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ANDRÉA MARTINI RIBEIRO
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E OSMORREGULATÓRIAS EM Prochilodus lineatus
EXPOSTOS AO CHUMBO
Londrina – Paraná
2007
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ANDRÉA MARTINI RIBEIRO
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E OSMORREGULATÓRIAS EM Prochilodus lineatus
EXPOSTOS AO CHUMBO
Supervisor de Estágio Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez
Londrina – Paraná 2007
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina
como um dos requisitos à obtenção do título de Bacharel em Ciências
Biológicas.
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BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez
Profa. Dra. Marta M. Souza
Profa. Ms. Marina Mori Camargo
Londrina, 23 de novembro de 2007
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu
amado filho João Guilherme.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Cláudia Martinez pela paciência, pelo apoio e
ensinamentos.
Agradeço a todos os colegas de laboratório: Bel, Carol, Dalita, Esther, Gabriel, Jaque, Jú,
Kathya, Lindalva, Lú Loira, Luzinha, Mari, Marina, Michel, Rafa, Renata e Vanessa.
Agradeço aos meus colegas de turma e amigos, que se fizeram presentes durante o
decorrer de toda a graduação.
Agradeço em especial à minha querida amiga Amanda, pela amizade incondicional.
Agradeço aos meus pais pela presença constante.
E agradeço à minha família, pelo apoio e incentivo.
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SUMÁRIO
Pág.
1. Introdução 1
2. Revisão de Literatura 4
3. Objetivos 10
4. Artigo 11
5. Referências Bibliográficas Gerais 32
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RESUMO
Prochilodus lineatus é uma espécie de peixe neotropical com hábito alimentar detritívoro. Esta espécie caracteriza-se um ótimo bioindicador, uma vez que se mostra bastante sensível à presença de poluentes aquáticos. Sua distribuição abrange as Bacias Paraíba do Sul, Paraguai e Paraná. Nesta última localiza-se o município de Londrina, onde por muitos anos funcionou uma fábrica de baterias automotivas, empreendimento que tem como uma de suas principais matérias primas o chumbo. Este metal pesado é extremamente tóxico e seus efeitos são cumulativos. Uma vez no ambiente, o chumbo liga-se fortemente ao sedimento, sendo facilmente ingerido por animais detritívoros, como o P. lineatus. Em peixes, dentre os índices que podem sofrer alterações causadas pelo chumbo estão, os parâmetros hematológicos (conteúdo de hemoglobina, número de eritrócitos e hematócrito), glicêmico e osmorregulatórios (atividade da enzima Na+/K+-ATPase e íons plasmáticos). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar as possíveis alterações hematológicas, glicemicas e osmorregulatórias em P. lineatus causadas pela exposição aguda e subletal ao chumbo. Para tanto, juvenis desta espécie foram expostos a uma concentração de 0,5 mg.L-1 de chumbo dissolvido (Pb) ou apenas à água (CTR), durante 6, 24 e 96 horas. Sangue e brânquias foram coletados para as análises. Os resultados obtidos mostraram que os valores de hematócrito, RBC e hemoglobina aumentam no período inicial e diminuiram passadas 96 horas. Os valores de glicose plasmática mostraram tendências de variação em todos os tempos experimentais. Enquanto os valores do íon cloreto no plasma se mantiveram inalterados, os valores de potássio aumentam significativamente e os de sódio apresentaram uma clara tendência à diminuição. Este resultado foi, ainda, acompanhado de uma tendência da diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase. O aumento dos parâmetros hematológicos no período experimental mais curto (6h) indica o aumento do número de hemácias circulantes, provavelmente como resultado da contração esplênica, em conseqüência da resposta ao estresse. Já no período de exposição mais longo (96h), a redução dos parâmetros hematológicos indica o possível efeito do chumbo nos processos de síntese de hemoglobina e eritrócitos, ou ainda a ocorrência de um processo de hemólise, visto que os valores de potássio plasmático aumentaram significativamente. Pode-se ainda prever que concentrações mais altas desse metal poderiam interferir de forma negativa sobre a osmorregulação deste peixe, visto que a atividade da enzima Na+/K+-ATPase e consequentemente o íon sódio nesta concentração de chumbo, apresentaram uma tendência à diminuição de seus valores. Palavras-Chave: ecotoxicologia, hematologia, osmorregulação, Prochilodus lineatus, chumbo.
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1. INTRODUÇÃO
O desejo do homem moderno pelo desenvolvimento de novos recursos
é incansável. Estes recursos, por sua vez, desempenham um importante papel na
sociedade como geradores de benefícios, quanto à produção de bens de consumo,
impostos e empregos (YABE e OLIVEIRA, 1998). Entretanto, o desejo de
aprimoramento científico e a busca por novas tecnologias, pode acarretar sérios
problemas ao meio-ambiente, principalmente para as bacias hidrográficas, onde vêm
sendo depositados uma ampla gama de rejeitos.
