Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Aldaíza Salomão Monteiro

Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose

Hepática com CCl4

São José dos Campos, SP

2006

Aldaíza Salomão Monteiro

Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose

Hepática com CCl4

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

Orientador: Prof. Dr. Wellington Ribeiro

São José dos Campos, SP

2006

FICHA CATALOGRAFICA

Autorizo, exclusivemente para Íins ecadêmicos e cientíÍicos, a

.eprodução total ou perciâl desta disserteção por procèssos

fotocopiedores ou por transmissão eletrônice.

o,o",,@*ffií**,,o

M774e Monteiro, Aldâiza SalomãoEfeitos do Laser de Baixâ Potência sobre um Modelo

Experimental de Cirrose Hepáticâ com QQlq. I AldaizaSaìomão Monteiro. São José dos Campos: Univap, 200ô.

56f.: i l.; 30cm

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programade Pós-graduação em Bìoengenharia do Instituto dePesquisa e Desenvolvimento-Universidade do Vale doParaÍba,2006.

1. Terapia a laser de baixa intensidade 2. CirroseHeDáticâ 3. Tetracloreto de Carbóno 4. ToxicidadeHepáticâ l. Ribeiro, Wellington ll. Monteiro, AldaízaSalomão

CDU: 621.375.826

13t'12t2006

Banca Exaniinadora:

i

"EFEITOS DO LASER DE BÂIXA POTÊNCIÁ SOBR.E TJM MODELO EXPERM{ENTAL DE

CIRROSE HEPATICA COM CCÌ,"

Aldaíza Salomão Monteiic

j

PÌof. Dr. R(bosEVELT ALVES DA sILvA (UNTVI

PÍof Dr. WDLLINGTON RIBEIRO (lNrVAP)-

Prof. Dra. VALERIA ABRÂNTES P, CARVALEO

Prol Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco

Dirçtor do IP&D - Univap

Efeitos do Laser de Baixa Potência sobre um Modelo Experimental de Cirrose

Hepática com CCl4

Resumo

A terapia com laser de baixa potência (TLBP) tem sido proposta como terapia reparadora da estrutura e função hepática em ratos parcialmente hepatectomizados. Entretanto os efeitos da TLBP sobre a cirrose hepática ainda não foram avaliados. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos da TLBP na função e estrutura do fígado após a indução da cirrose por tetracloreto de carbono (CCl4). Nós usamos ratos Wistar divididos em cinco grupos, Controle, CCl4, Veículo, TLBP, CCl4, e CCl4+TLBP. Os grupos CCl4 e CCl4+TLBP receberam 0.4g/kg, i.p., três vezes por semana durante 08 semanas. A TLBP consistiu em (pulso contínuo, comprimento de onda 830nm, 35mV, 2,5J/cm2 por ponto), 04 pontos por fígado, 71 segundos por ponto durante 15 dias. A análise histológica e a atividade enzimática do fígado (AST, ALT, ALP, GGT, LDH) foram avaliadas após a TLBP. A TLBP reduziu significantemente o aumento da atividade da AST e LDH induzidas pelo CCl4. TLBP também reduziu as lesões causadas pelo CCl4 demonstradas através da reparação da arquitetura hepática e do número de células de Kupffer. Os resultados sugerem que a TLBP apresenta efeitos regeneradores sobre estrutura e função hepática causados pela administração crônica do CCl4. Palavras-chave: laser de baixa potência, toxicidade hepática, cirrose hepática, CCl4.

Abstract

Low-level laser therapy (LLLT) has been purpose to regenerate liver structure and function in partially hepatectomized rats. However the effects of LLLT on hepatic cirrhosis have been not yet evaluated. The aims of this work were to evaluate the effects of LLLT on liver function and structure after CCl4-induced liver cirrhosis. Wistar rats divided in five groups Control, CCl4Vehicle, LLLT, CCl4 and CCl4+LLLT was used. CCl4 and CCl4+LLLT groups received 0.4g/kg, i.p., three times per week during 08 weeks. LLLT (continuous pulse, wave-lenght 830nm, 35mV, 2,5J/cm2 per point) 4 points for liver, 71 seconds per liver point for 15 days. Histological analysis and enzymatic liver activity (AST, ALT, ALP, GGT, LDH) were evaluated after treatment. LLLT significantly reduced the increased activity of AST and LDH enzymes induced by CCl4. LLLT also reduced the lesion on liver architecture and the number of Kupfer cells induced by CCl4. The results suggest that LLLT presents regenerative effects on liver function and structure followed by CCl4 chronic administration. Key Words: laser therapy, liver toxicity, hepatic cirrhosis, CCl4.

Sumário

1 Introdução 01

1.1 Laser de Baixa Potência ou Laser Não Cirúrgico 05

1.1.1 Laser de Baixa Potência e Regeneração Hepática 06

1.2 Cirrose Hepática e Tetracloreto de Carbono 06

1.3 Avaliação Bioquímica das Funções Hepáticas 08

2 Objetivos 16

3. Material e Métodos 17

3.1 Animais 17

3.2 Grupos Experimentais 17

3.3 Protocolo Experimental 18

3.3.1 Indução da Cirrose 18

3.3.2 Tratamento com Laser de Baixa Potência (Thera Laser®) 18

3.3.3 Anestesia, Sacrifício e Coleta de Tecido Hepático e Sangue 19

3.4 Determinações Bioquímicas para Avaliar a Função Hepática 19

3.5 Histomorfologia e Histomorfometria 20

4 Resultados 24

5 Discussão 34

5 Conclusões 40

Referências Bibliográficas 41

Anexo A (Comitê de Ética em Pesquisa)

1

1. Introdução

Cada vez mais têm crescido o número de estudos com o intuito de se

descobrir novas estratégias terapêuticas que sejam menos onerosas e mais

eficazes. Uma dessas novas estratégias é a utilização do laser de baixa e alta

potência, os quais têm sido utilizados com variados objetivos na área de saúde,

como por exemplo, em cirurgias dos olhos (LIMA et al, 2003), destruição de cálculos

renais (MARIANI, 2004), regeneração de feridas cutâneas (EBERLEIN et al, 2005),

no tratamento de diferentes tipos de dores (CHOW;BARNSLEY, 2005), no

tratamento de alguns tipos de câncer (BETLEJEWSKI et al, 2005) e como

estimulador de regeneração celular (KHADRA, 2005).

A palavra LASER significa “Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiation”, que traduzida para a língua portuguesa significa “Amplificação da Luz por

Emissão Estimulada de Radiação” (HARRIS, 1991). A tecnologia laser teve início em

1917, por Albert Einsten, a partir de sua Teoria da “Emissão Estimulada”, a qual se

baseia na Teoria Quântica, proposta em 1890 por Planck, a qual corrobora sobre a

quantidade de energia liberada pelo processo atômico. O primeiro laser foi

desenvolvido por Theodore Maiman, em 1960, nos laboratórios da Hughes, no

estado da Califórnia, EUA. O laser desenvolvido por Theodore produzia um raio de

luz vermelha com um cristal de rubi com comprimento de onda de 694,3nm

(GENOVESE, 2000). Em 1961, com o constante desenvolvimento dos lasers, Javan

e colaboradores desenvolveram um laser a gás (He-Ne) (GENOVESE, 2000).

