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RESUMO: As atividades antrópicas geram grandes quantidades de poluentes que, dependendo da forma que são liberados no meio ambiente, podem ocasionar graves distúrbios ecológicos. Neste contexto, a intensa atividade agrícola existente no estado de São Paulo, resulta em aumento na utilização de agrotóxicos. Dentre os agrotóxicos mais utilizados destaca-se a ametrina que, quando utilizada inadequadamente é lixiviada em grande quantidade pelas chuvas, atingindo os cursos d’ água contaminando todo o ecossistema. Desta forma, torna-se necessário um estudo para determinar a toxicidade da ametrina na biota aquática (peixes e moluscos). Assim, alevinos de tilápias (Oreochromis niloticus), e moluscos bivalves (Anodontites trapesialis) foram utilizados em testes de toxicidade aguda e crônica com diferentes concentrações de ametrina, e os efeitos produzidos nesses animais foram monitorados por análises hematológicas, de estresse oxidativo e pela histologia dos órgãos alvos, altamente suscetíveis às alterações do ambiente como as brânquias e o fígado. Portanto, o uso de biomarcadores pode ser um bom indicador da qualidade de um ecossistema.

ABSTRACT: The Human activities generate large amounts of pollutants, that depending on how they are released into the environment may cause severe ecological disturbances. In this context, the intense agricultural activity exists in the São Paulo state could results in increased use of pesticides. Among the pesticides most commonly used to highlights ametryn which, if used inappropriately is leached in large quantities by the rains, reaching waterways contaminating the entire ecosystem. So, the monitoring of oxidative stress in aquatic organisms may be a good display quality of an ecosystem. In this context,it is necessary a study to determine the ametryn toxicity in aquatic biota (fish and bivalve). For this reason, fry tilapia (Oreochromis niloticus) and freshwater bivalve (Anodontites trapesialis) were used in tests of acute and chronic toxicity with different concentrations of ametryn, and their effects in these animals were monitored by hematologic analyzes, oxidative stress and by histology of target organs, highly susceptible to environmental changes such as gills and liver. Therefore, the use of biomarkers can be a good indicator of the quality of an ecosystem.

ESTUDO DE BIOMARCADORES DO ESTRESSE OXIDATIVO EM PEIXES (OREOCHROMIS NILOTICUS) E MOLUSCOS (ANODONTITES TRAPESIALIS) SUBMETIDOS A ENSAIOS DE TOXICIDADE COM HERBICIDA AMETRINA

PublicaçãoAnhanguera Educacional Ltda.

CoordenaçãoInstituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE

CorrespondênciaSistema Anhanguera deRevistas Eletrônicas - [email protected]

v.6 • n.16 • 2012 • p. 83-100

Katia Kiyomi Iseki – Centro Universitário Anhanguera - unidade LemeHeliana Clara Salles – Faculdade Anhanguera de PiracicabaGlauce Ribeiro Gouveia – Faculdade Anhanguera do Rio GrandeClaudio Mantovani Martins – Universidade Anhanguera de São Paulo - Santo André (UniABC)João Alfredo Carrrara – Faculdade Anhanguera de Bauru

ANUÁRIO DA PRODUÇÃO ACADÊMICA DOCENTE

Palavras-chave: Bioensaio; agrotóxico; Oreochromis niloticus; Anodontites; estresse oxidativo; histologia; biota aquática

Keywords: Bioassay; pesticide; Oreochromis niloticus; Anodontites; oxidative stress; histology; aquatic biota.

artigo originalRecebido em: 20/12/2012Avaliado em: 28/12/2012Publicado em: 19/05/2014

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Estudo de biomarcadores do estresse oxidativo em peixes (Oreochromis niloticus) e moluscos (Anodontites trapesialis) submetidos a ensaios de toxicidade com herbicida ametrina

1. INTRODUçãO

A pesquisa foi composta por 4 experimentos: Experimento 1) Teste de toxicidade aguda em peixes; Experimento 2) Teste de toxicidade crônica em peixes; Experimento 3) Teste de toxicidade aguda em moluscos bivalves e Experimento 4) Teste de toxicidade crônica em moluscos bivalves.Esse trabalho apresentará os resultados dos 3 primeiros experimentos:

2. OBjETIVOS

O objetivo geral da pesquisa foi avaliar o efeito do herbicida ametrina, através de testes de toxicidade aguda e crônica em tilápias Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) e moluscos bivalves de água doce Anodontites trapesialis (Lamarck, 1819) usando como marcadores biológicos e de estresse oxidativo as análises bioquímicas, hematológicas e histopatológicas para avaliar o impacto de uma possível contaminação de agrotóxico sobre peixes e moluscos antes mesmo que esses animais apresentem qualquer alteração em sua saúde, comportamento ou aparência externa.

