três vezes e na última lavagem, foi adicionada quantidade de fixador
suficiente para conseguir uma diluição adequada. Depois disso o material foi
acondicionado em geladeira.
3.3 CULTURA DE FIBROBLASTOS
Foi utilizada a técnica de desagregação enzimática de polpa de
pena segundo MARTINS (1988) para cultura de fibroblastos, ambas com
modificações:
- Em uma câmara de fluxo laminar, o bulbo da pena foi colocado em
uma placa de Petri estéril e, com o auxílio de tesoura (ou bisturi) e pinça
estéreis, foi aberto para que sua polpa fosse retirada;
- O tecido limpo foi transferido para uma segunda placa de Petri,
contendo 3 mL de colagenase tipo IV, e então foi seccionado em pequenos
fragmentos.
- O material foi ressuspendido com pipeta Pasteur e incubado por 30
minutos.
- Foram adicionados 2mL de meio de cultura à temperatura ambiente
com 10% de soro de galinha.
- O material foi novamente ressuspendido, e então foi transferido para
um tubo de centrífuga, sendo centrifugado por 10 minutos, à 800rpm.
- Após ser centrifugado, o sobrenadante foi desprezado, e foram
adicionados ao tubo 5mL de meio completo (contendo 10% de soro de
galinha, 1% de antibióticos, 0,5% de fungizona e 1% de L-glutamina) para
35
que o material pudesse ser ressuspendido novamente e transferido para uma
garrafa de cultura (Corning 25 cm²).
- A garrafa foi incubada a uma temperatura de 37 a 40°C, dando início
desta maneira à cultura primária.
- Por um período de 48 horas, esse material não foi manipulado para
que ocorresse uma perfeita adesão das células à superfície da garrafa
banhada pelo meio.
- Após esse tempo foi realizada uma lavagem da cultura com 2mL de
Versene (Gibco), e foram adicionados 5mL de meio à cultura, e a mesma foi
observada diariamente para que fossem tomadas as medidas apropriadas
referentes à troca de meio e repique.
3.4 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
Antes de sua utilização, as lâminas foram rigorosamente lavadas
com detergente neutro, colocadas em um recipiente com água destilada e
guardadas na geladeira.
- No momento de serem utilizadas, as lâminas foram retiradas do
recipiente contendo álcool, e secas com lenço de papel.
- A lâmina foi deixada por alguns minutos em uma caixa de
alumínio em banho-maria a aproximadamente 50ºC
- A suspensão cromossômica condicionada em tubo de centrífuga
foi devidamente ressuspendido com pipeta Pasteur e com uma micropipeta,
20µL desse material foram gotejados na lâmina.
- Após alguns minutos, a lâmina foi retirada da caixa, e levada para
estufa para envelhecimento ou corada para análise.
36
3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTOS CROMOSSÔMICOS
Coloração Convencional
É normalmente utilizada para localização de metáfases, análise do
número e morfologia dos cromossomos. Para esse tipo de análise, o material
citológico foi corado com Eosina Azul de Metileno, segundo Giemsa (Merck).
- 1,5 mL de corante foi diluído em 28 mL de tampão fosfato pH 6,8,
obtendo-se assim uma solução a 5%. A solução foi despejada sobre a
lâmina, permanecendo por 10 minutos.
- Logo depois a lâmina foi lavada com água destilada, e secada à
temperatura ambiente.
Técnica de Bandeamento G
O bandeamento G é utilizado para identificação individual e
dedução de homeologias cromossômicas. Utilizou-se a técnica segundo
SEABRIGHT (1971) com modificações:
- Uma solução de Tripsina 0,05% foi preparada;
- Depois de envelhecida em estufa a 37°C por 2 a 3 dias, a lâmina
foi mergulhada na solução de tripsina por 5 segundos;
- A lâmina foi lavada com água destilada gelada (para cortar a ação
da tripsina), e secou à temperatura ambiente.
- Logo depois a lâmina foi corada com Giemsa a 5% por 10
minutos.
37
Técnica de Bandeamento C
Essa técnica tem como objetivo identificar as regiões
cromossômicas ricas em heterocromatina constitutiva, compostas por DNA
altamente repetitivo e que replicam tardiamente na fase S. Para evidenciar
essas regiões, foi utilizada a técnica descrita por SUMNER (1972), com
modificações:
- A lâmina previamente envelhecida foi incubada por 15 minutos
em uma solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1N à temperatura ambiente, e
depois lavada em água destilada.
- Depois de secar o excesso de água, a lâmina foi incubada por 2
minutos em solução de hidróxido de bário (Ba(OH)2) a 4%, à 47ºC;
- Logo depois a lâmina foi mergulhada em ácido clorídrico (HCl)
0,1N à temperatura ambiente para neutralizar a ação do hidróxido de bário, e
lavada imediatamente com água destilada.
- Após isso, a lâmina foi incubada em solução salina 2X
concentrada (2XSSC) à 60º C por 30 minutos e lavada com água destilada.
- Finalmente, depois de secar a temperatura ambiente, a lâmina foi
corada com Giemsa a 5% por 20 minutos e analisada ao microscópio.
3.6 TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)
Dois tipos distintos de sondas foram utilizados. As sondas
cromossomo-específicas de Gallus gallus, obtidas por citometria de fluxo
foram cedidas pelo FISH Laboratory, Veterinary School, University of
38
Cambridge. Já as sondas de 18S/28S DNAr humano foram gentilmente
cedidas pelo Dr. Vladimir Trifonov.
3.6.1 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr 18S/28S
Preparação e marcação da sonda de rDNA
As sondas de DNA ribossômico humano (18S e 28S) foram
marcadas com biotina pela técnica de Nick Translation, utilizando-se o kit
“Nick Translation” da Gibco, segundo as especificações do fabricante, e
mantidas em freezer até o momento do uso.
Preparação das lâminas
As lâminas foram preparadas como no item 3.4, e imediatamente
após sua secagem, foram observadas ao microscópio com contraste de fase,
para avaliação de sua qualidade. Constatada uma boa qualidade, as lâminas
com as preparações cromossômicas foram tratadas com RNAse e
desidratadas, seguindo as etapas abaixo:
- As lâminas foram incubadas com uma solução de RNase diluída
em 4xSSC/T (100 µg/ml) por 20 minutos, a 37ºC.
- Após esse período, as lâminas foram incubadas em 2xSSC por 5
minutos, por duas vezes.
- As lâminas foram então desidratadas em uma série de etanois a
70% (2x), 90% (2x) e 100%, 5 minutos em cada banho.
- Depois disso, as lâminas foram incubadas por duas horas em
estufa a 65ºC.
39
3.6.2 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda cromossomo-
específicas de Gallus gallus
Preparação e marcação da sonda
As sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus,
correspondentes aos pares 1 a 7 e o cromossomo Z, obtidas por citometria
de fluxo, foram amplificadas e marcadas por DOP-PCR. Utilizamos duas
marcações específicas: biotina e fluorosceína.
Preparação das lâminas
As lâminas foram preparadas como no item 3.4, e imediatamente
após sua secagem, foram observadas ao microscópio com contraste de fase,
para avaliação de sua qualidade. Constatada uma boa qualidade, as lâminas
com as preparações cromossômicas seguiram para desidratação na série de
etanóis e incubadas a 65ºC por duas horas, como descrito anteriormente.
3.6.3 Desnaturação das Sondas de DNA e dos Cromossomos
Metafásicos
Antes de sua utilização, as sondas foram adicionadas à solução de
hibridização, em uma proporção de 1 µL de sondas para 14 µL de solução,
em um tubo de microcentrífuga. Seguiu-se a desnaturação das sondas,
mantendo o tubo a 75ºC por 10 minutos e imediatamente utilizada. No caso
das sondas cromossomo-específicos, o material permaneceu a a 75ºC por 10
minutos, a preparação foi mantida a 37ºC por 30 minutos antes do uso,
permitindo assim que as seqüências repetitivas de DNA se reassociem.
40
Da mesma forma, as lâminas seguiram para o processo de
desnaturação dos cromossomos metafásicos, seguindo os seguintes passos:
- As lâminas foram incubadas por 90 segundos em formamida
70%/2xSSC a 73ºC.
- Imediatamente após a desnaturação, as lâminas foram
mergulhadas em etanol a 70%, gelado, e incubadas por 4 minutos.
- As lâminas foram desidratadas em uma série de etanois a 70%
(x), 90% (2x) e 100%, 2 minutos em cada banho.
3.6.4 Hibridação e detecção dos sinais correspondentes
Após as sondas serem denaturada, em solução de
hibridização, foram aplicados 15 µL de solução de hibridização contendo as
sondas, de acordo com os passos a seguir:
- Foram aplicados, sobre as lâminas, cerca de 15 µl da solução de
hibridação;
- As lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC “overnight”
no caso das sondas de rDNA, e por 72 horas no caso das sondas
cromossomo-específicas.
- Seguiu-se com a lavagem de estringência, incubando-se as
lâminas com solução de formamida 50% em 2xSSC pH 7,0 por 5 minutos, a
42ºC, duas vezes;
- As lâminas foram lavadas com 2xSSC a 42ºC, por 5 minutos;
- Cerca de 200 µl de solução de detecção foram colocados sobre
cada lâmina, e procedeu-se com a incubação das mesmas por 20 minutos, a
37 ºC.
41
- Depois disso, as lâminas foram lavadas por três vezes com
4xSST a 38 ºC, 5 minutos cada.
- Após escorrer o excesso de 4xSST, colocou-se cada lâmina
sobre uma lamínula contendo duas gostas de meio de montagem (antifade e
DAPI).
- O excesso de meio de montagem foi retirado em um bloco de
papel filtro, e a lamínula foi selada com o uso de esmalte incolor.