A utilização do laser possui diversas aplicações, na área médica, entretanto, é

mais utilizado nos processos cirúrgicos e fisioterápicos (laserterapia) (BAXTER,

1991; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al, 2006). Diversos estudos

têm demonstrado que as interações dos diversos tipos de lasers com diferentes

2

tecidos biológicos resultam em efeitos térmicos, fotoquímicos e não lineares e que o

grau de interação entre laser tecido biológico é determinado pelo comprimento de

onda da luz do laser e pelas características ópticas de cada tecido (PINHEIRO et al,

1998; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al, 2006). Dessa forma, os

diversos tipos de lasers são absorvidos de maneiras diferentes pelos diferentes

componentes de tecidos biológicos, e algumas áreas do corpo, particularmente os

olhos podem ser afetados de maneira bastante prejudicial se apresentados a uma

irradiação laser. Quanto ao grau de periculosidade dos lasers, a American National

Standards Institute (ANSI), classifica os lasers de acordo com a potência de saída e

comprimento de onda. Essa classificação é dividida em quatro classes:

Classe 1 – lasers sem perigo, cuja potência não é percebida pelos olhos.

Exemplo: leitor de CD.

Classe 2 – lasers perigosos apenas para os olhos. Exemplo: leitor de código

de barras.

Classe 3a – lasers de média potência, perigosos se o feixe de luz for incidido

sobre os olhos através de lentes ópticas. Exemplo: ponteiras laser.

Classe 3b – lasers de média potência, perigosos se simplesmente forem

vistos diretamente. Exemplo: laser de diodo.

Classe 4 – lasers de alta potência ou laser cirúrgico, os quais causam dano

ocular não apenas por contato direto, mas também quando refletidos, sendo

danosos à pele e inflamáveis. Na prática cirúrgica, tem sido utilizado com objetivos

de cortar, vaporizar, coagular e esterilizar. Exemplo: laser de CO2.

A luz é um fenômeno ondulatório formado pelos fótons, que são pequenos

pacotes de energia eletromagnética. A energia eletromagnética propaga-se através

de ondas eletromagnéticas e são caracterizadas por seu comprimento de onda,

3

freqüência e energia. O comprimento de onda é a distância entre duas sucessivas

cristas do espectro eletromagnético, o que determina cor do espectro e é mensurada

em nanômetros. Os comprimentos de onda da energia laser apresentam espectros

variados, partindo do comprimento de onda ultravioleta (ondas curtas) até o

infravermelho longo (ondas longas). A amplitude de uma onda é a altura do topo da

crista indicando a força da onda. A freqüência é a medida do número de cristas que

passam por um determinado ponto durante o período de um segundo, e é expressa

em Hertz (Hz). A energia, mensurada em Joules (J), refere-se ao número de fótons

incidentes no alvo. A densidade de energia (DE) é a energia depositada por unidade

de volume, normalmente dada em Joules/cm3. A potência é a energia distribuída por

unidade de tempo e é normalmente apresentada em Joules/segundo ou Watts (W).

A irradiância é a potência por unidade de área, normalmente expressa em watts/cm2

(GENOVESE, 2000).

4

Figura 1 – Distribuição do Espectro Eletromagnético

Fonte:http://lasp.colorado.edu/cassini/images/Electromagnetic%2520Spectrum.jpg&imgrefurl

5

1.1 Laser de Baixa Potência ou Laser Não Cirúrgico

Os lasers de baixa potência emitem radiações eletromagnéticas de baixa

potência e possuem ação fotoquímica e fotobiológica, como por exemplos

analgésica, antiinflamatória e bioestimuladora (PINHEIRO et al, 1998; GENOVESE,

2000; MATERA et al, 2003; SANTANA-BLANK et al, 2005; COLLOMBELI et al,

2006). A terapia com laser de baixa potência utiliza porções do espectro visível e

infravermelho da luz, pois as primeiras pesquisas foram realizadas com lasers de

rubi, argônio e hélio-neônio, as quais pertencem ao espectro visível (DOIRON;

PROFIO 1985). Só recentemente, lasers de diodo semicondutor de arseneto de

gálio (GaAs) e arseneto de gálio e alumínio (GaAlAs) no espectro infravermelho têm

sido mais utilizados (TAM, 2005; NG et al, 2005). Inicialmente, os aparelhos de laser

desenvolviam uma potência de até 1mW, o que exigia um prolongado tempo de

aplicação. Atualmente, os aparelhos de laser desenvolvem uma potência entre 10 e

90mW, o que diminuiu significativamente o tempo de aplicação.

Um exemplo clássico de laser de baixa potência é o laser de hélio-neônio

(He-Ne), o qual surgiu na década de 70 e emite luz em torno de 630nm. Este tipo de

laser trabalha de modo contínuo ou intervalado (pulsado), a uma potência entre 01 e

10mW. Este laser pode ser aplicado diretamente ou através de fibras ópticas e seu

alcance ou capacidade de penetração é de 06 a 10mm, de acordo com sua potência

(POSTEN et al, 2005).

1.1.1 Laser de Baixa Potência e Regeneração Hepática

6

Os dados referentes aos efeitos da TLBP sobre o fígado demonstram efeitos

anti-inflamatórios, antioxidantes, aceleradores do processo mitótico, reparadores do

“status” energético celular e estimuladores da angiogênese (LIMA et al, 2000; LIMA

et al, 2001; KAO ; SHEEN, 2003; IAKIMENKO et al, 2004). Quando se trata da TLBP

na regeneração hepática, (LIMA et al, 2001) demonstrou que a TLBP acelerou a

regeneração hepática após a indução da cirrose hepática obtida por meio de

ligadura do ducto biliar comum por 04 semanas. Melo et al, (2005), também

demonstram uma melhora da regeneração e função hepática em ratos submetidos à

hepatectomia parcial, utilizando-se de parâmetros bioquímicos (teste de função

mitocondrial) e imunohistoquímicos (nível de regeneração celular por antígeno de

proliferação nuclear celular – PCNA). Por outro lado, Kao e Sheen, (2003),

demonstraram em cultura de células hepáticas de ratos Sprague-Dawley, que a

irradiação com o laser de baixa potência, aumentou a expressão de glutationa

reduzida e diminuiu o conteúdo de glutationa total, e aumentou os níveis de

peroxidação lipídica, indicando um aumento no estresse oxidativo, levando a danos

na estrutura e função do hepatócito.

1.2 Cirrose Hepática e Tetracloreto de Carbono

A cirrose hepática constitui no estágio final de diversas hepatopatias crônicas

de variadas etiologias (LIMA et al, 2001). A cirrose hepática é definida

histopatologicamente pela existência de nódulos de regeneração circundados por

pontes de tecido fibroso, caracterizando alteração estrutural difusa (GAYOTTO;

ALVES, 2001; LIMA et al, 2001). Classicamente, as cirroses hepáticas podem ser

classificadas através de três aspectos: morfológicos (1), etiológicos (2) e clínicos (3).

