Angela Maria Ramos Lobo

Alteração dos ritmos diários de temperatura e

atividade motora provocada pelo diabetes

induzido por estreptozotocina em ratos wistar

São Paulo

2013

Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Fisiologia Humana Orientador: Prof. Dr. José Cipolla-Neto Versão original

RESUMO

Ramos Lobo AM. Alteração dos ritmos diários de temperatura e atividade motora provocada pelo diabetes induzido por estreptozotocina em ratos Wistar. [dissertação (Mestrado em Ciências)] – São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2013.

Nos mamíferos, os núcleos supraquiasmáticos coordenam a ritmicidade biológica, regulando os ritmos circadianos e sazonais do organismo. A melatonina, hormônio produzido principalmente pela glândula pineal, é conhecida por ser um importante agente regulador dos ritmos endógenos, incluindo atividade motora (AM) e temperatura corporal (TC), sendo a sua produção influenciada por diversos fatores, como por exemplo, o diabetes mellitus tipo I (DM1). No rato, o DM1 promove a diminuição da TC, da AM e da síntese de melatonina, e o tratamento com insulina reverte tanto o efeito sobre a média da TC quanto sobre a síntese de melatonina, porem não reverte à diminuição da media da AM. No entanto, ainda não são conhecidos, nesse modelo experimental, os perfis diários da TC e da AM, marcadores do sistema circadiano. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos do DM1 sobre os ritmos de TC e AM, seus parâmetros rítmicos (MESOR, amplitude e acrofase), peso e glicemia, assim como as modificações resultantes dos tratamentos tardios e precoces com insulina (6U/dia) (INSt e INSp), melatonina (0,5mg/kg/dia) (MELt e MELp) ou ambos (INS+MELt e INS+MELp). Ratos Wistar (200-250g), implantados com um transmissor tiveram sua temperatura e atividade motora registradas com um sistema de telemetria durante 55 dias. Após uma semana de registro, o diabetes foi induzido com estreptozotocina (60mg/kg) e os animais divididos em seis grupos: INSt, MELt, INS+MELt iniciando os tratamentos após 33 dias de diabetes, e INSp, MELp, INS+MELp, tratados após de 3 dias da indução, passando por um intervalo de 15 dias sem tratamentos e restituídos por mais 15 dias. O grupo controle foi injetado com veiculo (tampão citrato).Trinta e três dias de diabetes levaram a ruptura do ritmo de TC junto com a redução da TC media, e a diminuição da AM com alteração do seu ritmo. Os tratamentos (INSt e INS+MELt) reverteram o quadro, sendo o INS+MELt mais eficiente. MElt restaurou apenas alguns parâmetros rítmicos, sendo mais eficiente sobre a AM. O grupo controle não apresentou modificações na TC nem na AM ao longo do experimento. Três dias de DM1 alteraram o ritmo da TC, mas não o de AM nem as medias de TC e AM. Os tratamentos precoces restauraram as alterações do diabetes no ritmo de TC. A interrupção dos tratamentos diminuiu as médias de temperatura e atividade e alterou parcialmente os ritmos. A restituição dos tratamentos melhorou o quadro diabético, porem diferente do controle. Esses resultados mostram que, além da hipotermia, a redução de peso, a hiperglicemia e a diminuição na media da atividade motora, o estado diabético leva a uma ruptura do ritmo diário de TC e uma forte alteração no ritmo de AM. Os tratamentos INSt e INS+MELt revertem os efeitos deletérios, sendo mais eficiente quando combinado com a melatonina. A MElt atenua os efeitos deletérios, sendo mais evidente na AM. A ação da insulina é mais rápida, mais duradoura e mais eficiente do que a melatonina, a qual tem melhor ação sobre a atividade, e essas melhoras são dependentes da continuidade dos tratamentos.

Palavras-chave: Ritmos biológicos. Diabetes. Temperatura corporal. Atividade motora. Insulina. Melatonina.

