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NATALIE CHAVES FERREIRA

Efeito da N-acetilcisteína sobre a inflamação, estresse

oxidativo e morte celular em camundongos com esteato-

hepatite submetidos à isquemia e reperfusão hepática

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para a

obtenção do título de Doutor em Ciências

Programa de Clínica Cirúrgica

Orientadora: Profa. Dra. Edna Frasson de

Souza Montero

(Versão corrigida, Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A versão

original está disponível na Biblioteca da FMUSP)

SÃO PAULO

2018

Ferreira NC. Efeito da N-acetilcisteína sobre a inflamação, estresse oxidativo e

morte celular em camundongos com esteato-hepatite submetidos à isquemia e

reperfusão hepática [doutorado]. São Paulo: Universidade de São Paulo, Faculdade

de Medicina; 2018.

Banca examinadora

Presidente da Banca: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero

Instituição: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Membro Titular: Prof. Dr. Edivaldo Massazo Utiyama


Membro Titular: Prof. Dr. Francisco de Salles Collet e Silva

Instituição: Instituto Central do Hospital das Clínicas

Membro Titular: Prof. Dr. Marcelo Moura Linhares

Instituição: Escola Paulista de Medicina-Universidade Federal de São Paulo

Membro Suplente: Prof. Dr. Alfredo Luiz Jacomo


Membro Suplente: Prof. Dr. Franz Robert Apodaca Torrez

Instituição: Escola Paulista de Medicina-Universidade Federal de São Paulo

Membro Suplente: Profa. Dra. Margareth Pauli Lallée

Instituição: Instituto Central do Hospital das Clínicas

Dedico aos meus pais, Diva e Cecílio, pelo apoio e dedicação

durante toda a minha caminhada até aqui.

Aos meus avós maternos, Teodolino (in memoriam) e Tertulina

(in memoriam), pelos ensinamentos e conselhos, e aos meus

avós paternos, Gerolino (in memoriam) e Maria (in memoriam),

pelo carinho em família.

Aos meus familiares, tios, tias, primos, primas e a Federico

Martín Cayuela por todo incentivo em cada momento de minha

vida.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Profª Drª Edna Frasson de Souza Montero, pela

oportunidade de desenvolver esta tese, pela disponibilidade e dedicação em

transmitir seus conhecimentos científicos, e pela confiança em meu trabalho.

Ao Prof. Dr. Edivaldo Massazo Utiyama, Professor Titular da Divisão de

Clínica Cirúrgica III, pelo apoio no desenvolvimento dos projetos no Laboratório de

Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62).

Aos membros do Laboratório de Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62), Mário

Matsuo Itinoshe, Marco de Luna, Luci Yukiko Takasaka, Elisabete Hiroe Minami e

Ana Maria de Lima Cattani, pelo suporte técnico no desenvolvimento desse trabalho,

e à estagiária Gabrielly Pascoa Negreti por sua participação voluntária nesse

projeto.

À secretária do Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica, Eliane

Falconi Monico Gazetto, por todo auxílio prestado com as questões burocráticas da

Pós-Graduação.

À Drª Marcia Kiyomi Koike, pelas orientações e pelo suporte profissional

durante a execução do projeto de doutorado.

Ao Prof. Dr. José Antonio Picanço Diniz Júnior por todo apoio para a

conclusão desse trabalho, e aos funcionários do Laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Evandro Chagas pelo suporte técnico.

À Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, onde pude ampliar

minha qualificação profissional e consolidar meus conhecimentos.

Agradeço especialmente a Federico Martín Cayuela, aos meus pais,

familiares e amigos, que são pessoas importantes na minha vida e, de alguma

forma, contribuíram para a realização desse trabalho e para o meu crescimento

profissional e pessoal.

“De tudo ficarão três coisas: a certeza de que estamos

começando, de que é preciso continuar e de que podemos ser

interrompidos antes de terminar. Fazer da interrupção um

caminho novo. Da queda, um passo de dança. Do medo, uma

escada. Do sonho, uma ponte. Da procura, um encontro”

(Fernando Sabino, 1956).

RESUMO

Ferreira NC. Efeito da N-acetilcisteína sobre a inflamação, estresse oxidativo e

morte celular em camundongos com esteato-hepatite submetidos à isquemia e

reperfusão hepática [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo; 2018.

A manipulação cirúrgica do fígado com esteato-hepatite pode levar a complicações

pós-operatórias importantes. A N-acetilcisteína (NAC) apresenta efeito protetor em

modelos de I/R hepática, bem como na doença hepática gordurosa não alcoólica.

Porém, há carência de estudos relacionados a seu efeito em lesões de I/R em fígado

com esteato-hepatite. Portanto, esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito da

NAC sobre a reação inflamatória, estresse oxidativo e morte celular induzidos pela

I/R hepática associada à esteato-hepatite. Foram utilizados camundongos

C57BL/6J, machos, com oito semanas e peso entre 25 e 30 gramas, que receberam

ração normal AIN-93M ou deficiente em Metionina e Colina (DMC) de acordo com o

grupo de estudo. A NAC (150mg/kg) foi administrada 15 minutos antes da isquemia

(DMC-I/R+NAC). Nos grupos DMC-I/R e DMC-I/R+NAC, os animais foram

submetidos a 30 minutos de isquemia e 24 horas de reperfusão. Após esse período,

o sangue foi coletado, para análise bioquímica das transaminases, e o fígado,

removido cirurgicamente para avaliação histopatológica, dosagem das citocinas IL-

1β, TGF-β1 e IFN-, nitrito e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS),

análise da expressão celular de Bcl-2 e apoptose (TUNEL). A histopatologia mostrou

redução de focos inflamatórios no grupo DMC-I/R+NAC. Os níveis AST foram

elevados no grupo DMC-I/R enquanto que os de ALT diminuíram em relação ao

controle. No grupo DMC-I/R+NAC houve redução em ambas as transaminases,

sendo significante apenas para a avaliação de AST. A produção das citocinas IL-1β

e TGF-β1 foi elevada no fígado esteatótico de camundongos submetidos à I/R em

comparação aos animais com fígado normal; porém, o tratamento com NAC

promoveu uma redução significante dessas citocinas. A análise do estresse

oxidativo mostrou que os animais com esteato-hepatite submetido à I/R tiveram as

concentrações de TBARS e de nitrito elevadas em relação aos camundongos com

fígado normal. No entanto, ao receberem o tratamento com NAC, esses animais

apresentaram uma redução de ambos. A análise da expressão de Bcl-2 mostrou que

essa proteína estava elevada em camundongos com fígado normal, e reduzida na

presença de esteato-hepatite ou quando esta afecção está associada à I/R. A NAC,

nesse caso, promoveu o aumento da expressão de Bcl-2 em camundongos com

esteato-hepatite submetido à I/R. Esse resultado estava associado aos dados de

apoptose, nos quais foi observado aumento do número de células apoptóticas no

fígado esteatótico de camundongos em que a I/R foi induzida e redução nos animais

tratados com NAC. Desta forma, conclui-se que o uso da NAC promove efeitos

benéficos sobre o fígado de camundongos com esteato-hepatite associada à lesão

de I/R por meio da redução do infiltrado inflamatório, das concentrações de IL-1β e

TGF-β1, do estresse oxidativo e da morte celular.

Descritores: fígado gorduroso; citocinas; estresse oxidativo; morte celular; fígado;

camundongo; acetilcisteína.

ABSTRACT

Ferreira NC. Effect of N-acetylcysteine on inflammation, oxidative stress, and cell

death in mice with steatohepatitis submitted to hepatic ischemia and reperfusion

[thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2018.

The surgical manipulation of the liver with steatohepatitis may lead to important

postoperative complications. The N-acetylcysteine (NAC) has a protective effect in

hepatic I/R models, as well as in non-alcoholic fatty liver disease. However, there is a

lack of studies related to its effect inI/R injury to liver with steatohepatitis. Therefore,

the purpose of this study was to assess the effect of NAC over inflammatory,

oxidative stress and cell death induced by hepatic I/R associated to steatohepatitis.

The mice used were C57BL/6J, male, eight weeks old and weighing between 25 and

30 grams, which received normal diet AIN-93M or Methionine and Choline-deficient

diet (DMC) according to their study group. The NAC (150mg/kg) was administered 15

minutes before the ischemia (DMC-I/R+NAC). In groups DMC-I/R and DMC-

I/R+NAC, the animals were submitted to 30 minutes of ischemia and 24 hours of

reperfusion. After this period, blood was collected, for biochemical analysisof

transaminases, and the liver, surgically removed for histopathological assessment,

dosage of cytokines levels IL-1β, TGF-β1 and IFN-, nitrite and Reactive Substances

to Thiobarbituric Acid (TBARS), analysis of cell expression of Bcl-2 and apoptosis

(TUNEL). The histopathology showed a reduction of inflammatory foci in DMC-

I/R+NAC group. The AST levels were elevated in DMC-I/R group while the ALT

reduced in comparing to control. In the DMC-I/R+NAC group there was a reduction in

both transaminases, being significant only for AST assessment. The production of

cytokines IL-1β and TGF-β1 was elevated in the liver with steatosis of mice

submitted to I/R when compared to the animals with normal liver; however, the

treatment with NAC provided a significant reduction of these cytokines. The oxidative

stress analysis showed that the animals with steatohepatitis submitted to I/R had the

concentrations of TBARS and nitrite elevated when compared to the mice with

normal liver. However, when they received treatment with NAC, these animals

presented a reduction in both. The analysis of the Bcl-2 expression showed that this

protein was high in mice with normal liver, and reduced in the presence of

steatohepatitis or when this affection is associated to I/R. A NAC, in this case, lead to

an increase of Bcl-2 expression in mice with steatohepatitis submitted to I/R. This

result was associated to data of apoptosis, where increase in the number of apoptotic

cells in liver with steatosis of mice in which theI/R was induced and reduction in

animals treated with NAC was observed. Therefore, the conclusion is that the use of

NAC promotes beneficial effects on the liver of mice with steatohepatitis associated

to I/R injury through the reduction of inflammatory infiltrate, of concentrations of IL-1β

and TGF-β1, of oxidative stress and cell death.

Descriptors: fatty liver; cytokines; oxidative stress; cell death; liver; mice;

acetylcysteine.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Distribuição dos grupos experimentais........................................... 36

Figura 2 – Fotografias da cavidade abdominal e da oclusão do pedículo

hepático clampeado dos camundongos.......................................... 38

Figura 3 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo Controle..... 46

Figura 4 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC.......... 46

Figura 5 – Fotomicrografias do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R... 47

Figura 6 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-

I/R+NAC.......................................................................................... 48

Figura 7 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo Controle

mostrando a expressão de Bcl-2.................................................... 56

Figura 8 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC


Figura 9 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R



I/R+NAC mostrando a expressão de Bcl-2..................................... 57


apresentando apoptose.................................................................. 59

Figura 12 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC


Figura 13 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R



I/R+NAC apresentando apoptose............................................................. 61

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Níveis de AST no soro dos camundongos dos grupos

experimentais, expressos em média ± desvio padrão.................. 49

Gráfico 2 – Níveis de ALT no soro dos camundongos dos grupos


Gráfico 3 – Quantificação da citocina IL-1β no fígado de camundongo dos

grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão...... 51

Gráfico 4 – Quantificação da citocina TGF-β1 no fígado dos camundongos

dos grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão 52

Gráfico 5 – Quantificação de TBARS no fígado dos camundongos dos

grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão...... 53

Gráfico 6 – Quantificação de nitrito no fígado dos camundongos dos grupos


Gráfico 7 – Contagem de células apoptóticas no fígado dos camundongos

dos grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão 58

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Valores de AST e ALT no soro dos camundongos, expressos

em média ± desvio padrão........................................................... 50

Tabela 2 – Valores das citocinas IL-1β e TGF-β1 no fígado dos

camundongos, expressos em média ± desvio padrão................. 52

Tabela 3 – Valores de TBARS e nitrito no fígado dos camundongos,

expressos em média ± desvio padrão......................................... 55

Tabela 4 – Contagem de células apoptóticas no fígado dos camundongos,

expressos em média ± desvio padrão......................................... 59

LISTA DE SIGLAS

AIF: Fator indutor de apoptose

ALT: Alanina aminotransferase

AMP: Adenosina monofosfato

AST: Aspartato aminotransferase

ATF4: Activating transcription factor 4

ATP: Adenosina trifosfato

BAG: Bcl-2 associated athanogenes

Bad: Bcl-2 associated agonist of cell death

Bak: Bcl-2 homologous antagonist/killer

Bax: Bcl-2 associated X protein

Bcl: B-cell Lymphoma (-x, -XL, -XS, -w, -10, -2)