6

7

De acordo com os caracteres morfológicos, a cirrose pode ser classificada em

micronodular, macronodular ou mista. A cirrose micronodular é caracterizada pela

presença de septos fibrosos espessos e regulares que envolvem pequenos nódulos,

com discreta variação de tamanho, até um máximo de 3mm de diâmetro (GAYOTTO

; ALVES, 2001). A cirrose macronodular é caracterizada pela presença de septos

fibrosos espessos e regulares que envolvem nódulos de tamanho variados,

normalmente maiores que 3mm de diâmetro (GAYOTTO; ALVES, 2001). A cirrose

mista apresenta características micro e macronodulares, e é resultante de

processos regenerativos de cirrose micronodular (GAYOTTO; ALVES, 2001). Os

principais caracteres etiológicos da cirrose hepática são etilismo crônico, vírus

das hepatites B, C e D, congestão venosa crônica, obstrução de fluxo hepático

venoso, síndrome de Budd-Chiari, pericardite constritiva, doença venoclusiva,

colestase prolongada intra e extra-hepática, cirrose biliar primária e

secundária, colangite esclerosante primária, síndromes ductopênicas da

criança e do adulto, diversas alterações metabólicas, hepatite auto-imune,

drogas e medicamentos, agentes tóxicos, curto-circuito intestinal e cirrose

infantil da Índia. Cirroses de etiologias não conhecidas ou criptogênicas

preferencialmente acomentem mulheres idosas com função hepática razoavelmente

preservada (GAYOTTO ; ALVES, 2001). A classificação clínica mais conhecida e

utilizada divide a cirrose em compensada e descompensada. As compensadas são

caracterizadas pela ausência de grandes complicações, como colestase, ascite,

hemorragia digestiva e encefalopatia hepática, cujo surgimento é devido tanto à

insuficiência hepatocelular como à hipertensão portal (GAYOTTO ; ALVES, 2001).

O tetracloreto de carbono (CCl4) é uma potente droga hepatotóxica que

ocasiona dano hepático por intermédio de radicais livres formados durante a sua

8

metabolização: o triclorometil (CCl3) e o tricloro-metilperoxil (OOCCl3) (TOLEDO et

al, 1993; PERES et al, 2000). A indução do sistema de enzimas oxidativas, através

da administração de fenobarbital, intensifica a necrose hepática produzida pelo CCl4

(McLEAN et al, 1969; JIMENEZ et al, 1992). O primeiro estudo avaliando a cirrose

por CCl4 foi descrito por Cameron e Karunarate, em 1936. Este modelo permite, em

longo prazo, a obtenção de modificações histológicas e hemodinâmicas

características da cirrose hepática e da hipertensão portal, verificadas em humanos

e parece ser o mais apropriado para o estudo da formação da cirrose hepática e do

líquido de ascite. Na cirrose têm sido descritas alterações nos mecanismos

oxidantes/antioxidantes, que se encontra em desequilíbrio e contribuem em grande

parte para a necrose hepática (JIMENEZ et al, 1992; ALEYNIK et al, 1997; PEREZ

et al, 2000). Os produtos originários da peroxidação lipídica parecem estimular a

expressão dos genes responsáveis pela síntese de colágeno, um dos principais

componentes da fibrose (LOPEZ-NOVOA et al, 1976; LOUIS et al, 1998;

HELLERBRAND et al, 1999).

1.3 Avaliação Bioquímica das Funções Hepáticas

As enzimas Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina

Aminotransferase (ALT) catalisam a transferência reversível dos grupos amino de

um aminoácido para o a-cetoglutarato, formando cetoácido e ácido glutâmico

(GAYOTO; ALVES, 2001). Para que essas reações ocorram é necessário a

presença de uma coenzima denominada piridoxal fosfato. As reações catalisadas

pelas aminotranferases exercem papéis centrais tanto na síntese como na

degradação de aminoácidos. Além disso, como essas reações envolvem a

8

9

interconversão dos aminoácidos a piruvato ou ácidos dicarboxílicos, atuam como

uma ponte entre o metabolismo dos aminoácidos e carboidratos (TUTOR-CRESPO

et al, 2004). Essas aminotranferases estão distribuídas amplamente nos tecidos. As

atividades mais elevadas da AST encontram-se no miocárdio, fígado, músculo

esquelético, com pequenas quantidades nos rins, pâncreas, baço, cérebro, pulmões

e eritrócitos. A AST e a ALT são encontradas em abundância nos hepatócitos.

Assim, uma vez que haja uma lesão dos hepatócitos, estas enzimas são liberadas

para a circulação. A ALT é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito,

enquanto que 80% da AST dos hepatócitos estão presentes nas mitocôndrias

(GAYOTO; ALVES, 2001). Por este motivo, grandes elevações nos níveis séricos da

AST, quando associado com outros indicadores (bioquímicos e histológicos) de dano

hepático, podem representar dano mitocondrial dos hepatócitos. Em dano

hepatocelular leve a forma encontrada no soro é predominantemente citoplasmática,

enquanto em lesões mais graves há liberação da enzima mitocondrial, elevando a

relação AST/ALT ou Índice deRitis para Índice maior que 1. Na cirrose hepática,

principalmente no início do estabelecimento da cirrose, níveis de até 05 vezes os

limites superiores podem ser encontrados. Entretanto, normalmente os valores

diminuem para níveis próximos aos da normalidade após um longo período da

doença, devido a mecanismos adaptativos do fígado.

A Gama-glutamiltransferase (GGT) catalisa a transferência de um grupo

gama-glutamil de um peptídeo para outro peptídeo ou para um aminoácido

produzindo aminoácidos gama-glutamil e cistenil-glicina. Esta enzima está envolvida

no transporte de aminoácidos e peptídeos através das membranas celulares, na

síntese protéica e na regulação dos níveis de glutatião tecidual (ROSALKI 1975). A

GGT é encontrada no fígado, rins, intestino, próstata, pâncreas, cérebro e coração.

9

10

Apesar da atividade enzimática ser maior nos rins, a enzima presente no soro é de

origem, principalmente, do sistema hepatobiliar. No fígado, a GGT está localizada

nos canalículos das células hepáticas e, particularmente, nas células epiteliais que

revestem os ductos biliares (ROSALKI, 1975). A GGT está presente em grandes

quantidades no retículo endoplasmático agranular e, portanto, elevações em seus

níveis séricos quando associados a outros indicadores (bioquímicos e histológicos),

podem representar alteração ultra-estrutural ao nível do retículo endoplasmático

agranular.