ABSTRACT

Ramos Lobo AM. Streptozotocin-induced diabetes disrupts body temperature and home cage activity daily rhythms in Wistar rats. [Masters thesis in Human Physiology] – São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2013. In mammals, body temperature (BT) and home cage activity (HCA) rhythms are two of the diverse rhythms in the body regulated by the circadian pacemaker located in the suprachiasmatic nuclei (SCN), and are considered “marker rhythms” of the circadian pacemaker. Melatonin, the pineal gland hormone, is a major regulator of the endogenous rhythms including BT and HCA. Its production is influenced by many factors, such as type 1 diabetes mellitus. In rats, T1DM leads to hypothermia and reduced melatonin synthesis and HCA; insulin treatment reestablishes normal BT and melatonin but not HCA. However, the BT and HCA rhythms, in this experimental model, remain unknown. The present work studied the effects of diabetes on the BT and HCA rhythms and the possible modifications resulting from early and late treatment with insulin (6U/day) (L-INS and E-INS), melatonin (daily 0.5mg/kg) (L-MEL and E-MEL), or both (L-INS+MEL and E-INS+MEL) on daily BT and HCA rhythms, its rhythmic parameters (MESOR, amplitude and acrophase), glycaemia and body weight on streptozotocin-induced (60mg/kg) Wistar rats (250g) for 55 days. After a week of control registration, diabetes was induced by a streptozotocin injection (60mg/kg) and the animals were divided in six groups: L-INS, L-MEL, L-INS+MEL, starting treatments after 33 days of diabetes, and E-INS, E-MEL, E-INS+MEL, treated after 3 days of diabetes for 15 days, with an interval of 15 days off treatments and then restored for 15 more days. Control group was injected with citrate buffer. Thirty tree days of diabetes led to hypothermia and loss of BT rhythm, reduced HCA and its rhythm altered. L-INS and L-INS+MEL treatments reverted to normal, being L-INS+MEL more efficient. L-MEL restored some of the rhythmic parameters but had no effect on body weight and glycaemia. BT and HCA rhythms were not modified in control group. Three day diabetes altered BT, but not HCA rhythms nor mean BT and HCA. All early treatments reverted alterations in BT rhythm; however E-MEL had no effect on body weight and glycaemia. Interruption of treatments reduced mean BT and HCA and altered their rhythms. Restitution of treatments attenuated the deleterious effects, but did not restore normal parameters. Taken together, T1DM leads to disruption of BT and alteration of HCA rhythms. Late treatments with insulin restore normal rhythms, being more efficient when combined with melatonin. Melatonin attenuates the deleterious effects, being more evident on HCA. Insulin effects are faster, last longer and are more efficient than melatonin, which are more evident in HCA, and these effects depend on the maintenance of the treatments.

Keywords: Biological rhythms. Diabetes. Body temperature. Home cage activity. Insulin. Melatonin.

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Ritmos biológicos

Os ritmos biológicos circadianos, ubíquos nos seres vivos, constituem uma

adaptação altamente eficiente uma vez que garantem a relação temporal entre os

seres vivos e seu meio ambiente, em geral sincronizada pelo ciclo claro escuro do

dia e da noite. Para isso, o sistema de temporização circadiana, organiza

temporalmente todos os processos fisiológicos e comportamentais de forma que os

sistemas funcionais no organismo se expressam com intensidades e qualidades

diferentes de acordo com a hora do dia, garantindo, assim, essa relação temporal

vital entre os seres vivos e seu ambiente, contribuindo com a sobrevivência

individual e da espécie (Cipolla-Neto, 1988).

A persistência da ritmicidade circadiana em um ambiente carente de pistas

externas sugere a existência de um sistema que mantém a organização temporal

interna, chamado de oscilador interno (Benstaali et al., 2001).

A capacidade do oscilador interno de ajustar sua frequência a dos ritmos

ambientais é chamada de sincronização. Os diversos ciclos ambientais capazes de

regular o período e a fase dos osciladores internos são chamados de Zeitgebers, em

alemão, “doador de tempo” (Zeit=tempo; Geber=doador), “sincronizadores”, ou

“agentes arrastadores” (Cipolla-Neto, 1988).

Para a maioria dos organismos, e principalmente os roedores, o agente

sincronizador mais importante é o ciclo claro/escuro, porem outros fatores

ambientais periódicos também podem cumprir o papel de agentes sincronizadores,

como a temperatura ambiental, os ciclos de disponibilidade de alimento, fatores

sociais, etc (Cipolla-Neto, 1988).

Apesar dos vários ritmos de um organismo estarem sincronizados entre si,

eles apresentam uma dispersão de fase ao longo do dia. Assim, diversos ritmos

biológicos exibem seus picos de máximo (hora do dia em que é mais provável que a

variável estudada atinja seu valor máximo na oscilação) em diferentes momentos do

ciclo de 24 h. No entanto, a relação de fase entre eles é estável, garantindo a

manutenção da ordem temporal interna circadiana (Cipolla-Neto, 1988). Isto significa

que os ritmos de sistemas e órgãos de um organismo mantêm relações de fase

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estáveis entre si e com o ciclo claro escuro ambiental (Marques, Menna-Barreto,

2003).