3. jUSTIfICATIVA

A ametrina constitui um herbicida amplamente usado no Brasil desde 1975, principalmente nas culturas de soja, milho e da cana de açúcar, dependendo da sua formulação e aplicação pode permanecer nas águas e no solo por meses ou anos (ANDRADE, 2008). Segundo dados do IEA (Instituto de Economia Agrícola) em 2010, os herbicidas representavam 52,5% do volume total de defensivos agrícolas utilizados no país. Assim, o impacto do agrotóxico sobre os organismos aquáticos pode ser estimado através de análises do estresse oxidativo, das alterações bioquímicas, hematológicas e histopatológicas. A importância do uso desses modelos biológicos (peixes e moluscos) para detecção de toxicidade ambiental é descrita pela quantidade e qualidade de pesquisadores envolvidos nesse tema (MORGAN & TOWELL, 1973; MALLAT, 1985; LOPES et al.,1992; BRUSLÉ, GONZALES & ANADON, 1996; ZELIKOFF, 1998; BLACK & MC CARTHY, 1999; CALLIL e JUNK, 1999; LEONARDO et al., 2001; FANTA, et. Al, 2003; TOMAZELLI et al.; 2003; MARTINEZ, et al., 2004; FIGUEIREDO-FERNADES et al., 2007; LUPI, et al., 2007; SANTOS et al., 2007; JESUS & CARVALHO, 2008; SILVA et al., 2008; BIAGINI, DAVID & FONTANETTI, 2009; PAULINO, 2011).

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Katia Kiyomi Iseki, Heliana Clara Salles, Glauce Ribeiro Gouveia, Claudio Mantovani Martins, João Alfredo Carrrara

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4. REVISãO BIBLIOgRáfICA

A água é um dos elementos essenciais para a sobrevivência dos organismos nos ecossistemas, portanto se esta estiver contaminada por agrotóxicos pode-se considerar que os demais componentes bióticos e abióticos do sistema também estejam. Os testes de toxicidade aquática têm sido cada vez mais utilizados para a determinação de efeitos deletérios dos agrotóxicos em organismos aquáticos (FERREIRA, 2002).

Sabe-se que a contaminação do ambiente aquático por agrotóxicos pode ocorrer de diversas formas, sendo as vias mais comuns: a) aplicação direta, visando o controle de insetos e plantas aquáticas; b) aplicação de pulverizações em áreas agrícolas; c) carreamento de partículas de solo contaminado; d) lixiviação; e) limpeza de embalagens e equipamentos utilizados nas aplicações (BAPTISTA, 1988).

Neste sentido, há maior preocupação quanto à utilização de grandes quantidades de herbicidas agrícolas no Estado de São Paulo, como sendo um risco potencial à contaminação do solo, das águas subterrâneas e das águas superficiais (JACOMINI, 2006).

Embora a EPA (Environmental Protection Agency), órgão de proteção ambiental americano, tenha classificado a ametrina como moderadamente tóxica para peixes e moderada à altamente tóxica para moluscos, ela é o herbicida comercializado em maior volume no Estado de São Paulo.

A eficiência da ametrina, um herbicida triazínico, deve-se ao fato deste ser absorvido rapidamente pelas folhas e raízes, sendo translocado pelo xilema, acumulando no meristema apical da planta, impedindo, desta forma, a fotossíntese e outros processos enzimáticos essenciais à sobrevivência da planta (ROBERTS, 1998).

Os organismos vivos quando em contato com substâncias com alto potencial oxidante, como no caso da ametrina, respondem, inicialmente, produzindo maior quantidade de radicais livres que provocam danos celulares e moleculares (estresse oxidativo) (WINSTON e DIGIULIO, 1991). A quantificação desses danos oxidativos provocados pela ametrina sobre os organismos aquáticos podem ser usados como biomarcadores de estresse oxidativo e estimados e monitorados por testes de toxicidade conduzidos em laboratórios (AHMAD et al., 2006; RAND & PETROCELLI, 1985). De acordo com estes últimos autores é preferível fazer uso no monitoramento ambiental de organismos-teste presentes nas regiões sujeitas ao aporte destes contaminantes.