A Fosfatase Alcalina (Falc) compreende um grupo de enzimas

fosfohidrolases que possuem atividade máxima em pH alcalino próximo de 10

(ROSS et al, 1951). Nestas condições, esta enzima catalisa a hidrólise de ésteres do

ácido fosfórico. Existem várias isoenzimas da Falc em praticamente todos os

tecidos, localizando-se na membrana celular (FISHMAN, 1974). Encontra-se em

maiores quantidades nas células do epitélio intestinal, ossos, fígado, túbulos renais e

placenta (GOLDFISCHER et al, 1964; HUGON; BORGERS, 1966). A concentração

sérica de Falc em animais jovens é 2 a 3 vezes maior do que em adultos (KAPLAN,

1972). Em gestantes, o aumento pode ser de 300% do normal, devido a sua

presença na placenta (HULSTAERT et al, 1973). A isoforma hepática da Falc, a

Falc-1, é a que predomina no plasma, fazendo com que esta enzima tenha maior

importância no diagnóstico da doença hepatobiliar, de forma que numa colestase,

por exemplo, quanto maior a atividade detectável de Falc, maior o grau de obstrução

biliar. Por outro lado, a isoenzima Falc óssea, Falc-2, também é encontrada no

plasma, juntamente com a Falc-1, obrigando, dessa forma, em casos de doenças

ósseas, o fracionamento dessas isoenzimas através do teste de estabilidade do 10

11

calor e pelo fracionamento eletroforético, uma vez que a isoenzima Falc-1 é termo

estável e a isoenzima Falc-2 é inativada pelo calor (MOSS, 1986).

A Lactato Desidrogenase (LDH) é uma enzima da classe das oxirredutases

que catalisa a reação reversível do lactato a piruvato, em presença da coenzima

NAD+ que atua como doador ou aceptor de hidrogênio. A LDH está presente em

todas as células do organismo, sendo mais abundante no miocárdio, fígado,

músculo esquelético, rins e eritrócitos. Os níveis teciduais de LDH são,

aproximadamente, 500x maiores do que os encontrados no soro e lesões nesses

tecidos provocam elevações plasmáticas significantes desta enzima. Isoenzimas da

LDH – devido à presença da lactato desidrogenase em vários tecidos, aumentos dos

teores séricos da mesma é um achado inespecífico. É possível obter informações de

maior significado clínico pela separação da LDH em cinco frações isoenzimáticas. As

isoenzimas da LDH são designadas de acordo com a sua mobilidade eletroforética.

Cada isoenzima é um tetrâmetro formado por quatro subunidades chamadas H para

a cadeia de polipeptídica cardíaca e M para a cadeia polipeptídica muscular-

esquelética. As cinco isoenzimas encontradas no soro são a LDH-1 (HHHH) (14 a

26% - miocárdio e eritrócitos), a LDH-2 (HHHM) (29 a 39% - miocárdio e eritrócitos),

a LDH-3 (HHMM) (20 a 26% - pulmão, linfócitos, baço e pâncreas), a LDH-4

(HMMM) (8 a 16% - fígado e músculo esquelético) e a LDH-5 (MMMM) (6 a 16% -

fígado e músculo esquelético). A hemólise produzida durante a coleta e/ou

manipulação de sangue, pode elevar as frações da LDH-1 e LDH-2 (CABAUD;

WRÓBLEWSKI, 1981).

As Proteínas Totais compreendem um grupo de proteínas plasmáticas, onde

as principais proteínas são, a albumina, as globulinas (a-1, a-2, ß e ?), e o

fibrinogênio. Essas proteínas estão envolvidas em inúmeras funções, como 11

12

manutenção da pressão osmótica e da viscosidade do sangue, transporte de

nutrientes, metabólitos, hormônios, fármacos e produtos de excreção, regulação do

pH sanguíneo, além de participação na coagulação. Diversos fatores, como por

exemplo, desidratação, transtornos gastrintestinais, renais, hemorragias, deficiências

nutricionais e hepatopatias podem elevar ou diminuir os níveis das proteínas totais

além dos limites da normalidade. Em estados de inanição, muita proteína de

reserva, especialmente dos músculos e do fígado, é degradada para servir de fonte

de glicose, ao mesmo tempo em que ocorre diminuição das proteínas totais do

plasma, provocando queda na osmolaridade plasmática, o que resulta em saída de

líquidos da corrente sanguínea para os tecidos (edema). Normalmente, dietas com

teores inferiores a 10% de proteínas causam diminuição dos níveis protéicos no

sangue.

A Albumina é a proteína mais abundante no plasma, perfazendo cerca de

50% do total das proteínas. É sintetizada no fígado (cerca de 120mg/kg diariamente)

e contribui com 80% da osmolaridade do plasma sanguíneo, consistindo também,

uma importante reserva protéica, bem como um transportador de ácidos graxos

livres, aminoácidos, metais, cálcio, hormônios e bilirrubina (GUYTON, 2002). A

albumina também tem função importante na regulação do pH sanguíneo, atuando

como ânion. As únicas causas do aumento da concentração de albumina plasmática

(hiperalbuminia) é a desidratação ou choque. A concentração de albumina

plasmática diminuída (hipoalbuminia) pode ocorrer em várias situações, como por

exemplo, em doenças hepáticas crônicas, na doença renal, em estados de

desnutrição, em infecções prolongadas, em queimaduras graves, ou em hemorragia

grave (WILKINSON, 1963). Quando os níveis de albumina estão diminuídos e os de

globulinas, particularmente de ?-globulina aumentados, podemos afirmar que uma 12

13

doença hepática crônica está estabelecida primariamente associada à uma

diminuição da síntese de albumina (WILKINSON, 1963).

As Globulinas são constituídas por um grupo de proteínas denominadas alfa-

1-globulina, alfa-2-globulina, beta-globulina e gama-globulina. Essas proteínas

desempenham inúmeras funções no organismo, mas principalmente no sistema

imunológico inato e adquirido. Constituindo a alfa-1-globulina, a alfa-1-antitripsina

responde por cerca de 90% dessas proteínas. A deficiência da alfa-1-antitripsina

está associada ao enfisema pulmonar e à cirrose hepática. Só é detectável pela

eletroforese quando homozigótica; os estados heterozigóticos só podem ser

identificados por técnicas imunoenzimáticas que também são utilizadas para

confirmação das deficiências homozigóticas. É uma das proteínas de fase aguda e

pode ser encontrada em outros fluidos orgânicos, como lágrimas, sêmen, bile e

líquido amniótico. Nos 10% restantes, estão a alfa-1-glicoproteína ácida, a

alfafetoproteína e outras proteínas. Os níveis se elevam nas doenças inflamatórias

agudas e crônicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a gravidez ou

estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento

da alfafetoproteína. As alfa-2-globulinas incluem a haptoglobina, a alfa-2-

macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente encontram-se alterações nessa

banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos

demais mesmo dentro da faixa de referência. Níveis elevados de alfa-2-

macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome

nefrótica. Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se

elevados em numerosas situações que levam à reação de fase aguda. Os níveis de

haptoglobina apresentam-se diminuídos nas hepatopatias graves, na anemia

megaloblástica, nas situações de aumento da hemoglobina livre, como na hemólise 13

14

de eritrócitos ou na reabsorção de grandes hematomas e na terapia com estrogênios

e corticóides. Os níveis de ceruloplasmina aumentam na estrogenioterapia e se

encontram diminuídos na doença de Wilson, na desnutrição, na síndrome nefrótica e

nas enteropatias com perda de proteína. As beta-globulinas são compostas pelas

beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento,

beta-2-microglobulina e antitrombina III. A redução dessa banda não é freqüente.

