0 estudo de bioequivalência com metodologias não tradicionais ( métodos não cromatográficos)...

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Estudo de Bioequivalência com Metodologias não Tradicionais

( Métodos Não Cromatográficos)

Luciano Miranda

Especialista Científico Imunoensaios

Abbott Laboratórios do Brasil Ltda

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Tecnologia Axsym FPIA x MEIA

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Centro de procesamento

Suporte para células matrix

Centro de suprimentos

Centro de controle do sistema

Centro de amostras

DESCRIÇÃO DO ANALISADOR AxSYM

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1. Manutenções:

15 minutos diarios

30 minutos semanal e mensal

Procedimentos extremamente simples

2. Software amigável e atualizado

3. Monitor com tela táctil

4. Capacidade de urgência real

Fácil de aprender, fácil de operar, plataforma ideal para aplicações de rotina e investigações

Fácil de aprender, fácil de operar, plataforma ideal para aplicações de rotina e investigações

FÁCIL DE UTILIZAR AxSYM

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• Lista de carregamento de amostras

• Revisão de resultados

• Reporte/seleção de resultados

• Transferencia de resultados por lote ou em tempo real

• Imprimir resultados do paciente

• Armazena e arquiva resultados

• Revisão de calibração

SISTEMA CENTRAL DE INFORMAÇÃO AxSYM

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Tecnologias AxSYM

MEIA: Inmunoensaio Enzimático por Micropartículas

•Ensaio desenhado para efetuar determinações de analitos de alto peso molecular (moléculas grandes)

•Ensaio Não Competitivo

FPIA: Imunoensaio de Polarização Fluorescente

•Esta tecnología foi desenhada para fazer determinações de moléculas pequenas.

•Todas as moléculas que se encontram dissolvidas em líquido, se encontram em rotação, e sua velocidade de rotação depende de seu tamanho

•Ensaio competitivo

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MEIA Tecnologia não competitiva

Os ensaios não competitivos tipo sandwich se adaptam para formatos de 1 passo, 2 passos e 3 passos

A concentração do analito é diretamente proporcional ao sinal de fluorescência medida

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Ensaios COMPETITIVOS DE UM PASSO

Análise competitiva homogênea - Desenhado para poder analizar moléculas muito pequenas (como é o caso das drogas, alguns esteróides, alguns aminoácidos como homocisteína)

• FPIA é uma análise competitiva

• Reativo = Contém o mesmo analito a medir marcado com “Fluoresceína”

• A reação se prende a uma solução, e o complexo não requer passo de lavado para separar o complexo

FPIA Tecnologia

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Ensaios FPIA de dois passos

Estão desenhados para melhorar a sensibilidade dos ensaios

Um primeiro passo se junta com o excesso de Anticorpos e permite suficiente tempo de incubação

Um segundo passo permite a união do antígeno marcado com as imunoglobulinas presentes

FPIA Tecnologia

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FPIA

O módulo óptico mede as trocas de polarização quando são expostos a luz polarizada

• As moléculas com traçador não unidas ao complexo não emitem luz polarizada

• As moléculas com traçador unidas ao complexo emitem luz polarizada

• Um sinal de luz elevada indica baixo nível de analito na amostra do paciente

FPIA Tecnologia

FPIA – Menos antígeno “marcado” unido é indicador de mais antígeno presente na amostra

A quantidade de antígeno presente na amostra é inversamente proporcional ao sinal de luz polarizada registrada

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A Fluorescência ocorre devido a um marcador fluorescente. A Fluorescência ocorre devido a um marcador fluorescente. Este absorve a energia da luz em 490 nm e libera essa energia em Este absorve a energia da luz em 490 nm e libera essa energia em um comprimento de onda mais alto (520 nm) como luz um comprimento de onda mais alto (520 nm) como luz fluorescente.fluorescente.

490 nm490 nm

Fonte de Fonte de LuzLuz

Ag ligado Ag ligado FluoresceínaFluoresceína

520 nm520 nm

Detector de Luz em Detector de Luz em 520 nm520 nm

FPIA Tecnologia

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Moléculas grandes rotacionam mais lentamente em solução do que moléculas Moléculas grandes rotacionam mais lentamente em solução do que moléculas pequenas. pequenas. Este princípio pode ser usado para distinção entre uma pequena molécula de Este princípio pode ser usado para distinção entre uma pequena molécula de antígeno-fluorescente (AgF), que possui rotação rápida, e os complexos maiores antígeno-fluorescente (AgF), que possui rotação rápida, e os complexos maiores Ac-AgF, que possuem uma rotação mais lenta em solução.Ac-AgF, que possuem uma rotação mais lenta em solução.

