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Visão regulatória no Brasil para métodos bioanalíticos não-

cromatográficos

João Tavares Neto

Coordenação de Bioequivalencia – COBIO

Gerência Geral de Medicamentos - GGMED

Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA

São Paulo 07/06/2010

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Sumário

• Métodos Não-Cromatográficos e RE 899/2003

• Recomendações Cristal City 2006

• Draft Guia EMEA 2009 para Validação de Métodos Bioanalíticos

• Implicações práticas para a ANVISA

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Métodos Não-Cromatográficos e RE 899/2003

• 2. Considerações gerais

• 2.1. “As informações contidas neste guia aplicam-se a métodos bioanalíticos, tais como cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida ... , utilizados na determinação quantitativa de fármacos e/ou metabólitos em matrizes biológicas, ... Também se aplica a outras técnicas analíticas, tais como métodos microbiológicos e imunológicos, ou para outras matrizes biológicas, embora, nestes casos, pode-se observar um alto grau de variabilidade.

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• 2. Considerações gerais

• 2.4. Para os estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência deve-se utilizar padrão interno, sempre que métodos cromatográficos forem utilizados. Deve-se justificar a impossibilidade de sua utilização.

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• 3.1. Especificidade

• 3.1.1. ... “Cada amostra branco deve ser testada utilizando o procedimento e as condições cromatográficas propostas”...

• 3.1.2. ... “interferência significativa no tempo de retenção do fármaco, metabólito ou padrão interno” ...

• 3.1.4. ... “deve ser injetado separadamente para determinar os tempos de retenção individuais”.

• 3.1.5. ... “A resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco deve ser inferior a 20%”...

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• 3.2. Curva de calibração/linearidade

• 3.2.2. Para a determinação da curva de calibração, deve-se analisar amostras extraídas da matriz apropriada, no mínimo 6 (seis) concentrações diferentes. Procedimentos alternativos devem ser justificados, como na obtenção de uma correlação não-linear, em que um maior número de concentrações de padrões serão necessários.

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• 3.5. Limite inferior de quantificação (LIQ)

• 3.5.1. Estabelecido por meio da análise de matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável com precisão e exatidão aceitáveis.

• 3.5.2. e 3.5.3. Razão de 5:1 entre o sinal e o ruído

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• “Because of these significant differences between small and macromolecule analytes, different technologies, such as LC-MS for small molecules and LBAs for macromolecules, are often employed to determine drug levels for PK assessments.”

• “As a result of small molecule analysis moving to the LCMS platform, LBAs are now almost exclusively used to measure macromolecules.”

(Viswanathan et al. 2007)

• “Ligand-binding assays or immunoassays are nowadays especially used for macromolecules. In these assays, quantification is based on macromolecular interactions between the macromolecule and antibody.”

(EMEA 2009)

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Cristal City (Viswanathan et al. 2007)

VALIDAÇÃO DE LBAS PARA MACROMOLÉCULAS

• Precisão e exatidão com CQs em matrizes equivalentes às previstas no estudo

• Preparação da matriz devido a substancias endógenas

• Avaliação de 5 ou mais concentrações cobrindo a faixa de quantificação do método:

• 1ª – LIQ• 2ª – baixa (3 X LIQ)• 3ª – média (média geométrica)• 4ª – alta (75% LSQ)• 5ª – LSQ

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Cristal City (Viswanathan et al. 2007)

VALIDAÇÃO DE LBAS PARA MACROMOLÉCULAS

• Para LBAs a variabilidade inter-corridas normalmente contribui mais para a variabilidade geral do que a variabilidade itra-corrida.

• É recomendada ao menos 2 determinações independentes de cada amostra de validação em cada corrida por no mínimo 6 corridas.

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Cristal City (Viswanathan et al. 2007)

VALIDAÇÃO DE LBAS PARA MACROMOLÉCULAS

• Para aceitação do método a imprecisão e a exatidão inter-corrida devem ser até 20% (25% para LIQ e LSQ)

• É recomendado que a soma da precisão mais a exatidão seja menor que 30% (40% para LIQ e LSQ)

• Todas as corridas devem ser incluídas nos cálculos finais, a não ser em casos de erros óbvios e documentados.

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Cristal City (Viswanathan et al. 2007)

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DE CORRIDAS ANALÍTICAS

• 75% dos CCs dentro de 20% de exatidão (25% para LIQ e LSQ)

• CQB, CQM e CQA no mínimo em duplicata (5% do total de amostras desconhecidas)

• Aprovação mínima de 4 em 6 CQs dentro de 20% de exatidão e ao menos 50% de cada concentração

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DRAFT EMEA 2009

Especificidade e Seletividade

• Especificidade do anticorpo e seletividade do método são pontos críticos do ensaio.