3.7 ANÁLISE CARIOTÍPICA
Citogenética Clássica
Todas as preparações cromossômicas (coloração convencional e
bandeamentos G, C e NOR) foram analisadas em microscópio óptico Zeiss
Axiostar com objetiva de imersão com 100 vezes de aumento e ocular com
20 vezes de aumento. As localizações das melhores metáfases foram
registradas em uma lâmina branca, para posterior captura em sistema digital.
De cada animal, pelo menos 20 metáfases em coloração convencional
completas foram utilizadas para a definição do número diplóide e morfologia
cromossômica.
Experimentos de FISH e Captura de Imagens
As lâminas com coloração fluorescente foram analisadas em
fotomicroscópio de fluorescência Zeiss Axiophot II, com objetiva de 100x e
ocular com aumento de 10x. O optovar foi de 1,6, e os filtros utilizados foram
Zeiss BP 436, FT 460 e LP 470.
42
As imagens das preparações foram capturadas digitalmente com o
auxílio de câmera Zeiss AxioCam MRm por meio do programa AxioVision 3.1
(controlador da câmera de vídeo e de captura digital de imagens). No caso da
preparação com fluorescência, foi feita uma pseudocoloração das imagens
no próprio programa AxioVision. Na edição final das imagens, utilizamos o
programa Adobe Photoshop 7.1.
3.8 ORGANIZAÇÃO DO CARIÓTIPO
Para montagem dos cariótipos, foi usado o programa Adobe
Photoshop 7.1. Com o auxílio desse programa, os cromossomos foram
“recortados” e organizados aos pares, em ordem decrescente de tamanho,
de acordo com a proposta de LADJALI – MOHAMMEDI et al. (1999) para o
sistema internacional de padronização de cariótipos de aves. A determinação
do comprimento relativo dos braços (maior ou menor) foi feita com o auxílio
do programa Adobe Photoshop 7.1. Os valores médios de cada par foram
calculados para poder determinar a relação de braços (RB). Para o cálculo de
NF os cromossomos metacêntricos (M), submetacêntricos (SM) e
subtelocêntricos (ST) foram considerados com dois braços, enquanto que os
acrocêntricos (A) constituídos por um único braço.
A identificação cromossômica foi feita seguindo a nomenclatura
proposta por LEVAN et al.(1964), onde os tipos cromossômicos são:
METACÊNTRICOS (M)................................RB = 1,00 - 1,70
SUBMETACÊNTRICOS (SM)......................RB = 1,71 - 3,00
SUBTELOCÊNTRICOS (ST).......................RB = 3,01 – 7,00
ACROCÊNTRICOS (A)................................RB = maior que 7,0
43
4. RESULTADOS
4.1. O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE CATHARTIDAE
As espécies de abutres do Novo Mundo analisadas no presente
trabalho apresentaram constituições cariotípicas bastante semelhantes, com
o mesmo número cromossômico. Entretanto, diferenças foram observadas na
distribuição e quantidade de blocos heterocromáticos.
Sarcoramphus papa
Foram analisados dois exemplares de urubu-rei (S. papa), um
macho e uma fêmea, que apresentaram 2n=80 e NF=90. Convencionou-se
classificar os dez primeiros pares como macrocromossomos, por
apresentarem-se bem diferenciados dos restantes pares, que por sua vez
apresentaram-se bastante homogêneos quanto à forma e tamanho. O par
sexual encontra-se formado por um cromossomo Z submetacêntrico, com
tamanho próximo ao do quarto par, e um cromossomo W metacêntrico, com
tamanho próximo ao do nono par (fig. 08A). O idiograma referente aos dez
primeiros pares mais o par sexual está representado na figura 08B, com a
sua respectiva classificação morfológica.
Na figura 09 apresentamos o padrão de bandeamento G dos pares
de 1 a 10 e do par sexual. Na foto da metáfase, observa-se que os menores
pares apresentados não mostraram um padrão definido, devido ao seu
pequeno tamanho.
44
O bandeamento C revelou blocos heterocromáticos na região
pericentromérica de todos os cromossomos, porém com tamanhos diferentes,
sendo mais extensos nos pares 1, 2, 3 e no cromossomo W (fig.10).
Figura 08 – A: Cariótipo do urubu rei (Sarcoramphus papa) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos de S. papa, mais o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico)
45
Figura 09 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 20 do urubu rei (Sarcoramphus papa).
Figura 10 – Padrão de bandeamento C de Sarcoramphus papa. O cromossomo W apresenta-se indicado.
46
Cathartes aura
O exemplar de urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura)
analisado, uma fêmea, apresentou 2n=80 e NF=90. Os dez primeiro pares
foram considerados macrocromossomos, por se apresentarem distintos dos
demais pares, que tinham tamanho menor e uniforme. O par 8 apresentou-se
heteromórfico em todas as metáfases analisadas. O par sexual encontra-se
formado por dois cromossomos Z submetacêntricos, com tamanho próximo
ao do quarto par (fig. 11A). O idiograma referente aos dez primeiros pares
mais o par sexual está representado na figura 11B, com a indicação de sua
classificação morfológica.
Pelo padrão de bandeamento G, foi possível identificar os
homólogos dos maiores pares. Entretanto, os menores pares não
apresentaram um padrão distinto que permitisse sua identificação (fig. 12).
Blocos de heterocromatina foram observados na região
pericentromérica de todos os cromossomos, inclusive microcromossomos.
Além disso, grandes blocos de heterocromatina constitutiva foram revelados
nos cromossomos de C. aura, nos pares 6 e 8. Observa-se um bloco de
heterocromatina constitutiva na região terminal do braço longo em apenas um
dos cromossomos do par 8 (fig. 13).
47
Figura 11 – A: Cariótipo do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
48
Figura 12 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura).
Figura 13 – Padrão de bandeamento C de Cathartes aura. O par 8, heteromórfico, apresenta-se indicado.
49
Cathartes burrovianus
O urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) analisado
neste trabalho, uma fêmea, apresentou o mesmo número diplóide das
espécies anteriores, com 2n=80 e NA= 92. Seu cariótipo em coloração
convencional é mostrado na figura 14A, juntamente com o idiograma dos dez
primeiros pares mais o par sexual na figura 14B. O par sexual é composto
por um cromossomo Z submetacêntrico, com tamanho aproximado entre o
terceiro e quarto pares, e um cromossomo W metacêntrico, com tamanho
aproximado do nono par.
Como seu cariótipo apresenta um grande número de
microcromossomos, o bandeamento G produziu um padrão identificável
apenas nos maiores pares, permitindo a identificação dos homólogos (fig.
15). A técnica de bandeamento C revelou blocos heterocromáticos
pericentroméricos em todos os cromossomos do complemento. Além disso,
observou-se um bloco heterocromático na região terminal do braço longo do
par 6, e um bloco extenso no cromossomo W (fig. 16).
4.2 O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE ACCIPITRIDAE
Foram analisadas três espécies da família Accipitridae. Uma
grande diversidade cromossômica foi observada entre as espécies essas
espécies, com números diplóides variando de 2n=58, na harpia (Harpia
harpyja), a 2n=68, no gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) A
distribuição de heterocromatina constitutiva também mostrou variação em
sua distribuição e quantidade.
50
Figura 14 – A: Cariótipo do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
51
Figura 15 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus).
W
52
Figura 16 – Padrão de bandeamento C de Cathartes burrovianus. O cromossomo W apresenta-se indicado.
Harpia harpyja
Dois exemplares foram analisados, e a morfologia cromossômica
confirmou o sexo dos animais: um macho e uma fêmea. O número diplóide
foi igual a 58, e o NF=102. Apenas os pares 20, 25, 26, 27 e 28 são
acrocêntricos. Os cromossomos apresentaram uma diminuição gradual de
tamanho. Os quatro últimos pares, puntiformes, podem ser classificados
como microcromossomos. O Z apresentou-se metacêntrico, com tamanho
equivalente ao primeiro par, e o W submetacêntrico, menor, correspondendo
a aproximadamente um terço do tamanho do Z. O par 8 mostrou-se
heteromórfico na fêmea, e no elemento maior observa-se uma constrição
secundária evidente (fig. 17A). O idiograma da figura 17B representa todos
os cromossomos da harpia (Harpia harpyja).
O bandeamento G é mostrado na figura 18, e a maioria dos pares
apresentou um padrão distinto que permitiu a identificação dos homólogos,
principalmente nos pares de maior tamanho. Porém alguns pares médios e
pequenos, com morfologia semelhante, revelaram padrões pouco
informativos, dificultando sua correta identificação.
Os blocos heterocromáticos apresentaram-se distribuídos somente
na região pericentromérica de todos os cromossomos. Entretanto, alguns
pares médios metacêntricos apresentaram blocos menos conspícuos. Um par
de acrocêntricos, provavelmente par 20, revelou um bloco heterocromático no
braço longo. Além disso, o cromossomo W apresentou-se parcialmente
heterocromático, sendo banda-C positivo no braço curto e em parte do braço
longo (fig. 19).
53
Figura 17 – A: Cariótipo da harpia (Harpia harpyja) em coloração convencional, com 2n=58 e NF=102; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
A
B
54
Figura 18 – Padrão de bandeamento G de Harpia (Harpia harpyja), fêmea.
55
Figura 19 – Padrão de bandeamento C de Harpia harpyja. O cromossomo W apresenta-se indicado.
Spizaetus tyrannus
O gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) apresentou 2n=68 e
NF=108. Seu cariótipo, típico de Accipitridae, mostrou uma variação gradual
do tamanho dos pares cromossômicos. Os seis menores pares poderiam ser
classificados como microcromossomos. O cromossomo Z, submetacêntrico,
apresentou um tamanho próximo ao do quinto par. Já o cromossomo W
apresentou-se metacêntrico, com tamanho aproximado ao do décimo sexto
par. A constrição secundária apresentou-se evidente no par 25 (fig. 20A). O
idiograma representativo do cariótipo dessa espécie é mostrado na figura
20B.
Mostramos o padrão de bandeamento G na figura 21, onde se
percebe uma melhor definição nos pares de maior tamanho, que diminui
proporcionalmente com o tamanho dos cromossomos.
