agradecimentos - repositorio-aberto.up.pt · a evoluÇÃo dos conhecimentos, as publicaÇÕes e o...
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Agradecimentos
Quero agradecer a várias pessoas que de forma directa ou indirectamente me
ajudaram no percurso, muitas vezes complicado, deste trabalho experimental e da
conclusão desta tese.
Em primeiro lugar gostaria de agradecer à minha orientadora, a Sra. Dra.
Professora Maria José Pinto da Costa, pelo encaminhamento todo feito ao longo deste
trabalho.
Os alunos de Mestrado que me acompanharam ao longo deste percurso deixo-
lhes um grande abraço e os desejos de toda a sorte do mundo, com muito carinho,
pois foi também através do apoio deles que atingi as minhas metas, entre os quais
gostaria de destacar em especial a Dirce e a Júlia.
Agradeço à Vanessa e à Elva que me ajudaram no laboratório, especialmente
no princípio deste trabalho. Tenho também de agradecer à minha família, em especial
aos meus pais que foram as pessoas que me persuadiram a completar este Mestrado
e por fim, agradeço ao Helder, que acabou por ser a pessoa que na recta final me deu
a força que já me começava a faltar para não desistir e para levar esta tese a bom
porto.
A todos um muito obrigado
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AGRADECIMENTOS .......................................................................................................................... 1
OBJECTIVOS ...................................................................................................................................... 2
ABSTRACT.......................................................................................................................................... 5
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 7
A MEDICINA LEGAL ............................................................................................................................ 7
A EVOLUÇÃO DOS CONHECIMENTOS, AS PUBLICAÇÕES E O PAI DA MEDICINA LEGAL .......................... 8
MEDICINA LEGAL NO MUNDO E A SUA EVOLUÇÃO ............................................................................... 8
ORGANIZAÇÃO MÉDICO-LEGAL EM PORTUGAL .................................................................................... 9
TOXICOLOGIA: ENQUADRAMENTO HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA MÉDICO-LEGAL .................................. 10
TABELA NACIONAL DE INCAPACIDADES (TNI) ................................................................................... 15
DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS ................................................................................................... 16
PATOFISIOLOGIA DA DOENÇA DE ALZHEIMER ................................................................................... 18
BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA (BHE) ............................................................................................ 27
STRESS OXIDATIVO .......................................................................................................................... 29
MERCÚRIO ....................................................................................................................................... 30
MERCÚRIO E A DOENÇA DE ALZHEIMER ............................................................................................ 33
METAIS PESADOS E INFLAMAÇÃO ..................................................................................................... 33
METAIS, INFLAMAÇÃO E CANCRO ...................................................................................................... 35
ENZIMAS ANTIOXIDANTES / SELÉNIO................................................................................................. 38
SELÉNIO........................................................................................................................................... 40
2. MÉTODOS ................................................................................................................................. 44
MATERIAIS ....................................................................................................................................... 44
CULTURA DA LINHA CELULAR ............................................................................................................ 44
3. RESULTADOS .............................................................................................................................. 48
3.1.A ............................................................................................................................................... 48
3.2 ................................................................................................................................................... 51
3.3 ................................................................................................................................................... 52
3.C ENSAIOS COM MICROGLIA DE RATO .......................................................................................... 60
4. DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 61
5. PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................................................ 66
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................. 67
3
Resumo
Este trabalho teve como objectivo relacionar a demência, ou a doença de
Alzheimer, com a exposição a metais pesados, nomeadamente ao mercúrio e a
capacidade destoxificadora do selénio. Tem vindo a ser sugerido desde há vários anos
o possível papel que este género de metais terá no desenrolar desta demência. Esta é
uma hipótese largamente aceite na comunidade científica, embora não tenha sido
comprovada para lá de qualquer dúvida, principalmente devido à grande dificuldade de
aplicar um modelo de estudo e também à grande multitude de características e
factores que rodeiam esta doença. Para além destes efeitos, os metais pesados têm
também sido relacionados com diversos tipos de cancros e estão a ser alvo de vários
estudos nesse campo. Assim sendo, é notória a influência deste tipo de metais na
saúde humana e o conhecimento dos seus efeitos é de elevado interesse.
Como existe uma forte relação entre a exposição dos metais pesados à
indução de processos inflamatórios e produção de espécies reactivas de oxigénio nas
doenças cancerígenas, isso leva a crer que existam também processos semelhantes
no que diz respeito às demências.
Foram realizados ensaios experimentais cada um com a duração de três dias
para detectar os efeitos do cloreto de mercúrio na linha celular “Human Brain
Microvascular Endothelial Cell” (HBMEC), em diferentes concentrações, através de
microscopia óptica e pela aplicação do corante Neutral Red. Após vários ensaios
determinou-se que havia uma variedade demasiado grande de resultados
discrepantes para poderem ser tomados em conta. Devido a esta situação procedeu-
se a ensaios de viabilidade de células da microglia de ratos, tendo em consideração
que este tipo celular está directamente ligado à doença de Alzheimer. O interesse
nestas células seria de cultivar células adultas que se assemelham mais ao estado
natural da microglia nos doentes. O protocolo aplicado mostrou-se ineficiente para
manter estas células durante tempo suficiente para atingirem o estado de maturidade
pretendido.
Assim sendo, o que se pôde determinar foi que possivelmente o mercúrio
provoca efeitos diferentes dependendo do estado celular das HBMECs e que seriam
precisos estudos mais aprofundados para determinar exactamente qual o estado
fisiológico mais apropriado para efectuar estes testes de forma coerente.
De qualquer das formas, a influência dos metais pesados na saúde humana é
evidente. A nível da formação de cancros, os metais pesados já demonstraram ter um
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peso considerável, sendo então um campo de estudo em aberto e com várias
perspectivas de investigação.
Mesmo sem apresentar resultados específicos, este trabalho expõe o
conhecimento existente acerca do mercúrio e os seus efeitos na saúde humana, com
especial atenção para o cancro e a doença de Alzheimer. São apresentadas várias
perspectivas de trabalho futuro, com ênfase em possíveis estudos com a HBMEC e
um novo protocolo que permitirá o cultivo de células da microglia envelhecidas de
modo a imitar o seu estado nesta doença neurodegenerativa.