• Não deve haver reações cruzadas do anticorpo com outros compostos de estrutura semelhante ao analito.

• A especificidade é validada utilizando matriz de 10 fontes.

• A presença de anticorpos endógenos deve ser considerada.

• Devido à interferência de compostos endógenos a resposta do branco pode ser maior do que 20% da resposta do LIQ, o que é aceitável desde que não comprometa a exatidão do método.

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DRAFT EMEA 2009

Curva de calibração

• É importante que a matriz das amostras e a matriz padrão sejam equivalentes.

• Caso não sejam, deve ser demonstrado que a relação dose- resposta não é afetada pela matriz.

• Quando padrões de calibração “âncora” forem utilizados, seus valores devem ser muito bem documentados.

• A exatidão dos padrões de calibração deve estar dentro de + ou – 20% (25 para LIQ e LSQ).

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DRAFT EMEA 2009

Controles de Qualidade

• Ao menos 3 concentrações de CQ devem ser incluídas em cada corrida analítica.

• A precisão e a exatidão inter e intra-corrida deve estar dentro de 20%.

• O erro total deve ser menor do que 30% (40% LIQ e LSQ)

• Os resultados de todas as corridas devem ser incluídos para validação, exceto nos casos em que os erros são óbvios e documentados.

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DRAFT EMEA 2009

Considerações gerais sobre a validação

• É recomendado que o tamanho da corrida de validação seja comparável ao das corridas com amostras desconhecidas.

• Deve ser demonstrado que as características do analito não são afetadas pelos métodos de preparação de amostras, aditivos (ex. anticoagulantes) e estabilidade durante todo o processo.

• A avaliação não deve apenas considerar propriedades fiisico-químicas mas também a integridade biológica.

• Cuidado com mudanças no método após a validação! (Diluentes, reagentes, pH, etc.)

• Os resultados de todas as corridas devem ser incluídos para validação, exceto nos casos em que os erros são óbvios e documentados.

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DRAFT EMEA 2009

Kits Comerciais

• Kits comerciais podem ter sido desenvolvidos com propósitos diferentes de sua aplicação em estudos de bioequivalência.

• Necessitam ser revalidados.

• Os princípios de validação listados acima se aplicam.

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Implicações práticas para a ANVISA

• Considerar as peculiaridades dos métodos não-cromatográficos na revisão da RE 899/2003.

• Para moléculas passíveis de análise por métodos cromatográficos,

é recomendado que estes sejam a primeira escolha.

• Quanto uma análise for possível por métodos cromatográficos, mas a empresa quiser utilizar imunoensaios, os mesmos parâmetros de precisão e exatidão devem ser exigidos, acrescidos dos demais cuidados peculiares à técnica.

• Para drogas cujo ensaio cromatográfico não for indicado, podem ser aceitos 20/25% como parâmetros de precisão e exatidão, acrescidos dos demais cuidados peculiares à técnica.

• Kits comerciais devem ser revalidados para estudos de biodisponibilidade relativa.

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Referências

• C. T. Viswanathan,  Surendra Bansal ,  Brian Booth , Anthony J. DeStefano , Mark J. Rose , Jeffrey Sailstad , Vinod P. Shah , Jerome P. Skelly , Patrick G. Swann , and Russell Weiner. Workshop/Conference Report — Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. The AAPS Journal. 2007; 9 (1) Article 4

• John W. A. Findlay  and Robert F. Dillard. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. The AAPS Journal. 2007; 9 (2) Article 29.

• EMEA. GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS. (DRAFT) 2009.

• Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. D.O.U. 02/06/2003

• Ligand Binding Assay Bioanalytical Focus Group (www.aaps.org)

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Obrigado!

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Comparação entre macromoléculas e moléculas pequenas

Macromoléculas Moléculas Pequenas

Natureza Biopolímeros complexos Orgânicas

Síntese Biosíntese Orgânica

Padrões de referência Heterogêneos e impuros Homogêneos de alta pureza

Solubilidade Hidrofílicas Variável

Avaliação de estabilidade

Complexa (bio-integridade)

Simples

Relação com o organismo

Endógenas ou similares a elementos endógenos

Geralmente xenobióticas, ausentes na

matriz.

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Ligand Binding Assay - Definição

• Ligand: Latin ligare = ligar, Ligante

• Bind: Ligar, Prender, Unir

Ensaio de Ligação de Ligante

Imunoensaio*

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Imunoensaio - Definição

• Um ensaio utilizado para detectar ou medir a interação macromolecular entre um ligante (analito de interesse) e um anticorpo.

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Imunoensaio - Características

(Findlay & Dillard 2007)

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Imunoensaio - Características

(Findlay & Dillard 2007)

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Imunoensaio - Características

Não se emprega Padrão Interno