56
Figura 20 – A: Cariótipo do gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) em coloração convencional, com 2n=68 e NF=108; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
A
B
57
Figura 21 – Padrão de bandeamento G do gavião pega macaco (Spyzaetus tyrannus), fêmea.
58
Dois pares de microcromossomos e um par metacêntrico médio,
provavelmente correspondendo ao par 8, apresentaram a região
pericentromérica claramente marcada, assim como a região pericentromérica
e terminal do braço longo de um par médio de cromossomos acrocêntricos,
enquanto outros blocos coraram-se de maneira mais pálida. O cromossomo
W apresentou o braço curto heterocromático (fig.22).
Figura 22 – Padrão de bandeamento C de Spizaetus tyrannus. O cromossomo W apresenta-se indicado.
W
59
Leucopternis albicollis
O gavião branco (Leucopternis albicollis) analisado, fêmea,
mostrou um complemento cromossômico com 2n=66 e NF=104. O cariótipo
apresentou cromossomos diminuindo gradativamente de tamanho e poucos
cromossomos puntiformes, com um Z submetacêntrico, com tamanho
próximo aos pares 3 e 4, e o W submetacêntrico, menor, com um tamanho
próximo ao par 16. No par 9, observa-se uma constrição secundária (fig.
23A). Na figura 23B mostramos o idiograma representativo, contendo todos
os pares cromossômicos da espécie.
O bandeamento G permitiu a identificação dos pares homólogos,
sendo essa identificação mais exata nos primeiros pares, de maior tamanho.
Não se observou padrões de bandeamento G nos menores pares (fig. 24).
A aplicação da técnica de bandeamento C revelou blocos
heterocromáticos apenas na região pericentromérica dos pares 1, 2 e 3, de
dois pares acrocêntricos (provavelmente pares 22 e 24), e em um três pares
de microcrossomos. Além desses, um par acrocêntrico, provavelmente par 27
ou 28, apresentou-se heterocromático. O cromossomo W apresentou um
extenso bloco que se estendeu por grande parte do seu comprimento total
(fig. 23).
60
Figura 23 – A: Cariótipo do gavião branco (Leucopternis albicollis) em coloração convencional, com 2n=66 e NF=104; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).
A
B
61
Figura 24 – Padrão de bandeamento G do gavião branco (Leucopternis albicollis), fêmea.
62
Figura 25 – Padrão de bandeamento C de Leucopternis albicollis. O cromossomo W apresenta-se indicado.
4.3 EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
4.3.1 HIBRIDIZAÇÕES COM 18S/28S R-DNA
Família Cathartidae
As três espécies de abutres do Novo Mundo analisadas no
presente trabalho mostraram apenas um cromossomo marcado pelas sondas
de 18S/28S r-DNA. Em todas elas, um pequeno par de cromossomos
apresentou sinais de hibridização. Em Sarcoramphus papa o par marcado
correspondeu ao tamanho aproximado entre os pares 8-10, acrocêntrico (fig.
26A, B). Um resultado semelhante foi observado em Cathartes burrovianus
(fig. 26C, D) e em Cathartes aura (fig 26E, F).
W
63
Figura 26 – Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Cathartidae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. O cromossomo W está indicado no caso das fêmeas. A e B: Sarcoramphus papa; C e D: Cathartes aura; E e F: Cathartes burrovianus.
64
Família Accipitridae
Os resultados dos experimentos de hibridização de sondas de
18S/28S r-DNA foram bastante variados nas espécies da família Accipitridae.
Harpia harpyja apresentou dois pares com sinais de hibridização, sendo um
par subtelocêntrico e heteromórfico (par 8) e o outro um par pequeno,
acrocêntrico, provavelmente par 25 (fig. 27A, B). A marcação no par 8,
heteromórfico no indivíduo analisado, concordou com a localização da
constrição secundária.
Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicolis apresentaram apenas
um par marcado. Entretanto, enquanto o par portador da NOR apresentou-se
pequeno e acrocêntrico em S. tyrannus. O par marcado corresponde
provavelmente ao par 25, que apresentou uma evidente constrição
secundária. Da mesma forma, no indivíduo analisado por essa técnica, o par
apresentou-se visivelmente heteromórfico, fato também evidente pelo
tamanho do sinal da sonda, bem maior em um dos homólogos (fig. 27C, D)
Em L. albicolis, observamos apenas um par marcado, como na
espécie anterior. Porém, o mesmo correspondeu a um par submetacêntrico
grande, correspondente ao par 9. A marcação concordou com a constrição
secundária observada em coloração convencional. (fig. 27E, F).
65
Figura 27 – Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Accipitridae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. A e B: Harpia harpyja; C e D: Spizaetus tyrannus; E e F: Leucopternis albicollis.
4.3.2 HIBRIDIZAÇÕES COM SONDAS CROMOSSOMO-ESPECÍFICAS DE
Gallus gallus
66
Os experimentos de hibridização in situ com sondas cromossomo
específicas de Gallus gallus foram realizados apenas na espécie Catharte
aura.
Com exceção do par 4, todas as sondas utilizadas marcaram apenas um
cromossomo de C. aura cada. A sonda GGA 4 marcou um par de
macrocromossomos e um par de microcromossomos. As figuras 28 e 29
ilustram o resultado dos experimentos de hibridização in situ com as sondas
de Gallus gallus correspondentes aos cromossomos de 1 a 7 e o
cromossomo Z.
Figura 28 – Resultado da hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus (cromossomos 1 a 4) em metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.
67
Figura 29 – Resultado da hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus (cromossomos 5 a Z) em metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.
Figura 29 – Mapeamento dos cromossomos de Gallus gallus (à direita dos cromossomos) no cariótipo de Cathartes aura.
68
5. DISCUSSÃO
5.1 SISTEMA INTERNACIONAL PARA PADRONIZAÇÃO DO CARIÓTIPO
DE AVES
Com o desenvolvimento do mapa genético molecular de Gallus gallus,
vários encontros na década de 80 e 90, com o objetivo de se padronizar a
organização de cariótipos de aves, facilitando assim futuras comparações.
Na década de 80, em resposta às sugestões feitas no IV Colóquio
Europeu de Citogenética de Animais Domésticos, um grupo de
citogeneticistas especializados em Aves concordou que os cromossomos de
aves deveriam ser numerados e organizados no idiograma de acordo com o
tamanho, decrescente. Os cromossomos sexuais (Z e W) seriam o par
terminal. A nomenclatura de rearranjos heteromórficos seguiria as
recomendações da ISCN (1978), assim como a definição e nomenclatura das
bandas longitudinais (Q, G e R) (LADJALI-MOHAMMEDI, 1999).
No início da década de 90, novos encontros tiveram como principal
objetivo reforçar o uso das normas propostas para publicação e organização
do cariótipo de aves. Assim, LADJALI-MOHAMMEDI et al. (1999) publicaram
o Sistema Internacional para Padronização do Cariótipo de Aves
(International System for Standardized Avial Karyotypes – ISAAK), que
seguiam as normas propostas na década de 80, adicionando a descrição do
padrão de bandas de cada par de macrocromossomos de Gallus gallus.
A análise de cariótipos de aves previamente publicados mostra que os
cariótipos bimodais, ou seja, formados por macro e microcromossomos, são
normalmente ordenados de acordo com as normas da ISAAK. Entretanto, os
69
cariótipos de aves de rapina (Accipitridae e Falconidae) tendem a ser
ordenados com base no tamanho decrescente e posição do centrômero,
iniciando com os cromossomos de dois braços, e o segundo grupo iniciando
com o maior acrocêntrico/telocêntrico (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM et
al., 1998, 2003; BED’HOM, 1999; NANDA et al., 2006). Porém, a
padronização proposta pelo ISAAK foi utilizada por DE OLIVEIRA et al.
(2005), na análise do cariótipo de Harpia harpyja.
Tendo em vista essa controvérsia, e na ausência de outras
publicações que discutam a padronização do cariótipo de aves, com exceção
das citadas anteriormente, decidiu-se utilizar a proposta da ISAAK para todas
as espécies analisadas no presente trabalho. Salienta-se que nesse trabalho
incluímos espécies com cariótipo bimodal (Cathartidae) e gradual
(Accipitridae). O uso de dois padrões diferentes na organização dos
cariótipos tornaria mais difícil sua comparação e análise.
5.2 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA
CATHARTIDAE
Das sete espécies da família Cathartidae, cinco já tiveram seus
cariótipos analisados, pelo menos com o número diplóide determinado.
Apenas o urubu da mata (Cathartes melambrotus) e o urubu de cabeça
amarela (Cathartes burrovianus) não apresentam dados citogenéticos
publicados até o momento.
As três espécies aqui analisadas mostraram complementos
cromossômicos muito semelhantes, com uniformidade no número de
cromossomos e de braços. Cathartes burrovianus, espécie cujo cariótipo foi
70
analisado pela primeira vez, mostrou seguir a tendência de outros
congêneres, apresentando 2n=80. Apesar do número de cromossomos de
Cathartes aura ter sido anteriormente determinado como 2n=76 (WILLIAM &
BENIRSHKE, 1976), nossos dados mostraram que essa espécie apresenta
2n=80, mesmo número encontrado nas outras espécies da família.
Uma das principais causas da dificuldade em se determinar o número
diplóide nos abutres do Novo Mundo pode ser atribuída à sua organização
genômica: como a maioria das aves analisadas até o momento, os
Cathartidae mostraram cariótipos formados por dez pares de
macrocromossomos e um grande número de microcromossomos.
De fato, o cariótipo de Cathartidae pode ser classificado como uma
característica plesiomórfica, ou seja, um caráter que se encontra em um
estado ancestral, não derivado. Ao se comparar as espécies aqui analisadas
com outras previamente publicadas, observa-se que a morfologia
cromossômica é muito conservada, com os pares apresentando os mesmos
índices centroméricos. Os primeiros pares, de 1 a 5, apresentaram-se
metacêntricos, submetacêntricos ou subtelocêntricos, assim como o par 9,
metacêntrico, em todos os Cathartidae analisados.