Bid: Bax like BH3 protein

Bik: Bcl-2 interacting killer

Bim: Bcl-2 interacting mediator of cell death

Blk: B lymphoid tyrosine kinase

CHOP: Proteína homóloga à proteína de ligação ao potenciador-CCAAT

DAB: Diaminobenzidina

DAMPs: Padrões moleculares associados a danos

DHGNA: Doença hepática gordurosa não alcoólica

DIABLO: Proteína de ligação direta ao inibidor de proteínas de apoptose com

baixo ponto Isoelétrico

DMC: Deficiente em metionina e colina

DNA: Ácido desoxirribonucléico

EHNA: Esteato-hepatite não alcóolica

ERN: Espécies reativas de nitrogênio

ERO: Espécies reativas de oxigênio

FMUSP: Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

GRP78: Glucose regulated protein 78

HCl: Ácido clorídrico

H2SO4: Ácido sulfúrico

IEC: Instituto Evandro Chagas

IL-1β: Interleucina-1β

IFN-γ: Interferon-γ

iNOS: Óxido nítrico sintase induzida

I/R: Isquemia e reperfusão

LIM 62: Laboratório de Fisiopatologia Cirúrgica

LLE: Lobo lateral esquerdo

LME: Laboratório de Microscopia Eletrônica

LME: Lobo medial esquerdo

MDA: Malondialdeído

Mcl-1: Myeloid leukemia cell differentiation protein

MnTBAP: Cloreto de porfirina de Mn (III) tetraquis (ácido benzóico-4)

NAC: N-acetilcisteína

NaOH: Hidróxido de sódio

NK: Natural killer

NO: Óxido Nítrico

PBS: Tampão fosfato com salina

pH: Potencial hidrogeniônico

SBF: Soro bovino fetal

SBH: Sociedade Brasileira de Hepatologia

Smac: Segundo ativador mitocondrial de caspase

TBA: Ácido tiobarbitúrico

TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA: Ácido tricloroacético

TGF-β1: Transforming growth factor-β1

TMB: Tetrametilbenzidina

TNF-α: Fator de necrose tumoral-α

TRL-4: Toll-like receptor-4

TUNEL: Marcação de terminais dUTP em fitas simples de DNA mediadas por

deoxinucleotidil terminal transferase

VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 18

1.1 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA (DHGNA)......... 19

1.2 I/R EM FÍGADO ESTEATÓTICO............................................................... 21

1.3 RESPOSTA INFLAMATÓRIA.................................................................... 22

1.4 ESTRESSE OXIDATIVO........................................................................... 24

1.5 MORTE CELULAR.................................................................................... 27

1.6 N-ACETILCISTEÍNA (NAC)....................................................................... 29

2 OBJETIVOS.............................................................................................. 32

3 MÉTODOS................................................................................................. 34

3.1 TIPO DE ESTUDO.................................................................................... 35

3.2 AMOSTRA................................................................................................. 35

3.3 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO............................................................ 36

3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO........................................................ 39

3.5 DOSAGEM BIOQUÍMICA DE TRANSAMINASES.................................... 39

3.6 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA AS DOSAGENS DE CITOCINAS,

TBARS E NITRITO.................................................................................... 39

3.6.1 Dosagem de citocinas............................................................................. 40

3.6.2 Dosagem de TBARS................................................................................ 40

3.6.3 Dosagem de nitrito.................................................................................. 41

3.7 DETECÇÃO DE Bcl-2 POR IMUNOHISTOQUÍMICA............................... 41

3.8 DETECÇÃO DE APOPTOSE PELA TÉCNICA DE TUNEL..................... . 42

3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................... 43

4 RESULTADOS.......................................................................................... 44

4.1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA................................................................ 45

4.2 ANÁLISE BIOQUÍMICA DAS TRANSAMINASES..................................... 48

4.3 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CITOCINAS....................................... 51

4.4 ANÁLISE DA QUATIFICAÇÃO DE TBARS E DE NITRITO..................... 53

4.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE Bcl-2....................................................... 55

4.6 ANÁLISE DE NECROSE E APOPTOSE NO TECIDO HEPÁTICO....... 58

5 DISCUSSÃO............................................................................................. 62

6 CONCLUSÃO........................................................................................... 72

REFERÊNCIAS......................................................................................... 74

APÊNDICE................................................................................................ 93

APÊNDICE A............................................................................................. 93

ANEXOS.................................................................................................... 94

ANEXO A................................................................................................... 94

ANEXO B................................................................................................... 95

ANEXO C............................................................................... .................... 96

18

1 INTRODUÇÃO

19

1 INTRODUÇÃO

A prevalência de obesidade tem aumentado sensivelmente nos últimos anos,

passando a ser um problema de saúde pública, não somente no Brasil, mas também

em outros países, principalmente nos desenvolvidos. Uma das preocupações com

relação à obesidade é o possível desenvolvimento de esteatose no fígado, e, caso

essa afecção hepática não seja devidamente tratada, pode ser agravada e evoluir

para uma esteato-hepatite1.

Pacientes com esteato-hepatite submetidos a procedimentos cirúrgicos no

fígado podem apresentar complicações importantes que dificultam a sua

recuperação. Dentre os procedimentos, destacam-se operações que promovam

lesão de isquemia e reperfusão (I/R) hepática, tais como ressecção e transplante de

fígado, trauma abdominal e choque hemorrágico2,3,4.

A busca por estratégias de prevenção ou terapêuticas na abordagem cirúrgica

de pacientes acometidos com essa enfermidade é de alta relevância. Os modelos

murinos são bastante adequados para estas avaliações pré-clínicas, pelo baixo

custo e pelo conhecimento que se tem desse modelo experimental em diferentes

áreas5.

1.1 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA (DHGNA)

Dentre os diversos tipos de doenças associadas ao acúmulo de lipídeos nas

células, a DHGNA é uma das afecções hepáticas mais presente em países

desenvolvidos e está associada principalmente à obesidade e à síndrome

metabólica6,7. Na população global, a prevalência dessa doença é de 4 a 46%8,9, e

deste valor, 90% ocorre em obesos mórbitos6. No Brasil, a Sociedade Brasileira de

Hepatologia (SBH) estima que cerca de 20% da população do país apresenta o

quadro histológico da DHGNA1.

Nos dias atuais, essa afecção tornou-se a segunda maior causa para a

indicação de transplante hepático nos Estados Unidos10 e chega a estar presente em

até 26% dos potenciais doadores11. Dentre outras causas, o aumento do número de

pacientes com necessidade de transplante hepático em decorrência do acúmulo de

lipídeos no fígado e deve ao estilo de vida ocidental12.

20

A DHGNA é definida como uma condição em que mais de 5-10% dos

hepatócitos apresentam esteatose macroscópica – observada por microscopia de

luz – na ausência de outras etiologias de doenças hepáticas6,13, tais como o

consumo excessivo de álcool, doenças auto-imunes ou induzidas por drogas e por

hepatite viral14. O espectro histológico dessa doença pode variar de uma esteatose

simples a esteatohepatite não alcoólica (EHNA), com fibrose hepática e

cirrose13,14,15.

A esteatose hepática, sendo considerada como uma das fases da DHGNA, é

caracterizada pelo acúmulo de vacúolos de lipídeos nos hepatócitos, principalmente

de triacilgliceróis, sem inflamação importante16,17,18. Mudanças na oxidação das

gorduras ou a diminuição da exportação, no fígado, de lipoproteína de muito baixa

densidade (VLDL) são os principais mecanismos envolvidos na esteatose hepática19.

À medida que o dano provocado pelo acúmulo de lipídeos se mantém no

tecido hepático, a esteatose simples evolui para uma EHNA. Esta, por sua vez, é

caracterizada principalmente pela presença de uma esteatose macro e

microvesicular, infiltrado inflamatório e baloneamento dos hepatócitos14,20,21. Em

alguns indivíduos com o fenótipo de EHNA, o fígado não consegue manter o seu

ritmo de regeneração devido ao aumento da taxa de morte celular, o que resulta na

cicatrização do órgão com fibrose22,23.

Diante dessa condição, a EHNA pode progredir para cirrose – 10 a 29% dos

indivíduos desenvolvem-na no prazo de 10 anos. Na cirrose, os hepatócitos são

substituídos por colágeno tipo 1, o principal componente do tecido cicatricial, que é

produzido pelas células estreladas ou células de Ito ativadas por uma lesão

hepática. Nessa fase, os pacientes podem morrer de complicações de hipertensão

portal, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular, caso o transplante de fígado

não seja realizado24,25.

Essas alterações podem demorar anos para se estabelecer em humanos com

comportamento alimentar hipercalórico e sedentarismo; porém, para melhor

compreender o desenvolvimento da DHGNA, vários modelos animais foram

estabelecidos, como o uso de uma dieta hipercalórica26,27,28 ou de uma dieta

deficiente de metionina e colina29,30, ou ainda o uso de animais geneticamente

modificados para desenvolver obesidade31,32.

21

1.2 I/R EM FÍGADO ESTEATÓTICO

A I/R no fígado caracteriza-se por ser uma interrupção parcial ou completa do

fluxo sanguíneo e do abastecimento de oxigênio nesse órgão, seguido do

restabelecimento do fluxo e consequente reoxigenação do tecido33,34. Nesse

processo, a isquemia provoca várias alterações hepáticas, que estão principalmente

relacionadas à diminuição do metabolismo aeróbico causado pela falta de

disponibilidade de oxigênio; no entanto, é durante a reperfusão, na qual se observa

o recrutamento de leucócitos, a liberação de mediadores inflamatórios e o aumento

da produção de radicais livres, que as lesões no tecido hepático são agravadas35.

A esteatose hepática é um dos fatores que podem aumentar a

susceptibilidade do fígado à lesão causada pelo processo de I/R. Dessa forma, a

esteatose tornou-se o fator de risco clínico mais importante para esse tipo de lesão

hepática36,37,38, aumentando o risco de morbidade e mortalidade pós-operatório,

inclusive em casos de transplante38,39,40. É o fator de maior impacto na disfunção

primária do enxerto e de baixa sobrevida entre os transplantados, assim como de

mau resultado em procedimentos que exijam isquemia transitória41,42,43. Esses

resultados, em relação à isquemia no fíagdo esteatótico, têm sido estudados e sua

causa é atribuída a diversos fatores, tais como alterações microvasculares,

alterações funcionais do hepatócito14, maior sensibilidade às espécies reativas de

oxigênio (ERO), entre outros44,45.

O acúmulo de triacilgliceróis dentro dos hepatócitos, por exemplo, provoca o

aumento do volume dessas células, distorcendo toda a arquitetura sinusoidal e

diminuindo o diâmetro do lúmen dos vasos sanguíneos em até 50%, quando

comparados aos fígados sem esteatose37. A redução do espaço sinusoidal faz com

que a hipóxia persista durante o processo de I/R, causando ainda mais dano ao

tecido hepático. Além disso, em fígados esteatóticos, proteínas da membrana

interna da mitocôndria induzem a diminuição da síntese de adenosina trifosfato

(ATP) e o aumento da produção de ERO46,47.

Quando fígados esteatóticos são submetidos à I/R, apresentam respostas

mais intensas em relação às manifestadas em fígados normais. Selzner e

colaboradores (2000) afirmam que há maior quantidade de necrose do que apoptose

em análises bioquímicas e histológicas48. Em outros estudos, encontram-se dados

22

que reforçam a ideia de uma maior resposta inflamatória em fígados esteatóticos

submetidos a episódios de isquemia transitória, quando comparados com fígados

normais49,50.

1.3 RESPOSTA INFLAMATÓRIA

A resposta imune do fígado está envolvida com a defesa desse órgão, por

meio da apresentação de antígenos para linfócitos e a eliminação de patógenos. No

entanto, as células imunes hepáticas podem também estar relacionadas com a

patogênese metabólica e fibrose do fígado, por meio das interações com outras

células, tais como hepatócitos, células endoteliais sinusoidais ou células

estreladas51,52.

Dentre as células que participam do sistema imune do fígado, estão presentes

os linfócitos hepáticos53,54, células de Kupffer55,56, infiltrado de monócitos57 e

eosinófilos58. Estas interagem com as células adjacentes no fígado e liberam

citocinas, resultando no desenvolvimento de doenças hepáticas51,59.

Citocinas são peptídeos reguladores pleiotrópicos que podem ser sintetizados

por diferentes tipos celulares. Em muitos tecidos, incluindo no fígado, ocorre sua

produção basal; no entanto, a síntese desses mediadores inflamatórios pode ser

aumentada mediante um estímulo, seja ele fisiológico ou patológico, levando a

doenças inflamatórias60,61.

Diferentes processos podem contribuir para o desenvolvimento de doenças

inflamatórias no fígado. Tilg e Moschen (2010) sugerem que mediadores

inflamatórios de vários tecidos, em especial do intestino e do tecido adiposo, podem

ter papel fundamental na ativação da cascata inflamatória, na fibrose e por fim no

desenvolvimento de tumor no fígado62.