490490 nmnm

Ag ligado Ag ligado FluoresceínaFluoresceína

Luz “despolarizada”Luz “despolarizada”

Fonte de Fonte de LuzLuz

ComplexoComplexo Ac-AgFAc-AgF

Fonte de Fonte de LuzLuz

Luz polarizadaLuz polarizada

490 nm490 nm

FPIA Tecnologia

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Dterminação de Levotiroxina (T4 Total)

• O ensaio AxSYM T4 Total é utilizado como um auxiliar na avaliação e monitoramento de estado da tireóide;

• A tiroxina é um hormônio que contém iodo com aproximadamente 777 daltons onde é secretado pela glândula da tireóide;

• É responsável em nosso organismo em torno de 90% de iodo ligado à proteína em circulação;

• Valores elevados de determinações de T4 Total são encontrados em pacientes com hipertireoidismo;

• Servem para monitoramento de pacientes que fazem o tratamento desta patologia.

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AxSYM

Centro de Amostragem:

• Amostra, solução de pré-tratamento e tampão são pipetados em uma cavidade de reaction vessel;

• Alíquota é transferida para uma das cavidades da célula da reação;

• A solução de pré-tratamento remove o T4 dos sitios de ligação na TBG, pré-albumina e albumina;

• Esta reaction vessel é transferida para o centro de processamento onde são realizadas outras etapas com agulha específica para evitar contaminação.

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AxSYM

Centro de Processamento:

• Uma segunda alíquota da reação é trasnferida para uma das cavidades do traçador ( MUP );

• O analito T4 e o traçador marcado competem pelos receptores na molécula do anticorpo;

• A intensidade da luz fluorescente polarizada é determinada pelo ssistema óptico FPIA.

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Calibradores

Seis calibradores standard:

Concentração de T4 Total (µg/dl): 0; 3; 6; 12; 18 e 24.

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Controles

AxSYM T4 Total Controles (Nº 7A55-10)

3 frascos (8 mL cada) de Controles AxSYM T4 Total, contendo tiroxina preparada em soro humano processado não reativo para HBsAg, RNA do HIV-1 ou Antígeno do HIV-1, anti-HCV e anti-HIV-1/HIV-2, produzindo as seguintes faixas de concentrações:

Concentração de T4 Total Intervalo

Frasco μg/dL

Baixo 4,5 3,3 – 5,7

Médio 8,0 6,6 – 9,4

Alto 15,0 12,5 – 17,5

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Parâmetros do Ensaio1 Long Assay Name (English): Total_T4

6 Abbrev Assay Name (English): Total_T4

11 Assay Number: 245

12 Assay Version: *

13 Calibration Version: *

14 Assay File Revision: *

15 Assay Enabled >ON

17 Assay Type : FPIA

18 Standard Cal Reps >2

19 Master Cal Reps:>2

20 Cal Adjust Reps: 0

21 Cal A Concentration: 0.00

22 Cal B Concentration: 3.00

23 Cal C Concentration: 6.00

24 Cal D Concentration: 12.00

25 Cal E Concentration: 18.00

26 Cal F Concentration: 24.00

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Parâmetros do Ensaio

27 Master Calibrator 1 Concentration: 0.00

28 Master Calibrator 2 Concentration: 18.00

43 Default Dilution Protocol >UNDILUTED

44 Default Calibration Method >Standard Cal

45 Selected Result Concentration Units >μg/dL

46 Selected Result Decimal Places >2

62 Blank I-Max background intensity:*

63 Min tracer-Min background intensity: *

73 Low Limit-Normal/Therapeutic Range lower limit > 0.00

74 High Limit-Normal/Therapeutic Range upper limit > 0.00

75 Low Extreme Value > 0.00

76 High Extreme Value > 0,00

91 Low Range Undiluted: *

92 High Range Undiluted: *

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Sensibilidade

A sensibilidade do Ensaio AxSYM T4 Total foi calculada como sendo de 1,05 μg/dL (n = 65 execuções).

Essa sensibilidade é definida como a concentração a dois desvios-padrão no AxSYM T4 Total Calibrador A (0,0 μg/dL) e representa a mais baixa concentração determinável de T4 que pode ser diferenciada de zero.

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Especificidade

A especificidade do Ensaio AxSYM T4 Total foi determinada através do estudo da reação cruzada com a triiodotironina (T3). Ao se determinar a razão das concentrações de T4 para T3, que corresponde ao ponto médio.

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Obrigado!Luciano.miranda@abbott.com