Os blocos de heterocromatina apresentaram uma certa variação tanto
em tamanho como em localização. Além disso, em alguns casos, houve a
ausência de blocos heterocromáticos em certos pares. No caso do
Gymnogyps californianus, o par 3 não apresentou nenhum bloco
heterocromático revelado pelo bandeamento C (RAUDSEPP et al., 2002).
Dentre as espécies analisadas, C. aura e C. burrovianus apresentaram os
cariótipos mais diferenciados, por apresentarem, além de marcações na
71
região pericentromérica de todos os cromossomos, um grande bloco
heterocromático no par 6, na região distal do braço longo. Em C. aura, a
presença de um bloco heterocromático na mesma posição em um dos
cromossomos do par 8, causou um heteromorfismo observado em coloração
convencional. Sarcoramphus papa apresentou marcações somente na região
pericentromérica dos cromossomos, com exceção do cromossomo W, que
apresentou-se heterocromático na maior parte de seu comprimento. O
mesmo foi observado no Gymnogyps californianus (RAUDSEPP et al., 2002).
A presença de extensos blocos heterocromáticos no cromossomo W em aves
é um fato comum, inclusive em espécies com o par sexual monomórfico (DE
OLIVEIRA et al., 2006). A comparação com dados previamente publicados
indica que o cariótipo de Cathartes apresenta certa semelhança com o de
Coragyps atratus, que tem blocos heterocromáticos conspícuos em um par
de cromossomos acrocêntricos (CORNELIO et al., 2001)
Os experimentos de hibridização in situ confirmaram a constância
cromossômica e manutenção dos grupos sintênicos entre os abutres do Novo
Mundo. A utilização de sondas 18S/28S r-DNA marcou um único par de
microcromossomos nas três espécies de Cathartidae analisadas. Um
resultado similar foi observado no condor da Califórnia (Gymnogyps
californianus) (RAUDSEPP et al., 2002). A localização da região
organizadora de nucléolos (NOR) em um par de microcromossomos também
parece ser uma característica ancestral em aves. Segundo LADJALI-
MOHAMMEDI et al. (1999), em Gallus gallus convencionou-se que o par 16
corresponde aos microcromossomos portadores da NOR. Tal convenção
72
caberia bem na família Cathartidae, já que o par portador da NOR
assemelha-se em tamanho com o observado em G. gallus.
Com exceção da sonda GGA 4, as sondas cromossomo-específicas
correspondentes aos sete primeiros pares e o cromossomo Z de G. gallus
hibridizaram em um único par cada uma. Isso indica uma total conservação
desses grupos sintênicos entre essas duas espécies. Resultados
semelhantes, incluindo a hibridização de dois pares pela sonda GGA4, foram
obtidos em Gymnogyps californianus e em outras aves pertencentes a ordens
diferentes, como em Anseriformes, Strigiformes, Columbiformes e
Strutioniformes (GUTTENBACH et al., 2003). A conservação desses grupos
sintênicos foi comprovada entre Gallus e uma espécie de tartaruga,
Pelodiscus sinensis, com o uso de BACs (MATSUDA et al., 2005),
confirmando seu estado ancestral. No caso dos Cathartidae, a identificação
dos pares hibridizados pela sonda GGA4 foi facilitado pela morfologia desses
cromossomos, correspondendo ao par 4 (submetacêntrico) e ao par 9
(metacêntrico) de Cathartes aura, assim como em Gymnogyps californianus
(RAUDSEPP et al., 2002).
Os dados obtidos até o momento indicam que a diferenciação
cariotípica entre as espécies de Cathartidae relaciona-se somente à
quantidade e distribuição dos blocos heterocromáticos, sem modificações no
número diplóide, número de braços ou cromossomos portadores de regiões
organizadoras de nucléolo. Talvez a aplicação de sondas loco-específicas ou
BACs possam revelar rearranjos intracromossômicos não revelados pelas
técnicas já empregadas.
73
5.3 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA
ACCIPITRIDAE
Vários autores descrevem o cariótipo das espécies pertencentes à
família Accipitridae como atípicos, quando comparados a outros grupos de
aves (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM, 1999; BED’HOM et al., 2001;
AMARAL & JORGE, 2003; DE OLIVEIRA et al., 2005, 2006). Essa
denominação vem da organização peculiar do cariótipo dessas espécies que,
ao invés de se apresentar formado por alguns pares de macrocromossomos
e um grande número de microcromossomos, inclui cromossomos que
diminuem gradualmente de tamanho, e apenas os últimos pares que
correspondem a uma pequena parte do total de cromossomos, são
microcromossomos puntiformes.
As três espécies analisadas não fugiram a essa regra. Os números
diplóides variaram de 58 a 68, podendo ser considerados relativamente
baixos quando comparados com valores próximos a 80, encontrados na
maioria das espécies de aves analisadas (DE LUCCA, 1992).
O gavião real ou harpia (Harpia harpyja) apresentou 2n=58. Esse
número é concordante com publicações prévias (HOFFMANN et al, 1976; DE
OLIVEIRA et al., 2005) e se encontra entre os mais baixos reportados e aves
de rapina. De fato, entre Accipitridae, a única espécie publicada até o
momento que apresenta um número diplóide menor, igual a 56, foi Morphnus
guianensis (WILLIAM & BERNISCKE, 1976). É interessante notar que os
gêneros Harpia e Morphnus parecem ser próximos filogeneticamente
(LERNER & MINDELL, 2005). Talvez a diminuição do número cromossômico
seja uma característica citogenética da subfamília Harpiinae, na qual esses
74
dois gêneros neotropicais estão incluídos, juntamente com Harpyopsis
novaeguineae, cujos dados citogenéticos ainda são desconhecidos.
Ressalta-se que o cariótipo de Harpia harpyja apresenta um grande número
de cromossomos de dois braços. A diminuição do número diplóide pode estar
relacionada com essa característica: apesar dos cromossomos de dois
braços poderem ser originados a partir de inversões pericêntricas, alguns
deles podem se originar através de processos Robertsonianos (fusões
cêntricas). No caso da harpia, provavelmente ocorreram os dois casos, já que
observamos uma diminuição no número diplóide, mas também um aumento
do número de braços em relação às outras espécies.
O padrão de bandeamento C revelou a presença de blocos
heterocromáticos na região pericentromérica de todos os cromossomos,
sendo que em alguns pares a marcação não foi conspícua, sendo que
apenas depois da análise de muitas metáfases foi possível sua detecção.
Como em outras espécies de Aves, o cromossomo W apresentou-se
parcialmente heterocromático. Um grande bloco heterocromático também foi
observado no braço longo de um par acrocêntrico, provavelmente
correspondente ao par 16. Esse padrão é concordante com outras aves, já
que nessa classe, com poucas exceções, os cromossomos apresentam
pouca heterocromatina constitutiva, concentrada principalmente na região
pericentromérica.
Diferentemente das outras espécies analisadas, Harpia harpyja
apresenta dois pares portadores de regiões organizadoras de nucléolo
(NORs). Esse fato também é concordante com os resultados obtidos por
impregnação por prata (DE OLIVEIRA et al., 2005). Poucas espécies de Aves
75
apresentam suas NORs descritas. De forma interessante, no caso de outros
Accipitridae (BED’HOM, 1999), Gruidae (NISHIDA & SASAKI, 1980),
Columbidae (SMALL et al., 1993), Tinamidae (GARNERO, 1996) e Rheidae
(GUNSKI et al., 1998), observamos NORs reveladas por impregnação por
prata em um único par de microcromossomos. O mesmo resultado foi
observado entre as espécies aqui analisadas, todas com apenas um par de
cromossomos portadores de NORs. Ao que parece, a observação de mais de
um par de cromossomos portadores de NORs é um fato raro entre Aves.
Em alguns organismos, como em peixes, a duplicação das regiões
organizadoras de nucléolo é considerada como uma característica derivada,
enquanto um par portador de NOR seria o estado ancestral ou plesiomórfico
(GALLETI et al., 1995). Apesar da controvérsia a esse respeito, o cenário
apresentado pelas aves se encaixaria bem nessa proposta, visto que a
duplicação da NOR estaria associada também a um cariótipo altamente
derivado, no caso da harpia. Seria interessante a existência de dados
referentes à localização de NORs no cariótipo de outros Harpiinae: talvez a
duplicação das NORs poderia ser um marcador cromossômico para esse
grupo, e talvez indique a proximidade filogenética entre outros gêneros de
Accipitridae que também apresentem mais de um par de cromossomos
portadores de NOR.
O par 6, que corresponde aos macrocromossomos portadores da NOR
em H. harpyja, apresentou-se heteromórfico em um dos indivíduos. Esse
heteromorfismo relaciona-se com comprimentos diferentes dos braços curtos,
muito maior em um deles. Além disso, o cromossomo maior apresentou uma
conspícua constrição secundária, não visível em seu homólogo. O uso de
76
sondas de DNA ribossômico comprovou que esse heteromorfismo deveu-se
a uma amplificação da região organizadora de nucléolos em um dos
homólogos, visto que o sinal de hibridização foi muito mais intenso e ocupou
uma maior extensão no cromossomo de maior comprimento. Esse tipo de
polimorfismo no tamanho da NOR é relativamente comum, sendo inclusive
utilizado como marcador populacional em alguns organismos (HIRAI et al.,
1998).
Spizaetus tyrannus apresentou um número diplóide igual a 68,
semelhante a muitas outras espécies de Accipitridae (Anexo II). Outra
espécie do gênero, S. nipalensis, também apresenta 2n=68, com a presença
de quatro pares de microcromossomos (TAKAGI & SASAKI, 1974). Uma
espécie de outro gênero, relacionado com Spizaetus, Stephanoaetus
coronatus, apresentou 2n=66, com cinco pares de microcromossomos (DE
BOER & SINOO, 1984).