A nível sistêmico, a ritmicidade circadiana (circa = aproximadamente; diana =

referente a um dia) depende do oscilador central, capaz de impor sua frequência de

oscilação aos outros osciladores presentes no organismo. Os marca-passos

circadianos podem ser únicos como os núcleos supraquiasmáticos (NSQ) em

roedores, ou múltiplos, como os NSQ e a pineal em aves (Cipolla-Neto, 1988). O fato

dos osciladores centrais serem capazes de impor seu período aos osciladores

secundários caracteriza uma hierarquia funcional dentro da estrutura multioscilatória

dos vertebrados. A ablação neonatal dos NSQ em ratos elimina permanentemente

os ritmos de atividade locomotora e de ingestão de água, o que sugere que outras

áreas do cérebro não têm a capacidade de reorganizar e suprir a função

desempenhada pelos NSQ (Marques et al., 1997). Por outro lado, várias secreções

endócrinas podem, por sua vez, influenciar o período e a sincronização do oscilador

central. Isso indica que osciladores subordinados, como algumas glândulas

endócrinas, podem retroagir, modulando a função dos osciladores centrais. A

hierarquia da estrutura multioscilatória dos vertebrados mencionada acima depende

da modulação por retroalimentação dos outros osciladores periféricos para que se

dê a sua expressão funcional.

Em nível comportamental, a estrutura circadiana dos surtos de atividade e de

repouso é fundamental para observar as outras distribuições temporais. Atividade e

repouso são categorias definidas, em geral, a partir da observação comportamental.

Desta forma, distinguem-se da vigília e o sono, cuja caracterização básica provém,

principalmente, da análise de parâmetros fisiológicos (atividade elétrica cerebral,

muscular, ocular, parâmetros neurovegetativos, etc.). Nem sempre a categoria

atividade, comportamentalmente definida, corresponde a um estado fisiológico de

vigília; assim como o repouso comportamental nem sempre corresponde a estados

de sono, fisiologicamente definidos (Cipolla-Neto, 1988). Por outro lado, o ritmo de

temperatura é um dos diversos ritmos no organismo regulado pelo sistema oscilador

circadiano. Devido a sua robustez e a facilidade relativa para seu monitoramento, foi

estabelecido como um dos “ritmos marcadores” do marca-passo circadiano

(Hanneman, 2001; Kelly, 2006; Minors et al., 1996). Scheer et al. (2005)

descreveram um efeito dual dos NSQ na termorregulação de ratos, levando a

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diminuição da temperatura corporal durante a fase clara e ao aumento durante a

fase escura, independentemente da atividade motora. Além disso, os NSQ são

fundamentais para a determinação dos ritmos metabólicos tais como as mudanças

na glicemia, no cortisol e melatonina plasmáticos (Goncharova et al., 2005; Korkmaz

et al., 2009; la Fleur et al., 2001a,b; Peschke et al., 2006, 2007; Reiter et al., 2009).

Na década de 60 se acreditava que, em roedores noturnos, o aumento na

atividade durante a fase escura do ciclo claro/escuro poderia ser responsável pelo

pico diário da temperatura (Abrams, Hammel, 1965). Contudo, De Castro (1978)

concluiu que no rato a variação diária da temperatura central é produto do ciclo

diário de atividade e do ciclo diário do limite superior da termorregulação; o limite

inferior é mantido constante. Atualmente ainda está em discussão se os ritmos de

temperatura e atividade dos ratos são controlados pelo mesmo oscilador ou por

osciladores diferentes no NSQ.

1.2 Características dos ritmos circadianos

O termo ritmo biológico é aplicado a qualquer oscilação de uma variável

biológica, seja qual for o nível de organização considerado, que se repete com o

mesmo período. O período é então o intervalo de tempo em que um ciclo se

completa (Figura 1). Cada um dos valores que a variável assume durante um ciclo

define uma fase do ritmo. Apesar de fase significar cada um dos momentos de um

ritmo, esse termo é empregado para exprimir os estados de um processo ou de um

ciclo ambiental. Assim, no ritmo de atividade fala-se de “fase de repouso” e “de

atividade”; no ciclo de um dia, designa-se a “fase clara” e “escura”; no ciclo de

temperatura, distingue-se a “fase quente” da “fase fria” (Marques et al., 1997).