A inflamação no fígado pode estar relacionada, por exemplo, ao acúmulo

excessivo de lipídeos nesse órgão e, consequentemente, à doenças metabólicas

hepáticas, tais como a EHNA. Nesses casos, acredita-se que as citocinas pró-

inflamatórias sejam um dos responsáveis pela desregulação metabólica no

fígado63,64.

A lesão hepática causada por I/R também está relacionada ao

desenvolvimento de uma resposta inflamatória exacerbada, caracterizada pela

23

síntese de citocinas inflamatórias e quimiocinas que recrutam leucócitos para o

tecido isquêmico, intensificando ainda mais a lesão no tecido hepático65. Dentre as

citocinas que participam da patogênese da EHNA e da resposta inflamatória

proveniente da I/R no fígado, podem ser destacadas a IL-1β, TGF-β e INF-γ.

AIL-1β é uma citocina pró-inflamatória produzida por macrófagos, monócitos,

células dendríticas, células NK, linfócitos B66, além de células epiteliais67 e células

endoteliais68. Está presente como um precursorinativo que, por meio da clivagem de

sítios específicos realizada pela caspase 166,69 ou por proteases derivadas de

neutrófilos, pode se tornar uma citocina biologicamente ativa70; e quando ativada, se

liga ao seu receptor e desencadeia a resposta inflamatória71.

Na EHNA, a produção de IL-1β é elevada devido ao acúmulo de ácidos

graxos saturados que induz a ativação do inflamossomo nas células hepáticas72, o

que pode aumentar o recrutamento de leucócitos e intensificar o processo

inflamatório, causando ainda mais danos ao tecido hepático73. Durante a I/R, a IL-1β

é uma das principais citocinas responsáveis pelo desenvolvimento do processo

inflamatório. Harada e colaboradores (2002) mostraram que, quando a produção

dessa citocina é reduzida, diversas reações inflamatórias mediadas por ela podem

ser bloqueadas e, consequentemente, a lesão causada pela I/R é atenuada74.

O TGF-β é uma citocina que participa de uma variedade de processos

biológicos, incluindo crescimento celular, diferenciação, adesão celular, migração e

resposta imune, além de ter um papel importante nas mudanças fibroproliferativas

que podem ocorrer em muitos órgãos e tecidos danificados, como fígado, rim,

coração pele, pulmão e parede das artérias75,76. O TGF-β é um dos principais

mediadores da resposta imune responsável pela proliferação e ativação das células

estreladas, e estas, por sua vez, estão relacionadas com a superprodução e

acumulação de colágeno que levam a fibrose no fígado em casos de doenças

hepáticas53,77.

A esteatose no fígado é considerada como um fator de risco para a

progressão da fibrose em casos de doenças hepáticas, já que, durante a injúria

causada pelo processo inflamatório resultante do acúmulo de ácidos graxos, as

células estreladas hepáticas são ativadas e liberam o TGF-β, uma das principais

citocinas fibrogênicas, que por sua vez levam à transdiferenciação das células

estreladas em miofibroblastos para a produção de tecido fibrótico78,79.

24

Na lesão de I/R, também pode ser observado o processo de fibrose mediado

pela citocina TGF-β80. Yu e colaboradores (2012) mostraram que a I/R em lobos

clampeados contribuiu para a regeneração hepática de lobos não clampeados, já

que a produção dessa citocina foi menos estimulada nos lobos não clampeados,

entretanto, a produção dessa citocina foi menos estimulada nos obos não

clampeados, e assim, ocorreu menos fibrose hepática nessa região81.

O IFN-γ é uma citocina pertencente ao grupo de interferon do tipo II e

desempenha um papel muito importante tanto na defesa do organismo quanto na

regulação da resposta imune82. Inicialmente acreditava-se que essa citocina

apresentava apenas função antiviral82, porém, atualmente sabe-se que o IFN-γ está

associado à sinalização de apoptose83, e que também apresenta funções anti ou

pró-tumorais84,85.

De acordo com Inzaugarat e colaboradores (2017), pacientes com DHGNA

apresentaram um aumento de infiltrado inflamatório no fígado, formado por linfócito

T CD4+, e esse aumento está associado à presença de níveis elevados de IFN-γ no

tecido hepático86. Devido o IFN-γ estar associado à sinalização de morte celular por

apoptose mediada pela via JAK2/STAT1, o aumento dessa citocina no fígado

submetido à I/R pode ser responsável pela lesão no tecido hepático87.

Esses mediadores inflamatórios, em geral, podem causar danos ao fígado por

meio da indução do estresse oxidativo e, consequentemente, de morte celular88.

Dessa forma, o controle da síntese e liberação de citocinas em fígado esteatótico

submetidos à I/R é de grande importância para diminuir os efeitos deletéreis do

processo inflamatório no fígado.

1.4 ESTRESSE OXIDATIVO

O estresse oxidativo é caracterizado pelo desequilíbrio entre as

concentrações de substâncias pró e antioxidantes, que pode resultar no aumento da

produção de ERO e espécies reativas de nitrogênio (ERN) e em uma desordem no

estado redox celular89,90. O fígado é um órgão que fisiologicamente produz elevadas

taxas de ERO e ERN, por isso, a presença de afecções hepáticas, tais como

hepatites virais91, DHGNA92, I/R e transplante hepático42, pode intensificar a

produção desses radicais livres e induzir o estresse oxidativo.

25

A patogênese da DHGNA, incluindo a atuação do estresse oxidativo sobre o

tecido hepático, ainda é pouco conhecida. Até então, a melhor hipótese para explicar

o desenvolvimento dessa afecção é o modelo de duas fases93. A primeira fase

consiste em uma alteração metabólica, com a presença de resistência à insulina,

hiperglicemia, hiperlipidemia e o acúmulo de triglicerídeos nos hepatócitos, que

resultam em esteatose; a segunda fase é a progressão para esteatohepatite, fibrose

e cirrose94,95,96.

No fígado, a resistência à insulina, causada pelo bloqueio dos receptores de

insulina por meio do aumento dos níveis de citocina pró-inflamatória derivada do

tecido adiposo97, induz a síntese de ácidos graxos dentro dos hepatócitos, que são

acumulados em forma de triacilgliceróis ou processados pelas vias de catabolização

de ácidos graxos realizados pela mitocôndria e peroxissomos. Também ativa a

enzima Citocromo P450 no retículo endoplasmático98,99. Esses processos resultam

no aumento da síntese de ERO, ERN e outros componentes derivados do estresse

oxidativo100,101.

As ERO e ERN produzidas e liberadas pelas células hepáticas provocam

morte celular no fígado, levando à formação de Padrões Moleculares Associados a

Danos (DAMPs), que se ligam ao receptor semelhante ao Toll-4 (TLR-4) na

superfície das células de Kupffer. Como resultado, essas células induzem a

produção de citocinas e quimiocinas, o recrutamento de células inflamatórias e maior

síntese de ERO e ERN (feedback positivo)102,103.

Dessa forma, a DHGNA acaba evoluindo de uma esteatose simples para uma

esteato-hepatite, e é nesse momento que o estresse oxidativo aparece de forma

mais intensa, causando danos ainda maiores, como peroxidação lipídica,

degeneração e necrose das células do tecido hepático, morte celular por

apoptose104,105,106 e ativação das células estreladas, com consequente indução de

fibrinogênese93,107.

A I/R, na sua fase inicial, provoca a hipóxia celular, o que reduz o ATP a

adenosina monofosfato (AMP) intracelular e hipoxantina. Na fase subsequente de

reperfusão, com aumento da oferta de oxidantes, a hipoxantina é metabolizada pela

enzima xantina oxidase, formando ERO108,109,110, que podem vir a exceder a

capacidade de degradação das enzimas antioxidantes, em especial as superóxido-

desmutases45.

26

Além disso, a isquemia provoca danos nos hepatócitos e também induz a

liberação de DAMPs. Assim como ocorre na DHGNA, esses metabólitos celulares se

ligam aos seus respectivos receptores na superfície das células de Kupffer e as

ativam111, promovendo a liberação de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas,

ciclooxigenases e ERO43,112, e o recrutamento de neutrófilos e monócitos que

potencializam a resposta inflamatória no fígado43,113. O aumento de ERO resulta em

mais ativação das células de Kupffer, que acarretam um ciclo de autoativação10,

causando lesão direta ao DNA e peroxidação lipídica das membranas

plasmáticas108,109.

O óxido nítrico (NO) também é considerado um importante mediador

inflamatório que pode promover ou prevenir danos ao tecido3. Em condições

fisiológicas, o NO induz a vasodilatação e impede o acúmulo de células

polimorfonuclerares e a adesão plaquetária, contribuindo para que não ocorra a

obstrução dos sinusóides hepáticos114. No entanto, quando, em uma reação

inflamatória, citocinas e/ou endotoxinas induzem a síntese exacerbada de NO por

períodos prolongados, esse mediador inflamatório é capaz de reagir com ERO e

produzir peroxinitrito, um compomente reativo, tóxico e altamente oxidativo115,116.

Fuita e colaboradores (2010) mostraram que a presença de NO e nitrotirosina,

produto derivado da nitração de tirosina por ERN, está intimamente associada ao

estresse oxidativo e pode ser um indicativo de progressão da EHNA117. Durante o

processo de I/R, a diminuição de NO pode acarretar na constrição dos vasos

sanguíneos e na intensificação da lesão no fígado118,119. Em contrapartida, o

aumento exagerado na produção de NO na lesão após o procedimento de I/R

hepática, provocam citotoxicidade por meio da ação de componentes secundários,

tais como nitrito e nitrato, formados a partir das reações enzimáticas sobre o NO120.

Varela e colaboradores (2011) afirmam que a produção de NO é um dos principais

responsáveis pelos danos ocorridos no tecido hepático durante a I/R em fígado com

esteatose121.

Essas alterações histopatológicas causadas tanto pela DHGNA quanto pela

lesão de I/R, além de provocar morte celular no fígado, podem resultar na perda

generalizada de células endoteliais dos vasos sanguíneos que nutrem esse órgão, o

que desencadearia uma trombose e, conseqüente, resposta inflamatória sistêmica,

levando à insuficiência de múltiplos órgãos122,123.

27

1.5 MORTE CELULAR

Diversos processos metabólicos, tóxicos ou inflamatórios no fígado, como a

DHGNA e a I/R, podem resultar em lesão hepática por meio da ativação dos

mecanismos de morte celular principalmente por apoptose ou necrose; contudo,

outras formas de morte celular podem acontecer124,125.

A apoptose é um tipo de morte celular programada que está envolvida na

morfogênese durante o desenvolvimento embrionário e também no controle da

homeostase do tecido adulto, eliminando células envelhecidas ou prejudiciais ao

organismo126. No fígado, a apoptose é fundamental para controlar o crescimento e

regeneração desse órgão127; porém, pode intensificar as lesões quando associadas

a doenças hepáticas.

A apoptose predomina na segunda fase da DHGNA, e a ela se deve o

aumento da fragilidade das membranas, tanto externa quanto das organelas128. No

caso das lesões induzidas por I/R, as ERO e a hipóxia são as principais

responsáveis pelos mecanismos de morte celular por apoptose, particularmente os

que estão associados à via intrínseca129.

Os mecanismos de apoptose são considerados como eventos dependentes

de energia, que resultam na condensação e marginalização da cromatina,

fragmentação nuclear, encolhimento celular e formação de corpos apoptóticos,

mediante a ativação de cascatas de eventos moleculares complexos. Esse tipo de

morte celular pode ser desencadeado pela ativação de receptores de morte (via

extrínseca) ou pelo estresse intracelular, com participação da mitocôndria no

processo apoptótico (via intrínseca)129,130. Tanto os eventos de via extrínseca quanto

os de via intrínseca da apoptose são dependentes da ativação de um grupo de

proteínas pertencentes à família das proteases aspartato-específicas dependentes

de cisteína, denominadas de caspases131. Em algumas células, como nos

hepatócitos e colangiócitos, essas duas vias de apoptose podem ocorrer juntas, já

que o envolvimento mitocondrial é necessário para amplificar o sinal apoptótico dos

receptores de morte132.

Na via extrínseca da apoptose, os receptores de morte celular, ao unirem-se

ao seu ligante, recrutam o complexo de sinalização induzido por morte, que promove

a clivagem proteolítica da pró-caspases 8 e/ou 10 em caspases ativadas. Estas, por

28

sua vez, induzem a ativação das caspases efetoras 3, 6 e 7, tanto de forma direta

quanto por mecanismos que envolvem a atuação da mitocôndria125. No que se

refere à via intrínseca da apoptose, diversos estímulos podem ser responsáveis por

desencadeá-la, como estresse oxidativo, radiação gama, dano no DNA, toxinas,

estresse no retículo endoplasmático, dentre outros. As cascatas de sinalização

induzidas por esses estímulos acabam convergindo para os mecanismos de morte

celular que envolvem a mitocôndria125.