Um dado interessante sobre o cariótipo de S. tyrannus é a pequena
quantidade de heterocromatina observada: muitos pares não apresentaram
nenhuma marcação pelo bandeamento C, ou apresentaram blocos pouco
evidentes. Apesar do cariótipo das aves ser caracterizado por uma pequena
quantidade de heterocromatina, geralmente somente na região
pericentromérica, a maioria das espécies apresenta marcações em todos os
cromossomos, ou pelo menos na maioria dos pares. Esse não é o caso de
Spizaetus tyrannus, que mostrou blocos pouco conspícuos em alguns de
seus cromossomos, com exceção de dois pares de microcromossomos que
foram marcados fortemente pelo bandeamento C.
77
A localização das regiões organizadoras de nucléolo em um pequeno
par de cromossomos em Spizaetus tyrannus foi diferente das outras espécies
de Accipitridae analisadas no presente trabalho. Porém, dados semelhantes
foram observados em outras espécies de Accipitridae, como em Aquila
adalbertii (PADILLA et al., 1999). É possível associar a localização de NORs
em microcromossomos com um estado menos derivado que sua localização
em macrocromossomos. Nos resultados apresentados por DE OLIVEIRA et
al. (2005), demonstrou-se que o par de macrocromossomos portador da NOR
originou-se a partir da fusão entre um macrocromossomo e um
microcromossomo de Gallus gallus. Resta ser comprovado se o
macrocromossomo portador da NOR em outras aves de rapina, como
Leucopternis albicolis, corresponde ao mesmo observado em harpia. Além
disso, apenas um par portador de NOR parece corresponder a uma condição
mais basal, como discutido anteriormemte.
Dos gêneros que se encontram mais próximos de Leucopternis
albicolis filogeneticamente, são disponíveis informações cariotípicas apenas
para o gênero Buteo. Nesse gênero, o número diplóide é igual a 68 ou 70 e
aproximadamente quatro pares de microcromossomos (DE BOER, 1976; DE
LUCCA, 1985; SCHNOFFNER, 1974 apud AMARAL & JORGE, 2003;
SCHMUTZ et al., 1993). Isso faz com que Leucopternis e Buteo tenham
cariótipos semelhantes pelo menos no número diplóide e de
microcromossomos.
Como em Spizaetus tyrannus, poucos blocos heterocromáticos foram
detectados em Leucopternis albicollis. Aparentemente, a existência de
poucos blocos heterocromáticos é mais regra do que exceção entre aves de
78
rapina. A presença de um ou dois pares com a maior parte de seu
comprimento heterocromático e microcromossomos com blocos
heterocromáticos ocorrem com freqüência nesse grupo: esse fato foi
observado em Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis,
no presente trabalho, e em outras espécies como Theratopius ecaudatus
(BED’HOM et al., 1998) e Elanus caeruleus (BED’HOM et al., 2003).
Leucopternis albicollis apresentou a região organizadora de nucléolo
localizada em um macrocromossomo submetacêntrico. Esse fato, juntamente
com um maior número de cromossomos de dois braços quando comparado
com Spizaetus, faz os cariótipos de Harpia e Leucopternis mais semelhantes
entre si.
Os dados obtidos dessas três espécies de Accipitridae confirmam a
necessidade de análises cariotípicas mais pormenorizadas e em um maior
número de espécies, para que se tenha um panorama da evolução cariotípica
ocorrida no grupo. Mesmo com poucas espécies analisadas, alguns aspectos
parecem se relacionar e têm potencial para serem utilizados como caracteres
em análises filogenéticas, como o caso das regiões organizadoras de
nucléolo. A aplicação de sondas cromossomo-específicas deverá trazer
respostas importantes para as relações intra e intergenéricas. A variabilidade
cariotípica está presente: precisamos saber explorá-la.
.
5.4 DADOS CROMOSSÔMICOS E A POSIÇÃO FILOGENÉTICA DE
CATHARTIDAE E ACCIPITRIDAE
Exceto pela família Cathartidae, que reteve um cariótipo plesiomórfico
e semelhante à maioria das espécies de aves analisadas, os outros grupos
79
classicamente incluídos na Ordem Falconiformes apresentam cariótipos
bastante derivados, com um número diplóide mediano, em torno de 66, e
poucos pares de microcromossomos (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM,
1999).
Apesar de LIGON (1967 apud AMARAL & JORGE, 2003) sugerir a
existência de afinidades entre o complemento cromossômico de Cathartidae
e Ciconiiformes, a análise do cariótipo de espécies desses dois grupos não
mostra semelhanças maiores que entre Cathartidae e espécies pertencentes
a outras ordens que conservam a mesma organização cariotípica. Assim,
Mycteria americana (Ciconiidae) apresenta apenas dois pares acrocêntricos
entre os dez maiores pares de seus complementos (pares 3 e 9), sendo os
outros pares, de 1 a 10, de dois braços (FRANCISCO & GALETTI JR, 2000).
Da mesma forma, FRANCISCO & GALETTI JR (2000) sugerem que
Mycteria americana, com 2n=72, seria o cariótipo ancestral de Ciconiidae, já
que este grupo tende a ter números diplóides entre 2n=52 a 72. Esse fato, na
verdade, aproximaria Ciconiiformes de Accipitridae e Falconidae, cujos
números diplóides tendem a apresentar números semelhantes. Entretanto, é
importante frisar que números diplóides per si dizem muito pouco: sua análise
tem que ser complementada com padrões de bandeamento e mapeamento
gênico, o que infelizmente ainda não foi publicado. Os cariótipos das
espécies de Ciconiidae apresentam um número menor de
microcromossomos, mas ainda são bimodais, com uma distinta divisão entre
macro e microcromossomos (FRANCISCO & GALETTI JR, 2000).
A retenção de um cariótipo conservado em Cathartidae foi confirmada
com os dados de pintura cromossômica em Gymnogyps californianus
80
(RAUDSEPP et al., 2002) e em Cathartes aura, aqui apresentado. As outras
espécies dessa família apresentaram cariótipos similares. É razoável afirmar
que os grupos sintênicos estejam conservados entre todas as espécies,
apoiados nos dados obtidos até o momento. Dessa forma, se considerarmos
as famílias que são incluidas nas propostas clássicas, dentro da ordem
Falconiformes – Cathartidae, Saggitaridae, Falconidae e Accipitridae - a
posição basal de Cathartidae seria apoiada pelos dados citogenéticos. Um
cariótipo menos derivado é observado em Saggitarius serpentarius, que
também apresenta 2n=80. Porém, seu cariótipo apresenta um grande número
de cromossomos de dois braços, resultantes provavelmente de rearranjos
intracromossômicos (BED’HOM, 1999). De qualquer forma, do ponto de vista
citogenético, Cathartidae e Saggitaridae seriam mais basais em relação a
Accipitridae e Falconidae.
Ambas as espécies de Accipitridae analisadas no presente trabalho –
Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis – apresentaram
cariótipos com números diplóides menores que Cathartidae. Essa diminuição
no número de cromossomos é reusltado de uma extensa reorganização
cromossômica. Apesar de muitos autores sugerirem que so principais tipso
de rearranjo ocorridos sejam as fusões envolvendo microcromossomos (DE
LUCCA, 1992; AMARAL & JORGE, 2003), os experimentos de pintura
cromossômica revelaram que, na verdade, tanto macrocromossomos como
microcromossomos sofreram rearranjos, e tanto fusões como fissões
ocorreram em grande número (DE OLIVEIRA et al., 2005).
Finalmente, os dados cromossômicos existentes para aves até o
momento, apesar de fragmentados e incompletos na maioria das vezes, com
81
ausência de caracterização de padrão de bandas, apontam para uma posição
filogenética próxima entre Accipitridae e Falconidae, e uma posição mais
basal para Saggitaridae e Cathartidae. Essas famílias distinguem-se entre si
cromossomicamente. Entretanto, os dados existentes ainda não são o
bastante para esclarecer as relações filogenéticas entre Cathartidae e
Ciconiidae, já que esses últimos parecem apresentar um cariótipo mais
derivado em relação ao complemento cromossômico tido como ancestral nas
Aves, o qual se assemelha àquele observado em Cathartidae.
82
6. CONCLUSÕES
A análise citogenética de três espécies de Cathartidae e três espécies
de Accipitridae nos permitiu concluir que:
1. Sarcoramphus papa apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo
bimodal, com 10 pares de macrocromossomos. O par sexual é formado por
um cromossomo Z submetacêntrico e um W metacêntrico. Além das regiões
pericentroméricas de todos os cromossomos, um grande bloco
heterocromático foi observado no cromossomo W. As sondas de 18S/28S r-
DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos.
2. Catharte aura apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo bimodal,
com 10 pares de macrocromossomos. Por se tratar de um macho, apenas a
morfologia do cromossomo Z foi determinada, sendo um cromossomo
submetacêntrico. Grandes blocos heterocromáticos foram observados na
região terminal do braço longo do par 6 e em um dos cromossomos do par 8,
além das regiões pericentroméricas de todos os cromossomos. As sondas de
18S/28S r-DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos.
3. Catharte burrovianus apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo
bimodal, com 10 pares de macrocromossomos, com o cromossomo Z
submetacêntrico e o W metacêntrico. Grandes blocos heterocromáticos foram
observados na região terminal do braço longo do par 6, além das regiões
pericentroméricas de todos os cromossomos e no W. As sondas de 18S/28S
r-DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos. As sondas
cromossomo-específicas de Gallus gallus mostraram que Cathartes aura
83
apresenta os grupos sintênicos correspondentes aos cromossomos de 1 a 7
e mais o Z de Gallus conservados, com exceção do par 4, que se encontra
dividido em dois cromossomos distintos.
4. A família Cathartidae apresenta-se muito conservada do ponto de vista
citogenético, com todas as espécies analisadas até o momento exibindo
número diplóide e de braços iguais. A principal variação constatada foi
quanto à quantidade e distribuição de blocos heterocromáticos.