O chumbo é comumente utilizado nas indústrias de tintas, vidros, e
baterias, e também na indústria petroquímica como aditivos em combustíveis, sendo,
portanto, uma importante fonte de contaminação ambiental. Muito pesado e
extremamente maleável, o chumbo resiste muito mais à corrosão do que a maioria dos
metais, ligando-se também à maior parte deles (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Os óxidos de chumbo são amplamente utilizados nas placas de
baterias elétricas e acumuladores (PbO e 2PbO.PbO2), como agentes componentes na
manufatura da borracha (PbO), como ingredientes nas tintas (Pb3O4) e como
constituintes de vitrificados, esmaltes e vidros (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Com o objetivo de caracterizar a bacia do ribeirão Cambé quanto à
presença de poluentes, no município de Londrina – PR, Yabe e Oliveira (1998)
identificaram diversos metais pesados em águas superficiais. As estações de coletas
seguiam desde o manancial da bacia até o Lago Igapó I, passando por um trecho onde
se encontrava uma fábrica de baterias. As concentrações médias de chumbo
encontradas na água aumentavam em direção à jusante, extrapolando em grande
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proporção os níveis máximos permitidos pela legislação nacional vigente. Nas
proximidades da fábrica de baterias, Yabe e Oliveira (1998) registraram variações
bruscas de pH, que ocasionou um aumento significativo nas concentrações dos metais
estudados. Ao longo de todo o percurso analisado do ribeirão houve a presença
sistemática dos elementos chumbo, níquel, cádmio, cromo e cobre, introduzidos por
fontes cuja origem está na urbanização e industrialização, além de ferro, alumínio,
manganês, cálcio e mercúrio, originados, principalmente, do carreamento de partículas
por meio das águas de escoamento.
O complexo de lagos (Igapó I, II, III e IV), localizado no município de
Londrina foi projetado em 1957, como uma solução para o problema da drenagem do
ribeirão Cambé (PML, 2007). Este complexo de lagos abriga, portanto, diversas
espécies nativas de peixes que anteriormente habitavam aquele ribeirão.
O peixe characiforme Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) é um
animal endêmico das bacias do Paraíba do Sul (FISHBASE, 2007), Paraná e Paraguai
(FISHBASE, 2007; FUGI et al., 1996). Detritívoro, consome quase exclusivamente finas
partículas do lodo, onde estão contidos sedimentos inorgânicos, que é a parcela mais
considerável da sua dieta, além de detritos orgânicos e diatomáceas (FUGI et al.,
1996). Esta espécie caracteriza-se como um ótimo bioindicador, uma vez que mostra-
se bastante sensível a poluentes, podendo ser, portanto, empregada com sucesso em
testes de toxicidade (MARTINEZ e CÓLUS, 2002).
Após a captação de chumbo pelos peixes, este se acumula
principalmente nas brânquias, fígado, rins e ossos. Também foram identificadas altas
concentrações de chumbo em ovos de peixes expostos à níveis elevados deste metal
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(WHO apud PAOLIELLO e CHASIN, 2001). Portanto, testes fisiológicos tornam-se de
fundamental importância para a determinação da toxicidade deste elemento para essa
espécie neotropical de peixe.
Atualmente, biomarcadores fisiológicos têm se mostrado de
fundamental importância na avaliação e quantificação tanto da exposição quanto dos
efeitos de poluentes ambientais (WINKALER et al., 2001). Sabe-se que diversos
poluentes são capazes de causar alterações morfológicas e funcionais nos mais
diversos tecidos dos peixes. Entretanto, os metais pesados, além de provocarem
alterações no epitélio das brânquias, podem alterar a atividade da enzima Na-K-
ATPase e, dessa forma, o fluxo normal de íons (SKIDMORE, 1970; PINHEIRO, 2004).
Outras importantes alterações fisiológicas que podem ser encontradas em peixes
expostos a poluentes além dos desajustes iônicos, incluem alterações hematológicas e
metabólicas (MAYER, 1992; WINKALER et al., 2001).
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2. REVISÃO DE LITERATURA
O chumbo é um elemento relativamente abundante na crosta terrestre,
tendo uma concentração média entre 10 e 20 mg/kg. As maiores fontes naturais de
chumbo são emissões vulcânicas, intemperismo geoquímico e névoas aquáticas
(PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
O chumbo ocorre numa variedade de minérios, sendo a galena (sulfeto
de chumbo) a mais importante fonte primária de chumbo e a principal fonte comercial.
A produção de chumbo no Brasil refere-se principalmente ao chumbo secundário,
obtido a partir da recuperação do metal de sucatas e rejeitos (PAOLIELLO e CHASIN,
2001).
Materiais e dispositivos que contém chumbo não podem ser
descartados no ambiente, devem ser reciclados. Mas a reciclagem é um processo com
grandes desafios, já que grande quantidade de resíduos são gerados e ocorrem
emissões de gases e efluentes contaminados com o chumbo (JOST, 2001).
Na reciclagem da bateria chumbo-ácido estão envolvidos três
processos: quebra da bateria, redução e refinamento do chumbo. Dentre as fontes
comuns de impacto ambiental deste processo de redução, destacam-se: rejeitos
contaminados com chumbo, poeira contaminada com chumbo (dos filtros), emissão de
SO2, emissão de compostos clorados e produção de dejetos. Em média, cerca de 300-
350 kg de dejetos são produzidos para cada tonelada de chumbo metálico, e cerca de
5% desses dejetos são compostos de chumbo (JOST, 2001). Uma vez lançado no
ambiente, o chumbo pode ser transformado de uma espécie inorgânica para outra, ou
de um tamanho de partícula para outro. Entretanto, como elemento, não está sujeito a
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degradação (PAOLIELLO e CHASIN, 2001).
Em sistemas aquáticos contaminados, apenas uma pequena fração do
chumbo encontra-se dissolvida na água, pois a maior parte do metal liga-se fortemente
ao sedimento. O chumbo é extremamente tóxico e seus efeitos são cumulativos e, na
maioria das vezes, se desenvolvem após uma exposição prolongada (WHO, 1989).