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Abstract
This work aimed to establish a relation between dementia, more specific,
Alzheimer’s disease, and the exposition to heavy metals, namely mercury and the
detoxifying action of selenium. It has been suggested for some time the possible role
that these metals have on this disease. This is a hypothesis well accepted in the
scientific community, though it has not yet been completely demonstrated beyond any
doubt, due to the difficulty of stabilizing a working model and also due to the various
characteristics of the disease. Also, these metals have been associated to several
types of cancer and are being extensively studied in that field. The effect of these
metals in human health is very important.
Heavy metals induce inflammation and the generation of ROS in cancer, it’s
also thought to have a similar effect on neurodegenerative diseases.
In this work we studied the effects of HgCl2 during three days on the HBMEC
cell line using different concentrations. After several tests we concluded that the results
obtained were too strange to be taken on account. We tried then to apply the same
studies to a different type of cells, using rat’s microglia. The most important aspect in
using these cells was to try to cultivate aged cells to mimic the environment found in
Alzheimer’s disease. The applied protocol was not efficient to maintain these cells time
enough to achieve the expected maturity.
The only thing that we were able to determine was that mercury has probably
different effects depending on the physiological state of HBMEC cell line and that
would be necessary more profound tests to determine exactly which physiological state
would be more appropriate.
Anyway, the influence of heavy metals in human health is beyond doubt. In the
cancer development, heavy metals have demonstrated to have a key role, being under
study with several ramifications.
Even without specific results, this work explains the existing knowledge
concerning mercury and its effects in human health, especially in cancer and
Alzheimer’s disease. There are several possibilities for future work to determine line of
study in the use of HBMEC cell line and a new protocol that will make possible the
culture of aged microglia to perform more accurate studies about the
neurodegenerative disease.
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Objectivos
Este trabalho teve como objectivo relacionar o desenvolvimento da doença de
Alzheimer com a intoxicação por mercúrio. Para tal dividiu-se o trabalho em duas
partes: expôs-se a linha celular HBMEC a várias concentrações de mercúrio e ao
mesmo tempo efectuou-se ensaios com mercúrio e selénio para verificar os seus
efeitos protectores. Os efeitos destes dois metais foram avaliados em termos de
concentrações e de evolução ao longo do tempo. As células foram observadas por
microscopia de contraste e a sua viabilidade determinada pela utilização do corante
Neutral Red.
Outro objectivo foi tentar cultivar células da microglia para um estado fisiológico
mais avançado de modo a se poder testar os efeitos do mercúrio na doença de
Alzheimer.
E por fim fazer uma exposição bibliográfica dos conhecimentos actuais acerca
da doença e da relação do mercúrio com o seu desenvolvimento e no
desenvolvimento de cancros.
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1. Introdução
A Medicina Legal
A Medicina Legal é uma ciência de largas abrangências e de extrema
importância para os processos jurídicos.
É uma especialidade médica que reúne e aplica conhecimentos de diversas
áreas ao serviço da Justiça.
É uma disciplina de grandes abrangências e por isso muito requisitada. Além
do conhecimento da Medicina e do Direito, é necessário o conhecimento de outras
áreas como a biologia, química, toxicologia, entre várias outras. Hélio Gomes
asseverava que “não basta um médico ser simplesmente médico para que se julgue
apto a realizar perícias ” para poder exercer esta disciplina. São necessários estudos
mais acurados, treino adequado, não sendo só a aplicação da medicina pura. Nenhum
médico está capacitado para exercer as funções de perito só pela formação médica.
É-lhe indispensável o conhecimento a nível jurídico a que ele tem de obedecer. As
inúmeras relações com várias outras áreas tornam a sua definição algo complexa.
Existem várias definições dadas ao longo do tempo por diferentes
personalidades, o que demonstra em parte, a dificuldade de estabelecer uma definição
para uma área tão abrangente como esta:
“A arte de pôr os conceitos médicos ao serviço da administração da Justiça” –
Lacassagne.
“É o ramo da medicina que reúne todos os conhecimentos médicos que podem
ajudar a administração da Justiça” – Vargas Alvarado.
“É a Medicina considerada em suas relações com o Direito Civil, Criminal e
Administrativo” – Briand e Chaudé.
“É a disciplina que efectua o estudo teórico e prático dos conhecimentos
médicos e biológicos necessários para a resolução dos problemas jurídicos,
administrativos, canónicos ou militares, com utilitária aplicação propedêutica a estas
questões” – Basile e Warisman.
“Medicina Legal é todo um conjunto de conhecimentos médico-psico-biológicos
aplicados ao direito nas mais diversas expressões deste, direito civil, direito penal,
direito de trabalho, direito administrativo e muitos outros” – Pinto da Costa.
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Desde os tempos antigos que o conhecimento médico-legal, ainda que de uma
forma rudimentar, era usado e aplicado para determinar a causa de certos eventos
traumáticos.
Numa Pompilio, em Roma (753 A.C. – 673 A.C.) ordenou o exame às grávidas
que morriam e Antistio examinou o cadáver de Júlio César verificando a existência de
23 golpes de adaga, sendo apenas um o golpe fatal. [1]
A evolução dos conhecimentos, as publicações e o Pai da Medicina Legal
Em 1209 deu-se início a perícias médicas, embora rudimentares, através da
instituição da legislação canónica por Inocêncio III. Gregório IX, em 1234, na
publicação Peritorum indicio medicarum, exigia a opinião médica na determinação de
lesões mortais e em De probatione, consentia a nulidade do casamento na prova da
não consumação carnal do mesmo. O corpo do papa Leão X foi necropsiado para
determinar a causa de morte em 1521. Lazaretti afirma que o início da Medicina Legal
ocorreu em 1525 com a publicação Edito della Gran Carta della Vicaria di Napoli.