A anemia por deficiência de ferro leva ao aumento da transferrina. O hipotireoidismo,

a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se evidenciar

pelo aumento de colesterol e conseqüente aumento das beta-lipoproteínas (LDL). A

beta-globulina está freqüentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e

menos freqüentemente em alguns casos de hepatite. Quase sempre, está elevada

nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com

sobreposição ou fusão das bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre

nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na artrite

reumatóide. Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do

complemento podem ocorrer em hipertensão maligna, doença de Cushing,

poliarterite nodosa e carcinomas. As gamaglobulinas são compostas pelas

imunoglobulinas, predominantemente pela IgG. As imunoglobulinas A, M, D, E e

proteína C reativa encontram-se na área de junção beta-gama. A ausência ou a

diminuição da banda gama indica imunodeficiências congênitas ou adquiridas. O

aumento dessa banda sugere o aumento policlonal das gamaglobulinas associadas

a doenças inflamatórias crônicas, reações imunes, doenças hepáticas ou neoplasias

disseminadas. Bandas oligoclonais podem eventualmente ser observada em

infecções virais crônicas, em algumas infecções bacterianas como as pneumonias

por pneumococos e as hepatites crônicas ativas. Tuberculose, sarcoidose,

15

linfogranuloma venéreo e sífilis terciária são doenças crônicas que levam ao

aumento dessa banda. Artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e outras

colagenoses podem apresentar níveis normais à acentuadamente aumentados,

dependendo da fase de atividade da doença. Níveis aumentados também são

encontrados em linfomas malignos, doença de Hodgkin e leucemia linfocítica

crônica. Tipicamente, a macroglobulinemia de Waldenström e o mieloma múltiplo

exibem um pico homogêneo que pode ou não resultar do aumento total da área

gama. As hepatopatias cursam freqüentemente com aumento da banda das

gamaglobulinas. Na hepatite, verifica-se um aumento das beta e gamaglobulinas

com redução da albumina. Nas cirroses, o padrão mais sugestivo consiste na

elevação da gamaglobulina de base ampla, juntamente com a fusão da beta e da

gamaglobulina, sem a individualização dos picos da chamada ponte beta -gama.

Apenas cerca de 20% dos cirróticos apresentam a fusão completa, e cerca de 3%

apresentam a fusão parcial.

16

2. Objetivos

Verificar os efeitos de 15 dias de terapia com laser de baixa potência sobre a

estrutura e função do fígado de ratos tratados por 08 semanas com tetracloreto de

carbono.

17

3. Material e Métodos

3.1 Animais

Foram utilizados 72 ratos machos da linhagem Wistar, adultos jovens, obtidos

do biotério da Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), campus de Botucatu.

Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22° a 25°C),

umidade (50-70%) e luminosidade (12h/claro 12h/escuro). Os animais tiveram

acesso “ad libtum” a água e ração (Purina/Brasil).

3.2 Grupos Experimentais

Os animais foram distribuídos da seguinte maneira:

01 – Controle – 12 animais – administração de solução salina 0,9% (1ml),

intra-peritonial, com o objetivo de verificar os efeitos do estresse de manipulação dos

animais sobre o fígado.

02 – Veículo (Nujol®) – 10 animais – administração do veículo (oléo mineral)

da marca Nujol® (1ml), intra-peritonial.

03 – Laser – 08 animais – administração de salina 0,9% (1ml), intra-peritonial

e também da administração do laser conforme demonstrado no item 3.3 com o

objetivo de avaliar os efeitos do laser sobre um fígado normal de ratos.

04 – Tetracloreto de Carbono (CCl4) – 10 animais – administração intra-

peritonial de 0,4g/kg/dia peso corporal de CCl4, diluído na proporção de 1:6

(CCl4/veículo) em óleo mineral Nujol®.

18

05 – Tetracloreto de Carbono (CCl4) + Laser – 10 animais – administração

intra-peritonial de 0,4g/kg de peso corporal de CCl4, diluído na proporção de 1:6

(CCl4/veículo) em óleo mineral Nujol® somado à terapia conforme protocolo no item

3.3 Protocolo Experimental

3.3.1 Indução da Cirrose

Os grupos tratados com CCl4 receberam a dose de 0,4g/kg, via intra-

peritonial, três vezes por semana, durante 08 semanas.

3.3.2 Tratamento com Laser de Baixa Potência (Thera Laser®)

Vinte e quatro horas após o último dia da administração i.p. de CCl4, iniciou-se

o tratamento com o laser de baixa potência, o qual foi realizado durante quinze dias

consecutivos, com os animais acordados, sem nenhum tipo de anestesia,

transcutâneo, seguindo os seguintes parâmetros:

Tempo de Irradiação: 71 segundos por ponto.

Quantidade de Pontos: 04 pontos distribuídos no fígado, totalizando 4 minutos e 44

segundos, pulso contínuo.

Comprimento de Onda (?): 830nm.

Potência: 35mW.

Densidade de Energia: 2,5J/cm2 por ponto.

3.3.3 Anestesia, Sacrifício e Coleta de Tecido Hepático e Sangue

19

Os animais foram anestesiados com Ketamina (75mg/kg) e Xilazina

(40mg/kg). Uma vez anestesiados, foi realizada uma incisão na linha mediana, de 3-

4 cm, próximo do apêndice xifóide (laparatomia), onde foram coletados amostras de

sangue via veia cava inferior e todo o tecido hepático. O tecido hepático foi

imediatamente pesado, cortado e fixado em formol 10% durante 24 horas para

posterior processamento e análise histomorfométrica. Os 5ml de sangue foram

coletados e centrifugados a 3000rpm, e o soro foi utilizado para determinações

bioquímicas com o intuito de avaliar a função hepática.

3.4 Determinações Bioquímicas para Avaliar a Função Hepática

As determinações bioquímicas foram realizadas através de kits comerciais da

marca Analisa®, por meio de um espectrofotômetro Hitachi, modelo U-2001. Foram

avaliados os seguintes parâmetros:

3.4.1 Aspartato Aminotransferase (AST)

Realizado segundo o método descrito por (BERGMEYER, 1983).

3.4.2 Alanina Aminotransferase (ALT)

Realizado segundo o método descrito por (BERGMEYER, 1983).

3.4.3 Fosfatase Alcalina (ALP)

Realizado segundo o método descrito por (ROY, 1970).

3.4.4 Gamma-Glutamyltransferase (GGT)

Realizado segundo o método proposto pelo Expert Panel on Enzymes of the

Comisson of Standards of the IFCC, descrito por (BERGMEYER, 1983).

3.4.5 Proteínas Totais

20

Realizado utilizando-se o método descrito por (LOWRY, 1951).