Um dos fatores mais importantes que influenciam a toxicidade aquática
deste metal é a concentração iônica livre, a qual interfere na disponibilidade do chumbo
para os organismos (PAOLIELLO e CHASIN, 2001). A toxicidade do sal inorgânico do
chumbo é muito dependente de condições ambientais, como a dureza da água, pH,
quantidade de partículas orgânicas e salinidade (HODSON, 1979; DEMAYO et al.,
1982; WHO, 1989). A toxicidade deste elemento não está, portanto, ligada apenas às
concentrações da espécie metal, mas também à capacidade de absorção da biota
aquática (HODSON et al., 1980).
Cada poluente é capaz de gerar diferentes alterações em determinado
animal, e estas alterações, quando usadas a fim de identificar danos, são chamadas
biomarcadores (WINKALER et al., 2001). Os biomarcadores constituem importantes
ferramentas para monitorar o equilíbrio do ecossistema aquático e têm sido
empregados em diversos programas de monitoramento em vários países (ADAMS et
al., 1990; WALKER et al., 1996). Atualmente, os biomarcadores fisiológicos,
histológicos e bioquímicos vêm sendo utilizados amplamente para apontar e quantificar
tanto a exposição quanto os efeitos de contaminantes ambientais (ADAMS et al., 1990;
WINKALER et al., 2001).
Os efeitos de poluentes em animais aquáticos podem ser estimados
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através da avaliação da sobrevivência e do sucesso reprodutivo das populações
(RANKIN et al., 1982), nas disfunções fisiológicas, alterações estruturais em órgãos e
tecidos e modificações comportamentais que levam ao prejuízo do crescimento e
reprodução (ADAMS et al., 1990). A biota aquática é, portanto, uma boa alternativa
como indicador dos metais biologicamente disponíveis. E, pela definição, metal
absorvido pela biota deve estar biologicamente disponível (HODSON et al., 1980).
Soluções letais de chumbo (assim como muitos outros metais pesados)
causam aumento da formação de muco nos peixes. Esse excesso de muco coagula-se
sobre o corpo do animal acumulando-se principalmente sobre as brânquias, interferindo
na função respiratória, podendo causar morte por hipóxia (ARONSON apud EISLER,
1988). Em concentrações de chumbo maiores que 10 µg.L-1 são esperados efeitos
severos em peixes expostos por um longo tempo (DEMAYO et al., 1982).
Peixes que são cronicamente expostos ao chumbo mostram uma
grande variedade de sinais de envenenamento: curvatura espinhal, usualmente lordose
(SIPPEL et al., 1982; HOLCOMBE et al., 1976); degeneração da nadadeira caudal
(SIPPEL et al., 1982); destruição dos neurônios espinhais (SIPPEL et al., 1982); atrofia
muscular (SORENSEN, 1991); paralisia (SORENSEN, 1991); mudanças
comportamentais (SORENSEN, 1991); alterações sanguíneas (DEMAYO et al., 1982;
SORENSEN, 1991; HEATH, 1995; MARTINEZ et al., 2004); inibição da enzima ALA-D
em eritrócitos, fígado e tecidos renais (HODSON, 1979; JOHANSSON-SJOBECK e
LARSSON, 1979); extravasamento de eritrócitos (DEMAYO et al., 1982); elevação da
concentração de chumbo no sangue, ossos, brânquias, fígado e rins (HOLCOMBE et
al., 1976); destruição do epitélio respiratório (HOLCOMBE et al., 1976); alterações na
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osmorregulação (AHERN e MORRIS, 1998; ROGERS et al., 2003; MARTINEZ et al.,
2004) inibição do crescimento (HOLCOMBE et al., 1976); retardamento da maturação
sexual (DAVIES et al., 1976); alterações histológicas de brânquias (MARTINEZ et al.,
2004), testículos e ovários (KUMAR e PANT, 1984); e até morte (EISLER, 1988).
Dentre os parâmetros hematológicos que podem ser alterados pela
presença de chumbo, estão conteúdo de hemoglobina, número de células vermelhas e
hematócrito. Dá-se o nome de hematócrito ao volume ocupado pelas células vermelhas
sangüíneas. Diferentes espécies de peixes podem apresentar grande variação neste
índice (STREIT, 1998). A medida dos valores de hematócritos foi sugerida como um
possível indicador de condições poluídas, sendo que esse índice mostrou-se útil em
alguns casos, como para peixes expostos ao cádmio (LARSSON et al., apud HUGHES,
1987). Um aumento do valor do hematócrito pode ser causado, por exemplo, por danos
nas brânquias em decorrência de hipóxia interna, ocorrendo, neste caso, um inchaço
dos eritrócitos (HEATH, 1995).
Dawson (1935) verificou que a exposição a altas concentrações de
chumbo causou anemia e hemólise das células sanguíneas vermelhas de Ictallurus
nebulosus. Anemia hemolítica em peixes é característica de curta exposição (até 90
horas) a uma concentração de até 15 mg Pb.L-1 (DEMAYO et al., 1982).
Outros índices que podem sofrer alterações após a exposição do
animal a um agente estressor, são o conteúdo de hemoglobina, o número de eritrócitos
(red blood cells – RBC) e o volume corpuscular médio (VCM). A baixa concentração de
hemoglobina, assim como a redução do número de eritrócitos, são as causas do
quadro de anemia desenvolvido por animais expostos a contaminantes (HEATH, 1995).
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O principal efeito do chumbo no sistema hematopoiético, entretanto, é a
morte prematura das células vermelhas sanguíneas maduras e a inibição da formação
da hemoglobina através da inativação da enzima ácido δ-aminoleviúnico desidratase
(ALA-D) (HODSON, 1979; PAOLIELLO et al., 1993; CALDEIRA et al., 2000).