Em 1532 foi instituído o Constitutio Criminalis Carolino e mais tarde em 1575,
Ambroise de Paré publicou Des Rapports et des Mayens d’Embaumer les Corps
Morts, onde discutia as técnicas de embalsamamento, feridas, asfixias, diagnóstico da
virgindade; tendo sido considerado o pai de Medicina Legal.
Fortunatus Fidelis, em 1602, publicou De Relatoribus LIbri Quater in Qubis ea
Omnia in Forensibus de Publicis Causis Medici Preferre Salent Plenissime Traduntur.
Mais de um século depois, surgiu a publicação Institutiones Medicinae Legalis Vel
Forensis, por Herman Teichmeyer. [1]
Medicina Legal no Mundo e a sua evolução
Em 1836 deu-se a reforma do ensino em Portugal e o ensino da Medicina
Legal foi incluído.
A Rússia, a partir de 1858, começa a desenvolver a Medicina Legal com
Sergei Gromov, entre outros. Em 1945, Guillermo Uribe Cuallo fundou a Escola
Superior de Ciências Médico-Forenses na Colômbia.
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No Peru, Mariano Arosamena Quesada foi o primeiro professor desta
disciplina em 1855. No Paraguai, a disciplina iniciou-se em 1903.
Nos EUA a contribuição desta disciplina é na verdade irrisória, baseando-se em
testes sofisticados laboratoriais. As faculdades não possuem esta disciplina. É
utilizado o cargo “coroner” sendo uma posição política e não cientifica, ou então o
médico-examinador cuja única função é determinar a causa de morte.
No Brasil, a Medicina Legal foi influenciada pelos franceses. Na actualidade a
Medicina Legal Portuguesa teve também grande influência, especialmente nomes
como José António Lourenço Lesseps e José Eduardo Lima Pinto da Costa, entre
outros. [1]
Organização médico-legal em Portugal
Embora qualquer médico possa ser requisitado para efectuar uma perícia
médico-legal, os tribunais preferem recorrer a profissionais especializados na área da
Medicina Legal. Para além da particularidade de a profissão médica se encontrar
subdividida em múltiplas especializações, o exercer da função de perito implica um
certo conhecimento jurídico. Estes conhecimentos são adquiridos no Curso Superior
de Medicina Legal.
Na evolução legislativa sobre este género de serviços médico-legais, a Carta
de Lei de 17 de Agosto de 1899 foi o primeiro diploma médico-legal. O Decreto nº
4808 de 11 de Setembro serviu para fundar o Instituto de Medicina Legal de Lisboa. [2]
O Decreto-Lei nº 5023 de 29 de Novembro de 1918 surgiu da necessidade de
introduzir alterações e regras na forma como estes serviços são administrados criando
os Institutos do Porto e Coimbra e integrando os três Institutos de Medicina Legal, nas
Faculdades de Medicina de Lisboa, Porto e Coimbra. Além disso, criou os lugares de
peritos das Comarcas e os Conselhos Médico-Legais. [3]
Mais tarde, o Decreto-Lei 373/75 retirou os Institutos de Medicina Legal da
tutela das Universidades e passou-os para o Ministério da Justiça. O Decreto-Lei nº
42216, de 15 de Abril de 1959 veio completar e aperfeiçoar o regime de contratação
de peritos. [4]
Em 1987, o Decreto-Lei 387-C de 29 de Dezembro teve como objectivo
reorganizar os Institutos, criando o Conselho Superior de Medicina Legal, o Serviço de
disponibilidade permanente e os gabinetes. [5]
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O Decreto-Lei nº 431/91, de 2 de Novembro criou a igualdade entre a profissão
de médico-legista e os outros médicos. [6] O Decreto-Lei nº 11/98 de 24 de Janeiro,
reformulou os serviços, fundindo os gabinetes médico-legais das comarcas para os
círculos judiciais. [7] O Decreto-Lei nº 96/2001, de 26 de Março, teve como intuito
centralizar todos os serviços no Instituto Nacional de Medicina Legal e criou as
delegações de Porto, Coimbra e Lisboa. [8]
O Instituto Nacional de Medicina Legal tem como organização interna, nos seus
serviços centrais, as seguintes unidades orgânicas: departamento de Administração
Geral, departamento de Investigação, Formação e Documentação, serviço de
Genética e Biologia Forense, serviço de Química e Toxicologia Forense, serviço de
Tecnologias e Criminalística. Esta organização veio na sequência do DL nº 166/ 2012
de 31 de Julho e pela portaria nº19/2013 de 21 de Janeiro.
Cada delegação dispõe de vários serviços técnicos: o serviço de Tanatologia
Forense, Clínica Médico-Legal, Toxicologia Forense, Genética e Biologia Forense,
Psiquiatria Forense e Anatomia Patológica Forense.
O Serviço de Tanatologia Forense tem como função a realização das
autópsias, identificação de cadáveres, embalsamamento e estudo de peças
anatómicas. Ao Serviço de Clínica compete a realização de perícias no vivo. Na
Toxicologia Forense realizam-se as perícias laboratoriais químicas e toxicológicas. Ao
Serviço de Genética e Biologia Forense competem exames de hematologia e vestígios
orgânicos, nomeadamente os exames de investigação biológica de filiação e de
criminalística biológica. Ao Serviço de Psiquiatria Forense competem os exames
psiquiátricos e psicológicos. Por último, no Serviço de Anatomia efectuam-se os
exames patológicos forenses.
Toxicologia: enquadramento histórico e importância médico -legal
Definição
A Toxicologia Forense é um dos ramos pertencentes à Medicina Legal. É a
ciência que se ocupa dos tóxicos. Investiga as suas propriedades, métodos de acção e
processos de combate à sua nocividade. A toxicologia apoia-se por isso em três
aspectos mutuamente relacionados: o agente tóxico, o sistema biológico e o efeito.
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Importa fazer a distinção entre tóxico e veneno. Tóxico pode ser qualquer
substância, que em doses adequadas é útil para o organismo e que em doses
excessivas ou efeito cumulativo se pode tornar prejudicial. No que concerne à
definição de veneno é toda a substância que mesmo em doses mínimas provoca
reacções adversas no organismo.