Deste modo, a tilápia (Oreochromis niloticus), uma espécie cosmopolita, rústica, precoce, muito consumida no Brasil (CASTAGNOLLI, 1992; SCORVO-FILHO et al., 2010) vem sendo utilizada em estudos de toxicidade por ser uma espécie frequentemente criada em açudes e reservatórios sujeitos ao aporte de agrotóxicos utilizados em atividades agrícolas (TOMITA & BEIRUTH, 2002); além disso, apresenta notável capacidade de adaptação às condições de laboratório e extensa literatura sobre seu comportamento, fisiologia e requerimentos



ambientais, tornando-a relevante para testes, a fim de avaliar os efeitos biológicos de substâncias químicas tóxicas (ISHIKAWA et al., 2007; MOHAMMED E SAMBO, 2008; RAND, 2008; FRANÇA et al.; 2011).

Outro organismo que tem sido utilizado como bioindicador em estudos de monitoramento ambiental é o Anodontites trapesialis (LOPES et al.,1992; CALLIL e JUNK, 1999; TOMAZELLI et al.; 2003; SILVA et al., 2008), um molusco bivalve de água doce que também tem se despontado como uma fonte alternativa para a aquicultura, devido ao seu alto valor proteico (TELLO-PANDURO et al., 2004; FILIPI e SOUZA, 2008).

5. EXPERIMENTOS

Esse trabalho apresentará os resultados de 03 experimentos:5.1 Experimento 1 - Teste de Toxicidade aguda em peixes;5.2 Experimento 2 - Teste de Toxicidade crônica em peixes;5.3 Experimento 3 - Teste de Toxicidade aguda em moluscos bivalves.

5.1. Experimento 1) Teste de Toxicidade aguda em peixes

Metodologia

O experimento foi realizado no Laboratório de Estudos Aquáticos (LEA) localizado no Centro Universitário Anhanguera – Unidade Leme/SP. Os alevinos utilizados na pesquisa foram tilápias sexualmente revertidas (100% macho), Oreochromis niloticus, com peso médio 0,36 ± 0,12 g e comprimento médio 1,93 ± 0,29 cm, adquiridos da piscicultura comercial Santa Cândida, localizada no município de Santa Cruz da Conceição/SP. Cerca de 350 peixes foram divididos e acondicionados em dois tanques, cada um com capacidade para 80 litros, e preenchidos com água tratada e declorada. Os alevinos foram alimentados com ração comercial e permaneceram em observação a fim de se verificar possíveis variáveis que pudessem interferir no experimento. Após 7 dias, os alevinos foram transferidos para aquários com capacidade para 5 L de água, com sistema de aeração individual e revestidos internamente com sacos plásticos transparentes. A densidade utilizada foi de 10 peixes por aquário (0,8 g L-1) e foi usado o sistema semi-estático onde 1,5 L da água dos aquários era substituída a cada 24 horas. O período total do teste de toxicidade aguda foi de 96 horas (ABNT, 2004; APHA et al., 2005) (Figura 1A; B; C e D).

O produto químico utilizado foi a ametrina (Metrimex® 500 gL-1 SIPCAM ISAGRO, Uberaba-MG, Brasil) diluída para 1 litro de água destilada, ficando em uma solução estoque de 50 gL-1. Testes preliminares foram realizados para determinar as concentrações que seriam utilizadas no experimento. Assim, 3 concentrações foram testadas: 0; 10 e 20 mg L -1. Como a

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mortalidade nas concentrações 10 e 20 mg L -1 foi de 100%, foi determinada as concentrações a serem testadas resultando nas seguintes concentrações de ametrina: 0 (controle); 2,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 e 9,0 mg.L -1.

Diariamente foi monitorada a temperatura da água com um termômetro de mercúrio e, ao final do experimento, foi medida, a concentração de oxigênio dissolvido e pH de todos os aquários com um oxigenômetro digital.

O comportamento dos animais foi monitorado durante o experimento e foram avaliados 04 parâmetros comportamentais: 1) mudança de coloração – escuros, levemente escuros e claros; 2) frequência respiratória– abertura e fechamento da boca e opérculo na superfície (dispneia) e normal; 3) equilíbrio – perda e normal e 4) movimentação – imobilidade (perda de reação ao toque), hipoatividade (movimentação lenta) e normal.