Resultando, mais uma vez em anemia nas exposições a altas concentrações.
As brânquias também podem sofrer mudanças na morfologia devido à
uma ação ou como uma resposta aos poluentes ambientais, representando assim
estratégias adaptativas a fim de manter íntegras suas funções (LAURENT e PERRY,
1991). As brânquias dos peixes exercem papéis vitais, visto que, além de serem o
principal sítio de trocas gasosas (SCHMIDT-NIELSEN, 2002; HUGHES, 1982) também
estão envolvidas nos processos de osmorregulação (FLIK e VERBOST, 1993;
SCHMIDT-NIELSEN, 2002), equilíbrio ácido-básico (EVANS et al., 1982), excreção de
compostos nitrogenados (MACHADO, 1999; SCHMIDT-NIELSEN, 2002) e gustação
(HUGHES, 1982). As brânquias possuem rastros branquiais que impedem que
partículas sólidas entrem em contato com os filamentos e as lamelas, podendo causar
injúrias. Entretanto, se agentes irritantes encontrarem-se dissolvidos na água,
inevitavelmente entrarão em contato com os filamentos branquiais e com as lamelas
respiratórias, podendo alterar a morfologia normal da brânquia (RANKIN et al., 1982;
LUVIZOTTO, 1994).
Metais pesados, além de provocarem alterações no epitélio das
brânquias, podem alterar a atividade da enzima Na+/K+-ATPase e, dessa forma, o fluxo
normal de íons (SKIDMORE, 1970). Em condições normais, um peixe dulcícola deve
captar os íons do meio e eliminar água. Essa captação é feita principalmente pelas
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brânquias, onde encontram-se as células cloreto, ricas em mitocôndrias, e relacionadas
com o transporte ativo de íons (RANDALL et al., 2000; MARTINEZ e CÓLUS, 2002).
Estas células possuem em suas membranas baso-laterais grande quantidade da
enzima Na+/K+-ATPase, além de outros trocadores na membrana apical (EVANS et al.,
1999). Esta enzima revelou-se bastante sensível a diversos tipos de contaminantes,
podendo ser eficazmente utilizada para o monitoramento das condições ambientais
(STAGG et al., 1992).
Em seu trabalho, Ahern e Morris (1998) averiguaram que a espécie de
lagostim Cherax destructor tem um decréscimo de 40% na atividade da enzima Na+/K+-
ATPase das brânquias quando exposto in vivo a uma concentração sub-letal de
chumbo de 0,5 mg.L-1 por um período de 21 dias. E este decréscimo é ainda maior
quando o experimento é repetido in vitro.
A interrupção do mecanismo osmorregulatório por metais, geralmente
está associada à inibição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase nas brânquias e
talvez também no intestino (MARTINEZ et al., 2004). Martinez et al. (2004) sugeriram
que o chumbo pode inibir a Na+/K+-ATPase nas brânquias em Prochilodus lineatus
causando prejuízo na hiperregulação do sódio plasmático. Variáveis fisiológicas tais
como as concentrações plasmáticas dos íons sódio, potássio e cloreto, assim como a
osmolaridade, podem ser, portanto, empregadas como bons biomarcadores de efeitos
crônicos de contaminantes em peixes (RANKIN et al., 1982; ABEL, 1989).
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3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a ocorrência de alterações fisiológicas relacionadas a índices
hematológicos, iônicos e enzimáticos na espécie de peixe neotropical Prochilodus
lineatus.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Realizar testes estáticos agudos com concentrações sub-letais de
chumbo com Prochilodus lineatus, por períodos de 6, 24 e 96 horas.
o Determinar os parâmetros sangüíneos (hematócrito, RBC e hemoglobina)
nos peixes expostos ao chumbo.
o Determinar as concentrações plasmáticas dos íons sódio, potássio e
cloreto, a osmolaridade e a glicemia nos peixes expostos ao chumbo.
o Verificar a atividade da enzima Na+/K+-ATPase nas brânquias dos animais
em contato com o metal.
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4. ARTIGO:
Alterações Hematológicas e Osmorregulatórias em
Prochilodus lineatus Expostos ao Chumbo
A.M. Ribeiro, M.B.F.A. Vilela, C.B.R. Martinez
Universidade Estadual de Londrina – UEL, Departamento de Ciências Fisiológicas, Londrina – PR, Brasil
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RESUMO
O chumbo é um poluente relativamente comum no meio aquático, e é sabidamente
capaz de gerar diversas alterações nos organismos que vivem neste meio. Apesar do
grande número de estudos já realizados com peixes de clima temperado, seus efeitos
para espécies neotropicais ainda são pouco conhecidos. Assim, juvenis de Prochilodus
lineatus foram expostos a uma concentração de 0,5 mg de chumbo dissolvido.L-1 por
períodos de 6, 24 e 96 horas. Medidas do conteúdo de hemoglobina, RBC e
hematócrito foram tomadas, assim como concentração da glicose e dos íons cloreto,
sódio e potássio plasmáticos e da osmolaridade, e ainda a atividade branquial da
enzima Na+/K+-ATPase. Foram encontradas alterações significativas no hematócrito
dos peixes expostos ao chumbo por 6 e 96 h, e pequenas variações nos outros índices
hematológicos. O potássio plasmático apresentou-se aumentado, indicando o
rompimento de células sanguíneas. As concentrações iônicas de sódio apresentaram
tendência de diminuição, assim como a atividade da enzima Na+/K+-ATPase, nos
animais expostos ao chumbo. Os resultados obtidos indicam que na espécie
neotropical P. lineatus a concentração de chumbo testada afeta a hiperregulação do
sódio e a capacidade de transporte de oxigênio.