O papel das Substâncias Tóxicas
As substâncias tóxicas têm sido largamente utilizadas como arma pelo Homem.
A utilização de venenos é antiga e uma das causas de morte mais difíceis de
detectar. Existem evidências da sua utilização por homens primitivos que revestiam as
pontas das suas armas com essas substâncias.
Este tipo de substâncias foram muitas vezes utilizadas como tratamento para
doenças tanto físicas como psicológicas. A contaminação de solos por certos tóxicos
afectou a agricultura e a poluição das águas, a pesca. Já os venenos eram utilizados
desde há muitos séculos como arma de assassinatos políticos.
Casos da História e a evolução do conhecimento
Os primeiros relatos associados a tóxicos já vêm da Antiguidade o que por si
só já mostra a importância que estas substâncias têm vindo a ter na história humana.
Em 2696 AC, Shen Nung terá provado 365 ervas e consequentemente morrido de
uma overdose tóxica. É considerado o pai da Medicina Chinesa. Já os Ebers Payprus
são os primeiros registos escritos de anatomia, fisiologia, toxicologia e tratamentos e
provêm da antiguidade egípcia.
Os tóxicos sempre tiveram uma larga utilização nos assassinatos, como se
suspeita que tenha sido o caso de Alexandre, o Grande, em 356 AC, utilizando
helebora ou estricnina. Em 131 AC, Mitridates VI, rei de Pontus na Asia Menor testou
vários antídotos nele próprio e em prisioneiros.
O primeiro Tratado acerca de venenos e antídotos foi escrito por Moses
Maimonides em 1135. Por sua vez, Leonardo Da Vinci estudou a bioacumulação de
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venenos em animais. Em 1493, Paracelso estabelece: “Todas as substâncias são
venenosas; não existe nenhuma que não o seja. A dose certa distingue o veneno do
remédio.” Catherine de Medici, em 1519, testou venenos nos pobres e doentes.
Bernardino Ramazzi foi o primeiro a estabelecer uma relação entre ocupações
de trabalho e doenças no livro “De Morbis Artificum Diatriba”, em 1633, estabelecendo
dessa forma o início da consciência das chamadas doenças profissionais. Em 1702,
Richard Meade escreveu “A Mechanical Account of Poisons”, dedicados a animais e
plantas venenosas.
O pai da toxicologia moderna, Orfila, publicou em 1813 o “Traite des Poisons”.
Análises a cabelos de Beethoven demonstraram quantidades elevadas de chumbo
(Pb), dando as suspeitas de que o compositor terá morrido devido a saturnismo. Em
1830, Claude Bernard estudou os efeitos do monóxido de carbono e curare. James
Marsh desenvolveu o teste para a detecção de arsénico e foi usado pela primeira vez
no julgamento de Marie LaFarge em 1840. Em 1855 Friedrich Gaedcke isolou a
cocaína a partir da planta Erythroxylon coca.
O estudo e a aplicação de conhecimentos a nível toxicológicos chegaram à
questão da saúde pública e em 1906, foi aprovado o “Pure Foods and Drugs Act”, em
que era impedida a produção ou o tráfico de comidas mal etiquetadas ou venenosas e
remédios. Outra lei importante foi a “Harrison Narcotics Tax Acts”, de 1914, que
regulava a utilização de opiáceos. Em 1915, o químico alemão Fritz Haber
desenvolveu os gases cianido e clorino.
Em 1938, Albert Hofsman sintetizou pela primeira vez LSD e testou-o em si
próprio. Em relação a químicos utilizados a nível de controlo de pragas, o DDT foi
reconhecido como insecticida em 1939 e banido em 1972 e a relação entre o fumo de
tabaco e o cancro do pulmão foi estabelecida em 1950 por Austin Hill. Estes registos
são alguns dos muitos contributos que foram dados ao longo dos séculos por
investigadores, médicos e curiosos. Foi o acumular de todos os conhecimentos
obtidos com as diversas substâncias e as suas muitas aplicações que levaram ao
estabelecimento das relações entre causa e efeitos de muitos tóxicos e à sua
subsequente regulação a nível legal. [1]
Existem muitas situações associadas a envenenamentos acidentais, como o
caso da contaminação de água com arsénico no Bangladesh em 1970; casos de
terrorismo, como o ataque com gás Sarin no Metro de Tóquio em 1995 ou
assassinatos, como o ataque a Litvinenko em 2006 com polónio 210.
As substâncias venenosas e tóxicas têm sido largamente utilizadas e têm
havido muitas tentativas para legislar e impedir/prevenir situações que ponham em
perigo a saúde e a vida das pessoas.
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Um dos grandes problemas associados a este tipo de intoxicações,
especialmente até inicio do século XIX, era a dificuldade em determinar a causa da
doença e/ou morte. Até esta altura não haviam métodos científicos para detectar estas
substâncias. Só a partir do momento em que surgiram os conhecimentos em química
e fisiologia é que isso se tornou possível.
A Toxicologia na Actualidade
O objectivo desta área de investigação da Toxicologia Forense é a detecção e
possível quantificação de substâncias tóxicas. Contudo, a actividade do toxicologista
forense aplica-se a situações judiciais subjacentes a questões postas a identificar e
quantificar o risco para a saúde humana.
Como tal põe em prática todos os conhecimentos científicos à disposição na
actualidade. Até ao século XX, esta ciência sujeitava-se simplesmente à identificação
da origem tóxica de um determinado crime, geralmente sempre resultando em morte.
Actualmente, o campo de acção desta área abrange a perícia no vivo e post-
mortem e questões de saúde pública e laboral. Neste último caso normalmente é
através da avaliação dos parâmetros que são abrangidos pela TNI. Vários trabalhos
têm sido feitos nesta área, como o estudo da importância dos metais pesados no
desenvolvimento infantil [10], interacção entre mercúrio e os sistemas biológicas [11] e
a pesquisa de mercúrio em amálgamas dentárias [12].