A regulação dos eventos mitocondriais da apoptose é feita por um grupo de

proteínas definidas como família Bcl-2. Algumas proteínas dessa família têm ação

pró-apoptótica, como Bcl-10, Bax, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik, e Blk, enquanto outras

são caracteristicamente anti-apoptóticas, a exemplo de Bcl-x, Bcl-XL, Bcl-XS, Bcl-w,

BAG e a proteína que dá nome à família, Bcl-2. Todos os membros dessa família

são proteínas que atuam de maneira direta ou indireta na permeabilidade da

membrana mitocondrial, regulando da liberação de citocromo C, SMAC/DIABLO,

Fator Indutor de Apoptose (AIF) e endonuclease G. Enquanto os dois primeiros

contribuem para a cascata apoptótica que induz a ativação de caspases efetoras, os

dois últimos medeiam os mecanismos de degradação do DNA129,133,134.

Citando apenas como exemplos, outras organelas atuam no processo de

morte celular, tais como lisossomo e retículo endoplasmático. Os lisossomos, em

resposta a vários estímulos, podem apresentar aumento da permeabilidade da

membrana e liberar o seu conteúdo para o citosol135. Muitas das enzimas

lisossomais liberadas atuam na clivagem e ativação da proteína Bid e das proteínas

anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1, contribuindo, dessa forma, para a cascata

apoptótica associada à mitocôndria. Este processo é denominado de mecanismo de

apoptose lisossomal136,137.

No retículo endoplasmático, quando o estresse ocorre com grande

intensidade e duração, podem ocorrer erros no mecanismo de restauração da

homeostase, o que resulta em apoptose. Um dos mediadores desse estresse é a

Proteína Homóloga da Proteína de Ligação ao Potenciador-CCAAT (CHOP), que

atua aumentando a concentração das proteínas pró-apoptóticas138 e reduzindo a

quantidade de proteínas Bcl-2139. No fígado, a presença de concentrações levadas

de ácido palmítico, um ácido graxo fisiológico, pode ser tóxico e induzir a ativação da

CHOP e consequentemente levar à apoptose140.

29

A falha em manter todos esses processos, muito dependente do consumo de

ATP, resulta em necrose. Esse tipo de morte celular é caracterizado pela perda da

homeostase iônica, aumento dos níveis de cálcio intracelular, ativação de proteases

e fosfolipases e perda da integridade mitocondrial, que culminam no edema celular e

ruptura da membrana plasmática141,142.

A necrose difere da apoptose por ser um evento com maior liberação de

precursores inflamatórios e maior repercussão inflamatória local e sistêmica. Isto

ocorre devido ao rompimento da membrana plasmática que resulta na liberação dos

componentes do interior da célula para o meio extracelular. Este é um mecanismo

de proteção contra agressões por microrganismos e presente no processo de

cicatrização. Entretanto, quando ocorre em grande intensidade, pode desencadear a

síndrome da resposta inflamatória sistêmica143,144.

Na DHGNA, pode ocorrer lesão hepatocelular na região próxima à veia

centrolobular (zona 3), que inclui baloneamento, apoptose e formação de

corpúsculos de Mallory – acúmulos grumosos ou filamentosos no citoplasma de

parte dos hepatócitos, constituído principalmente de citoqueratina e outras

proteínas145. Além disso, o estresse oxidativo associado ao processo inflamatório

acaba resultando em necrose focal ou zonal e pode provocar destruição dos

hepatócitos e desordem na arquitetura celular146.

Na lesão de I/R, a morte celular hepática é caracterizada principalmente pela

presença de necrose oncótica associada a apoptose. Nesse caso, o dano celular

inicia na fase de isquemia, com a queda na produção de ATP, e se intensifica na

fase de reperfusão, quando ocorre a ativação do sistema imune, com a presença de

células de Kupffer ativadas e infiltrado inflamatório, liberação de citocinas pró-

inflamatórias e indução do estresse oxidativo147,148.

1.6 N-ACETILCISTEÍNA (NAC)

Para combater o estresse oxidativo que pode causar a morte celular, o

organismo estimula a produção de grandes quantidades de componentes celulares

denominados de antioxidantes, que são capazes de evitar ou reduzir a oxidação de

proteínas, DNA e lipídeos no interior das células, e assim contribuir para a proteção

do tecido lesionado149,150.

30

Dentre os antioxidantes presentes nas células, a glutationa é o mais

abundante, e atinge concentrações elevadas no fígado. É um tripeptídeo composto

por glutamato, cisteína e glicina, sendo considerado um importante agente para

manter a homeostase do estado redox celular e, consequentemente, proteger as

células dos efeitos do estresse oxidativo151.

Como principais funções, a glutationa realiza o sequestro direto do radical

hidroxil e superóxido, serve como cofator para a metabolização do peróxido de

hidrogênio e peróxidos de lipídeos, restaura outros antioxidantes – como a vitamina

C e E –, regula a homeostase do óxido nítrico, entre outros152.

Camundongos knockout Gclc (h/h) específico de hepatócitos é usado para

avaliar os efeitos da redução dos níveis de glutationa no fígado. No estudo de Chen

e colaboradores (2007) foi observado que a extensa redução desse antioxidante no

tecido hepático resulta no desenvolvimento de uma esteatose grave, acompanhada

da destruição dos hepatócitos e da presença de infiltrado inflamatório153.

Para tentar reverter essa situação, a terapêutica farmacológica com

administração de antioxidantes exógenos está sendo avaliada em modelos

animais154. Dentre estes antioxidantes, a NAC vem sendo estudada em nosso

laboratório nos diferentes modelos experimentais de isquemia e reperfusão, para

avaliar seu efeito nas lesões morfológicas, bioquímicas e funcionais em diferentes

órgãos155-160.

A NAC é uma substância de baixo custo, alta disponibilidade e de uso clínico

seguro. É utilizada na prática clínica, como substância mucolítica, antídoto para

intoxicação por paracetamol, prevenção da disfunção renal por radiocontrastes,

potencializador dos efeitos hemodinâmicos da nitroglicerina e protetor contra

radiação em investigações militares161. É uma pequena molécula composta do

aminoácido cisteína ligado a um grupo acetil, e é convertida em diferentes

metabólitos, incluindo a cisteína, um precursor da glutationa, que participa

conjuntamente com a enzima glutationa peroxidase na cascata de degradação das

ERO162. Tem sido utilizada em estudos experimentais envolvendo redução de lesão

tecidual hepática em modelos experimentais de transplante de fígado, comprovando

sua eficácia ao prevenir a lesão de isquemia e reperfusão162.

Em modelo de choque hemorrágico, observou-se proteção tecidual em

pulmão, avaliando o comprometimento sistêmico155,156, e em fígado submetido à I/R

31

após choque hemorrágico157, assim como a sobrevida dos animais nesses modelos.

Na I/R hepática associada à hepatectomia foi observado efeito protetor enzimático e

morfológico ao fígado158,159. E, no estudo em que foi realizada a associação da NAC

com o precondicionamento isquêmico, não se observou efeito sinérgico ou

antagônico no tecido hepático ou pulmonar após I/R hepática, uma vez que o efeito

protetor foi similar160.

Apesar das evidências experimentais citadas acima em relação aos efeitos

benéficos da NAC em diferentes afecções, Robinson e colaboradores (2013)

encontraram dificuldades em provar as vantagens do uso da NAC no seu estudo em

pacientes submetidos à ressecção hepática segmentar163. Esse fato evidencia a

necessidade de uma maior compreensão do uso da NAC em lesão hepática

resultante de I/R. Além disso, há carência de estudos na literatura dos efeitos

exercidos pelo uso desse antioxidante exógeno na inflamação, estresse oxidativo e

morte celular em modelos de I/R hepática associada à DHGNA; o que justifica a

busca por fármacos reguladores do potencial inflamatório e oxidativo, como a NAC,

com utilidade clínica para esse tipo de afecção hepática.

32

2 OBJETIVO

33

2 OBJETIVO

Avaliar o efeito da NAC sobre a resposta inflamatória, o estresse oxidativo e a

morte celular em camundongos com esteato-hepatite submetidos à I/R hepática.

34

3 MÉTODOS

35

3 MÉTODOS

3.1 TIPO DE ESTUDO

Esta é uma pesquisa experimental, transversal, controlada e aleatorizada.

Todos os animais foram manipulados de acordo com “Os Princípios Éticos da

Experimentação Animal da União Internacional Protetora dos Animais” e da Lei Nº

11.794, de 8 de outubro de 2008. Este projeto foi submetido à Comissão de Ética em

Pesquisa da FMUSP, e foi aprovado sob o parecer nº 243/13 (Anexo A e B).

3.2 AMOSTRA

A amostra utilizada neste projeto constou de 48 camundongos (Mus

musculus), da linhagem C57BL/6J, machos, com idade de oito semanas e peso

entre 25 e 30 gramas. Os animais provenientes do Centro de Bioterismo da FMUSP

foram operados no Laboratório de Fisiopatologia Cirúrgica (LIM 62) da FMUSP.

Aqueles provenientes do Centro de Bioterismo do Instituto Evandro Chagas (IEC)

foram operados no Laboratório de Microscopia Eletrônica (LME) do IEC. Todos os

animais passaram por esse procedimento operatório após período de adaptação e

controle nutricional no biotério setorial de cada laboratório.

Durante o experimento, os animais foram alojados em gaiolas apropriadas

com as dimensões 40x30x25cm, em grupos de no máximo três animais e foram

alimentados com ração específica para o grupo ao qual pertenciam e água ad

libitum. O ritmo circadiano dos animais foi respeitado, mantendo as condições

sanitárias adequadas. Antes do experimento, os animais tiveram restrição de

alimentos sólidos por quatro horas.

O grupo de animas que foi submetido à alimentação esteatogênica recebeu

uma dieta Deficiente em Metionina e Colina (DMC) (Anexo C). Esta dieta é

constituída majoritariamente de amido de milho, dextrina, sucrose, extrato de

amendoim e óleo vegetal, assim como outros componentes em menor quantidade,

objetivando um total de metionina de 300mg/kg de alimento, e com cloridrato de

colina totalizando 50mg/kg de alimento. É uma dieta elaborada e fornecida

36

comercialmente para o propósito de indução de DHGNA em modelos animais para

estudo29.

Os animais foram separados, por sorteio, em quatro grupos contendo 12

animais cada – seis desses animais foram manipulados no LIM-62 e os outros seis,

no IEC –, sendo esses grupos designados de acordo com a dieta alimentar e o

procedimento operatório realizado: Grupo Controle, composto por animais

submetidos apenas à anestesia e laparotomia; Grupo DMC, composto por animais

alimentados com dieta DMC e submetidos apenas à anestesia e laparotomia; Grupo

DMC-I/R, composto por animais alimentados com dieta DMC e submetidos à I/R; e

Grupo DMC-I/R+NAC, composto por animais alimentados com dieta DMC,

submetidos à I/R e tratados com NAC (Figura 1).

Figura 1– Distribuição dos grupos experimentais

Grupo DMC = Grupo dieta DMC; Grupo DMC-I/R = Grupo dieta DMC-Isquemia/Reperfusão; Grupo DMC-I/R+NAC = Grupo dieta DMC-Isquemia/Reperfusão + N-acetilcisteína. Fonte: desenho esquemático feito pelo próprio autor (2017).

3.3 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO

Após pesados, os animais receberam uma solução de atropina intramuscular

de 0,04mg/kg, 10 minutos antes da indução anestésica. Depois, os animais foram

37

anestesiados com uma associação dos fármacos xilazina (10 mg/Kg) e cetamina (70

mg/kg) por via intramuscular, na face lateral da pata traseira direita. O animal foi

considerado em plano anestésico quando houve a perda dos reflexos córneo-

palpebral e de retirada da pata traseira contralateral, ao estímulo doloroso por

preensão digital. Quando necessário, foi utilizado dose complementar de anestésico,

correspondendo à metade da dose inicial.

Em seguida, realizou-se a tricotomia e antissepsia com álcool a 70% da

região abdominal e procedeu-se a hidratação com soro fisiológico a 0,9%, em

volume correspondente a 80mL/Kg do peso corpóreo. Nesse momento, foi feito o

sorteio do procedimento a ser realizado nos animais alimentados com ou sem dieta

DMC: anestesia e laparotomia, I/R ou I/R e tratamento com NAC.