Palavras-Chave: ecotoxicologia, hematologia, osmorregulação, Prochilodus lineatus, chumbo.
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Introdução
O chumbo é um metal pesado extremamente maleável, comumente
utilizado nas indústrias de tintas, vidros e baterias (PAOLIELLO et al., 2001), e como
elemento não está sujeito a degradação (PAOLIELLO e CHASIN, 2001). A reciclagem
de materiais contendo chumbo gera grande quantidade de resíduos, o que facilita a
contaminação do ambiente por este metal (JOST, 2001). Na bacia do ribeirão Cambé
(Londrina-Pr-Brasil) Yabe e Oliveira (1998) constataram que as concentrações de
chumbo dissolvido presentes em trechos do ribeirão cercados por atividades urbanas e
industriais superavam, em grandes proporções (até 4,5 ± 0,49 mg Pb.L-1), os níveis
permitidos pela legislação então vigente (até 0,5 mg Pb.L-1) (CONAMA, 1986).
Dentre os peixes que compõem a ictiofauna desta bacia está o
Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) (FISHBASE, 2007; FUGI et al., 1996), um
peixe neotropical da família Characiforme com hábito alimentar detritívoro (FUGI et al.,
1996). Esta espécie é considerada um ótimo bioindicador, uma vez que mostra-se
bastante sensível à presença de poluentes aquáticos, podendo ser, portanto,
empregada com sucesso em testes de toxicidade (WINKALER et al., 2001; MARTINEZ
e CÓLUS, 2002). Em seu trabalho, Martinez et al. (2004) encontraram alterações em
diversos índices fisiológicos de P. lineatus expostos ao chumbo. Os autores reportaram
que o peixe exposto por um longo período a esse contaminante tem suas funções
metabólicas comprometidas, uma vez que os níveis de proteína, lipídeos e glicose
apresentam-se diminuídos.
De maneira geral este metal pode causar vários efeitos em peixes,
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dentre os quais pode-se destacar alterações na atividade a enzima Na+/K+-ATPase e
conseqüente desajuste no balanço iônico (ROGERS et al., 2003; PINHEIRO, 2004),
alterações sanguíneas (DEMAYO et al., 1982; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et
al., 2004) e mudanças nos níveis de glicose (WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et al.,
2004).
Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e quantificar as possíveis
alterações fisiológicas e enzimáticas, relacionadas à osmorregulação e aos parâmetros
sanguíneos, que ocorrem na espécie neotropical de peixe Prochilodus lineatus quando
exposta por curtos períodos a concentrações subletais do contaminante chumbo.
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Material e Métodos
Condições experimentais
Juvenis de Prochilodus lineatus (Peso=9,26 ± 3,22 g; CT=9,7 ± 1,1 cm
e CP=7,7 ± 0,9 cm; n=74), fornecidos pela Estação de Piscicultura – UEL, foram
mantidos por uma semana em tanques de 300L sob condições de temperatura, pH e
oxigênio controladas para aclimatação. Os peixes foram alimentados a cada 48 horas,
sendo que 24 horas antes do início do experimento a alimentação foi suspensa.
Procederam-se testes estáticos de exposição aguda por períodos de
6, 24 e 96 horas. Foram utilizados aquários de 100 L, contendo 80 L de água, divididos
em dois grupos, experimental (contendo nitrato de chumbo) e controle (contendo
apenas água), ambos com réplicas. O grupo experimental foi exposto a uma
concentração nominal de chumbo 3,13 mg.L-1 (que corresponde a 5 mg.L-1 de
Pb(NO3)2) e em cada um dos aquários foram colocados 8 peixes. Os aquários foram
isolados para evitar interação entre os peixes, e cobertos para simular o ambiente
natural desses animais, o fotoperíodo foi de 12:12 (C:E) e os peixes não foram
alimentados durante o decorrer de todo o experimento. Diariamente foram tomadas as
medidas de temperatura, oxigênio dissolvido, pH e condutividade da água, que se
mantiveram em (média ± D.P.): 23,02 ± 2,1º C; 7,41 ± 0,22; 7,05 ± 0,61 mgO2.L-1; 63,55
± 7,3 µS.cm-1 respectivamente. As quantidades de chumbo dissolvido e de chumbo
total foram medidas em amostras de água coletadas ao final de cada experimento para
os aquários experimentais e suas réplicas e para os controles através de
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espectrofotometria de absorção atômica. Os testes in vivo tiveram duração de seis
meses (mar – ago/2007).
Amostragem
As amostragens foram realizadas sempre no período da manhã.
Imediatamente após a retirada do animal da água, este foi anestesiado com
benzocaína diluída em água (0,12 g.L-1) para a coleta do sangue pela veia caudal, com
seringas descartáveis lavadas com anticoagulante (heparina). O sangue foi
armazenado em tubos plásticos de 1,5 mL a 4º C até o momento das análises. As
medidas biométricas foram então tomadas e o animal sacrificado por secção medular.
Suas brânquias foram imediatamente removidas com o auxílio de material de
dissecção, lavadas com solução salina e os filamentos branquiais foram separados e
armazenados em tampão SEI (Sacarose, EDTA, Imidazol) e congelados a -20º C.