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Oscilação de uma função biológica hipotética ajustada a uma curva coseno e os parâmetros rítmicos que a definem. A duração do ciclo completo (período) é aproximadamente de 24 h. A amplitude é uma medida do grau de variação dentro da oscilação, ou seja, é a diferença entre o valor máximo (ou mínimo) e o valor médio. Fonte: Adaptado de Cardinali et al., 1994.

Para poder estudar a variável biológica desejada, são utilizadas funções

matemáticas como o ajuste da oscilação a uma função coseno, conhecido como o

método do Coseno ou Cosinor. Na curva ajustada, o valor médio da oscilação é

chamado de MESOR (Midline Estimating Statistic Of Rhythm), e a medida do tempo

transcorrido entre um instante de referencia e o instante no qual é maior a

probabilidade de ser encontrado o máximo é chamada de acrofase. A duração da

oscilação é definida como período e a medida do grau de variação dentro da

oscilação (entre o valor máximo ou mínimo e o MESOR) é chamada de amplitude.

Com esses parâmetros rítmicos (MESOR, amplitude, acrofase) e a curva ajustada é

possível definir qualquer função biológica no tempo. No caso das variáveis com

oscilação diária que estão sincronizadas ao ciclo claro-escuro, o período é definido e

de 24 h.

Um organismo sadio é caracterizado por um alto grau de ordem temporal na

sua organização circadiana, também chamado de acoplamento, entre os osciladores

Figura 1 – Parâmetros que definem uma oscilação circadiana.

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do organismo, que resulta em seu funcionamento coordenado ou ordem temporal

interna (Marques, Menna-Barreto, 2003). Os desvios desta ordem temporal interna

(desacoplamento) podem caracterizar uma doença crônica. Um indicador da

alteração cronobiológica consiste na diminuição da amplitude dos ritmos (Cardinali et

al., 1994).

A adaptação temporal envolve diversas etapas, todas elas mediadas pelo

oscilador interno, permitindo ao organismo organizar recursos e atividades antes da

ocorrência do momento em que sejam necessários (Pittendrigh, 1960). Assim, as

transições entre estados, como do sono à vigília ou do jejum à alimentação, na

verdade, são preparadas progressivamente, antes que o indivíduo acorde ou se

alimente. Por sua parte, também é observado esse fenômeno de antecipação nas

migrações sazonais.

1.3 Controle neural da síntese de melatonina

Em mamíferos, a informação das condições de luminosidade ambiental chega

às retinas sendo captada pelas células ganglionares e levada até a glândula pineal,

que na fase escura tem um aumento do seu produto de secreção, o hormônio

melatonina (Figura 2).

O sistema neural responsável pela síntese de melatonina envolve o núcleo

paraventricular (PVN), na sua porção parvicelular, que através de vias diretas e

indiretas, projeta-se sobre a coluna intermediolateral (IML) da medula espinhal. As

fibras pré-ganglionares simpáticas projetam-se sobre o gânglio cervical superior que,

por sua vez se projeta sobre a glândula pineal.

A produção de melatonina se dá de forma rítmica e circadiana devido a um

controle direto dos núcleos supraquiasmáticos sobre o PVN. Os NSQ orquestram os

ritmos circadianos através da informação temporal por vias neurais e humorais.

Nos mamíferos de hábito diurno, os NSQ modulam o sistema nervoso

autonômico e permitem o controle simpático do metabolismo, fenômeno do

amanhecer. Nesse momento, o conteúdo plasmático de epinefrina, norepinefrina, e o

cortisol estão elevados. O sistema de temporização circadiana faz com que, no

período de maior atividade e alimentação, os tecidos sejam mais tolerantes à glicose

além de aumentar a sensibilidade à insulina. No final dessa fase, as retinas são

expostas à escuridão e tem início o processo de síntese de melatonina pela glândula

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pineal. Ao mesmo tempo, os NSQ bloqueiam a tonicidade simpática e permitem o

controle parassimpático do metabolismo, fenômeno do entardecer. A presença de

luz durante a fase escura induz uma reação de alerta com mobilização do sistema

simpático, sendo este um efeito mascarador (neste caso, tratando-se de um

processo externo que produz a modificação da expressão do ritmo biológico, chama-

se mascaramento externo). Os NSQ inibem a secreção de melatonina da pineal e,

dependendo do momento da noite em que ocorre a foto-estimulação, atrasa o pico

da melatonina se for ao começo da noite ou adianta-o no dia seguinte se ocorrer no

fim da noite (Korkmaz et al., 2009). Dado que a melatonina é produzida sempre na

fase escura independente dos organismos serem de hábitos diurnos ou noturnos,

nesses últimos a regulação do metabolismo se da de forma inversa, ou seja, na fase

escura ocorre o controle simpático do metabolismo e na fase clara, o controle do

parassimpático do metabolismo.