No caso das perícias em pessoas vivas estas são mais requeridos para a
determinação de abuso de drogas em casos de toxicodependência e de uso de
substâncias psicoactivas nos utilizadores da via pública. Neste último, entendem-se a
quantificação dos níveis de alcoolémia e de substâncias legais e ilegais. Um outro
aspecto é a análise de intoxicação por metais pesados, especialmente no caso de
doenças de trabalho previstas na Tabela Nacional de Incapacidades (TNI). Os exames
têm como objectivo a avaliação da intoxicação como circunstância qualificadora de
delito, perigosidade ou inimputabilidade.
A definição do conceito de tóxico pode ser muito difícil, uma vez que qualquer
substância pode actuar como tóxico. Nesta medida, todas as substâncias seriam
tóxicas, incluindo alimentos ou medicamentos. São vários os critérios pelos quais os
tóxicos podem ser classificados. Para melhor sistematização, em toxicologia analítica
classificam-se os tóxicos de acordo com as formas de extracção destes. Os grupos
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são: substâncias voláteis, substâncias orgânicas termolábeis, metais ou metalóides,
pesticidas, aniões.
Formas de penetração dos Tóxicos
A penetração dos tóxicos no organismo pode dar-se pela via digestiva, cutânea
ou respiratória; e pode dar-se por mais de uma via ao mesmo tempo. Em termos de
exposição laboral, a forma de exposição mais vulgar é a respiratória.
Estas podem ocorrer na forma de: poeiras, como é caso da sílica que provoca
silicose, doença que afecta em grande maioria os mineiros; fibras, como o amianto,
como a asbestose, onde os afectados se encontram principalmente na construção
civil; fumo, por exemplo o chumbo, que provoca o saturnismo, que pode ocorrer nas
ocupações de fundição; aerossóis, entre os quais os insecticidas, muito utilizados na
agricultura; neblinas, como os açucares que provoca a bagaçose, doença que afecta
trabalhadores que lidam com resíduos de cana-de-açúcar; gases como o cloro,
utilizado na indústria; e vapores, entre os quais o mercúrio, que causa o hidrargirismo,
e pode ser encontrado numa variedade enorme de ocupações, como extracção e
fabricação do metal, tintas e lâmpadas, entre outros.
Estas situações são acompanhadas e tratadas pela Medicina do Trabalho. Este
tipo de medicina visa a prevenção da saúde dos trabalhadores, melhorando as
condições da sua actividade, o seguimento dos trabalhadores e análises periódicas
consoante as características específicas de cada local de trabalho. O artigo 29º do
Código de Trabalho, nas alíneas 1, 2, 3 refere as competências do perito nesta área
do Direito. É sempre necessário aplicar o nexo de causalidade entre o tóxico, o tempo
de exposição e a patologia. É por exemplo o caso da exposição prolongada ao
mercúrio que pode ser detectado no cabelo por SEM-XRM em certas profissões. [11]
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Tabela Nacional de Incapacidades (TNI)
A TNI foi legislada pela primeira vez em Portugal pelo Decreto-Lei nº 341/93,
com o objectivo de criar normas para a avaliação das incapacidades por acidentes ou
doenças de trabalho, com a finalidade de determinar compensações adequadas para
cada caso.
O Decreto-lei nº 352/2007 revogou o DL anterior, ajustando percentagens de
incapacidades de certas patologias. Neste decreto existem duas tabelas, uma
destinada aos casos de acidentes e doenças de trabalho e outra para a reparação de
dano em direito civil.
Todas as substâncias consideradas prejudiciais e que se encontram nos locais
de trabalho são mencionadas, assim como os valores de exposição considerados
aceitáveis. Isto permitiu a criação de um instrumento adequado de avaliação neste
domínio específico do direito, destinado à avaliação e pontuação das incapacidades
resultantes das alterações psíquicas e físicas.
O Decreto-Lei nº76/2007 de 17 Junho, define doença profissional que resulta
directamente das condições de trabalho e pertence à lista de doenças de trabalho e
que provoca incapacidade para exercer o mesmo. [13]
Já o Decreto-Lei nº99/2003 de 27 de Agosto, define acidente de trabalho como
acontecimento acidental no local e horário de trabalho (incluindo trajecto de ida e vinda
para o mesmo); este no entanto, não precisa de ter uma causa directamente
associada ao tipo de trabalho (isto é, não é obrigatório ser algo que depende das
funções, podendo ser simplesmente uma queda). [14]
Relativamente aos metais pesados, na legislação portuguesa o Decreto-Lei
nº274/89 de 21 de Agosto define quais os limites máximos para o chumbo. Estabelece
que o Valor Limite de concentração de chumbo no ar do local de trabalho é de
150µg/m3 e para o sangue o valor é de 70 µg por 100ml. [15] O Decreto-Lei nº
351/2007 de 23 de Outubro transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva
nº2004/107/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Dezembro, os
valores para as concentrações de arsénio e mercúrio. No caso do arsénio o valor é de
6µg/m3 e para o mercúrio 0.2mg/N m3. Estabelece métodos e critérios comuns para a
avaliação das concentrações destes metais no ar. A presença destes metais nos
locais de trabalho, no ambiente e mesmo em produtos alimentícios exige uma forte
regulamentação de modo a proteger as pessoas. [16]
16
A poluição ambiental dos países industrializados por metais pesados como os
mencionados na TNI é um grave problema de saúde pública. Ao estabelecer limites
tanto a nível ocupacional, como a nível ambiental e industrial, pretende-se minimizar
ao máximo o impacto destes na vida humana. O mercúrio é um desses exemplos.
Está demasiado disperso, encontrando-se presente em vários locais de trabalho
diferentes, em vários materiais e no ambiente. A poluição das águas com este metal
tem levantado muitos problemas desde há muitos anos e tem sido um problema de
saúde pública, exigindo uma monitorização apertada e legislação apropriada.