Registraram-se mortalidades nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas de exposição ao produto. Os alevinos mortos foram retirados com redes separadas para cada uma das soluções testes e foram colocados no formol para futuros estudos. Com os dados das mortalidades ao final do experimento foi realizada a análise estatística através do método Trimmed Spearman Karber (HAMILTON et al., 1977), determinando-se a concentração letal média (CL50-96h).

Figura 1 – Laboratório de Ensaios Aquáticos (LEA) do Centro Universitário Anhanguera – Leme. A – Peixes estocados em aquários de 80 litros; B – Exemplares de Oreochromis niloticus utilizados no experimento; C – Vista geral dos aquári-

os experimentais; D – Aquários revestidos com plástico transparente (Fotos – arquivo pessoal).



Síntese de Resultados

A temperatura da água dos experimentos se manteve, em média, em 16ºC e foi monitorada diariamente com um termômetro de mercúrio. No início e ao final do experimento foi medida a concentração de oxigênio dissolvido (OD) e pH de todos os aquários. O valor médio de OD e pH inicial foi de 8,5 mg L-1 e 6,0 respectivamente. O valor médio de OD final foi de 8,2 mg L-1 e o pH da água dos aquários controle foi de 5,5 e para os aquários com ametrina o pH foi de 7,0.

Na concentração de 0 (controle) mgL -1, os alevinos permaneceram, durante todo o experimento, sem nenhum sinal clínico e/ou alteração comportamental.

Em relação aos sinais comportamentais, observou-se que à medida que aumentava a concentração e o tempo de exposição à ametrina, os peixes escureciam, apresentavam progressivamente um quadro de dispneia e perda de equilíbrio atingindo, antes da morte, o estágio de imobilidade, ou seja, não reagindo ao toque.

Com relação à porcentagem de mortalidade de alevinos observou-se que esta aumentou à medida que as concentrações de ametrina e o tempo de exposição aumentavam. Na concentração de 9,0 mg L-1 , a mais elevada, observou-se 100% de mortalidade após 72 horas de exposição à ametrina. Já nas concentrações intermediárias 7,0 e 8,0 mg L-1 , a mortalidade de 100% foi observada somente ao final do período experimental. Nas concentrações de 2,0; 5,0 e 6,0 mg L-1 a porcentagem de mortalidade média ao final do período de experimentação foi de 45, 40 e 95%, respectivamente.

Com os dados de mortalidade obtidos no período de 96 horas foi possível determinar o valor da concentração letal média (CL50-96h) de ametrina para alevinos de tilápia, sendo 5,38 mg L-1 (intervalo de confiança de 5,10-5,68 mg L-1) feito pela Teste de Trimmed Spearman Karber.

Assim, de acordo com estes resultados a ametrina para alevinos de tilápia pode ser classificada como moderadamente tóxica segundo a United States Environmental Protection Agency, ou seja, classificação toxicológica III (EPA, 2005).

Considerações

Com a aprovação do projeto pela FUNADESP, foi iniciada a adequação do Laboratório de Ensaios Aquáticos (LEA) do Centro universitário Anhanguera em Leme. Nesta etapa, foi necessária a participação ativa do Chefe de Serviços Gerais, Sr. Israel Bruner, que providenciou a montagem das bancadas dos aquários, o sistema elétrico e o sistema de água. Assim que o laboratório ficou pronto, iniciou-se o treinamento das pessoas envolvidas no experimento em relação ao uso dos equipamentos individuais de proteção (EPI) como bota de cano alto, luvas de procedimento, máscara com filtro, jaleco e capa plástica. O material de consumo utilizado durante o experimento (luvas de procedimento, sacos plásticos, vidrarias, pipetas

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e ponteiras) foi cedido pelo Prof. Dr. João Negrão do Laboratório de Fisiologia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo – FZEA/USP. As amostras de sangue dos peixes foram coletadas por punção caudal e utilizadas para a realização das análises sanguíneas (hematócrito, contagem total de eritrócitos e leucócitos e contagem diferencial dos leucócitos).