Parâmetros analisados
Cerca de 20 µL de sangue de cada animal foram usados para a
determinação do hematócrito em microcapilares de vidro selados em uma das
extremidades e centrifugados (5.000 rpm por 5 min). Um cartão de padronização foi
utilizado para estimar a porcentagem das células sangüíneas. Outros 5 µL foram
colocados em 1 mL de tampão formol citrato para a contagem de eritrócitos (RBC) em
Câmara de Neubauer espelhada, sob microscópio de luz. Outra parcela do sangue total
foi usada para a determinação da quantidade de hemoglobina pelo método da
cianometahemoglobina com kit comercial (Labtest, Brasil) em espectrofotômetro (leitura
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em 540 nm). A partir dos dados de hematócrito, hemoglobina e RBC pôde-se calcular
os valores dos índices hematimétricos: Volume corpuscular médio (VCM = Htc x
10/RBC), hemoglobina corpuscular média (HCM = Hb x 10/RBC) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM = Hb x 100/Htc).
Do sangue restante foram obtidas amostras do plasma pela
centrifugação (5.000 rpm por 15 min), e estas foram congeladas (-20º C) até a
realização das análises. Primeiramente foram medidos os valores da osmolaridade de
cada uma das amostras em osmômetro de congelamento. A glicemia foi então
determinada usando-se o método colorimétrico pela glicose-oxidase com auxílio do kit
comercial (Labtest, Brasil) em espectrofotômetro (leitura em 505 nm). O plasma foi
diluído em água destilada (1:100) para a obtenção dos valores da concentração dos
íons sódio e potássio, com fotômetro de chama e comparados a padrões de
concentrações conhecidas. Já a quantidade de cloreto plasmático foi analisada pelo
método tiocianato de mercúrio em espectrofotômetro (leitura em 470 nm) através de kit
comercial (Analisa, Brasil). Todas as amostras foram feitas em duplicatas.
Para a determinação da atividade da enzima Na+/K+-ATPase, os
filamentos branquiais de cada animal foram homogeneizados em tampão SEI
(Sacarose, EDTA, Imidazol e β-mercaptoetanol) em diluição de 20x, centrifugados (por
10 min em 15.000 rpm a 4º C) e ao sobrenadante adicionou-se saponina (1:100). Dez
microlitros desta solução foram colocados em cada cavidade da microplaca juntamente
com 100 µL de solução de ouabaína ou KCl contendo 3 mM de Na2ATP, a placa foi
incubada no escuro por 30min, e 200 µL do reagente de cor (H2SO4, molibdato de
amônia e Fe2SO4.7H2O) foram adicionados para parar a reação. Cada uma das
18
amostras foi analisada em triplicata (3 com cloreto de potássio e 3 com ouabaína) em
leitora de microplacas (leitura em 620 nm). Como branco da reação, utilizou-se água e,
como padrão, solução de fósforo 0,65 mM (Sigma). A medida da concentração das
proteínas das brânquias foi feita através do método de Lowry et al. (1951) em
espectrofotômetro (leitura em 700 nm).
Análise estatística
Os dados estão apresentados como média ± desvio padrão. Os
resultados obtidos para cada um dos parâmetros analisados foram comparados entre si
através de teste t de Student (ANOVA). Foram considerados significativos valores de P
≤ 0,05. Todos os testes foram aplicados de acordo com Zar (1999).
19
Resultados
Os resultados para os níveis de chumbo na água mostraram que a
concentração uma média do chumbo total foi de 2,25 mg.L-1, e de chumbo dissolvido,
de 0,5 mg.L-1 nos aquários experimentais, enquanto nos aquários controle constatou-se
total ausência deste metal.
Os resultados obtidos (Média ± D.P.) mostraram que os peixes
expostos ao chumbo (Pb) durante 6 h apresentaram aumento significativo no valor do
Hcto (33,20 ± 4,26%) em relação ao controle (CTR) (25,60 ± 3,57%). Quando expostos
por 24 h os valores do grupo Pb e CTR foram iguais, mas houve um decréscimo
significativo do Hcto nos peixes expostos ao Pb por 96 h (27,20 ± 3,16%) em relação
ao CTR (32,82 ± 5,91%) (Fig. 1a). Observaram-se também tendências de aumento da
Hb e RBC nos animais expostos ao Pb durante 6 h, enquanto os animais exposto ao
metal por 96 h apresentaram uma tendência de redução destes valores, em relação ao
CTR (Fig. 1b e 1c).
Tabela 1: Volume corpuscular médio (VCM), Hemoglobina corpuscular média (HCM) e Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h.
VCM (µm3) HCM (pigm.cel-1) CHCM (%)
Tempo (h)
CTR Pb CTR Pb CTR Pb
6 129,2±18,6 (5) 176,8±29,1 (4) * 32,3±7,3 (5) 22,0±0,8 (4) * 25,7±7,7 (5) 12,8±2,6 (4) *
24 151,5±23,7 (4) 144,9±10,9 (4) 49,7±7,1 (4) 36,4±9,1 (4) 33,2±5,7 (4) 25,2±6,6 (4)
96 134,0±19,7 (5) 130,8±7,5 (7) 43,5±9,5 (5) 44,8±7,6 (7) 32,4±4,7 (5) 34,3±5,5 (7)
Os valores referem-se à média ± D.P. (n). * Valores diferentes de seus respectivos controles (P ≤ 0,05).