Existe também legislação a nível europeu, especialmente no que diz respeito
aos teores máximos de vários contaminantes nos géneros alimentícios. O regulamento
nº 1881/2006 da Comissão, de 19 de Dezembro de 2006, fixa os valores de ingestão
semanal de chumbo em 25 µg/Kg de peso corporal e de mercúrio em 1.6µg/Kg de
peso corporal. [17]
Doenças neurodegenerativas
A doença neurológica trata-se de uma degeneração generalizada das células
nervosas que transmitem os impulsos eléctricos necessários para o bom
funcionamento do organismo. Doenças neurodegenerativas são doenças em que
ocorre a destruição progressiva e irreversível de neurónios causando graves défices a
nível funcional, e dependendo do tipo de doença, a perda das capacidades a nível
motor, fisiológico e/ou cognitivo. O tratamento é feito com remédios que inibem ou pelo
menos retardam essa destruição. [18]
Demência, derivada da palavra latina, [de-=fora de + mens= da mente] significa
perda ou incapacidade a nível mental atribuída a uma doença. É geralmente entendida
hoje como a “perda de habilidades intelectuais” de tal forma que afecta o normal
funcionamento pessoal. Esta definição da Associação Americana de Psiquiatria existe
desde 1994.
Mas muito antes desta altura, já havia o conhecimento de um progressivo
deterioramento associado à idade. Tantos os Gregos como os Egípcios nos períodos
AC já haviam associado a idade ao desequilíbrio mental, assim como os Romanos nos
primeiros séculos DC e os médicos indianos. Existiam muitos termos e formas de
aludirem a este problema, mas em todas estas civilizações havia a noção da perda
das capacidades superiores intelectuais com o avançar da idade.
17
Esta problemática não é nova, simplesmente encontra-se magnificada no
nosso tempo devido ao aumento do envelhecimento na população mundial. [19]
Uma dessas doenças é a doença de Alzheimer, considerada como a principal
causa de demência na actualidade (50-60%, em pessoas com idades superiores a 65
anos), sendo presumido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) que cerca de 18
milhões de pessoas em todo o mundo estejam afectadas e cujas estimativas são de
34 milhões para 2025. Esta doença costuma afectar pessoas a partir dos 60 anos
embora também existam casos de Alzheimer precoce, iniciando-se por volta dos 40.
[18]
A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa lenta e
progressiva que afecta o cérebro e se encontra associada à idade e é caracterizada
pela toxicidade induzida pela deposição de formas anormais de proteínas. É
caracterizada clinicamente pela progressiva perda de memória, mas acabando por
evoluir para confusão, irritabilidade, e afastamento da realidade. O curso médio da DA
é de cerca de 10 anos, mas esta característica é variável de situação para situação.
Esta doença é considerada um problema de saúde pública, pois afecta cada
vez mais membros da população mundial. Os pacientes vão perdendo o contacto com
a realidade, tornando-se incapazes de se responsabilizar pelos seus próprios actos.
A doença de Alzheimer foi descrita pela primeira vez em 1906 pelo psiquiatra
alemão Alois Alzheimer. Foi no seu emprego no “Städtische Anstalt für Irre und
Epileptische” que tomou contacto com esta doença neurodegenerativa. Em 1901,
Alzheimer observou uma paciente no asilo de Frankfurt chamada Auguste Deter que
apresentava alguns sintomas típicos desta doença. Esta paciente tornou-se a grande
obsessão até à sua morte. Em Abril de 1906, a paciente morreu e Alzheimer fez com
que o cérebro dela chegasse até ele para observação. Juntamente com dois médicos
italianos empregou uma coloração com prata para determinar as lesões cerebrais
onde detectou as placas amilóides e os emaranhados neurofibrilares. Um discurso
dado a 3 de Novembro foi a primeira vez que esta doença foi apresentada com
aqueles dados.
Ao longo do tempo tem sido cada vez mais visível a importância de certos
metais no desenrolar deste tipo de doenças. Existem, por exemplo, certas doenças
neurodegenerativas em crianças que estão associadas a biometais, como o cobre,
ferro e zinco. [20] O cobre e o ferro também têm sido associados à doença de
Alzheimer. [21] [22] [23] [24]Outro tipo de metais também suspeitos de terem influência
nestas doenças são os metais pesados, como é o exemplo do mercúrio (Hg), sendo
este o objecto de estudo deste trabalho experimental e cujos motivos para estas
suposições serão tratadas mais profundamente num capítulo mais à frente desta tese.
18
Os doentes que sofrem desta desordem não são considerados responsáveis
pelos seus actos, devido ao permanente afastamento da realidade e incapacidade de
perceber as situações à sua volta. Pelo Código Penal Português são considerados
inimputáveis.
Patofisiologia da Doença de Alzheimer
Descobertas epidemiológicas sugerem que o baixo nível educacional, história
de trauma craniano e o consumo de elevadas calorias pode ser um factor activador da
doença que se caracteriza pela alteração global do funcionamento cognitivo,
suficientemente grave para ter efeitos a todos os níveis da vida de uma pessoa. [25]
[26]
Existem tanto factores genéticos como ambientais que contribuem para o
activar e desenrolar da doença de Alzheimer. Estudos genéticos indicam pontos de
mutação no gene da APP que pode levar ao desenrolar desta doença. As mutações
em genes relacionados só contabilizam cerca de 30% dos casos de Alzheimer. Vários
factores incluindo patologias concomitantes dificultaram a análise genética associada
ao Alzheimer tardio. Contudo, estudos de associação identificaram vários genes
possíveis. A exposição ou ingestão de substâncias tóxicas, entre as quais, os metais
pesados, traumas a nível craniano, radiação, infecções, doenças imunológicas,
cancro, altos níveis de colesterol e de hemocisteína, a obesidade, diabetes, são vários
dos factores que têm sido associados à doença de Alzheimer e que têm sido
estudados ao longo dos anos.
Os genes passados pelos pais podem ou não ter um importante papel na
determinação se uma dada pessoa vai desenvolver a doença. As várias descobertas
no campo das mutações genéticas associadas à doença de Alzheimer levaram ao
conhecimento das alterações celulares e moleculares que levam à neurodegeneração.
[27]
Duas grandes lesões são características da Doença de Alzheimer (DA): a
presença de emaranhados da proteína tau e a presença de placas senis. Existe um
terceiro factor que é tido também em conta que é a existência de processos
inflamatórios relevantes.