Para as análises histopatológicas dos testes de toxicidade crônica foram extraídos o fígado e as brânquias do 20 arco branquial direito dos peixes cultivados nos 3 diferentes tratamentos (T1, T2 e T3) e do grupo controle (C) conforme segue explicação: concentração de 0,025 mg L-1 de ametrina (T1); 0,053mg L-1 (T2); e 0,53 mg L-1 (T3), sendo amostrados 4 indivíduos em cada um deles nos dias: 0; 7 dias após o início do experimento; e 14 dias após o início do experimento. Em seguida, foram fixadas em solução de Bouin por 24 horas à temperatura ambiente. Fez-se a inclusão em parafina e os moldes foram cortados em micrótomo Leica RM 2155 com espessura de 6,0 µm. As lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina e montadas com bálsamo do Canadá. A análise e registro fotográfico foram feitas em Fotomicroscópio Leica associado ao programa LAS (Leica Application Suite - versão 2.81 de 2007).

Para as análises bioquímicas, uma porção do fígado e uma das brânquias foram coletadas e conservadas em nitrogênio líquido até o momento das análises de glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST) e catalase (CAT).

Diariamente foi monitorada a temperatura da água com um termômetro de mercúrio e ao final do experimento foi medido, com um oxigenômetro digital, a concentração de oxigênio dissolvido e pH de todos os aquários.

Para os testes de toxicidade crônica, foi realizada uma análise de variância (ANOVA) comparando-se os dados hematológicos dos animais do grupo-controle (sem ametrina) aos animais expostos a três concentrações de ametrina (tratamentos) ao longo do tempo (0, 7, 14, 21 e 28 dias de exposição). As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando-se o teste de Tuckey, para comparação de médias. Todos os testes foram realizados considerando o nível de significância de 5 %. Os dados obtidos nas análises histológicas foram submetidos ao teste não paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn, quando aplicável, considerando o nível de significância de 5 %.



Figura 2 - Laboratório de Ensaios Aquáticos (LEA) do Centro Universitário Anhanguera – Leme. A; B – Vista geral dos aquários experimentais; C – Exemplares de Oreochromis niloticus utilizados no experimento; D – Aquários utilizados nos

experimentos (Fotos – arquivo pessoal).

Síntese dos Resultados

Variáveis físicas e químicas da água dos ensaios

Não foram observadas diferenças significativas nas variáveis físicas e químicas da água dos aquários das diferentes concentrações testadas e ao longo do tempo que pudessem interferir nos resultados (Tabela 1).

Tabela 1- Valores médios e erro padrão das variáveis físicas e químicas da água no teste de toxicidade crônica com alevinos de Oreochromis niloticus expostos durante 28 dias a diferentes concentrações de ametrina: T1 - 0,025 mg L-1;

T2 - 0,053mg L-1; e T3 - 0,53 mg L-1.

Controle T1 T2 T3

Oxigênio Dissolvido (mg L-1) 6,35 ±0,05 6,25± 0,05 6,45± 0,05 5,85± 0,05

Temperatura (ºC) 19,7±0,17 19,6±0,16 19,7±0,16 19,7±0,16

pH 7,75±0,10 7,66±0,07 7,72 ± 0,09 7,82 ±0,08

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Análises hematológicas

Com relação às análises hematológicas foi observado que não houve diferença significativa nos valores de hematócrito, número de eritrócitos e número total de leucócitos dos peixes mantidos nas diferentes concentrações de ametrina durante o teste de toxicidade crônica (p>0,05).

De acordo com o resultados da contagem diferencial de leucócitos, verificou-se uma queda na porcentagem de linfócitos ao longo das coletas e essa diminuição se torna significativa (p<0,05) aos 21 e 28 dias de tratamento, principalmente nas concentrações de 0,5 mg L-1 e 0,05 mg L-1 quando comparado ao grupo controle.

Com relação à porcentagem de neutrófilos observou-se um aumento progressivo ao longo das coletas e esse aumento foi significativamente diferente (p<0,05) para a concentração de 0,5 mg L-1 aos 28 dias de tratamento, quando comparado ao grupo controle.

Os monócitos apresentaram aumento, mas não significativo em sua porcentagem, a partir dos 21 dias de tratamento, principalmente nas maiores concentrações de ametrina.

Os eosinófilos e os basófilos foram encontrados em baixa porcentagem no decorrer do experimento.

Assim, nota-se que houve predominância de linfócitos primeiramente seguidos de neutrófilos e monócitos na contagem diferencial de leucócitos.