20
Hematócrito
0
10
20
30
40
6 24 96
Tempo (h)
(%)
(a)
*
*
RBC
0
1
2
3
6 24 96
Tempo (h)
(nº cels.mm
- ³)
(b)
Hemoglobina
0
3
6
9
12
15
6 24 96
Tempo (h)
(g.dL-1)
CTR Pb
(c)
Figura 1: (a) Hematócrito (Htco), (b) RBC e (c) Hemoglobina (Hb) em Prochilodus lineatusexpostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P. * indica diferença significativa em relação ao CTR (P ≤ 0,05).
21
Os índices hematimétricos (VCM, HCM e VHCM) dos animais
expostos ao Pb por 6 horas variaram significativamente dos daqueles expostos
somente à água pelo mesmo período (Tab. 1). O volume médio dos eritrócitos (VCM)
dos peixes experimentais aumentou (176,9 ± 29,1 µm3) em relação ao CTR (129,2 ±
18,6 µm3). Em contrapartida, a quantidade de hemoglobina por célula e a concentração
da mesma (HCM e CHCM) do grupo experimental (22,0 ± 0,8 pigm.cel-1 e 12,8 ± 2,6%,
respectivamente) diminuíram em relação ao CTR (32,3 ± 7,3 pigm.cel-1 e 25,7 ± 7,7%,
respectivamente) (Tab. 1).
Figura 2: Concentração de glicose plasmática de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P.
Os valores da glicose plasmática apresentaram uma tendência de
aumento nas primeiras horas (6 e 24 h) e uma posterior tendência ao decréscimo nos
animais experimentais passadas 96 horas (Fig. 2). Os valores da osmolaridade se
mantiveram inalterados (Tab. 2).
Glicose
0
8
16
24
32
40
6 24 96
Tempo (h)
(mg.mL-1)
CTR
Pb
22
Tabela 2: Concentrações plasmáticas de sódio e cloreto e osmolaridade de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h.
[Na+] (mM) [Cl-] (mM) Osmolaridade (mOsm.L-1.H2O)
Tempo (h)
CTR Pb CTR Pb CTR Pb
6 168,5±7,9 (8) 149,0±36,0 (9) 110,8±5,8 (8) 110,6±5,8 (8) 330,1±8,7 (9) 336,1±16,4 (8)
24 154,0±10,0 (7) 160,4±18,5 (5) 97,1±4,4 (13) 92,9±9,2 (6) 341,2±21,8 (6) 321,2±16,6 (6)
96 170,2±24,9 (9) 137,4±42,2 (8) 89,5±7,6 (8) 91,8±8,2 (9) 297,5±14,0 (4) 295,8±3,6 (4)
Os valores referem-se à média±D.P. (n).
A atividade da enzima Na+/K+-ATPase apresentou redução na
atividade em todos os tempos experimentais, sendo que no tempo de 96 h, esta
redução foi de quase 50%, entretanto as diferenças não foram significativas (Fig. 3).
Figura 3: Atividade a enzima Na+/K+-ATPase de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P.
Os resultados dos níveis de potássio plasmático dos animais expostos
ao Pb no tempo experimental de 24 h apresentaram-se significativamente maiores
Na+/K+-ATPase
0
25
50
75
100
6 24 96
Tempo (h)
(%) CTR
Pb
23
(4,96 ± 0,32 mM) do que os encontrados no grupo CTR (4,31 ± 0,34 mM), assim como
os dos peixes expostos ao Pb por 96 h (7,27 ± 4,89 mM) com relação aos seus
respectivos controles (4,89 ± 0,3 mM), confirmando a tendência que se apresentou no
tempo inicial de 6 horas (Fig. 4). O íon sódio manteve-se inalterado, tendendo,
entretanto, a uma diminuição nos tempos de 6 e 96 h. Os valores experimentais de
cloreto plasmático foram iguais aos encontrados nos animais CTR em todos os tempos
(Tab. 2).
Figura 4: Concentração de potássio plasmático de Prochilodus lineatus expostos ao chumbo (Pb) ou apenas à água (CTR) por 6, 24 e 96 h. As barras indicam média e as linhas verticais o D.P. * indica diferença significativa em relação ao CTR (P ≤ 0,05).
Potássio
0
3
6
9
6 24 96
Tempo (h)
(mM) CTR
Pb
*
*
*
*
24
Discussão
A presença de chumbo na água causa um aumento do número de
células produtoras de muco nas brânquias dos peixes, aumentando,
conseqüentemente, a produção do mesmo (HEATH, 1985; MACHADO, 1999). Além
disso, esse metal pode causar um afastamento do epitélio branquial na tentativa de
evitar que o contaminante seja absorvido pelo organismo (WINKALER et al., 2001;
CAMARGO e MARTINEZ, 2007). Assim, tanto o aumento do espaço de difusão entre o
sangue e a água, quanto o excesso de muco produzido têm a função de tornar mais
difícil a entrada do chumbo através das brânquias. Estas, entretanto, revelaram-se más
adaptações, uma vez que com o aumento do espaço de difusão sangue/água e com a
barreira criada pelo muco, a tomada de oxigênio pelas brânquias é dificultada,
resultando, assim, em uma hipóxia interna (HEATH, 1985; WINKALER et al., 2001;
MARTINEZ et al., 2004; CAMARGO e MARTINEZ, 2007).
A falta de oxigênio causada pelas alterações branquiais influencia, por
sua vez, na porcentagem a que as células correspondem do sangue, podendo alterar,
assim, o valor do hematócrito (HEATH, 1985; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et
al., 2004). Portanto, o aumento deste índice (Fig. 1a), assim como o aumento dos
outros valores hematimétricos (número de hemáceas circulantes e concentração de
hemoglobina) encontrados nos peixes expostos ao chumbo por 6 horas, podem indicar
uma possível contração esplênica resultante da resposta à baixa concentração de
oxigênio sanguíneo (MARIANO, 2006).