3.4.6 Albumina

Realizado segundo o método descrito por (NOGUEIRA, 1990).

3.4.7 Globulinas Totais

Realizado pela diferença entre os valores de proteínas totais subtraídos os valores

de albumina.

3.4.8 Lactato Desidrogenase (LDH)

Realizado segundo o método descrito por (CABAUD ; WRÓBLEWSKI, 1981).

3.5 Análise Histomorfológica e Histomorfométrica

Após a coleta de todo o tecido hepático, o mesmo foi pesado, cortado e

imediatamente fixado em formol 10% por 24 horas. Após 24 horas de fixação os

cortes foram desidratados e diafanizados gradativamente em banhos de álcool,

começando em 50%, progredindo até o álcool absoluto 100%. Após a série de

banhos, os cortes foram tratados com substituto do xilol, para que a amostra do

tecido se tornasse translúcida. Assim, os cortes foram colocados em recipientes

adequados com Paraplast fundido por 24 hs para a impregnação do tecido. Após a

impregnação do corte histológico, foi realizada a inclusão do material, o qual foi

colocado num pequeno recipiente (fôrma de plástico para gelo) e coberto com o

Paraplast fundido por inteiro, e foi deixado para solidificar, formando um bloco

contendo o tecido. Os blocos contendo os tecidos foram cortados num micrótomo

(LEICA RM 2125RT), em fatias de 05 micrômetros os quais foram então embebidos

num meio adequado. Os cortes foram então colocados em lâminas de vidro com a

extremidade fosca (PERFECTA). A parafina foi removida dos cortes e o tecido foi re-

21

hidratado e corado. A coloração foi realizada utilizando-se os corantes

hidrossolúveis Hematoxilina de Harris-Eosina para análise quantitativa da arquitetura

hepática e qualitativa da inflamação. O Tricômico de Masson foi utilizado para a

avaliação qualitativa das áreas de fibrose através. Após a coloração o corte foi

novamente desidratado, para que a lamínula (PERFECTA) fosse fixada, utilizando

um meio de montagem permanente adequado (ENTHELLAN-MERCK). Após este

processo de montagem das lâminas, as mesmas foram fotografadas em microscópio

óptico trinocular Olympus, Modelo CH30. A análise morfométrica foi realizada no

mesmo microscópio utilizando-se uma ocular reticulada de 50 retas e 100 pontos de

área conhecida.

3.5.1 Análise Histomorfológica

Devido a limitações financeiras, não foi possível realizar a coloração com o

Tricrômico de Masson para cada um dos animais, por meio da qual gostaria de

quantificar as áreas de colágeno nas áreas fibróticas, realizando um estudo

morfométrico mais abrangente. Por esta razão, apenas três lâminas de cada grupo

experimental foram coradas com o Tricrômico de Masson, o que possibilitou apenas

uma análise qualitativa das áreas de fibrose, onde avaliamos 20 campos em

aumento de 200x por lâmina.

3.5.2 Análise Histomorfométrica

Para a realização da análise morfométrica foi utilizada uma ocular reticulada

de 50 retas e 100 pontos, para as seguintes análises:

22

3.5.2.1 Número de Binucleações (Taxa Mitótica), realizado segundo Silva

Júnior et al, (1991) e Lima et al, (2001)

Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se a TLBP

estimularia ou não a divisão dos hepatócitos. Utilizando-se as lâminas coradas com

H/E, num aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte,

do número de hepatócitos binucleados. Em cada um dos 10 campos analisados, a

área analisada correspondeu a 62500µm2.

3.5.2.2 Número de Hepatócitos

Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se a TLBP estimulou

ou não a hiperplasia hepatocitária. Utilizando-se as lâminas coradas com H/E, num

aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte, do

número de hepatócitos. Em cada um dos 10 campos analisados, a área analisada

correspondeu a 62500µm2.

3.5.2.3 Número de Células de Kupffer (macrófagos)

Esta análise foi realizada com o objetivo de verificarmos se o tratamento com

CCl4 aumenta a inflamação com predominância de macrófagos e também os efeitos

da TLBP sobre o recrutamento de macrófagos para a área inflamada. Utilizando-se

as lâminas coradas com H/E, num aumento de 400x, realizamos a contagem, em 10

campos para cada corte, do número de células de Kupffer. Em cada um dos 10

campos analisados, a área analisada correspondeu a 62500µm2.

23

3.5.2.4 Número de Células Perisinusoidais

Esta análise foi utilizada com o objetivo de verificar se uma hiperplasia destas

células ocorreria decorrente do tratamento com CCl4 e também da TLBP, uma vez

que as células perisinusoidais participam do processo de síntese de matriz

extracelular. Utilizando-se as lâminas coradas com H/E, num aumento de 400x,

realizamos a contagem, em 10 campos para cada corte, do número de células

perisinusoidais. Em cada um dos 10 campos analisados, a área analisada

correspondeu a 62500µm2.

22

24

4. Resultados

O gráfico 01 representa os níveis séricos da enzima AST.

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4 + Laser0

25

50

75

100

125

150

175 *U

/L

Gráfico 1- Representa os níveis séricos da AST em U/L. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa (p

25

O gráfico 03 representa os níveis séricos da enzima GGT

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.02.55.07.5

10.012.515.017.520.022.525.0

**

U/L

Gráfico 03- Representa os níveis séricos da GGT em U/L. Os valores representam a média

do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa quando comparados os grupos Controle

x CCL4 (p

26

O gráfico 05 representa os níveis séricos da enzima LDH

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0

25

50

75

100

125

150

175

200

225 *U

/L

Gráfico 05- Representa os níveis séricos da LDH em U/L. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A diferença estatística é significativa quando comparados os grupos Controle x CCL4 (p

27

O gráfico 07 representa os níveis séricos de Albumina

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

g/dl

Gráfico 07- Representa os níveis séricos de Albumina em g/dl. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.

O gráfico 08 representa os níveis séricos de Globulinas

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0

1.5

3.0

4.5

6.0

g/dl

Gráfico 08- Representa os níveis séricos de Globulinas em g/dl. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.

28

O gráfico 09 representa o número de Hepatócitos

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0

5

10

15

20

25

30

*N

° d

e H

epat

óci

tos/

62,5

mm

2

Gráfico 09- Representa o número de hepatócitos por 62,5mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística apresentou diferença significativa quando comparados os grupos Laser x Controle (p

29

O gráfico 11 representa o número de Células Perisinusoidais

Controle Veículo Laser CCL4 CCL4+Laser0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

N°

de

Cél

ula

sP

eris

inus

oida

is/6

2,5m

m2

Gráfico 11- Representa o número de células Perisinusoidais por 62,5mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística não apresentou diferença significativa quando comparados os cinco grupos experimentais.

O gráfico 12 representa o número de Células de Kupffer

Control Vehicle Laser CCL4 CCL4+Laser0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0*

N°

de C

élul

as d

eK

upff

er/6

2,5m

m2

Gráfico 12- Representa o número de células de Kupffer por 1mm2. Os valores representam a média do grupo e erro padrão. A análise estatística apresentou diferença significativa quando comparados os grupos Controle x CCL4 (p

30

A figura 13 (fotomicrografia com aumento de 400x) de um rato do grupo Controle. Coloração Tricômico de Masson.