5. Harpia harpyja apresentou o menor número diplóide dentre as espécies
analisadas, com 2n=58. O cromossomo Z é submetacêntrico, assim como o
W. Seu cariótipo é semelhante ao de outras espécies de Accipitridae, e difere
do padrão das aves por ser formado por cromossomos que diminuem
gradativamente de tamanho. Apenas os menores cromossomos de seu
complemento são puntiformes. Os blocos heterocromáticos aparecem na
região pericentromérica de seus cromossomos, no braço longo de um par de
acrocêntricos e no cromossomo W. Apresentou dois pares cromossômicos
marcados pelas sondas de R-DNA.
6. Spizaetus tyrannus apresentou 2n=68, com um cariótipo gradual e cerca
de cinco pares de microcromossomos. O cromossomo Z é submetacêntrico e
o W metacêntrico. Poucos cromossomos apresentaram blocos
heterocromáticos visíveis pelo bandeamento C. O W apresentou apenas um
dos braços heterocromático. Um par de cromossomos pequenos apresentou-
84
se hibridizado pela sonda de R-DNA, correspondendo ao par com constrições
secundárias visíveis pela coloração convencional.
7. Leucopternis albicollis apresentou 2n=66. Seu cariótipo, da mesma forma
que os outros accipitrídeos analisados, apresentou uma diminuição gradual
do tamanho de seus cromossomos. O cromossomo Z apresentou-se
submetacêntrico, assim como o W. Poucos cromossomos paresentaram
blocos heterocromáticos. Entretanto, um par de pequenos acrocêntricos
mostrou-se intensamente marcado, assim como grande parte do
comprimento do cromossomo W. Um par de submetacêntricos foi hibridizado
pelas sondas de R-DNA, correspondendo à localização da constrição
secundária.
8. Os Accipitridae analisados confirmaram a extensa variação cromossômica
que caracteriza essa família. Essa variabilidade cromossômica pode revelar
características importantes para estudos filogenéticos. Para isso, um maior
número de espécies precisa ser analisado citogeneticamente.
9. A retenção de um cariótipo plesiomórfico em Cathartidae faz com que esse
grupo se posicione de forma basal em relação aos Accipitridae e Falconidae,
reforçando a proposta de que essa família não se apresenta próxima
filogeneticamente de outras aves de rapina. Entretanto, os dados
citogenéticos existentes até o momento ainda não são o bastante para indicar
alguma relação entre Cathartidae e Ciconiidae, ou outro grupo de aves
qualquer.
85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
AMADON, D. (1977) Notes on the taxonomy of vultures. Condor 79: 413-416.
AMARAL, F. S. R.; MILLER, M. J.; SILVEIRA, L. F.; BERMINGHAM, E.;
WAJNTAL, A. (2006) Polyphyly of the hawk genera Leucopternis and
Buteogallus (Aves, Accipitridae): multiple habitat shifts during the Neotropical
buteonine diversification. BMC Evolutionary Biology, 6:10.
AMARAL, K. F & JORGE, W. (2003) The Chromosomes of the Order
Falconiformes: a review. Ararajuba 11(1): 65-73.
AMORIM, D. S. (2002) Fundamentos de Sistemática Filogenética. Ed Holos,
Ribeirão Preto.
ANSARI, H. A. & KAUL, D. (1986) Cytotaxonomic study in the order
Falconiformes (Aves) - Zool.Scr. IS: 351-356.
AVISE J. C.; NELSON W. S.; SIBLEY C. G. (1994) DNA sequence support for
a close phylogenetic relationship between some storks and New World
vultures. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5173–5177.
BED´HOM, B. (1999) Etude des caryotypes atypiques des Accipitridae (Aves,
Falconiformes) par cytogenetique classique et molecular, et modelisation de
leur evolution. Tese de Doutorado, Museu de História Natural. Paris, França.
BED’HOM et al., 2003
BLOOM, S. E.; DELANY, M. E.; MUSCARELLA, D. E. (1993) Constante and
Variable Features of Avian Chromosomes. In: Manipulation of the Avian
Genomes. CRC Press Inc. P. 39-59.
86
BROOKE M. & BIRKHEAD, T. (1991) A survey of modern birds. In: The
Cambridge Encyclopedia of ornithology, Ed Cambridge University press.
CORNÉLIO, D. A.; PICHORIM, M.; SBALQUEIRO, I. J.; DE OLIVEIRA, E. H.
C. (2001) Caracterização do cariótipo e padrões de bandas G, C e RON em
Coragyps atratus (Cathartidae). In: VIII Congresso Brasileiro de Ornintologia,
Curitiba.
BROWN, L. & AMADON, D. (1968) Eagles, Hawks and Falcons of the World.
McGraw Hill Book Company.
CHOWDHARY B. P.; RAUDSEPP T.; FRONICKE L.; SCHERTHAN H. (1998)
Emerging patterns of comparative genome organization in some mammalian
species as revealed by Zoo-FISH. Genome Res 8: 577–589.
CHOWDHARY, B. P. & RAUDSEPP, T., (2001) Chromosome painting in
farm, pet and wild animal species. Methods Cell Sci. 23:37–55.
CRACRAFT, J. (1981) Toward a filogenétic classification of the recent birds of
the world (Classe Aves) Auk 98: 681-714.
DE BOER, L. E. M. (1975) Karyological heterogeneity in the Falconiformes
(aves) Experientia 31: 1138-1139.
DE BOER, L.E.M. (1976). The somatic chromosomes of 16 species of
Falconiformes (Aves) and the karyological relationships of the order.
Genética 46:77-113.
DE BOER, L.E.M. & SINOO, R. P. (1984) A kariological study of acciptridae
(Aves: Falconiformes), with kariotipic descriptions os 16 species new to
cytology. Genetica 65:89-107.
87
DE LUCCA, E.J. & ROCHA, G.T. (1992). Citogenética de Aves. Bol. Mus.
Para Emilio Goeldi, série Zool 8:33-68.
DE OLIVEIRA, E. H. C.; HABERMANN, F.; LACERDA, O.; SBALQUEIRO, I.
J.; WIENBERG, J.; MULLER, E. S. (2005) Chromosome reshuffling in birds of
prey: the karyotypes of the world’s largest eagle (Harpy eagle, Harpia harpyja)
compared to that of the chicken (Gallus gallus). Chromosoma 114:338-343.
DE OLIVEIRA, E. H. C.; TAGLIARINI, M. M.; NAGAMACHI, C. Y.;
PIECZARKA, J. C. (2006) Comparação genômica em aves através de sondas
cromossomo- específicas. Revista Brasileira de Ornitologia MS 06-005:X-XX.
DE OLIVEIRA, M.D.V; JORGE, W. (2000) Análise cromossômica em Aves.
Melopsittacus 3(2):72-80.
DEL HOYO, J.; ELLIOTT, A.; SARGATAL, J. (1994). Handbook
of the birds of the world. Vol 2. New World vultures to Guineafowl. Lynx
Edicions, Barcelona. 639pp.
DOBIGNY, G.; DUCROZ, J. ROBINSON, T. VOLOBOUEV, V. (2004)
Cytogenetics and Cladistics. Syst. Biol. 53(3): 470-484.
DERJUSHEVA, S.; KURGANOVA, A.; HABERMAN, F.; GAGINSKAIA, E.
(2004) High chromosome conservation detected by comparative chromosome
painting in chicken, pigeon and passerine birds. Chromosome Res. 12:715-
723.
FRANCISCO M. R.; & GALETTI, P. M. (2000) Fist karyotypical description of
two american Ciiconiform birds, Mycteria americana (Ciiconidae) and Platalea
ajaja (Threskiornithidae) and its significance for the chromosome evolucionary
and biological conservation approaches. Genetics and Molecular Biology, 23,
4, 799-801.
88
FEDUCCIA, A. (1980) The age of birds. Cambridge, Harvard Univ. Press.
FEDUCCIA A. 1999. The Origin and Evolution of Birds. New Haven, CT: Yale
Univ. Press. 2nd ed.
GATES, R. R. (1925) Symposium on species and chromosomes: Species and
chromosomes. Am. Nat. 59: 193-224.
GALETTI, P. M.; MESTRINER, C. A.; MONACO, P. J.; RASCH, E. M. (1995)
Postzygotic modifications and intra- and Inter.-individual nucleolar organizing
region variations in fish: report of a case involving Leporinus friderici. Chrom.
Res. 3:285-290.
GARNERO, A. DEL V. (1996). Citogenética de Tinámidos de la Provincia de
Misiones. Licenciature thesis, UNaM, Posadas Mnes.
GRAVES, J. A. M. & SHETTY, S. (2001) Sex from W to Z: Evolution of
vertebrate sex chromosomes and sex determining genes. J. Exp. Zool.
290:449-462.
GREGORY, T. R. (2002) A bird’s-eye view of the c-value enigma: genome
size, cell size, and metabolic rate in the class aves. Evolution, 56(1), 2002,
pp. 121–130.
GRIFFITHS, C. S. (1994a) Monophyly of the Falconiformes based on the
syringeal morphology. Auk 111:787-805.
GRIFFITHS, C. S. (1994b) Syringeal morphology and the phylogeny of
Falconidae. Condor 96:127-140.
GRIFFITFIS, C. S. (1999) Phylogeny of the falconidae inferred from molecular
and morphological data. The Auk 116(1):116-130.
89
GUERRA, M. (1988) Introdução à citogenética geral. Ed Guanabara, 142p.
GUNSKI, R. J & GIANNONI, M. L. (1998) Nucleolar organizer regions and a
new chromosome number for Rhea americana (Aves: Rheiformes) Genet.
Mol. Biol. v. 21 n. 2 São Paulo Jun.
GUTTENBACH, M.; NANDA, I.; FEICHTINGER, W.; MASABANDA, J. S. ;
GRIFIN D. K. ; SCHMID, M. (2003) Comparative chromosome painting of
chicken autosomal paints 1–9 in nine different bird species. Cytogenet.