Análises Bioquímica das brânquias

Dentre os marcadores enzimáticos, a atividade da GST nas brânquias de tilápias Oreochromis niloticus não apresentou variação em relação ao grupo controle até 7 dias de tratamento em todas as concentrações testadas. Entretanto, a partir de 14 dias de exposição, houve uma variação em relação ao grupo controle com a maior dose utilizada (T3 – 0,5 mg L-1). No 21º dia de exposição, parece ter havido uma estabilização do quadro de estresse oxidativo nos peixes, por não apresentarem diferença em relação ao grupo controle. No 28º dia de exposição, aparentemente houve um aumento da atividade da GST em todas as concentrações testadas (T1 – 0,025 mg L-1, T2 – 0,05 mg L-1, e T3 – 0,5 mg L-1) comparadas ao grupo controle, sugerindo um estado de estresse oxidativo.

Com relação à GPx nas brânquias de tilápias Oreochromis niloticus, foi registrado um aumento na sua atividade no 14º dia de exposição na menor concentração (T1 – 0,025 mg L-1) e na concentração intermediária (T2 – 0,05 mg L-1), quando comparado ao grupo controle, possivelmente caracterizando uma situação de dano oxidativo nestes organismos. No 21º dia de exposição, verificou-se uma considerável redução na atividade desta enzima nas 3 concentrações testadas, em especial nas duas maiores concentrações (T1 – 0,025 mg L-1, T2 – 0,05 mg L-1). No 28º dia de exposição, foi notado que a atividade da GPx baixou



consideravelmente, sugerindo que o aumento da atividade da GST pode ter sido suficiente no combate ao estado de estresse.

Análise histopatológica das brânquias

As alterações morfológicas observadas nas brânquias de tilápias Oreochromis niloticus estavam presentes nas três diferentes concentrações de ametrina aos quais os peixes foram submetidos: 0,025 mg L-1 (T1); 0,053mg L-1 (T2); e 0,53 mg L-1 (T3), e algumas delas, em menor grau e extensão, também foram observadas no grupo controle. As anomalias encontradas nos tratamentos experimentais foram: destacamento do epitélio lamelar; hiperplasia e hipertrofia do filamento; hiperplasia da lamela; vasodilatação com consequente fusão lamelar; e aneurisma (MALLAT, 1985).

A alteração mais comum e presente em todas as amostras foi o destacamento do epitélio lamelar, também amplamente apontada por outros autores (MALLAT, 1985; BIAGINI, DAVID & FONTANETTI, 2009; FONTANETTI ET AL., 2010; PAULINO, 2011; REZENDE, 2011). No tratamento 1 essa anomalia aparece de maneira pontual, delimitando uma pequena região de lamelas com caracteres moderados, e à medida que o animal é submetido a variações na concentração de ametrina e essa aumenta, as anomalias tornam-se mais frequentes e presentes em quase todas as lamelas. À medida que a concentração do herbicida aumenta, principalmente nos tratamento 2 e 3, as alterações morfológicas tornam-se mais evidentes e severas.

Figura 3: Brânquia de Oreochromis niloticus alterada T1. Região rica em: d = destacamento do epitélio lamelar; * = vasodilatação do eixo lamelar e proliferação celular.

Portanto, a exposição da tilápia ao herbicida ametrina provoca alterações morfológicas de acordo com a concentração utilizada e ao tempo de exposição, e essas adaptações que o peixe realiza para tentar sobreviver podem, em estágios progressivos, comprometer a função tecidual e provocar a morte do animal.

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d d d

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Considerações

Para a realização desse experimento, bancadas mais resistentes tiveram que ser construídas no Laboratório de Estudos Aquáticos (LEA) do Centro Universitário Anhanguera – Unidade Leme/SP para suportar o peso dos aquários (10 aquários de 80 litros de água). Compressores de ar com maior potência foram adquiridos para fornecer uma oxigenação uniforme em todos os aquários.

Todo material de consumo (agulhas, agulhas, seringas, tubos para microcentrífuga, ponteiras, lâminas, lamínulas, reagentes, corantes, navalhas, fixador, parafina) utilizado durante o período experimental e nas coletas de sangue, fígado e brânquias foi cedido pelo Prof. Dr. João Negrão do Laboratório de Fisiologia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo – FZEA/USP. A análise hematológica foi coordenada pela Dr.ª Katia Kiyomi Iseki e foi realizada no Hospital Veterinário do Centro Universitário Anhanguera - Leme e na FZEA/USP em Pirassununga. Já a análise bioquímica, coordenada pela Dr.ª Glauce Ribeiro Gouveia, foi realizada na Universidade Federal do Rio Grande – FURG e contou com a colaboração da Dr.ª Juliane Ventura-Lima. Para que isso fosse possível, as amostras foram acondicionadas em gelo seco e transportadas pela Viação Penha (transporte rodoviário) saindo da Rodoviária Tietê em São Paulo e chegando na cidade do Rio Grande-RS em 26 horas.