Na doença de Alzheimer ocorre um elevado grau de atrofia no cérebro; sendo
esta perda dispersa. Em 1985, Rogers e Morrison, estudaram a distribuição das placas
19
senis, verificando a associação com o hipocampo e neocórtex. Esta situação acaba
por terminar em perda e morte dos neurónios. [28]
As placas senis são constituídas por proteína β-amilóide, associadas a
terminais nervosos degenerados. Outra característica é a presença de células da
microglia num estado activado e astrócitos.
Os emaranhados neurofibrilares são deposições de filamentos helicoidais da
proteína Tau que se encontra numa configuração anormal.
A inflamação é a outra característica presente nesta doença neurodegenerativa
com grande significância. Este processo está intimamente ligado à activação das
células da microglia.[29] [30] [31] [32]
O excesso de colesterol, hipercolesteromia, é um dos factores que se pondera
estar associado ao possível desenvolvimento da doença. Uma dieta enriquecida em
colesterol está associada com o aumento da deposição regional da proteína β-
amilóide e acumulação de Fe à volta destes depósitos. Co-localização do ferro e da
proteína foi associado a processos apoptóticos e dano da barreira hemato-encefálica
(BHE). Foi demonstrado também que estes processos estavam associados à via de
stress do reticulo endoplasmático e que estes danos podem tornar o córtex cerebral
mais vulnerável aos danos causados pelo colesterol. [33]
O elevado stress oxidativo e o metabolismo de energia celular danificado é
outra característica desta doença neurodegenerativa. Em especial junto às placas
senis e aos emaranhados existe grande quantidade de proteínas, lípidos e DNA
modificados oxidativamente. Isto é atribuído tanto à proteína β-amilóide como à
presença de metais como o Fe2+ e Cu2+. [34] [35] Uma nova aproximação para a
protecção contra a excitoxicidade e o stress oxidativo tem sido através do estudo de
compostos com capacidades antioxidantes, com o intuito de proteger e combater estes
efeitos na doença de Alzheimer. [36] O stress oxidativo, que será discutido mais em
relevo à frente, tem um papel bastante significativo nesta doença e existem já várias
tentativas de terapia através do combate aos seus efeitos.
Vários estudos também demonstraram a existência de uma espiral mitocondrial
em queda, envolvendo anormalidades no metabolismo energético, do cálcio e dos
radicais livres (espécies reactivas de oxigénio e nitrogénio). [37] Existem outras
desordens neurológicas que também estão associadas com a diminuição destes
metabolismos. [38] O enfraquecimento dos metabolismos referidos acima leva por sua
vez a um aumento da expressão da APP. [39] Isto, por conseguinte, leva à perda de
neurónios, aumento da APP e a anormalidades no citoesqueleto. [40]
A α-sinucleina possui um papel de relevância nos processos de metabolismo
de lípidos e transporte mediado por vesiculas em diversas doenças
20
neurodegenerativas. [41] A presença da dopamina citosólica em neurónios leva à
acumulação de α-sinucleina causando vulnerabilidade a estas doenças. [42] A
proteína Tau aumenta a toxicidade e agregação da α-sinucleina e interrompe a
formação de inclusões. Este efeito sinergístico patológico entre a Tau e α-sinucleina
pode assim amplificar o processo neurodegenerativo. [43]
Placas senis
A produção de APP, precursor da proteína amilóide, é influenciada pelo estado
fisiológico e desenvolvimento celular. É uma proteína integral da membrana com um
amplo terminal N glicosilado e um pequeno terminal C (Figura 1). A alteração dos
seus processos proteolíticos leva ao aumento da produção de formas neurotóxicas da
Aβ. É-lhe atribuído um papel importante na sobrevivência dos neurónios, crescimento
de neurites, plasticidade sináptica e adesão celular. É transportada pelos axónios aos
terminais pré-sinápticos onde se acumula em níveis altos. É esta acumulação que
forma as chamadas placas senis. [44]
Figura 1 – Representação dos produtos de clivagem da APP pelas secretases α, β, γ e ε, de onde resulta a produção da Aβ. ( Retirado de Ashe e Zahns, 2010)
21
A proteína β-amilóide é o produto de clivagens sequenciais da APP pela β-
secretase no terminal N e pela γ-secretase no terminal C. As sinapses são
susceptíveis aos efeitos adversos das formas segregadas da proteína β-amilóide. Esta
impede os transportadores iónicos e de glucose e compromete a plasticidade
sináptica. Outra forma de acção é a indução de stress oxidativo que acaba por
danificar os neurónios e a disrupção da homeostasia do cálcio. A capacidade de certas
terapias de removerem a proteína do cérebro de ratos com mutações na APP melhora
as suas funções sinápticas, o que reforça a ideia da sua influência na decadência das
capacidades neuronais. [45]
Processos proteolíticos podem ser uma das causas da alteração dos
mecanismos de energia celular. Metabolismo de energia perturbado tem efeitos na
acção patogénica do processamento alterado do precursor da β-amilóide, isto porque
o stress oxidativo e o metabolismo de energia danificado pode conduzir a processos
amiloidogénicos.
A existência das chamadas placas senis deve-se ao dobramento anormal de
proteínas que se vão acumulando em formas instáveis e por isso, muitas vezes,
difíceis de serem eliminadas pelo organismo. No caso particular da doença de
Alzheimer, a deposição é da proteína β-amilóide, que vai formando placas nos
espaços entre os neurónios, constituídas pela proteína concentrada em aglomerados
com microglia activada no centro, rodeada por astrócitos reactivos que demarcam os
locais de inflamação.