Genome Res. 103:173–184.
HELBIG, A. J.; KOCUMA, A.; SEIBOLD, I.; BRAUN, M. J. (2005) A multi-gene
phylogeny of aquiline eagles (Aves: Accipitriformes) reveals extensive
paraphyly at the genus level. Molecular Phylogenetics and Evolution 35:147–
164.
HIRAI, H.; HASEGAWA, Y.; KAWAMOTO, Y.;TOKITA, E. (1998) Tandem
duplication of nucleolus organizer region (NOR) in the Japanese macaque,
Macaca fuscata fuscata. Chromosome Research 6, 191±197
HUDSON, G. E. (1948) Studies on the muscles of the pelvic appendage in
birds II: The heterogeneous Order Falconiformes. American Midland
Naturalist, Vol. 39, no. 1: 102-127.
JAUCH, A.; WIENBERG, J.; STANYON, R.; ARNOLD, N.; TOFANELLI, S.;
ISHIDA, T.; CREMER, T. (1992) Reconstruction of Genomic Rearrangements
in Great Apes and Gibbons by Chromosome Painting. Proceedings of the
National Academy of Sciences, Vol 89, 8611-8615, Copyright © by National
Academy of Sciences.
90
JOLLIE, M. (1976) A contribution to the morphology and phylogeny of the
Falconiformes. Evol. Theor. 1: 285-298.
JOLLIE, M. (1977a) A contribution to the morphology and phylogeny of the
Falconiformes. Evol. Theor. 2: 115-208.
JOLLIE, M. (1977b) A contribution to the morphology and phylogeny of the
Falconiformes. Evol. Theor. 2: 209-300.
JOLLIE, M. (1977c) A contribution to the morphology and phylogeny of the
Falconiformes. Evol. Theor. 3: 1-141.
LADJALI-MOHAMMEDI, K.; BITGOOD, J.J.; TIXIER-BOICHARD, M.; PONCE
DE LEON, F.A. (1999) International System for Standardized Avian
Karyotypes (ISSAK): standardized banded karyotypes of the domestic fowl
(Gallus domesticus). Cytogenet Cell Genet 86:271–276.
LERNER,H. R. L. & MINDELL, D. P. (2005) Phylogeny of eagles, Old World
vultures, and Accipitridae based on nuclear and mitochondrial. Molecular
Phylogenetics and Evolution 37 (2005) 327–346.
LEVAN, A; FREDGA, K.; SANDBERG A. (1964) Nomenclature for
centromeric position on chromosomes. Hereditas. 52: 201-220.
LYSAK, M. A.; FRANSZ, P. F.; ALI, H. B. M.; SCHUBERT, I. (2001)
Chromosome painting in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. Blackwell
Synergy Journal Volume 28, Issue 6, Page 689-695.
KÖNIG, C. (1982) Zur systematischen Stellung der Neuweltgeier
(Cathartidae). Journal of Ornithology. Springer Vol 123:259-267
MARTINS, M. M. (1988). Sexagem de aves a partir de material de polpa de
pena. Botucatu, UNESP. Dissertação apresentada ao Dept. de Genética do
91
Instituto de Biociências da UNESP, para obtenção de título de Licenciado em
Ciências Biológicas, 50p. (Mimeografado).
MASABANDA, J. S.; BURT, D. W.; O’BRIEN, P. C. M. (2004) Molecular
cytogenetic definition of the chicken genome: the 1rst complete avian
karyotype. Genetics 166:1367–1373.
MOORHEAD, P. S.; NORWELL, P.C; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M.;
HUNGERFORD, D. A. (1960) Chromosome preparations of leucocytes
cultured from human peripheral blood. Experim Cell Res 20:613-615.
NANDA, I.; KARL, E.; VOLOBOUEV, V.; GRIFFIN, D. K.; SCHARTL, M.;
SCHMID, M. (2006) Extensive gross genomic rearrangements between
chicken and old world vultures (Falconiformes: Accipitridae). Cytogenet
Genome Res 112:286–295.
OLSON, S.L. (1985) The fossil record of birds. In: Avian biology Volume VIII.
Edited by: Farner D, King J R, Parkes K. New York:Academic Press; 79-239.
PADILLA, J.A.; MARTINEZ-TRANCON, M.; RABASCO, A.; FERNANDEZ-
GARCIA, J.L. (1999) The karyotype of the Iberian imperial eagle (Aquila
adalberti) analyzed by classical and DNA replication banding. Cytogenet Cell
Genet 84:61–66.
RAUDSEPP, T.; HOUCK, M. L.; O’BRIAN, P. C.; FERGUNSON-SMITH, M.
A.; RYDER, O. A.; CHOWDHARY, B. P. (2002) Cytogenetic analysis of
California Condor (Gymnogyps californianus) chromosomes: comparison with
chicken (Gallus gallus) macrochromosomes. Cytogenet Genome Res. 98:54-
60.
RODIONOV, A. V. (1997) Evolution of avian chromosomes and linkage
groups. Rus. J. Genet. 33:605–617.
92
SACCHET, A. M. O. F. (1999) Citogenética Vegetal: Instrumento de pesquisa
e ponte como ensino médio e fundamental. In: SACCHET, A. M. O. F. (Org.)
Genética pra que te quero? Porto Alegre: Ed. UFRGS. P 87-95.
SCHMID M.; NANDA I.; GUTTENBACH M.; STEINLEIN C.; HOEHN M.;
SCHARTL M. (2000) First report on chicken genes and chromosomes 2000.
Cytogenet Cell Genet 90: 169–218.
SCHWARZACHER, T. & HESLOP-HARRISON, P. (2000) Practical in situ
hybridization. Oxford: BIOS Scientific Publisher Ltd.
SEABRIGHT, M. (1971) A rapid banding technique for human chromosomes.
Lancet 2: 971-972.
SEIBOLD I. & HELBIG A. J. (1995) Evolutionary history of New and Old World
vultures inferred from nucleotide sequences of the mitochondrial cytochrome
b gene. Phil Trans R Soc Lond B Biol Sci 350: 163–178.
SIBLEY, C. G. & AHLQUIST J. E. (1990) Phylogeny and Classification of
Birds: a study in molecular evolution. New Haven & London: Yale University
Press.
SIBLEY, C. G. & AHLQUIST, J. A. (1990). Phylogeny and classification of
birds. Yale Univ. Press, New Haven, CT.
SHETTY S.; GRIFFIN D. K.; GRAVES J. A. (1999) Comparative painting
reveals strong chromosome homology over 80 million years of bird evolution.
Chromosome Res 7:289–295.
SHIBUSAWA M.; NISHIBORI M.; NISHIDA-UMEHARA C.; TSUDZUKI M.;
MASABANDA J.; GRIFFIN D. K.; MATSUDA Y. (2004a) Karyotypic evolution
in the Galliformes: an examination of the process of karyotypic evolution by
comparison of the molecular cytogenetic findings with the molecular
phylogeny. Cytogenet Genome Res 106:111–119.
93
SHIBUSAWA M.; NISHIDA-UMEHARA C.; TSUDZUKI M.; MASABANDA J.;
GRIFFIN D. K.; MATSUDA Y. (2004b) A comparative karyological study of the
blue-breasted quail (Coturnix chinensis, Phasianidae) and California quail
(Callipepla californica, Odontophoridae). Cytogenet Genome Res 106:82–90.
SICK, H. (1997). Ornintologia Brasileira, uma introdução. Ed Nova Fronteira,
Rio de Janeiro, RJ.
SLIKAS, B. (1997) Phylogeny of the Avian Family Ciconiidae (Storks) Based
on Cytochrome b Sequences and DNA–DNA Hybridization. Distances
molecular phylogenetics and evolution vol. 8, no. 3, december, pp. 275–300.
article no. fy970431. Academy of Natural Sciences, 1900 Benjamin Franklin
Parkway, Philadelphia.
SMALLS, M. F.; HOGAN, K. M.; SCUDDAY, J. F.( 1993) The karyotype of the
white-winged dove. TheCondor 95:1051-1053
STANYON, R.; WIENBERG, J.; ROMAGNO, D.; BIGONI, F.; JAUCH, A.;
CREMER, T. (1992). Molecular and classical cytogenetic analysis
demonstrate an apomorphic reciprocal chromosomal translocation in Gorilla
gorilla. Am J Phys Anthropol 88:245-250.
STORER, R.W. (1971) Classification of birds. In: Farner, D.S., King, J.R.,
Parkes, K.C. ed. Avian Biology, New York Academy Press.
STRESEMANN, E. & AMADON, D. (1979) Order Falconiformes. In: Peters, J.
L. (Ed), Check-list of the birds of the world. Harvard University Press,
Cambridge, MA, pp. 271-425.
SUMNER, A. T. (1972) A simple technique for demonstratina centromeric
heterochromatin. Exp. Cell. Res. 83: 438-442.
94
TAKAGI, N. & SAZAKI, M. (1974) A phylogenetic study of birds karyotypes.
Chromosoma (Berl) 46:91-120.
THIOLLAY, J. M. (1994) Family Accipitridae (Hawks and Eagles). In:
Handbook of the birds of the world. New World Vultures to Guineafowl
Volume 2. Edited by: Hoyo J del, Elliott A, Sargatal J. Barcelona: Lynx
Edicions; 52-205.
VENTURINI, G.; CAPANNA, E.; FONTANA, B. (1987) Size and structure of
the bird genome. II. Repetitive DNA and sequence organization. Comp.
Biochem. Physiol. B 87: 975-979.
WETMORE, A. (1960) A classification of the birds of the world. Smithsonian
misc. Colins 139(11) 1-37.
WILLIAMS, R. M. & BENIRSCKE, K. (1976) The chromosomes of four
species of falconiformes. Experientia 32:310-311.
WIENBERG, J.; JAUCH, A.; STANYON, R.; CREMER, T. (1990). Molecular
cytotaxonomy of primates by chromosomal in situ suppression hybridization.