Os animais foram fixados com fita crepe na bancada cirúrgica sobre colchão

térmico a 38oC e, utilizando-se o microscópio cirúrgico nos aumentos 6 a 16 vezes

bem como instrumental microcirúrgico apropriado, foram então submetidos ao

procedimento sorteado.

Para a realização da I/R hepática seletiva, foi ocluído o pedículo hepático

acima da emergência dos ramos dos segmentos lateral direito, lobo caudado e

processo papilar com clampe vascular microcirúrgico durante 30 minutos (Figura 2),

seguido de 24 horas de reperfusão. Nos animais dos grupos apropriados, a NAC foi

administrada lentamente na veia cava abdominal, na dose de 150 mg/kg de peso

corporal, 15 minutos antes da isquemia.

A parede abdominal dos animais foi suturada em dois planos – peritônio-

músculo-aponeurótico e pele –, ambos com fio de polipropileno 7-0. Ao término do

procedimento e recuperação da anestesia, os camundongos foram mantidos em

gaiolas e receberam água e ração ad libitum.

38

Figura 2 – Fotografias da cavidade abdominal e do pedículo hepático clampeado dos

camundongos

Para a realização do procedimento operatório, foi utilizado microscópio cirúrgico nas magnif icações de (A) 10x e (B, C e D)

16x. As imagens obtidas durante a cirurgia dos animais mostram (A) a cavidade abdominal após a laparotomia; (B) o fígado do camundongo em condições normais; (C) o pedículo hepático ocluído com clampe vascular microcirúrgico; e (D) a isquema parcial (70%) no fígado dos camundongos, evidenciada nos lobos medial direito (LMD), medial esquerdo (LME) e lateral esquerdo (LLE).

Os animais foram novamente anestesiados, após 24 horas, e reoperados

para coleta de soro e remoção cirúrgica do fígado para análise. Depois, foram

submetidos à eutanásia por exsanguinação, ainda sob anestesia. As carcaças foram

encaminhadas para descarte devidamente acondicionadas em sacos de cor branca

leitosa, etiquetados, conforme orientado na Cartilha de Orientação para Descarte de

Resíduo no Sistema FMUSP-Hospital das Clínicas.

A B

C D

LMD

LME

LLE

39

3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Após a remoção cirúrgica do fígado, uma parte do lobo hepático lateral

esquerdo do camundongo foi fixada em formol 10%, submetido ao processamento

histológico e emblocado em parafina. Os blocos foram posteriormente cortados com

espessura de 4µm em micrótomo Modelo RM2235 (Leica/Alemanha) e corados com

H/E.

Os cortes foram, então, avaliados em microscópio óptico Modelo Imager.A2

(Zeiss/Alemanha) por examinador que desconhecia o grupo ao qual pertencia o

animal, em parâmetros definidos por Kleiner e colaboradores (2005)164, conforme

segue no Apêndice A.

Após essa análise, o material foi fotografado com câmera Modelo AxioCam

MRc (Zeiss/Alemanha) acoplada ao microscópio citado, e as imagens foram

trabalhadas no software AxioVision LE (Zeiss/Alemanha).

3.5 DOSAGEM BIOQUÍMICA DE TRANSAMINASES

O sangue foi coletado por punção cardíaca com seringa hipodérmica de 1mL

e agulha de 25 x 0,60 descartáveis, foi centrifugado a 956g por 15 minutos a 4°C, e

o soro foi coletado, congelado em nitrogênio líquido e mantido em freezer -80°C para

a análise de ALT e AST, realizada no Núcleo Multiusuário do Laboratório de

Análises Especiais da FMUSP.

3.6 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA AS DOSAGENS DE CITOCINAS, TBARS E

NITRITO

A porção do tecido hepático dos camundongos que não foi utilizada para o

processamento histológico (item 3.4), foi congelada em nitrogênio líquido e

armazenada em freezer -80°C. Posteriormente, uma parte desse tecido hepático foi

homogeneizada em tampão PHEM 1X, pH 7.2 – para a dosagem de citocinas – e

outra parte em tampão fosfato, pH 7.2 – para as dosagens de TBARS e nitrito –

todos na concentração de 100mg/mL.O sobrenadante coletado foi armazenado em

freezer -80°C até o momento da realização dos testes experimentais citados.

40

3.6.1 Dosagem de citocinas

A dosagem de citocinas no tecido hepático foi feita por meio do Ensaio

Imunoenzimático (ELISA do tipo sandwich). Essa técnica foi realizada conforme

instruções do fabricante do kit BD OptEIATM (BD Biosciences/EUA) para analisar a

expressão das citocinas IL-1β, TGF-β e IFN-γ no tecido hepático.

Placas de 96 poços foram incubadas com anticorpo de captura específico

para cada citocina, overnight a uma temperatura de 4°C. As placas sensibilizadas

foram lavadas com uma solução contendo PBS e Tween 20 a 0,05% e depois

incubadas com 200μL de uma solução de bloqueio composta de PBS e 10% de SBF

por um período de uma hora a temperatura ambiente.

As placas foram novamente lavadas e a elas foram adicionadas os

sobrenadantes do fígado dos camundongos e das diluições seriadas da curva

padrão; seguida da incubação por duas horas à temperatura ambiente – para a

quantificação da citocina TGF-β1, as amostras foram previamente tratadas com

ácido clorídrico (HCl) por uma hora e depois neutralizadas com hidróxido de sódio

(NaOH) a 1N. Após esse intervalo de incubação, as placas foram lavadas cinco

vezes e incubadas por uma hora à temperatura ambiente com uma solução

contendo anticorpo de detecção biotinilado, conjugado de estreptavidina ligada à

peroxidase e solução de trabalho (ver instrução do kit) – para a dosagem da citocina

IL-1β, as amostras e as diluições seriadas da curva padrão devem ser incubadas

primeiramente com o anticorpo de detecção, por uma hora, e depois com o

conjugado de estreptavidina-peroxidase, por 30 minutos. As placas foram lavadas e

incubadas com o cromógeno (TMB - Tetrametilbenzidina) por um período de 15 a 30

minutos, à temperatura ambiente e protegidas da luz. Após incubação, a reação foi

interrompida com ácido sulfúrico (H2SO4) a 2N e lida em espectofotômetro Modelo

ELx800TM (BIO-TEK/EUA), com filtro decomprimento de onda de 450nm.

3.6.2 Dosagem de TBARS

Uma alíquota do sobrenadante do tecido hepático homogeneizado foi utilizada

para a dosagem de proteínas totais pelo método de Bradford. As amostras foram

diluídas na proporção de 1:10, misturadas a 300µL do Reagente de Bradford e lidas

41

em espectrofotômetro Modelo TP-Reader (ThermoPlate/China), com comprimento

de onda de 595nm. Após a dosagem de proteínas totais, foi realizada a dosagem de

TBARS. Às amostras de fígado, também diluídas na proporção de 1:10, foram

adicionadas 250µL de ácido tricloroacético (TCA) a 17,5% e 250µL de ácido

tiobarbitúrico (TBA) a 0,6%, incubando a solução por 15 minutos em banho-maria a

95°C. Depois, 250µL de TCA a 70% foram acrescentados a essa solução,

mantendo-a incubada por 20 minutos a 4°C. A absorbância da solução final foi então

mensurada em espectrofotômetro Modelo TP-Reader (ThermoPlate/China), com

filtro de comprimento de onda de 534nm.

3.6.3 Dosagem de nitrito

Para quantificação de nitrito foi realizada a técnica do Reagente de Griess. O

limite de detecção para esse método é de 1,0 μM de nitrito.

Foram colocados 50 μL de cada amostra em uma placa de 96 poços,

juntamente com as diluições previstas no kit emtampão apropriado para produzir a

curva padrão. Em seguida, nos poços que continham as amostras biológicas e as

diluições seriadas da curva padrão foram adicionados 50μL do reagente de Griess,

anteriormente preparado com volumes iguais do componente A (N-(1-naphthyl)

ethylenediamine dihydrochloride) e do componente B (ácido sulfanílico), incubando a

placa por uma hora à temperatura ambiente. A amostra de referência fotométrica foi

preparada misturando-se 50μL do reagente de Griess e 50μL de água deionizada.

Após incubação, a absorbância das amostras foi medida em espectrofotômetro

Modelo ELx800TM (BIO-TEK/EUA), utilizando filtro de comprimento de onda de

548nm.

3.7 DETECÇÃO DE Bcl-2 POR IMUNOHISTOQUÍMICA

Para a imunomarcação da proteína Bcl-2, foi utilizada a técnica de

imunoperoxidase usando um kit comercial VECTASTAIN® ABC (Vector

Laboratories/EUA), seguindo instruções do fabricante com adaptações. Os cortes

foram incubados com ácido cítrico a 0,1M por 30 minutos em panela de pressão

para fazer a recuperação antigênica. Depois foram permeabilizados com uma

42

solução de Triton X100 a 0,5%, os sítios inespecíficos foram bloqueados em solução

contendo soro de cabra a 10%, soro fetal bovino a 10% e BSA a 3%; foram

incubados overnight em anticorpo primário, depois em anticorpo secundário por três

horas, a peroxidase endógena foi inativada com peróxido de hidrogênio a 0,3%, e

por fimos cortes foram incubados com o reagente ABC por uma hora.

As reações imunohistoquímicas foram reveladas com solução reveladora

DAB/níquel, e os cortes marcados foram montados entre lâmina/lamínula com

Entellan (Merk/Alemanha), analisados em microscópio óptico de campo claro

(Axiophot - Zeiss/Alemanha) e fotografados com câmera digital (AxioCam HRC -

Zeiss/Alemanha). Os anticorpos primário e secundário utilizados nos ensaios de

imunomarcação foram anti-Bcl2 policlonal (Novus Biologicals - EUA) e Reagente IgG

anti-cabra biotinilado (ThermoFisher Scientific - EUA), respectivamente.

3.8 DETECÇÃO DE APOPTOSE PELA TÉCNICA DE TUNEL

A presença de células apoptóticas foi investigada pelo método de marcação

de dUTP terminais em fitas simples de DNA mediadas por deoxinucleotidil terminal

transferase (TUNEL), em cortes histológicos com 4 µm de espessura. Foi utilizado o

In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche Applied Science/Alemanha) com a

finalidade de identificar morfologicamente as células em processo de apoptose via

marcação de fragmentos terminais de DNA (porção 3'-OH), caracteristicamente

relacionado com a fragmentação do DNA nuclear.

Os cortes foram desparafinizados em xilol, mergulhados em álcool absoluto e

em diluições decrescentes de álcool (95%, 90%, 80%, 70%, 50%) por cinco minutos

em cada solução. Depois, foram lavados em tampão fosfato com salina (PBS), pH

7.2, incubados em solução de proteínas k (20µg/mL) por 20 minutos à temperatura

ambiente, lavados em água destilada, e incubados em peróxido de hidrogênio a 2%

por cinco minutos. Para a recuperação antigênica, os cortes foram incubados em

solução de proteinase k, por 15 minutos à temperatura ambiente, e para bloquear a

peroxidase endógena, foi utilizada uma solução de H2O2 a 3% em metanol puro v/v,

incubando os cortes nessa solução por cinco minutos. Após lavagem com PBS, os

antígenos inespecíficos foram bloqueados com albumina bovina (BSA) a 1% e SBF

a 20% em tampão Tris a 0,1M, pH 7.5, por uma hora à temperatura ambiente. Os

43

cortes foram, então, permeabilizados com Triton X-100 a 0,2% em tampão citrato de

sódio, pH 6,0, durante 30 minutos, depois incubados na solução label (POD kit) por

duas horas, lavados com PBS e incubados com na solução converter (POD kit) por

30 minutos.

Em seguida, os cortes foram novamente lavados em PBS e incubados com o

substrato para peroxidase (3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate -

DAB) (Merck/Alemanha) para a revelação da técnica. Ao final, os cortes foram

montados entre lâmina e lamínula, o material foi analisado e fotografado com

câmera Modelo AxioCam MRc (Zeiss/Alemanha) acoplada ao microscópio Modelo

Imager.A2 (Zeiss/Alemanha), e as imagens foram trabalhadas no software

AxioVision LE (Zeiss/Alemanha).

3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores bioquímicos de transaminases, dos níveis de citocinas, TBARS e

nitrito, e o número de células apoptóticas estão expressos em média ± desvio

padrão. Para a análise estatística dos resultados foi aplicado o teste ANOVA one

way, pós-teste de Bonferroni, utilizando o software GraphPad Prism 5. Em todos os

testes foi utilizado o nível de significância em 5% (p<0,05).

44

4 RESULTADOS

45

4 RESULTADOS

4.1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Com a análise histológica, puderam ser observadas as diferenças entre os

grupos experimentais com relação à presença de vesículas de gordura e de focos

inflamatórios e à estrutura morfológica do hepatócito, após a ingestão ou não da

dieta DMC, e a associação dessa dieta com o procedimento de I/R.