As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático, as quais

demonstram normalidade na sua distribuição. Nesta fotomicrografia também

podemos verificar uma distribuição considerada normal do parênquima hepático.

A figura 14 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo Veículo. Coloração Tricômico de Masson.

31

As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático. A seta

verde aponta para uma célula de Kupfer. A seta laranja aponta para três células

Perisinusoidais. Nesta fotomicrografia também verificamos a normalidade tanto na

distribuição de fibras de colágeno do sistema porta quanto na arquitetura do

parênquima hepático.

.

A figura 15 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo Laser. Coloração Tricômico

de Masson

As setas brancas indicam as fibras colágenas do sistema porta hepático. A seta verde aponta para

uma célula de Kupfer. A seta laranja aponta para três células Perisinusoidais. Nesta fotomicrografia

observamos uma distribuição considerada normal de colágeno no sistema porta e também no

parênquima hepático.

30

32

A figura 16 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo CCl4. Coloração Tricômico

de Masson.

As setas brancas indicam os septos fibrosos no parênquima hepático, as quais apontam para uma

típica área de cirrose, caracterizada por nódulos de regeneração circundados por pontes de tecido

fibroso. As setas laranjas apontam para áreas de necrose.

A figura 17 (fotomicrografia com aumento de 200x) de um rato do grupo CCl4. Coloração Tricômico de Masson.

33

As setas brancas indicam as áreas fibrosadas do sistema porta hepático. Notar que nas áreas de

fibrose há presença de intenso infiltrado inflamatório.

A figura 18 (fotomicrografia com aumento de 100x) de um rato do grupo CCl4+Laser. Coloração Tricômico de Masson.

As setas brancas indicam áreas de fibrose. As setas laranjas indicam para o parênquima hepático,

que se apresenta reorganizado e íntegro quando comparado ao grupo CCl4. Notar que no

parênquima hepático não se encontram mais as áreas de fibrose como no grupo CCl4. Percebemos

também que as (poucas) áreas de fibrose não estão deterioradas como no grupo CCl4.

34

A figura 19 (fotomicrografia com aumento de 400x) de um rato do grupo CCl4+Laser. Coloração Tricômico de Masson.

As setas brancas apontam para áreas de fibrose no parênquima hepático, mas com colágeno

preservado. As setas laranjas indicam para o parênquima hepático, que se apresenta reorganizado e

íntegro quando comparado ao grupo CCl4.

35

5. Discussão

Em relação à enzima AST, os resultados demonstram que o método de

indução da cirrose hepática utilizado foi capaz de provocar alterações significativas

nos níveis séricos da AST quando comparados os grupos Controle x CCl4.

Entretanto, os valores obtidos da AST não se apresentaram tão elevados como os

demonstrado por outros autores (LIMA et al, 2001; KAMALAKKANNAN et al, 2005).

Acreditamos que esses resultados se devem à alta dose de CCl4 (0,4g/kg) e ao

longo período utilizado para a indução da cirrose (08 semanas), diferente daqueles

utilizados por outros autores, que utilizaram doses menores e períodos mais curtos

para a indução da cirrose hepática. Entretanto, utilizamos um protocolo mais longo

(08 semanas) com o intuito de encontrarmos mais acertadamente o estabelecimento

da cirrose em cada um dos animais dos grupos tratados com CCl4. Singer et al,

(1995), demonstraram que níveis séricos extremamente aumentados das

aminotranferases são encontrados principalmente em processos tóxicos agudos, e

que tendem a diminuir quando há uma cronificação da exposição ao agente tóxico.

Nossos resultados também demonstram que a TLBP, demonstrado através dos

valores do grupo CCl4+Laser foi capaz de diminuir significativamente os valores da

AST para níveis próximos da normalidade, sugerindo um efeito hepatoregenerador

da TLBP, particularmente no que diz respeito à função mitocondrial, uma vez que

80% da AST hepatocitária encontra-se na mitocôndria do hepatócito. Estes

resultados também corroboram com os dados sobre os efeitos da TLBP sobre a

função mitocondrial de fígados cirróticos obtidos por LIMA et al, 2001. Portanto,

sugerimos através dos resultados obtidos em nossos experimentos, que a TLBP

auxilia na restauração da função mitocondrial, por algum mecanismo ainda não

36

elucidado, e que este efeito restaurador parece ser benéfico e importante no

processo regenerativo do fígado cirrótico. Com o objetivo de verificar possíveis

alterações na distribuição e estrutura das mitocôndrias nos hepatócitos, estudos de

microscopia eletrônica de transmissão serão realizados.

Em relação à enzima ALT, quando comparados os grupos Controle x CCl4, os

resultados demonstram que o modelo de indução de cirrose hepática utilizado foi

capaz de elevar significativamente os níveis da ALT. Quando comparados os grupos

Controle x CCl4+Laser verificamos que a TLBP não foi capaz de reduzir a lesão

hepática demonstrada através dos níveis aumentados da ALT e ainda que a TLBP

piorou o dano hepático elevando ainda mais os níveis da ALT, o que foi confirmado

quando comparados os valores dos grupos CCl4 x CCl4+Laser, os quais

encontraram-se significativamente mais elevados no grupo CCl4+Laser do que no

CCl4. Estes resultados sugerem que a TLBP nas condições utilizadas piorou a

função hepática por mecanismo ainda não conhecido. Uma vez que a ALT

hepatocitária encontra-se principalmente no citoplasma e que para que ocorra um

aumento dos seus níveis séricos é necessário um dano na membrana celular, o qual

pode ser causado por um aumento no estresse oxidativo, realizaremos um estudo

imunohistoquímico para o “prostaglandina-like” 8-isoprostano (o mais sensível

marcador da peroxidação lipídica), com o objetivo de avaliar se a TLBP leva a

alterações nos componentes lipoprotéicos das membranas celulares (DEBASHIS et

al, 2000).

No estudo da GGT, os resultados demonstram que o modelo de indução de

cirrose hepática utilizado foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da

GGT. Os resultados também demonstram que a TLBP não melhorou a função

hepática por não diminuir os elevados níveis de GGT decorrentes da cirrose. Neste

37

caso, entretanto, a TLBP não piorou a função hepática, como ocorrido no caso da

ALT. Sendo a GGT uma enzima encontrada principalmente no retículo

endoplasmático agranular e nos canículos dos hepatócitos, podemos sugerir que a

TLBP, nas condições utilizadas, não produziu efeito benéfico na regeneração do

retículo endoplasmático agranular e na permeabilidade dos canalículos dos

hepatócitos (GIANNINI et al, 2001; 2005). Com o objetivo de verificar possíveis

efeitos do CCL4 e da TLBP na estrutura e distribuição do retículo endoplasmático

agranular e dos canalículos dos hepatócitos, um estudo ultraestrutural e

histomorfométrico da distribuição, possíveis congestões e do diâmetro dos

canalículos também serão realizados.