Controle neural da síntese de melatonina, e as estruturas que participam desse processo. Fonte: Adaptado de Kormaz et al., 2009.

Figura 2 – Sistema de temporização do sistema circadiano na síntese de melatonina.

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1.4 Glândula pineal e melatonina

A melatonina, hormônio produzido pela glândula pineal, é sintetizada

exclusivamente na fase escura em resposta ao estímulo noradrenérgico proveniente

do gânglio cervical superior, que por sua vez está subordinado aos núcleos

paraventriculares hipotalâmicos. Esse sistema neural é temporizado

circadianamente pelos NSQ que, por sua vez, sincronizam-se ao claro-escuro

ambiental pela via retino-hipotalâmica. A síntese de melatonina envolve uma cascata

enzimática que começa na hidroxilação do aminoácido essencial triptofano pela

triptofano hidroxilase (TPH), gerando 5-hidroxitriptofano. Este por sua vez é

transformado em 5-hidroxitriptamina (serotonina) por uma descarbolixase

inespecífica de aminoácidos aromáticos. A serotonina é então N-acetilada pela

enzima arilalquilamina N-acetiltransferase (AANAT), gerando N-acetilserotonina, que

é transformada em melatonina pela hidroxindol-oxi-metiltransferase (HIOMT). A

secreção de melatonina dá-se por um mecanismo de difusão simples e por ser uma

molécula anfifílica difunde-se em meios aquosos ou lipídicos, não sendo

armazenada em vesículas. A vida média da melatonina circulante é de

aproximadamente 20 minutos em ratos, e sua metabolização periférica se dá

essencialmente pela transformação hepática (aproximadamente 90% da melatonina

circulante) em 6-hidroximelatonina que após conjugação com sulfatos (a maior parte)

ou com glucoronídeos é excretada na urina. No sistema nervoso central e na própria

glândula pineal a melatonina pode ser transformada em quinuraminas sob a ação da

2,3 indolamina dioxigenase (Castro Afeche, Cipolla-Neto, 2008).

A administração farmacológica de melatonina é capaz de sincronizar ritmos

circadianos em ratos em livre-curso (Rebolledo et al., 1983), e esse efeito depende

da integridade dos NSQ (Cassone et al., 1986). Parece claro que a melatonina atua

diretamente sobre os NSQ, pois a administração do hormônio durante a noite

subjetiva deprime a atividade metabólica do NSQ (Cassone et al., 1988) e provoca

deslocamentos de fase na atividade elétrica do NSQ in vitro (McArthur et al., 1991).

Além disso, Vanecek et al. (1987) e Reppert et al. (1988) encontraram uma alta

densidade de receptores de melatonina nos NSQ de roedores.

A duração das fases de claro e de escuro é fundamental para o

desencadeamento da resposta fotoperiódica e também para a regulação dos ritmos

diários. A duração da noite pelo organismo é avaliada a partir de um sinal humoral

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dado pela melatonina (Arendt, 1988, 1995; Armstrong, Redman, 1985; Brown et al.,

1981; Cardinali, 1981; Cardinali, Vacas, 1981; Goldman, 1983; Vollrath, 1981; Pevet,

1987; Reiter, 1983, 1987). A pineal nos mamíferos tem propriedades de transdutor

neuroendócrino, pois a informação fótica canalizada através de um sinal da via

simpática chega à glândula e regula a secreção de melatonina. A pineal é o principal

mediador da mudança fotoperiódica ambiental na preparação da resposta fisiológica

nos ritmos circanuais e um poderoso modulador dos ritmos circadianos. Ela é a

principal interface entre o ciclo claro/escuro ambiental e os sistemas nervoso central

e endócrino. Uma característica notável da bioquímica da pineal é a capacidade de

suas enzimas responderem imediatamente a mudanças fóticas ambientais,

apresentando uma atividade maior na fase escura e uma atividade inibida pela luz.

Essa regulação aloca a síntese de melatonina exclusivamente na fase escura,

proporcionando ao organismo um sinal circulante indicativo da duração da fase

escura (Cardinali, 1981; Honma et al., 1992).

É importante ressaltar que dentre suas ações, a melatonina promove a

sincronização das funções centrais (Gillette, Mitchell 2002) e periféricas (Alonso-Vale

et al., 2006, 2008; Lima et al., 1998; Picinato et al., 2002a), desempenhando um

papel importante no metabolismo energético, na ação (Anhê et al., 2004, Lima et al.,

1994) e secreção (Picinato et al., 2002a,b, 2008) da insulina, assim como na função

do tecido adiposo (Alonso-Vale et al., 2004a,b, 2005).