25
Já no período de exposição mais longo (96 h), a redução encontrada
nos parâmetros hematológicos (Fig. 1) indica o possível efeito do chumbo nos
processos de síntese de hemoglobina e eritrócitos. É sabido que o chumbo é capaz de
causar inibição na atividade da enzima ácido delta-aminolevulinico desidratase (δ ALA-
D) (JOHANSSON-SJOBECK e LARSSON, 1978; HODSON et al., 1980b). Esta enzima,
por sua vez, desempenha um importante papel na síntese da hemoglobina, e sua
inibição reflete a presença de chumbo na água (HODSON et al., 1980a e 1980b;
CALDEIRA et al., 2000). Entretanto, acredita-se que o tempo experimental em questão
não tenha sido suficiente para interferir sobre esta enzima provocando tais alterações.
Rogers et al. (2003) encontraram alterações nos valores de
hematócrito em experimentos realizados com trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
expostas ao chumbo. Porém, estes autores creditaram ao método amostral a razão da
diminuição dessa porcentagem, uma vez que nenhuma outra alteração que pudesse
indicar a causa da diminuição foi observada. Contudo, o aumento do potássio
plasmático encontrado no presente trabalho, sugere que a real causa da diminuição do
hematócrito e dos outros parâmetros hematológicos em P. lineatus esteja no
rompimento de células sanguíneas. Sabe-se que o potássio é um íon encontrado em
altas concentrações no interior das células (SCHIMIDT-NIELSEN, 2002), portanto
quando o valor de potássio plasmático encontra-se elevado, infere-se que tenha
ocorrido hemólise. Talvez exista uma relação entre este rompimento das células
sanguíneas com a redução encontrada na atividade da enzima Na+K+-ATPase, uma
vez que a inibição desta enzima pode causar um aumento do influxo de sódio a favor
do gradiente, juntamente com o aumento da entrada de água favorecida pelo gradiente
26
osmótico, o que acaba causando inchaço das células e conseqüente ruptura das
membranas (THAKER apud NICARETA, 2004).
O aumento da glicose plasmática nos tempos inicias (6 e 24 h) aponta
que os organismos expostos ao contaminante estiveram submetidos à uma situação de
estresse, mostrando uma tendência à mobilização de reservas energéticas,
possivelmente através da liberação de catecolaminas (HEATH, 1995; MARTINEZ e
CÓLUS, 2002). Martinez et al. (2004) já descreveram elevações nas concentrações
deste parâmetro para P. lineatus expostos a concentrações de 24 e 71 mg.L-1 de
chumbo. O resultado encontrado nos peixes expostos ao chumbo por 96 h mostra,
entretanto, uma tendência de decréscimo neste índice, sugerindo o esgotamento das
reservas energéticas e um possível processo de exaustão (HEATH, 1995; WINKALER
et al., 2001), tendências estas também observadas por Martinez et al. (2004).
Vários solutos influenciam na osmolaridade do plasma, e embora
nenhuma mudança tenha sido verificada neste índice, apesar das pequenas alterações
ocorridas com as concentrações de glicose, sódio e potássio, é possível que outros
íons não analisados, como o magnésio e o cálcio (AHERN e MORRIS, 1998; ROGERS
et al., 2003), estejam compensando este balanço. Amado et al. (2006) verificaram que
o chumbo aumenta as concentrações de cloreto plasmático na hemolinfa do
caranguejo Dilocarcinus pagei na presença de sal na água, por outro lado, diminuições
nos valores deste íon foram verificadas em trutas arco-íris expostas ao chumbo no
trabalho de Rogers et al. (2003). Contudo, no presente trabalho nenhuma alteração foi
verificada neste parâmetro.
27
A osmorregulação, por sua vez, faz-se essencial para a sobrevivência
de peixes de água doce, uma vez que o ambiente em que vivem proporciona um alto
gradiente iônico favorecendo as perdas de íons (RANDALL et al., 2000; SCHMIDT-
NIELSEN, 2002). A captação destes íons na água é regulada pela enzima Na+/K+-
ATPase (EVANS et al, 1982; MACHADO, 1999; WINKALER et al., 2001; MARTINEZ et
al., 2004; ATLI e CANLI, 2007), que tem sua atividade facilmente alterada pela
presença de chumbo (AHERN e MORRIS, 1998; MACHADO, 1999; MARTINEZ et al.,
2004; THAKER apud NICARETA, 2004). A diminuição de quase 50% da atividade
desta enzima encontrada nos animais experimentais expostos ao chumbo por 96 h, vai
ao encontro dos resultados obtidos por Rogers et al. (2003) para truta arco-íris
expostas ao mesmo metal. Estes autores reportaram que a atividade da Na+/K+-
ATPase dos peixes experimentais reduziu cerca de 40% a partir da 48ª hora e que esta
proporção se manteve nas horas seguintes. E associado a isso, assim como
verificaram Rogers e seus colaboradores (2003) para truta arco-íris, e Martinez et al.
(2004) para P. lineatus, o decréscimo das concentrações de sódio no plasma dos
animais expostos ao chumbo também foi constatado neste trabalho.
Em conclusão, os resultados obtidos indicam que a concentração
subletal de chumbo testada promoveu lise dos eritrócitos de P. lineatus e inibiu a
atividade da enzima Na+K+-ATPase nas brânquias, prejudicando, portanto, a
hiperregulação de sódio e o transporte de O2 pelo sangue dos peixes.
28
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