O estudo da FALC demonstrou que o modelo de indução da cirrose hepática

com CCL4 foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da FALC e que a

TLBP não foi capaz de reduzí-los. Dessa forma, os níveis aumentados da FALC

sugerem que a cirrose hepática induzida com CCL4 leva a dano na membrana

celular, uma vez que a FALC encontra-se na membrana celular e no epitélio dos

ductos biliares, e também que possivelmente existe um grau aumentado de

obstrução biliar, uma vez níveis aumentados de FALC representam este quadro

(SCHLAEGER et al, 1982; MOSS, 1997). Os resultados também sugerem que a

TLBP não foi capaz de proporcionar a regeneração da membrana dos hepatócitos e

também dos canalículos biliares, possivelmente lesados devido ao tratamento com

CCL4.

Os níveis séricos da LDH demonstraram que o modelo de indução da cirrose

hepática foi capaz de elevar significativamente os níveis séricos da LDH, o que,

segundo a literatura, indica um processo isquêmico hepático (SECTO et al, 2000).

Os resultados demonstraram também que a TLBP foi capaz de diminuir os níveis

38

séricos da LDH, provavelmente através da diminuição da isquemia, o que será

verificado posteriormente através de um estudo histomorfométrico dos vasos e

canalículos hepáticos.

Em relação à síntese hepática de proteínas, os resultados demonstram que o

modelo de indução da cirrose hepática utilizado e que a TLBP (tanto em fígados

sadios quanto em fígados cirróticos) não alteram a capacidade de síntese protéica

dos hepatócitos, sendo verificados através dos níveis séricos de proteínas totais,

albumina e globulinas. Estes dados diferem do trabalho de OHTA et al, 1999, os

quais demonstraram uma pequena diminuição nos níveis séricos de albumina após

06 e 08 semanas de tratamento com tetracloreto de carbono. Por outro lado,

Holecek et al, (1995), demonstram que a indução de cirrose hepática com

tetracloreto de carbono leva a uma elevação dos níveis de alguns aminoácidos e

diminuição de alguns outros, não perfazendo um pool aumentado das proteínas

totais.

A análise histológica com o objetivo de verificar os efeitos da TLBP na cirrose

instalada demonstrou diminuição da degradação de colágeno para o grupo CCL4 +

Laser. Este achado é de suma importância quando pensamos na progressão da

cirrose hepática, pois segundo Gayoto e Alves, (2003) e Lee et al (2005), o aumento

da degradação do colágeno de áreas fibróticas leva a uma perpetuação do

desarranjo estrutural com conseqüente e irreversível perda da função hepática.

Quanto aos mecanismos pelos quais a TLBP diminuiu a degradação de colágeno,

ainda desconhecemos. Entretanto, estaremos realizando um estudo

imunohistoquímico com o objetivo de avaliar os níveis de algumas citocinas e

metaloproteinases e seus respectivos inibidores que poderiam estar sendo ativados

ou suprimidos decorrentes da TLBP, pois segundo Bansal et al, (2005), Senties-

39

Gomez et al, (2005) e Zheng et al, (2005) o modelo de indução de cirrose hepática

via CCL4, ativa e inibe diversas citocinas, metaloproteinases e seus respectivos

inibidores.

A análise morfométrica para o número de hepatócitos demonstrou que a

TLBP estimulou a hiperplasia hepatocitária no fígado saudável, mas não em áreas

lesadas. Os resultados também demonstram que o tratamento com CCL4 diminui

significantemente o número de hepatócitos por unidade de área. HAMAJIMA et al,

2003, demonstraram que a TLBP foi capaz de estimular a síntese de osteoblastos

em cultura de células sem nenhuma adição de drogas ou quaisquer outros fatores

que provocassem algum tipo de injúria celular. Assim, nós poderíamos estabelecer

uma hipótese de que a TLBP somente seria capaz de estimular a síntese de células

saudáveis e não de células lesadas, como no caso de nosso estudo, onde grandes

áreas de lesão foram encontradas devido ao tratamento com CCL4, o qual provoca

dentre outros danos, danos nucleares e na síntese protéica Zima e Kalousová,

(2005).

A análise morfométrica para o número de binucleações revelou que tanto o

tratamento com CCL4 (nas condições utilizadas) quanto a TLBP não foram capazes

de provocar alterações significativas no número de binucleações, o qual tem sido

utilizado como um indicador da taxa mitótica celular Lima et al (2001) e Silva Júnior

et al, (1991).

A análise morfométrica do número de células perisinusoidais não apresentou

diferenças significativas entre os grupos. Esperávamos que estas células que

participam ativamente nos processos de síntese dos componentes da matriz

extracelular apresentassem uma maior expressão no grupo CCL4, no qual existem

grandes áreas de fibrose. Entretanto no modelo utilizado, por razões ainda

40

desconhecidas não encontramos aumento da expressão das células perisinusoidais.

Por outro lado, sabe-se que a ativação das células perisinusoidais é subseqüente a

ativação das células de Kupffer, que estão mais expressas neste modelo de cirrose

experimental (JOHNSON et al, 1992; BURT, 1993).

A análise morfométrica do número de células de Kupffer demonstrou um

significativo aumento da sua expressão no grupo CCL4 e uma redução no grupo

CCL4 + Laser. Tem sido sugerido que a ativação das células de Kupffer leva a

produção de mediadores que iniciam uma cascata de eventos levando a cirrose

(LASKIN, 1990). Estas células normalmente protegem os hepatócidos contra

partículas estranhas. Entretanto, quanto ativadas, estas células liberam citocinas,

mediadas por um aumento do cálcio intracelular, com capacidade de matar o

hepatócito (BIRMINEL; DECKER, 1983; DECKERT et al, 1989). Então seria razoável

pensar que bloqueando a ativação das células de Kupffer, nós poderíamos

interromper a sequência de eventos que conduzem a síntese de citocinas citotóxicas

e bloquear a ativação das células perisinusoidais. Em conseqüência, o processo de

fibrose e degradação da matriz extracelular poderiam ser interrompidos.

41

6. Conclusões

Concluímos de acordo com os resultados encontrados que a TLBP, nas condições

em que foi utilizada, apresentou resultados reparadores na estrutura e função do

fígado cirrótico induzido pela administração crônica de CCl4, particularmente na

regressão da degradação de colágeno, na expressão de células de Kupffer e

também na função hepática verificada através da diminuição dos níveis séricos da

AST e da LDH.

42

Referências Bibliográficas

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(COBEA/Junho de 1991) e segue as Normas Para a Prática Diútico-Científica

da Vivissecção de Animais (Lei 6638 de 08/0511979) sendo, portanto, aprovado

por esla Comissâo de Etica em Pesquisa.

Sào Jose dos Campos- 03 de junio de 2004.

PROF. DR LANDULFO SILI'EIRA JUNIORPresideíte do Comitê de Ética em Pesquisa da UN1VAP

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