Os animais do grupo Controle apresentaram fígado com arquitetura normal do

parênquima (Figura 3). Nos animais do grupo DMC observou-se esteatose hepática

macrovesicular panacinar de nível 3, com presença de inflamação lobular de nível 3

e inflamação portal (Figura 4). Já nos camundongos do grupo DMC-I/R (Figura 5A),

além dessas características mencionadas, foi evidenciada também a presença de

hepatócitos com baloneamento de nível 1 na maioria das lâminas avaliadas (Figura

5B).

No grupo DMC-I/R+NAC, foi observado que a maior parte dos camundongos

apresentou esteatose hepática macrovesicular periportal de nível 3, sendo possível

evidenciar uma diferença na extensão do parênquima comprometido, mas não no

grau de esteatose, quando comparado ao grupo DMC-I/R. Além disso, foi observada

uma redução da quantidade de focos inflamatórios no tecido hepático em quase

todos os animais do grupo DMC-I/R+NAC, em comparação aos animais do grupo

DMC-I/R, apresentando apenas inflamação lobular de nível 2. No entanto, foram

encontrados hepatócitos com baloneamento de nível 1 de forma similar ao grupo

DMC-I/R (Figura 6).

46


VCL = veia centrolobular; Tríade Portal: VP = veia porta, AH = artéria hepática, e DB= ducto biliar. Coloração por H/E, magnif icação 20x.

Figura 4 – Fotomicrografia do fígado de camundongos do Grupo DMC

As cabeças de seta em amarelo/preto mostram a presença de esteatose microvesicular e as setas em amarelo indicam esteatose macrovesicular. A área circulada em amarelo indica a presença de infiltrado inflamatório. VCL = veia centrolobular. Coloração por H/E, magnif icação 40x.

20μm20μm

VCL

VP

AH

DB

20μm

40μm

VCL

47

Figura 5 - Fotomicrografias do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R

Em (A) e (B), as imagens estão representadas com aumento de 40x. As cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a presença de esteatose microvesicular e as setas em amarelo indicam esteatose macrovesicular; a área circulada em amarelo indica presença de infiltrado inflamatório; e a área circulada em preto indica baloneamento do hepatócito. VCL = veia centrolobular. Coloração por H/E, magnif icação 40x.

A

40μm

B

40μm

VCL

48

Figura 6 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R+NAC

As cabeças de seta em amarelo/preto mostram a presença de esteatose microvesicular e as setas em amarelo indicam esteatose macrovesicular. A área circulada em amarelo indica a presença de infiltrado inflamatório e a área circulada em preto

destaca o baloneamento do hepatócito. VCL = veia centrolobular. Coloração por H/E, magnif icação 40x.

4.2 ANÁLISE BIOQUÍMICA DAS TRANSAMINASES

A partir da análise bioquímica realizada no soro dos camundongos, foi

possível observar diferenças nas concentrações de AST e ALT entre os grupos

experimentais avaliados, que podem estar relacionadas à presença ou não de lesão

no tecido hepático.

A avaliação de AST mostrou que os animais do grupo DMC-I/R e DMC-

I/R+NAC apresentaram níveis significantemente maiores que os animais do grupo

Controle e DMC. Ao comparar os níveis de AST dos camundongos do grupo DMC-

I/R e DMC-I/R+NAC, foi observada uma redução nos animais que foram tratados

com a NAC (Gráfico 1, Tabela 1).

Foi observada uma redução dos níveis de ALT nos camundongos do grupo

DMC-I/R+NAC em relação ao grupo DMC-I/R, porém, sem significância estatística.

VCL

40μm

49

Também pode ser observado que os camundongos do grupo DMC apresentaram

níveis elevados de ALT em relação aos animais do grupo Controle, mostrando assim

a presença de lesão no tecido hepático relacionada à esteatose, e redução dessa

transaminase nos grupos DMC-I/R e DMC-I/R+NAC em comparação ao grupo DMC

(Gráfico 2, Tabela 1).

Gráfico 1 – Níveis de AST no soro dos camundongos dos grupos experimentais,

expressos em média ± desvio padrão

DMC = grupo de animais alimentados com dieta deficiente em metionina e colina; DMC-I/R = grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática; DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína.

* = p<0,05, ** = p<0,01 e *** = p<0,001.

50

Gráfico 2 – Níveis de ALT no soro dos camundongos dos grupos experimentais,



*** = p<0,001.

Tabela 1 – Valores de AST e ALT no soro dos camundongos, expressos em média

± desvio padrão

DMC = grupo de animais alimentados com dieta deficiente em metionina e colina;

DMC-I/R = grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática; DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. AST: * = p<0,05 Controle vs DMC-I/R+NAC e DMC vs DMC-I/R+NAC, # =p<0,01 DMC-I/R vs DMC-I/R+NAC, § = p<0,001Controle vs DMC-I/R, DMC vs DMC-I/R;

ALT: § = p<0,001 Controle vs DMC, DMC vs DMC-I/R e DMC vs DMC-I/R+NAC.

Controle DMC DMC-I/R DMC-I/R+NAC

AST 110 ± 55 168 ± 83 1086 ± 287§§ 551± 174*#*

ALT 19 ± 13 400 ± 120§ 128 ± 81 59 ± 51

51

4.3 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CITOCINAS

A lesão hepática causada tanto pela esteatose quanto pela I/R, provocou

inflamação no fígado, que pode ser evidenciada pela presença de mediadores

inflamatórios, tais como as citocinas.

Com relação aos níveis de IFN-γ no tecido hepático dos camundongos, não

foi evidenciada diferença na expressão dessa citocina entre os grupos experimentais

analisados, já que o IFN-γ apresentou concentrações semelhantes entre os grupos.

(Tabela 2).

No entanto, quando os níveis das citocinas IL-1β e TGF-β1 foram

comparados entre os grupos DMC, DMC-I/R e Controle, observou-se que a

presença de esteatose hepática, associada ou não à I/R, elevou a expressão dessas

citocinas. A IL-β também se apresentou elevada no grupo DMC em relação ao grupo

DMC-I/R+NAC. Além disso, pode ser observado que os animais do grupo DMC-

I/R+NAC apresentaram uma redução nos níveis de IL-1β e TGF-β1 em comparação

aos camundongos do grupo DMC-I/R (Gráficos 3 e 4, Tabela 2).

Gráfico 3 – Quantificação da citocina IL-1β no fígado de camundongo dos grupos

experimentais, expressos em média ± desvio padrão


DMC-I/R= grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática; DMC-I/R+NAC= grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. * = p<0,05, ** = p<0,01 e *** = p<0,001.

52

Gráfico 4 – Quantificação da citocina TGF-β1 no fígado dos camundongos dos

grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão


* = p<0,05, ** = p<0,01 e *** = p<0,001.

Tabela 2 – Valores das citocinas IL-1β e TGF-β1 no fígado dos camundongos,


DMC = grupo de animais alimentados com dieta deficiente em metionina e colina; DMC-I/R = grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática;

DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. IL-1β: * = p<0,05 DMC-I/R vs DMC-I/R+NAC, # =p<0,01 Controle vs DMC-I/R e § = p<0,001 Controle vs DMC, DMC vs DMC-I/R+NAC TGF-β1: * = p<0,05 DMC-I/R vs DMC-I/R+NAC, # =p<0,01 Controle vs DMC, e § = p<0,001 Controle vs DMC-I/R.


INF- 276 ± 15 294 ± 26 223 ± 38 314 ± 75

IL-1β 3433 ± 282 4668 ± 99§ 4318 ± 197# 3850 ± 645*§

TGF-β1 1385 ± 290 2863± 396# 3122 ± 420§ 2201± 247*

53

4.4 ANÁLISE DA QUANTIFICAÇÃO DE TBARS E NITRITO

A peroxidação lipídica é o processo de degradação oxidativa dos ácidos

graxos das membranas plasmáticas causado pelas ERO, que são resultantes do

estresse oxidativo, e pode ser detectada pela presença de TBARS. O estresse

oxidativo que causa a oxidação dos ácidos graxos pode ser proveniente da lesão

causada pela esteatose hepática e pela I/R, presente nos animais dos grupos

experimentais avaliados.

Os animais do grupo DMC-I/R apresentaram aumento nos níveis de TBARS

em comparação aos animais do grupo Controle e DMC. No entanto, quando a NAC

foi administrada nos animais do grupo DMC-I/R+NAC, os níveis de TBARS no tecido

hepático reduziram em relação aos camundongos dos grupos DMC e DMC-I/R

(Gráfico 5, Tabela 3).

Gráfico 5 – Quantificação de TBARS no fígado dos camundongos dos grupos



DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. * = p<0,05 e *** = p<0,001.

54

O estresse oxidativo induzido pela esteatose hepática e pela I/R, às quais os

animais desse estudo foram submetidos pode provocar, além da peroxidação

lipídica, a produção de nitrito – produto derivado da degradação do ON –, e ambos

são responsáveis pela morte celular e os danos progressivoscausados ao tecido

hepático.

Nesse estudo, foi observado aumento dos níveis de nitrito nos animais dos

grupos DMC-I/R e DMC-I/R+NAC, quando comparados aos animais do grupo

Controle, e nos animais do grupo DMC-I/R em relação aos do grupo DMC. No

entanto, a administração da NAC nos camundongos do grupo DMC-I/R+NAC

provocou redução nos níveis de nitrito em comparação aos animais do grupo DMC-

I/R (Gráfico 6, Tabela 3).

Gráfico 6 – Quantificação de nitrito no fígado dos camundongos dos grupos



DMC-I/R = grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática; DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. * = p<0,05, ** = p<0,01 e *** = p<0,001.

55

Tabela 3 – Valores de TBARS e nitrito no fígado dos camundongos, expressos em

média ± desvio padrão

TBARS: * = p<0,05 DMC vs DMC-I/R+NAC, § = p<0,001 Controle vs DMC-I/R, DMC vs DMC-I/R e DMC-I/R vs DMC-I/R+NAC; Nitrito: * = p<0,05 Controle vs DMC-I/R+NAC, # =p<0,01 DMC-I/R vs DMC-I/R+NACe § = p<0,001 Controle vs DMC-I/R, DMC vs DMC-I/R.

4.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE Bcl-2

A Bcl-2 é uma proteína que faz parte da família de proteínas que regulam os

eventos mitocondriais relacionados à morte celular por apoptose, atuando direta ou

indiretamente sobre a permeabilidade da membrana das mitocôndrias. A presença

dessa proteína no tecido indica a ação anti-apoptótica das células diante de uma

injúria.

No fígado de camundongos do grupo Controle, foi observada a presença da

proteína Bcl-2 em uma grande área do tecido hepático (Figura 7); enquanto que, nos

animaisdo grupo DMC, a área onde a proteína Bcl-2 foi marcada é menor que a do

grupo Controle (Figura 8). Assim como no grupo DMC, os camundongos do grupo

DMC-I/R apresentaram menor marcação de Bcl-2 no tecido hepático que no fígado

dos animais do grupo Controle (Figura 9). Entretanto, quando a NAC foi

admisnistrada nos camundongos do grupo DMC-I/R+NAC, a presença de Bcl-2 no

tecido hepático foi aumentada (Figura 10), em comparação aos animais dos grupos

DMC e DMC-I/R (Figura 8 e 9).


TBARS 1,0 ± 0,4 2,0 ± 1,0 7,3 ± 1,3§§ 0,4 ± 0,1§*

Nitrito 134 ± 21 250 ± 117 546 ± 108§§ 316 ± 49*#

56

Figura 7 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo Controle mostrando

a expressão de Bcl-2

A área selecionada em preto mostra a marcação para Bcl-2 em células hepáticas. Tríade portal: VP = veia porta, AH = artéria hepática e DB = ducto biliar. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 20x.

Figura 8 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC mostrando a

expressão de Bcl-2

As áreas circuladas em preto mostrando marcação para Bcl-2 em células hepáticas; as setas em amarelo apontam para a esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose microvesicular. VCL = veia centrolobular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 20x

VP

20 µm

AH

DB

VCL

20μm

57

Figura 9 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R mostrando

a expressão de Bcl-2

As áreas circuladas em preto mostram a marcação para Bcl-2 em células hepáticas; as setas em amarelo apontam para a

esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose microvesicular. VCL = veia centrolobular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 20x.


mostrando a expressão de Bcl-2

As áreas circuladas em preto mostram a marcação para Bcl-2 em células hepáticas; as setas em amarelo apontam para a

esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose microvesicular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 20x.

VCL

20μm

20μm

58

4.6 ANÁLISE DE NECROSE E APOPTOSE NO TECIDO HEPÁTICO

A morte celular por apoptose é resultado da produção de citocinas pró-

inflamatórias e de mediadores do estresse oxidativo, os quais, nesse trabalho, foram

derivados da esteatose hepática e da I/R induzida nos camundongos avaliados.