1.5 Diabetes

O diabetes mellitus é um grupo de doenças metabólicas crônicas que se

manifesta quando o pâncreas não produz insulina adequadamente ou quando o

corpo não consegue utilizar apropriadamente a insulina que produz e, portanto

impede que as células incorporem glicose do sangue e a use para convertê-la em

energia, ocorrendo em ambos os casos um aumento da glicemia. A condição

diabética está associada a dano em longo prazo em vários órgãos e sistemas de

todo o organismo (Federação Internacional de Diabetes, IDF, 2012). Existem

evidências que indicam que a destruição das células β do pâncreas (responsáveis

pela síntese e secreção da insulina), por meio de mecanismos autoimunes, seria a

causa predominante do diabetes mellitus de tipo I (Andersson et al., 2001).

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O diabetes mellitus constitui um problema de saúde mundial. A IDF (2012)

estima que 8% da população mundial padecem de diabetes (371 milhões de

pessoas). O número de mortes atribuídas ao diabetes em 2012 foi de 4.8 milhões.

Em 2007 a mesma instituição mostrou que no Brasil havia uma prevalência do

diabetes de 5.8% (6.913.300 pessoas) com idades entre 20-79 anos e estimou que

em 2025 haveria 11.4% de prevalência. Em 2012 os estudos da IDF mostraram que

existem 13.8 milhões de pessoas diabéticas no Brasil (IDF, 2012).

Em 1997, a Associação Americana de Diabetes (ADA) estabeleceu novos

critérios de classificação para cada tipo de diabetes e diagnóstico. Essa classificação

do diabetes inclui quatro classes clínicas (ADA, 2009):

Diabetes do tipo I (DM1) - que resulta da destruição das células β

pancreáticas, geralmente levando a uma deficiência absoluta de insulina,

pode ser de origem autoimune ou idiopática;

Diabetes do tipo II (DM2) - graus variados de diminuição da secreção e

resistência à insulina;

Outros tipos específicos devido a outras causas - defeitos genéticos da

função da célula β, defeitos genéticos da ação da insulina, doenças do

pâncreas exócrino (ex. fibrose cística) e indução por drogas ou produtos

químicos (como no tratamento da SIDA ou após transplante de órgão);

Diabetes gestacional – diabetes diagnosticada durante a gravidez.

Quando a hiperglicemia se torna crônica, o substrato que normalmente é

utilizado como fonte de energia se torna tóxico. Cronicamente, a alta concentração

de glicose é a maior causa de retinopatias, nefropatias, neuropatias e doenças

macrovasculares (Gul et al., 2008).

É por essa razão que o estudo de modelos em animais diurnos e noturnos

que permitam conhecer mais a respeito dessa patologia resulta de uma ajuda

inestimável.

A indução experimental do diabetes é feito por drogas químicas que agem

através da destruição seletiva das células β nas ilhotas pancreáticas. As principais

substâncias utilizadas são a estreptozotocina (STZ) e a aloxana, que podem induzir

tanto diabetes do tipo1 como diabetes do tipo II (Szkudelski, 2001). A STZ é uma

alquil-nitrosourea isolada a partir da bactéria Streptomycetes achromogenes. Devido

a sua semelhança com a glicose essa molécula entra seletivamente na célula β

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através do transportador de glicose GLUT2 (Karunanayake et al., 1976; Tjälve et al.,

1976). A ação intracelular tóxica da STZ é devido à atividade alquilante do seu

grupamento metil-nitrosurea, que transfere o seu grupo metil para a molécula de

DNA, resultando em fragmentação do DNA. Em resposta aos danos causados ao

DNA, a enzima poli-ADP-ribose polimerase (PARP) tem sua ativação aumentada,

resultando na diminuição de NAD+ e dos estoques de ATP. Essa depleção no

estoque de energia celular resulta em necrose das células β (Lenzen, 2008;

Rakieten et al., 1963).