Genomics 8:347-350.
WIENBERG, J.; STANYON, R.; JAUCH, A.; CREMER, T. (1992) Homologies
in human and Macasa fuscata chromosomes revealed by in situ suppression
hybridization with human chromosome specific DNA libraries.
Chromosoma,101:265-270.
WIENBERG, J. (2004)The evolution of Eutherian Chromosomes. Curr opin
genet dev, 14:657-666.
WINK, M.; SEIBOLD, I.; LOTFIKHAH, F.; BEDNAREK, W. (1998) Molecular
systematics of Holarctic raptors (Order Falconiformes). In: Chancellor, R.D.,
95
Meyburg, B.-U., Ferrero, J.J. (Eds.), Holarctic Birds of Prey. Adenex,
WWGBP, Calamonte, pp. 29–48.
96
ANEXO
97
The chromosomes of the Order Falconiformes: a review
Ararajuba 11 (1): 65-73 67
Table 1. Karyoty characterization of Falconiformes
98
68 Ararajuba 11 (1): 65-73
Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks
Accipitridae Accipiter badius 66 - - 1stsm ? Kaul and ansari 1975 W not identified
A. dadius 66 32 10 1stsm ? t Misra and srivastava 1976 W is a small t, difficult to identify
A. gentilis 76 - - 4stsm ? m Jovanovic and Molosevic 1972 W not identified
A. gentilis 78 70 8 ? ? Boer 1976 Z and W not identified. Sant 4 th pair
A. nisus (?) * 64 - - 1stsm 6th ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 W is tentatively
Accipiter novaeholhandiae 66-68 - - ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sant 5 th pair
Aegypius monachus 66 58 8 1stsm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sant 16 th pair
Aquila adalberti 82 58 24 1stsm ? sm Padilha et al. 1999 W not distinguish between 3th and 4th pair
A. audax 66 58-60 6-8 1stsm ? m Boer 1976 W not identified A. rapax 68 58 10 1stsm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified A. chrysaetos 62 56 6 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Z and W not identified A. chrysaetos 66 56 10 ? ? Hoffmam 1976 Identical A. heliaca 68 58 10 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Identical
Buteo albicaudatus 68 - - ? ? Lucca 1985 Z and W not identified. Sant 7th pair
B. buteo 68 - - 4thm ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 W not identified
B. buteo 68 60 8 ? ? Boer 1976 Z and W not identified. Sat 6th pair
B. jamaicensis 70 - - ? 4th m ? m Shoffner 1974 Z tentatively. W not identified. Sat 5th pair
B. lagopus 68 - - ? ? Balatova 1977 No information on the Z and W. Sat 4th pair
B. magnirostris 68 60 8 ? ? Lucca 1983 Z and W not identified. Sat 5th pair
B. magnirostris (Rupornis magnirostris) 68 60 8 1st sm Amaral and Jorge (pers.
Comm. 2001) W not identified
B. nitidus 68 - - ? ? Schmutz et al. (1993) Z and W not identified Sant 4th pair
B. platypterus 68 - - ? 1st m ? Schmutz et al. (1993) Z tentatively. W not identified B. regalis 68 - - ? ? Schmutz et al. (1993) Z and W not identified B. swainsoni 68 - - ? m ? Schmutz et al. (1993) Identical
Circaetus gallicus 66 58 8 ? m ? st Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sat mic 29th pair
Circus aeruginosus 70-72 62 8-10 1st sm ? Boer and sinoo 1984 W not clearly identified. Sat 2th pair
C. cyaneus 72 62 10 ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not clearly identified C. pygarpus 70-72 62 8-10 1st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not clearly identified
Geranoaetus melanoleucus 68 60 8 1st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not clearly identified. Sant 5th pair
Geranospiza caerulescens 66 58 8 1st sm 15st m Williams and Benirschke 1976
Gypaetus barbatus 60 52 8 ? 1st sm ? m Boer 1976 Z tentatively. W not disringuish between 7th, 8th and 9th pair
99
Table 1. Continued.
Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks
Gyps bengalensis 66 58 8 ? 1st sm ? Boer and sinoo 1984 Z tentatively. W not identified. Sat 16th pair
G. coprotheres 66 58 8 1st sm 4th st Boer (1975, 1976) Sat 16th pair G. fulvus 66 58 8 1st sm 4th st Boer 1976 identical G. rueppellii 66 58 8 1st sm Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 16th pair
Haliaeetus alacanus 66 58 8 ? 4th sm ? m Au et al. 1975 Z is between 3th and 4th pair W not identified Sat 4th pair
H. albicilla 66 58 8 ? 2nd sm ? sm Omura 1976 Z tentatively. W not identifiel H. albicilla 66 58 8 1st sm ? m Boer 1976 W not identified H. albicilla 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 4th pair H. leucocephalus 66 58 8 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Z and W not identified
H. leucocephalus 66 58 8 ? 4th sm ? sm Au et al. 1975 Z is between 3th and 4th pair. W is tentatively. Sat 4th pair
H. leucocephalus 66 58 8 4th sm ? sm Hoffmann et al. 1975 W not identified H. leucocephalus 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 4th pair H. leucoryphus 66 58 8 ? sm ? m Boer and Sinoo 1984 Z and W not indentified H. leucogaster 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified
H. pelagicus 66 58 8 1st ? ? st Takagi and Sazaki 1974 Z tentatively sm or sr. W not identified
H. vocifer 68 58 10 1st sm 11th m Hoffmann et al. 1975 Discrepancy 2n compared with other species of genus
H. vocifer 66 58 8 1st sm ? 11th m Boer 1976 W tentatively. Sat 9th pair H. vocifer 66 58 8 ? 1st sm ? 11th m Boer and Sinoo 1984 Z and W tentatively. Sat 4th pair Haliastur Indus 66 58 8 1st sm ? m Boer 1976 W not identified. Sat 4th pair
Harpia harpyja 58 52 6 1st sm 9th ? Amaral and Jorge (pers. Comm. 2001) W tentatively
H. harpyja 58 52 6 ? ? Hoffmann et al. (1975) Z and W not identified
Lophoaetus occipitalis 66-68 56-58 8-10 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified probably between 7th an 9th pair
Milvus migrans 66 58 8 2nd sm ? sm Takagi and Sazaki 1974 W not identified M. migrans 66 56 10 ? ? Misra and Srivastava 1976 Z and W not identified Morphnus guianensis 54 48 6 3rd sm ? 19th m Williams and Benirscke 1976 W tentatively
Necrosyrtes monachus 66 58 8 ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sat 16th pair
Parabuteo unicinctus 68 - - ? m ? Schmutz et al. 1993 Z tentatively a large m pair. W not identified. Sat 4th pair
Pernis apivorus 66-68 58 8-10 1st ? ? st Takagi and Sazaki 1974 Z not defined probably sm or st. W not identified
P. apivorus 66-68 58 8-10 1st sm ? sm Boer and Sinoo 1984 W notg identified. Sat mic 29th pair
Pithecophaga jeffery 66 58 8 1st sm ? st Takagi and Sazaki 1974 Z tentatively sm or st. W not identified
P. jeffery 66 58 8 1st sm ? Hoffmann et al. (1975) W not identified P. jeffery 66 58 8 1st sm ? Boer 1976 Identical Sarcogyps calvus 66 58 8 1st sm 4o st Boer 1976
100
The chromosomes of the Order Falconiformes: a review Ararajuba 11 (1): 65-73 69
101
Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks
S. ccalvus 68 58 10 1st ? ? st Takagi and Suzuki 1974 Z tentatively sm or st. W not identified
Spizaetus nipalensis 68 60 8 1st ? ? t Takagi and Sazaki 1974 Identical
Stephanoaetus coronatus 66 56 10 ? 1 st sm ? Boer and Sinoo 1984 Z is tentantively. W not identified. Sat 29th pair
Terathopius ecaudatus 66 58 8 1 st sm ? 4th st Bed´Hom et al. 1998 W is tentatively 4th pair. Sat 16th pair
Torgos tracheliotus 66 58 8 1 st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 16th pair Falconidae Falco biarmicus 52 - - ? ac ? ac Boer 1975 – 1976 Z and W not identified
F. chiquera 50 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Just the diploid number described
F. columbarius 40 20 20 ? ? Longmire et al. 1988 Z and W not identified F. Jugger 48 - - ? 9th ac ? ac Belterman and Boer 1984 Z is tentatively. W small ac F. mexicanus 48 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Z and W not identified F. peregrinus 48 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Identical F. rusticolus 52 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Identical
F. Sparverius 80 - - 7th t 10th sm Shoffner 1974 Discrepancy between the diploid number
F. Sparverius 50 18 32 4th t 10th m Lucca 1983 (2n = 80 and 2n = 50)
F. tinnunculus 52 - - 1st ? 6th ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 Discrepancy on the Z and W
F. tinnunculus 50 - - 9th t ? t Bulatova and Radjabli 1974
Mivalgo chimachina ? 84 - - ? ? Belterman and Boer 1984 Diploid number is tentavilely. Z and W not identified
Phalcoboernus
megalopterus ? 90 - - ? ? Belterman and Boer 1990 Identical Polyborus plancus 84 - - ? ac ? ac Boer (1975, 1976) Z and W not identified
Pandionidae Pandion haliaetus 74 52 22 1st sm 7th sm Kholer and Achaadt 1989 Sagittariidae Sagittarius serpentarius 80 36 44 ? ? Boer (1975, 1976) Discrepancy between diploid S. serpentarius 74 - - ? ? Hoffmann et al. 1975 Number Z and W not identified
(m) Metacentric, (sm) submetacentric, (st) subtelocentric, (ac) acrocentric, (t) telocentric, (Mac) macrocromosome, (Mic), microcromosome, (Sat) Satellites, (-) absence of distinction between mac and mic, (?) not identified, (?t, ?m, ?st) not clearly identified. (*) Unknown especies, probabely A. nisus.
102
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
top related