Na avaliação histopatológica do fígado, não foi evidenciada a presença de

necrose no tecido hepático dos camundongos pertencentes aos grupos de estudo.

Com relação à apoptose, foi observada diferença estatística em todos os grupos

experimentais analisados. Os camundongos dos grupos DMC, DMC-I/R e DMC-

I/R+NAC apresentaram maior quantidade de células apoptóticas que os animais do

grupo Controle (Gráfico 7, Tabela 4, Figuras 11, 12 e 13). Nos camundongos do

DMC-I/R, observou-se um número maior de células apoptóticas do que os animais

do grupo DMC; porém, ao administrar a NAC nos animais do grupo DMC-I/R+NAC,

o número de células apoptóticas reduziu em relação aos grupos DMC e DMC-I/R

(Gráfico 7, Tabela 4, Figuras 12, 13 e 14).

Gráfico 7 – Contagem de células apoptóticas no fígado dos camundongos dos

grupos experimentais, expressos em média ± desvio padrão


DMC-I/R = grupo destes animais, nos quais foi realizada a isquemia e reperfusão hepática; DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. * = p<0,05** = p<0,01e *** = p<0,001.

59

Tabela 4 – Contagem de células apoptóticas no fígado dos camundongos,



DMC-I/R+NAC = grupo destes animais nos quais se associou a N-acetilcisteína. * = p<0,05 DMC vs DMC-I/R+NAC, # =p<0,01 Controle vs DMC-I/R+NAC e DMC vs DMC-I/R, e § = p<0,001 C vs DMC, Controle vs DMC-I/R e DMC-I/R vs DMC-I/R+NAC.

Figura 11 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo Controle

apresentando apoptose

As setas em preto apontam para o núcleo de células hepáticas em processo de morte celular por apoptose. VCL = veia centrolobular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 40x.


TUNEL 37± 12 99 ± 10§ 135 ± 4#§ 71 ± 8*#§

VCL

40μm

60

Figura 12 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC apresentando

apoptose

As setas em preto apontam para o núcleo de células hepáticas em processo de morte celular por apoptose; as setas em

amarelo mostram a esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose microvesicular. VCL = veia centrolobular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 40x.

Figura 13 - Fotomicrografia do fígado de camundongos do grupo DMC-I/R


As setas em preto apontam para o núcleo de células hepáticas em processo de morte celular por apoptose; as setas em amarelo mostram a esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose

microvesicular. TP = Tríade portal. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 40x.

VCL

40μm

40μm

TP

61



As setas em preto apontam para o núcleo de células hepáticas em processo de morte celular por apoptose; as setas em amarelo mostram a esteatose macrovesicular; e as cabeças de seta em amarelo/preto apontam para a esteatose

microvesicular. VCL = veia centrolobular. Imunohistoquímica com revelação por DAB/níquel, magnif icação 40x.

40μm

VCL

62

5 DISCUSSÃO

63

5 DISCUSSÃO

Em nosso estudo, a NAC foi capaz de reduzir a inflamação, por meio da

diminuição dos focos inflamatórios e dos níveis das citocinas IL-1β e TGF-β1, e o

estresse oxidativo, por meio da redução dos níveis de TBARS e nitrito, no fígado de

camundongos com esteato-hepatite submetidos à I/R hepática. Além disso, a NAC

promoveu a diminuição da quantidade de células apoptóticas no tecido hepático

acometido com essas afecções.

A DHGNA é uma das doenças mais comuns no mundo, principalmente em

países nos quais o comportamento sedentário e a alimentação com alto teor calórico

são bastante evidenciados. Juntamente com a obesidade e a resistência à insulina,

as quais desempenham um papel fundamental na síndrome metabólica, a incidência

da DHGNA vem aumentando ao longo dos anos165,166. Estas afecções podem

agravar situações que requeiram cirurgia, eletiva ou de urgência, traumática ou não.

Em transplantes, tem se intensificado o uso de doadores limítrofes, nos quais

a esteatose é um dos fatores agravantes na lesão de preservação e de isquemia e

reperfusão167,168,169. Desta forma, o presente estudo foi pensado para avaliar uma

estratégia de diminuir as repercussões deletérias na associação da DHGNA com I/R,

baseando-se no controle dos fatores que provocam lesões no tecido hepático, como

a inflamação, o estresse oxidativo e a morte celular, os quais podem prejudicar a

recuperação de um paciente.

Para tanto, foi utilizado nesse trabalho um agente farmacológico de baixa

custo e fácil acesso, a NAC, que tem sido usado como antioxidante no tratamento da

intoxicação por acetaminofeno, bronquite, encefalopatias hepáticas, toxicidade por

metais pesados, entre outros enfermidades170. Quando metabolizada, a NAC torna-

se um precursor da glutationa e atua no sequestro dos radicais livres – responsáveis

pelo processo de morte celular nos diferentes tecidos –, protegendo o fígado do

dano oxidativo171,172. Sagias e colaboradores (2010) mostraram que o uso desse

agente antioxidante é vantajoso durante o isolamento de hepatócitos de doadores de

tecido hepático esteatótico173. A partir desse estudo, a NAC é agora utilizada nos

protocolos de processamento de hepatócitos de fígados com esteatose para

transplante de células. Segundo González e colaboradores (2009), a co-

administração de NAC, coenzima Q10 e MnTBAP, uma substância equivalente à

superóxido dismutase, aumentou a expressão das subunidades do complexo I do

64

canal de transporte de elétrons mitocondrial, e reduziu a produção de ERO, a

disfunção mitocondrial e a morte celular dos hepatócitos174. Wang e colaboradores

(2014) também demonstraram que o uso da NAC pode prevenir os mecanismos de

morte celular por apoptose e autofagia induzidas pela I/R175.

Esses estudos mostram o potencial da NAC na proteção do fígado contra os

danos causados tanto pela DHGNA quanto pela I/R, separadamente. Desssa forma,

consideramos que a NAC também poderia apresentar efeito protetor quando essas

duas afecções fossem associadas. Tal efeito foi confirmado em nosso trabalho, já

que a NAC reduziu a inflamação, o estresse oxidativo e a morte celular em

camundongos com esteato-hepatite submetidos à I/R hepática.

Uma das formas mais empregadas em trabalhos experimentais para a

compreensão das doenças que afetam humanos e a análise de uma possível

estratégia farmacológica para tais doenças é o uso de modelos animais. Em nosso

estudo, foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6J alimentados com

dieta DMC como modelo animal para desenvolver esteato-hepatite, sendo estes

posteriormente submetidos à I/R e tratados com NAC.

A escolha desse modelo foi baseada no fato de que os roedores são os

animais mais rotineiramente utilizados nas pesquisas de DHGNA. Além disso, a

linhagem de camundongos C57BL/6J machos é muito usada para simular algumas

doenças metabólicas ou desordens lipídicas em diferentes modelos experimentais,

tais como os de animais geneticamente modificados para desenvolver obesidade ou

aqueles em que a DHGNA é induzida por meio de dieta específica176.

Os animais geneticamente obesos, como os camundongos ob/ob,

apresentam ocorrência natural de uma mutação de ponto espontânea no gene da

Leptina (Lepob, ob/ob), levando à deficiência absoluta desse hormônio derivado de

adipócitos, o que resulta em hiperfagia e obesidade acompanhada de uma síndrome

semelhante a diabetes do tipo 2, na qual se observa intolerância à glicose e

hiperglicemia177. Além disso, Ohyama e colaboradores (2014) mostraram que esses

camundongos desenvolvem esteatose hepática, com níveis elevados de ALT no

fígado178.

Os camundongos alimentados com dieta DMC, por sua vez, apresentam

perda de peso, redução dos níveis de colesterol, triglicerídeos, glicose, insulina e

leptina, além de apresentarem esteatose hepática, inflamação lobular e

65

baloneamento dos hepatócitos179. Caballero e colaboradores (2010) afirmaram que,

nos animais com DHGNA induzida pela dieta DMC, a falta de metionina pode ser

responsável pela maioria dos efeitos deletéreis no fígado dos camundongos, tais

como, perda de peso, lesão hepatocelular, estresse oxidativo, inflamação e fibrose,

e a deficiência de colina foi a principal responsável pelo desenvolvimento de

esteatose hepática180.

Para definir o melhor modelo animal de DHGNA associada à I/R, realizamos

um estudo prévio, no qual foram avaliados a inflamação e o estresse oxidativo no

tecido hepático de camundongos ob/ob e de camundongos alimentados com dieta

DMC submetidos à I/R. Nesse estudo, observamos que os animais dos dois

modelos experimentais avaliados apresentavam o mesmo nível de inflamação,

porém, nos camundongos alimentados com dieta DMC observou-se níveis mais

elevados de AST, TBARS e nitrito no tecido hepático, após I/R, do que nos animais

ob/ob. Dessa forma, optamos por utilizar o modelo animal de DHGNA induzida pela

dieta DMC em camundongos C57BL/6J devido ter-se mostrado mais adequado para

avaliar a lesão de I/R em fígado com esteato-hepatite e estudar o efeito protetor da

NAC sobre essas afecções associadas.

A partir das avaliações histopatológicas foi observado que a NAC apresentou

efeitos benéficos em relação à reação inflamatória presente no fígado esteatótico

submetido à I/R hepática, já que promoveu a redução dos focos de infiltrado

inflamatório. A redução da inflamação no fígado foi observada por Samuhasaneeto e

colaboradores (2007), no qual foram utilizadas diferentes doses de NAC para avaliar

o efeito desse antioxidante em ratos com EHNA181. Winbladh e colaboradores

(2012), avaliando o efeito da NAC em porcos submetidos à I/R, observaram

diminuição da inflamação, evidenciada pela queda de leucócitos no tecido

hepático154. Esses trabalhos confirmam o efeito benéfico da NAC sobre a inflamação

no tecido hepático tanto na esteato-hepatite quanto na lesão de I/R. Em nosso

estudo, mostramos esse efeito protetor na associação das afecções.

Em nosso trabalho, também foram avaliados os níveis das transaminases

AST e ALT no soro dos camundongos pertencentes aos grupos experimentais

analisados, já que a dosagem de ALT e AST no soro é a técnica mais comum para

avaliar a presença de doença no fígado182.

66

De acordo com os nossos dados, foi observado que a presença de esteato-

hepatite associada à I/R promoveu o aumento do nível de AST no fígado dos

camundongos em relação aos camundongos que não sofreram algum tipo de lesão

no tecido hepático. Considerando o nível de ALT, o aumento significante dessa

transaminase no fígado dos camundongos foi evidenciado apenas na presença de

esteato-hepatite, quando comparado ao fígado dos animais que não sofreram lesão

hepática. No entanto, a NAC foi capaz de reduzir tanto os níveis de AST quanto os

de ALT - apesar desse último não ter apresentado significância estatística - no

fígado dos camundongos que apresentaram esteato-hepatite e sofreram lesão de

I/R, em relação aos animais que se encontravam nas mesmas condições, mas não

receberam a NAC.

Wang e colaboradores (2014) mostraram redução de AST e ALT após o uso

da NAC somente em fígado submetido à I/R175. Níveis de ALT reduzidos, após o

tratamento com NAC e resveratrol associados, foram observados em camundongos

com lesão hepática decorrente apenas da DHGNA induzida pela dieta DMC183. Em

nosso estudo, a diminuição de ALT e AST após o uso da NAC evidencia o efeito

benéfico desse antioxidante exógeno na associação de esteato-hepatite e I/R

hepática.

O fato de a redução de ALT não ter apresentado significância estatística com

o uso da NAC nos animais com fígado esteatótico e lesão de I/R hepática é devido a

intensa diminuição no nível dessa transaminase quando os camundongos com

esteato-hepatite são submetidos à I/R. Nasiri e colaboradores (2018) mostraram

essa redução dos níveis de ALT durante a regeneração do fígado de camundongos

submetidos à I/R184. Nesse trabalho, o nível de ALT aumentou com três horas de

reperfusão e reduziu a praticamente menos da metade com 24 horas, e após 4, 7,

14 e 28 dias, encontrava-se no mesmo nível do Grupo SHAM, mostrando que o

fígado consegue se regenerar rapidamente ao longo do tempo. Em nosso estudo,

entretanto, essa regeneração pode não ter sido o motivo principal da redução de

ALT no fígado. Os camundongos com esteato-hepatite apresentaram níveis

elevados de ALT, porém, a redução de ALT no fígado dos animais em que essa

afecção foi associada à I/R pode ser decorrente da exaustação do hepatócito que já

estava lesionado na ocorrência da esteto-hepatite.