Uma hipótese alternativa propõe que parte do efeito diabetogênico da STZ se

deve a sua capacidade doadora de óxido nítrico (NO), porém o agente alquilante

metil-metanosulfonato, que possui a maior toxicidade em células produtoras de

insulina, não é uma molécula doadora de NO, indicando que o NO não é um pré-

requisito para a obtenção da ação tóxica da família dos agentes alquilantes à qual a

STZ pertence (Delaney et al., 1995). O tratamento de ratos jovens com STZ produz

um estado diabético caracterizado pela perda de peso, polidipsia, poliúria, glicosúria,

polifagia, hipoinsulinemia e hiperglicemia (Hakim et al., 1997). A ação coletiva da

STZ resulta na destruição das células β e consequentemente na hipoinsulinemia e

hiperglicemia resultantes. (Szkudelski, 2001).

1.6 Diabetes, atividade motora, temperatura corporal e melatonina

Evidências na literatura mostram que o diabetes induzido por uma única

injeção de STZ é capaz de produzir modificações tanto na temperatura corporal,

quanto na média da atividade motora e na frequência cardíaca. Ele age diminuindo

os três parâmetros em curto prazo e perdura até dez dias após a injeção de STZ. O

efeito do diabetes experimental sobre esses parâmetros foi agudo, porém atingiram

um estado estável aproximadamente 10 dias após a indução do diabetes. A redução

na atividade precedeu as reduções no batimento cardíaco e temperatura corporal

(Howarth et al., 2005a, b).

Além disso, também existem evidências da ação do diabetes a longo prazo,

observadas em até 5 meses. Após 4 semanas da indução do diabetes, tanto a

atividade física, quanto a temperatura foram significativamente menores do que as

observadas nos animais controles. A glicemia permaneceu elevada mesmo após 22

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semanas da indução. Esses efeitos são parcialmente normalizados pelo tratamento

com insulina, em um período de três semanas (Howarth et al., 2005b). Em outro

trabalho do grupo de Howarth et al. (2006) foi demonstrado que o tratamento com

insulina foi capaz de reverter a diminuição da temperatura média mas não a

diminuição na atividade motora média provocada pelo diabetes. A captação de

glicose durante o tratamento com insulina produz substratos necessários para gerar

energia e promover o subsequente aumento da temperatura corporal (Howarth et al.,

2006). Além disso, o hipotireoidismo é uma doença associada com os modelos mais

comuns de diabetes (STZ e aloxana) (Katovitch et al., 1993; Rodgers et al., 1991;

Rondeel et al., 1992; Schroder-Van Der Elst, Van Der Heide, 1992; Sochor et al.,

1987; Sundaresan et al., 1984). Mais recentemente foi demonstrado que o diabetes

induzido por STZ provoca um verdadeiro hipotiroidismo (valores diminuídos de T3 e

T4 livres, junto com os sinais clínicos de hipotiroidismo, como frequência cardíaca

diminuída, intervalo Q-T aumentado e menor temperatura retal), além de uma queda

significativa na temperatura com oito semanas de diabetes, porém, não com duas

semanas. Foi demonstrada uma correlação negativa entre a glicemia e o conteúdo

de T3 e T4 livre. O tratamento com insulina preveniu todos os sinais de

hipotireoidismo e restaurou os conteúdos de T3 e T4 livre. Já o tratamento com T3

normalizou a temperatura, a frequência cardíaca e o intervalo Q-T, mas não teve

efeito sobre a glicemia. Esse dado sugere que esses efeitos observados nos animais

diabéticos seriam decorrentes do hipotireoidismo secundário ao diabetes induzido

pela STZ (Zhang et al., 2002).

Dados da literatura mostram que o diabetes experimental provoca uma

redução na síntese e nos níveis circulantes de melatonina. Outros dados também

mostram certa controvérsia, Herichová et al., (2005) não encontraram diminuição na

síntese de melatonina pineal em ratos Wistar após 7 dias de indução de diabetes

com uma única dose de STZ (100 mg/kg) e outro trabalho mostra concentração

aumentada de melatonina plasmática pós-indução com STZ (Peschke et al., 2008).

No caso de animais com diabetes tipo II, uma maior concentração de insulina está

acompanhada da redução de melatonina (Peschke et al., 2008). Contudo, dados do

grupo (Amaral, 2009) indicam que o diabetes induzido por STZ causa uma

diminuição (50%) na produção de melatonina pela glândula pineal. Essa perda não é

por necrose ou apoptose dos pinealócitos e reflete um desarranjo no metabolismo

28

pineal. A menor concentração de melatonina circulante pode ser um fator

contribuinte para o desenvolvimento da doença, não só por diminuir a capacidade do

organismo de combater o estresse oxidativo, mas também por provocar alterações

na organização rítmica circadiana e prejudicar o importante papel exercido pela

melatonina na potenciação da ação da insulina in vitro (Garcia et al., 2008).