O processamento e as análises histopatológicas foram coordenadas e realizadas pela Drª Heliana Salles no laboratório de Histologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – FOP/UNICAMP, gentilmente cedido pelo Professor Dr. Pedro Duarte Novaes.

5.2. Experimento 3 - Teste de toxicidade aguda em moluscos

Metodologia

O experimento foi realizado no Laboratório de Estudos Aquáticos (LEA) localizado no Centro Universitário Anhanguera – Unidade Leme/SP.

Foram utilizados neste experimento 80 moluscos bivalves provenientes dos viveiros de piscicultura do Centro Especializado do Instituto Chico Mendes da Conservação de Biodiversidade – CEPTA/ ICMBio, localizado em Cachoeira de Emas – Pirassununga/SP (Figura 3). Os moluscos foram coletados tateando-se o fundo do rio ou tanque com os pés e mãos (Figura 4). Após a colheita, os animais foram acondicionados em caixas plásticas contendo água do local de coleta.



Figura 4 – Viveiros de peixes do CEPTA/ICMBIO em Cachoeira de Emas, Pirassununga – SP (Fotos – arquivo pessoal).

Figura 5 – Coleta de Anodontites trapesialis tateando o fundo do rio com o pés (Fotos – arquivo pessoal).

Os moluscos bivalves do gênero Anodontites apresentavam peso médio 76,27 ± 4,38 g e comprimento médio 9,89 ± 0,23 cm. Cerca de 80 indivíduos foram divididos e acondicionados em dois tanques cada, com capacidade para 200 litros de água tratada e declorada, contendo ao fundo 30 kg de areia fina, isenta de contaminação, como substrato. Os moluscos foram alimentados ad libitum, uma vez ao dia, com algas produzidas no laboratório. Os animais permaneceram em observação, a fim de se verificar possíveis variáveis que pudessem interferir no experimento. Após 2 dias, os moluscos foram transferidos para aquários com capacidade para 80 L de água, com sistema de aeração individual. A densidade utilizada foi de 10 moluscos por aquário (12,7 g L-1) mantidos em sacos de náilon individuais pendurados em suportes de madeira na altura da metade do aquário como demonstrado no esquema a seguir (Figura 6). Foi adotado o sistema estático, ou seja, não houve renovação de água durante o período total do teste de toxicidade aguda que foi de 96 horas (APHA et al., 1989) (Figuras 7A; B; C e D).

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Figura 6 – Esquema dos aquários experimentais utilizados no experimento com Anodontites trapesialis.

Figura 7 – Manutenção dos Anodontites em caixa de polietileno (A); Anodontites trapesialis (B); Aquários experimentais utilizados no experimento (C e D) (Fotos – arquivo pessoal).

O produto químico utilizado foi a ametrina Metrimex® (500 g L -1), diluída para 1 litro de água destilada, ficando em uma solução estoque de 50 g L-1. As concentrações testadas (concentrações baseadas nos testes crônicos em peixe) foram preparadas acrescentando-se à quantidade da solução estoque diretamente nos aquários, resultando nas seguintes concentrações de ametrina: 0 (controle); 2,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; e 9,0 mg L-1.

A temperatura da água foi monitorada diariamente, no início e ao final do experimento, com um termômetro de mercúrio, e a concentração de oxigênio dissolvido e o pH de todos os aquários foram medidos com um oxigenômetro digital.

Registraram-se mortalidades e comportamento nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas de exposição ao produto.



Cultivo de algas para alimentação dos Anodontites

Para a colheita de fitoplâncton, uma rede de plâncton de malha de 30 µm de diâmetro foi passada nos viveiros de cultivo de peixes do ICMbio. O material coletado foi medido e depositado em garrafas plásticas contendo 5 litros de meio de cultura à base de NPK (Sempre Verde Raiz, Bonigo Ltda, N 12%; P2O7 solução CNA 6%; K2O 6%) na concentração de 1:200 de água de mina, ou seja, 1 ml de NPK diluído em 199 ml de água. As garrafas contendo o fitoplâncton foram mantidas em laboratório sob iluminação constante. A repicagem foi feita a cada 4-5 dias, respeitando a proporção de 1:5, ou seja, 1 L de fitoplâncton em 4 L de meio de cultura (CUNHA, 2010).