67

Como consequência das injúrias causadas ao fígado, sejam elas provenientes

da presença de gordura ou da indução de I/R, o sistema imune do organismo

responde promovendo a inflamação no tecido hepático por meio da produção de

mediadores inflamatórios, tais como as citocinas185. Em nosso estudo foi observado

um aumento das concentrações das citocinas IL-1β e TGF-β1 tanto nos

camundongos que apresentaram somente esteato-hepatite quanto nos animais que

tinham a presença dessa afecção associada à lesão de I/R. No entanto, a expressão

de IFN-γ não apresentou alteração entre os grupos experimentais analisados.

A elevação de IL-1β no tecido hepático mostra o estado inflamatório do fígado

com DHGNA. Miura e colaboradores (2013) afirmaram em seu estudo que essa

elevação é decorrente da presença de ácido palmítico, um dos ácidos graxos mais

comuns encontrados em animais com esteatose186. Sadatomo e colaboradores

(2017), por sua vez, mostraram que a interação entre neutrófilos e macrófagos

promove a maturação de IL-1β e causa a inflamação derivada dessa citocina na I/R

hepática187.

Com relação ao TGF-β1, Seki e Schwabe (2015) afirmaram que a DHGNA

promove a produção dessa citocina no tecido hepático e esta induz a proliferação de

células estreladas, que são responsáveis pelo processo de fibrose no fígado188.

Yang e colaboradores (2014), por sua vez, afirmaram que a sinalização mediada por

TGF-β1 na DHGNA contribui para a morte de hepatócitos e para a acumulação de

lipídeos por meio da sinalização de Smad e produção de ERO, resultando no

desenvolvimento de EHNA189. Yu e colaboradores (2010) mostraram que em modelo

de transplante de fígado small for size ocorre a produção elevada de TGF-β1, sendo

essa citocina responsável pela fibrose no tecido hepático190.

Esses trabalhos corroboram com os dados obtidos em nosso estudo, pois

evidenciam o aumento IL-1β e TGF-β1 na presença de gordura no fígado ou na

indução de I/R hepática, o que pode intensificar o dano causado ao tecido hepático,

já que essas citocinas inflamatórias são capazes de induzir mediadores de estresse

oxidativo que provocam morte celular. Entretato, nosso estudo mostrou a elevação

de tais citocinas não somente na presença de esteato-hepatite, mas também na

associação dessa afecção à I/R.

Quando os animais com esteato-hepatite submetidos à I/R foram

administrados com NAC, as concentrações dessas citocinas no fígado foram

68

reduzidas em comparação aos animais em que a NAC não foi administrada.

Alexandropoulos e colaboradores (2017) mostraram o efeito benéfico da NAC sobre

a lesão hepática e renal causada por I/R intestinal em ratos ao observar a redução

da concentração de IL-1β e outras citocinas pró-inflamatórias191. El-Lakkany e

colaboradores (2016) mostraram que o uso associado da NAC com metformina no

fígado com DHGNA promoveu a redução da concentração de TGF-β e TNF-α, de

outros mediadores inflamatórios e de estresse oxidativo192. Em nosso estudo,

porém, a NAC isoladamente foi capaz de promover um efeito protetor no fígado com

esteato-hepatite submetido à I/R, por meio da redução das concentrações de ambas

as citocinas, IL-1β e TGF-β1.

Nakamura e colaboradores (2017) mostraram que, na lesão hepática de I/R, a

expressão de INF-γ foi aumentada, e com a ativação da sirtuina 1 pelo resveratrol,

antioxidante exógeno, sua expressão tornou-se reduzida193. Ellet e colaboradores

(2009) demonstraram níveis elevados de INF-γ em fígados esteatóticos submetidos

à isquemia e reperfusão194. Entretanto, em ambos os estudos a isquemia foi

diferente, ou mais prolongada193 ou total194, adicionando-se ainda que a dieta

hiperlipídica induziu DHGNA mais leve, atingindo a fase de esteatose. Estas

variações poderiam justificar os nossos achados, em que a associação da esteato-

hepatite com uma isquemia de curta duração e reperfusão prolongada não alterou a

concentração de INF-γ no fígado dos animais analisados de forma significante.

As citocinas inflamatórias em fígado esteatótico e/ou submetido à I/R são

responsáveis pela liberação celular de diversos fatores oxidantes no tecido hepático,

tais como as ERO e ERN195,196. Em circunstâncias normais, o fígado produz

quantidades fisiológicas de oxidantes, e essa produção é balanceada pela ação dos

antioxidantes naturais do organismo197. No entanto, o desequilíbrio entre as

quantidades de oxidantes e antioxidantes, denominado de estresse oxidativo, está

relacionadoà patogênese de uma série de doenças hepáticas198.

Os produtos aldeídos, que são gerados pela peroxidação lipídica nas

membranas celulares devido à ação das ERO sobre os ácidos graxos

poliinsaturados, têm uma meia-vida longa e são capazes de promover alterações

locais e sistêmicas199. O óxido nítrico, contudo, pode estar relacionado com a

sobrevivência ou a morte de células hepáticas. Por exemplo, o NO pode inibir a ação

das caspases, atuando diretamente nas vias apoptóticas200, ou pode inativar

69

moléculas de sinalização responsáveis por inibir os mecanismos de morte celular e

diminuir a transferência de elétrons na cadeia respiratória da mitocôndria no tecido

hepático201.

O aumento exacerbado do estresse oxidativo é consequência tanto da lesão

causada por I/R202,175 quanto daquela provocada pela esteato-hepatite203,204, sendo

este fato evidenciado em nossos resultados, quando foram observadas elevadas

concentrações de TBARS e de nitrito, nos animais que desenvolveram esteato-

hepatite e que foram submetidos à I/R.

Esse aumento nos níveis de TBARS e nitrito hepáticos pode ser explicado

pelo fato de que o estresse oxidativo na I/R induz a ativação e produção de

citocinas, prostaglandinas e moléculas de adesão, que promovem a inflamação, com

recrutamento de leucócitos, e consequentemente elevam a produção de agentes

oxidantes205. Na DHGNA, por sua vez, o estresse oxidativo está atribuído às

quantidades elevadas de ERO e ERN e peroxidação lipídica, que são gerados

durante o metabolismo dos ácidos graxos e são responsáveis pela morte celular no

fígado180. Outros trabalhos mostraram que o estresse oxidativo tem um papel

fundamental nos danos causados por I/R hepática ou por esteatose no fígado, e as

células de Kupffer são uma das responsáveis pelo aumento na produção de

mediadores inflamatórios nessas doenças206,207.

Em nosso estudo, ao ser administrada em camundongos com fígado

esteatótico submetidos à I/R, a NAC contribuiu para a diminuição acentuada das

concentrações de TBARS e nitrito, o que mostra o efeito benéfico desse agente

antioxidante na redução do estresse oxidativo diante das afecções em questão.

Sun e colaboradores (2014) mostraram que a NAC melhorou a lesão hepática

causada pelo estresse oxidativo do retículo endoplasmático após I/R, reduzindo a

concentração de TBARS e ERO208. Observaram ainda que a NAC foi capaz de inibir

a expressão dos genes GRP78, ATF4 e CHOP, que são característicos do estresse

oxidativo proveniente dessa organela. Hsieh e colaboradores (2014) demonstraram

que a NAC reduziu os níveis de TBARS e das atividades do NO em fígado

submetido à I/R209. Baumgardner e colaboradores (2008) observaram esse efeito da

NAC sobre os níveis de TBARS em ratos que desenvolveram DHGNA por meio de

dieta gordurosa administrada por via entereal total210. Nesses trabalhos, a redução

do estresse oxidativo promovida pela NAC foi verificada na lesão de I/R ou causada

70

por DHGNA, em nosso estudo, entretanto, esse resultado foi obtido na associação

de amabas as afecções hepáticas.

Fusai e colaboradores (2005) observaram que a NAC melhorou a lesão no

tecido hepático de coelhos submetidos à I/R quente, diminuindo as taxas elevadas

de ERO e ERN211. Nakano e colaboradores (1998), por sua vez, mostraram que o

uso da NAC pode evitar as lesões causadas por I/R fria em fígado esteatótico de

ratos, apresentando níveis mais elevados de glutationa nos animais tratados com

NAC212. Esses estudos corroboram com nosso trabalho no que diz respeito à

redução de ERO e ERN, porém, nos mesmos não foi analisado o efeito da NAC

sobre a inflamação e morte celular no tecido hepático com esteato-hepatite e

submetido à I/R.

O aumento dos níveis de ERO e ERN proveniente do processo inflamatório

no tecido hepático esteatótico e/ou submetido à I/R resulta na morte celular por

necrose213 ou apoptose214,215,216. A necrose é caracterizada pela tumefação de

células e organelas, rompimento de membranas e liberação de conteúdo celular que

provoca a ativação de fatores inflamatórios217. A necrose pode ser observada na

DHGNA218 ou na lesão de I/R com tempo prolongado de oclusão do pedículo

hepático, parcial ou total175,219. Em nossas análises histopatológicas não foi

observada a presença de necrose no tecido hepático esteatótico submetido à I/R,

provavelmente devido ao tempo de isquemia, que pode ter sido insuficiente para

causar necrose, e ao fato do clampeamento no fígado ter sido parcial. A morte

celular por apoptose caracteriza-se por retração celular, condensação da cromatina,

fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos220. A sinalização de

apoptose pode se iniciar tanto pela ativação de receptores de membrana221 quanto

por mecanismos em que há participação da mitocôndria. Nesse último evento, as

proteínas da família Bcl-2 estão intimamente envolvidas222.

A Bcl-2 é uma proteína pertencente à família de proteínas que regulam os

eventos mitocondriais relacionados à morte celular, atuando direta ou indiretamente

sobre a permeabilidade da membrana das mitocôndrias. Quando a expressão de

Bcl-2 está aumentada no fígado, a apoptose pode ser inibida nos hepatócitos223,224.

Em nossos resultados, foi observada a expressão aumentada de Bcl-2 no tecido

hepático de camundongos do grupo controle, que não sofreram lesão no fígado, em

contraste com a baixa expressão dessa mesma proteína no fígado dos animais com

71

esteato-hepatite, inclusive associada à lesão de I/R hepática. Esse dado está em

concordância com os resultados de contagem de células apoptóticas, nos quais

observou-se aumento das células apoptóticas nos camundongos com esteato-

hepatite, bem como nos animais que tinham essa afecção associada aos danos

causados por I/R hepática.

Nos camundongos com esteato-hepatite submetidos à I/R hepática, em que

se administrou NAC, a área marcada com Bcl-2 no fígado mostrou-se aumentada e

o número de células apoptóticas reduzido, em comparação àqueles com as mesmas

afecções, que não receberam a NAC. Resultados semelhantes foram encontrados

no trabalho de Shi e colaboradores (2018), no qual foi evidenciado o aumento da

expressão de Bcl-2 em fígado de ratos com esteatose tratados com microcápsulas

de carbono ativado de NAC (ACNAC), inibindo assim a apoptose dos hepatócitos218.

Wang e colaboradores (2014) demonstraram esse efeito, porém em camundongos

acometidos somente pelas lesões provenientes da I/R hepática e tratados com

NAC175. O efeito protetor da NAC em relação à morte celular tanto na DHGNA

quanto na lesão de I/R evidenciado nesses trabalhos foi mostrado em nosso estudo

quando as duas afecções estavam associadas.

A contribuição desse trabalho está em mostrar os efeitos benéficos da NAC

na presença de duas afecções associadas, esteato-hepatite e I/R. Esta avaliação

refere-se principalmente à atuação desse antioxidante exógeno sobre os danos

causados pela produção de mediadores inflamatórios, de estresse oxidativo e de

morte celular no tecido hepático. A partir desse trabalho, novos estudos podem ser

realizados para melhor avaliar o efeito protetor da NAC, analisando, por exemplo,

sua ação preventiva no desenvolvimento da DHGNA.

72

6 CONCLUSÃO

73

6 CONCLUSÃO

A NAC promoveu redução da resposta inflamatória, do estresse oxidativo e da

apoptose na lesão de isquemia e reperfusão hepática em camundongos com

esteato-hepatite induzida por dieta.

74

*De acordo com o Estilo Vancouver

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93

APÊNDICE

APÊNDICE A - Parâmetros histológicos, segundo Kleiner e colaboradores (2005)164,

utilizados para a avaliação histológica.

94

ANEXOS

ANEXO A - Parecer de aprovação do projeto pela Comissão de Ética em Pesquisa

da FMUSP

95

ANEXO B - Parecer de aprovação da mudança de pesquisador executante pela

Comissão de Ética em Pesquisa da FMUSP

96

ANEXO C - Composição da Dieta DMC

efeito da n-acetilcisteína sobre a inflamação, estresse ...... ferreira nc. efeito da...

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