Além disso, nosso grupo de pesquisa demonstrou que a insulina atua na

glândula pineal de ratos potencializando a síntese de melatonina dependente de

noradrenalina, através da regulação da atividade das enzimas envolvidas na síntese

de melatonina e que esse efeito de potencialização tem a participação da PI3K. Esse

efeito potencializador está restrito a dois períodos específicos da fase escura, um no

começo e outro no fim, portanto a glândula pineal apresenta duas janelas de

sensibilidade à ação da insulina durante a fase noturna, quando há a presença de

noradrenalina (Garcia et al., 2008, 2010).

Embora os efeitos da melatonina na modulação da glicemia em humanos não

estejam totalmente estabelecidos, pacientes com diabetes mellitus do tipo II (DM2)

apresentam uma diminuição no conteúdo plasmático de melatonina e um aumento

dos receptores de melatonina pancreáticos (Peschke et al., 2006; Tutuncu et al.,

2005). Além disso, Barone e Menna-Barreto (2011) demonstraram, em pacientes

com diabetes do tipo I, uma correlação negativa entre a hiperglicemia e a produção

de melatonina avaliada pela 6-sulfatoximelatonina urinária.

A diminuição da amplitude circadiana do sinal de melatonina endógena

(devido ao envelhecimento ou à luz durante a fase escura) pode resultar em um

aumento da massa corporal, da adiposidade visceral e as consequências

metabólicas adversas. Existem evidências na literatura de que a suplementação com

melatonina em ratos de meia idade consegue melhorar algumas respostas

reguladoras do metabolismo energético como a diminuição da massa corporal, da

adiposidade intra-abdominal, e das concentrações plasmáticas de insulina e leptina

sem alterar o consumo alimentar nem a adiposidade total, assim como aumentar a

temperatura corporal, a atividade física e o conteúdo plasmático de corticosterona,

que são características de indivíduos jovens (Rasmussen et al., 1999; Wolden-

Hanson et al., 2000; Zanuto et al., 2013).

A suplementação em horários inapropriados (durante a fase clara) pode

reduzir sua habilidade de controlar a massa corporal (Wolden-Hanson et al., 2000).

29

A suplementação no horário apropriado (na fase escura) pode potencialmente

funcionar como uma terapia ou prevenção para a resistência à insulina, o aumento

na gordura intra-abdominal e para patologias resultantes do envelhecimento

(Mendes et al., 2013; Rasmussen et al., 1999).

30

1.7 Justificativa

Com todas essas evidências descritas, ainda não é conhecido o efeito do

diabetes sobre o perfil diário da temperatura corporal, nem sobre o ritmo de atividade

motora. Sabe-se que na falta de insulina e consequentemente no desenvolvimento

do diabetes a síntese de melatonina diminui, sendo restaurada no tratamento com

insulina exógena. Além disso, o tratamento com insulina restabelece os parâmetros

metabólicos dos animais diabéticos. Por outro lado, e levando em consideração que

existe uma forte relação entre a melatonina, insulina e o metabolismo, é de suma

importância estudar os efeitos da insulina e da melatonina sobre os distúrbios

causados na ritmicidade de animais diabéticos, e se existe uma ação complementar

dos dois hormônios, assim como avaliar a ação desses hormônios em animais

tratados no inicio da doença.

94

6 CONCLUSÃO

Em conclusão, o diabetes do tipo I causa ruptura do ritmo diário de

temperatura corporal e severas alterações no ritmo de atividade motora, junto com

uma diminuição significativa da temperatura e da atividade média; quando a doença

é tratada, a insulina é capaz de restaurar o ritmo e reverter a hipotermia, porém não

tem efeito no ritmo da atividade; a melatonina não restaura o ritmo nem reverte a

hipotermia, mas restaura parcialmente o ritmo de atividade; o tratamento conjunto de

insulina e melatonina restaura completamente os ritmos e a temperatura e a

atividade média normal. Os tratamentos logo após o início da doença agem

precocemente prevenindo os efeitos deletérios do diabetes sobre os ritmos. A

melatonina atenua os efeitos deletérios e aumenta parcialmente a temperatura,

porém não é suficiente para manter o ritmo normal, tendo uma ação mais importante

sobre a atividade. A insulina e a melatonina agem de forma complementar,

resultando em um tratamento mais eficiente, quando administrados tanto de forma

precoce quanto tardia. Todos os tratamentos atuam de forma dependente da

continuidade dos mesmos, sendo os tratamentos precoces mais eficientes que

aqueles administrados quinze dias após interrupção.

95

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