Com os dados das mortalidades ao final do experimento, foi realizada a análise estatística utilizando-se do método Trimmed Spearman Karber (HAMILTON et al., 1977), determinando-se a concentração letal média (CL50-96h).

Síntese dos Resultados

Para a identificação da morte do animal durante o experimento, foi verificada a sua reação ao toque. Sistematicamente, durante o período de observação das mortalidades, os moluscos eram analisados quanto à velocidade de retração do pé ao toque (quando este estava exteriorizado) ou ao fechamento da abertura inalante após o toque. Se houvesse reação imediata, o molusco era considerado vivo.

Após 96 horas de exposição às diferentes concentrações de ametrina (0; 2,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; e 9,0 mg L-1) não foi detectado nenhuma mortalidade. Durante todo o período experimental os moluscos reagiram imediatamente ao toque e não apresentaram outro sinal que indicasse alteração comportamental devido à presença da ametrina.

Considerações

Foram feitas várias tentativas de coleta dos moluscos bivalves na natureza, todas coordenada pelo pesquisador Dr. Claudio Mantovani Martins. A 1ª tentativa foi feita em 28/06/12 na Represa Billings, em Ribeirão Pires. Duas outras foram realizadas na Represa do Rio Guarapiranga, em São Paulo, no mês de julho de 2012, entretanto, nenhum molusco foi encontrado. A 4ª tentativa foi realizada no dia 10/08/2012 no Rio Mogi-Guaçu, em Porto Ferreira, e também não foi possível encontrar os moluscos.

O não encontro dos animais possivelmente se deve a alguns fatos. No trimestre Março/ Abril/ Maio, durante o outono, segundo dados da Estação Meteorológica do Instituto de Astronomia, Geofísica e Ciências Atmosféricas da USP (IAG-USP) (SEÇÃO, 2012a), choveram 376,0 mm, cerca de 20% acima da média. No trimestre Junho/ Julho/ Agosto, durante o inverno, choveram 281,2 mm, 114% acima da média para o período, sendo que em Julho, houve a precipitação de 88 mm, o que representou 100% acima da média, e em

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Junho a diferença foi maior ainda, pois choveram 191,4 mm, quase quatro vezes mais do que a média climatológica (SEÇÃO, 2012b). Essa precipitação elevada fez subir muito o nível das represas, dificultando o acesso aos locais de maior probabilidade para o encontro dos animais. Esses moluscos vivem parcialmente enterrados no sedimento e a sua locomoção é quase restrita a um deslocamento vertical apenas. Aliado à água muito escura, e ao fundo lodoso, o qual dificultava a locomoção, o nível maior da água na represa impediu o acesso às regiões mais fundas, onde, provavelmente, poderiam estar os bivalves. Somente valvas roladas foram coletadas.

A colheita se deu no dia 26/09/2012, e ocorreu nos tanques de piscicultura do Centro Especializado do Instituto Chico Mendes da Conservação de Biodiversidade – CEPTA/ ICMBio, localizado em Cachoeira de Emas – Pirassununga/SP. Nesta colheita foram obtidos aproximadamente 90 moluscos bivalves.

Para fornecer aos moluscos condições propicias à sua manutenção em laboratório, foi realizada em final de maio/2012, a convite do Prof. Dr. Wagner Eustáquio Avelar, uma visita ao Laboratório de Malacologia do IB/USP, em Ribeirão Preto. Assim, de posse de novas ideias, novas adaptações foram feitas no Laboratório de Estudos Aquáticos (LEA) para receber os moluscos bivalves. Caixas de polietileno com capacidade para 200 litros de água foram adaptadas com filtro e sistema de recirculação de água, com a finalidade de manter os animais nas melhores condições possíveis.

6. CONSIDERAçõES fINAIS

A pesquisa proposta está em pleno desenvolvimento e há resultados interessantes. A maior parte dos experimentos com peixe está concluída e em fase de redação de artigos. O artigo: “Toxicidade aguda do herbicida ametrina para alevinos de Tilápia Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758)” foi submetido e aceito pela Revista Ensaios e Ciência. A continuidade das investigações histopatológicas com os peixes e os experimentos com moluscos bivalves Anodontotites trapesialis (experimento 3 e 4) estão previstos para o ano de 2013.

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