Um outro estudo em que se avaliou a utilização da 2-deoxiglucose (2-DG)
revelou que a sobreexpressão dos genes da APP leva a um hipometabolismo da
glucose no cérebro, que se pensa estar associado ou aos níveis elevados a Aβ ou à
função anormal da APP. [46][47] Esta possível associação com os níveis da proteína
amilóide foi demonstrada em células da glia assim como em culturas neuronais. [48]
[49]
O efeito da Aβ também foi observado em preparações de sinaptomas de rato e
levaram a deduzir que os problemas no transporte de glucose podem estar associados
à peroxidação da membrana lipídica pela proteína amilóide. [50]
A maior parte dos péptidos que são encontrados nas placas são Aβ1-12 e Aβ1-40,
péptidos que são produto da clivagem da APP. [51] Esta deposição é considerada
como o primeiro evento da doença e existem teorias que afirmam que a deposição da
β-amilóide é uma resposta aos processos inflamatórios. [52] Fragmentos desta
proteína parecem mediar alguns mecanismos de inflamação pela activação da via do
complemento; e as placas senis são em muitas formas semelhantes a locais de
inflamação persistente. [52] [53] [54] A via do complemento é iniciada pela união das
22
proteínas C1q às imunoglobulinas, o problema é que a proteína amilóide também
possui uma afinidade elevada com esta proteína e os complexos agregados contendo
este segmento ligam-se fortemente com o receptor na microglia. Pondera-se que este
seja um dos factores que provoca a activação da microglia [52]
Também foi estudada a influência dos metais no Alzheimer, em especial, dos
chamados biometais, metais necessários para efectuar certas funções biológicas.
Assim, foram medidas concentrações de cobre (Cu), ferro (Fe), e zinco (Zn) nas
bordas e núcleos das placas senis e encontraram-se valores mais elevados
associados à doença, colocando-se a hipótese de estes acelerarem a agregação do
péptido beta amilóide. [55]
Os derivados da proteína beta amilóide têm sido muito estudadas. A AβpE3
constitui grande parte das proteínas amilóides nas placas senis, enquanto a AβpE11
tem recebido menos atenção. Através da criação de anticorpos policlonais para
ambas, foi demonstrado que constituem grande parte das placas senis no córtex
cerebral. Os dados obtidos também sugerem que AβpE11 pode servir como local de
criação para a formação das placas senis. [56]
Também é conhecido que inibidores da acetilcolina protegem contra os danos
causados pela proteína amilóide, pois inibem a libertação de citoquinas da microglia e
monócitos, tal como a relação de anormalidades do sistema colinérgico com as
deficiências intelectuais e as placas senis na doença de Alzheimer. [57] [58] [59]
Emaranhados neurofibrilares
As doenças de Alzheimer, paralisia progressiva supranuclear, demência
frontotemporal, entre outras, são conhecidas como tautopatias, isto porque existem
emararanhados de uma forma anormal hiperfosforilada da proteína Tau. [51] Nos
neurónios saudáveis, esta proteína liga-se e estabiliza os microtúbulos. Muitas vezes
estes agregados proteicos são encontrados conjugados com ubiquitina. [60] São
abundantes no hipocampo, amígdala, lóbulo frontal, parietal e temporal. [51]
Exposição a longo termo a Aβ micromolar induz toxicidade celular colinérgica,
possivelmente através desta hiperfosforilação. Reciprocamente, activação de
receptores colinérgicos alteram a fosforilação desta proteína. [51]
23
Fosforilação da Tau é um evento inicial da degeneração neurofibrilar na DA,
que é relacionada com a evolução da característica demência desta doença. [61]
Meng et al demonstraram que motivos de formação de fibrilas podem levar a
diferentes composições da proteína e diferentes parâmetros cinéticos. Os seus
resultados sugeriam que os motivos de formação possuem um papel muito relevante
na fosforilação e possível má formação que leva ao início e desenvolvimento das
doenças neurodegenerativas. [62]
Alonso e o seu grupo estudaram os mecanismos de degeneração neurofibrilar
e a sua relação com as proteínas associadas aos microtúbulos. A afinidade da
associação da proteína é mais elevada que a da proteína dos microtúbulos, porque a
Tau impede a ligação tardia. A associação entre a Tau e as proteínas associadas aos
microtúbulos ocorrem in situ, e ambas se agregam no cérebro. É sugerido que a Tau
anormal pode sequestrar a proteína normal e prejudicar os microtúbulos. [63] Com a
formação destes filamentos, há uma interrupção do transporte e morte neuronal. [60]
[64] O nível da patologia neurofibrilar e o número de emaranhados parecem estar
relacionados com a gravidade da demência. [51]
Outro trabalho sugeriu que o metilglioxanal (MG) induz a hiperfosforilação da
tau do tipo habitual que se encontra na doença de Alzheimer pela formação de
produtos de glicação. [64]
Figura 2 – Representação esquemática da presença dos emaranhados neurofibrilares em doentes de Alzheimer. Imagem adaptada de American Health Assistance Foundation.
24
O papel da inflamação
A influência de processos inflamatórios em doenças neurodegenerativas como
a doença de Alzheimer (DA), esclerose múltipla (EM), doença de Parkinson (DP),
entre outras é um facto. [65]
A relação entre processos inflamatórios, depressão e a doença de Alzheimer,
assim como a atrofia do hipocampo é também considerada. Essa teoria é apoiada pelo
facto de serem visíveis sinais de depressão nas fases iniciais da doença. [66]
As placas senis, uma das imagens de marca desta doença, são comparáveis
em muitos aspectos com um local de inflamação persistente (embora a resposta
inflamatória clássica com infiltração de leucócitos e imunoglobulinas seja ausente).
Há uma concentração de células da microglia nos depósitos de amilóide que
interagem com astrócitos demarcando estes locais inflamatórios. Tanto as cascadas
do complemento como coagulação tornam-se activadas. Também se sabe que as
protéases possuem um papel na função da microglia, que são sintetizadas e
secretadas por macrófagos activados, tendo também sido demonstrado in vitro que
podem ser produzidas pela microglia activada e neurónios. A presença dos elementos
relacionados com o processo inflamatório, suportam a sua importância nos processos
desta doença. [67]
Cada vez mais se acredita num papel de grande relevância dos receptores do
tipo Toll (TLRs) no desenrolar da doença de Alzheimer. As células da microglia são
centrais na resposta inflamatória. São activadas por sinais de perigo das células
vizinhas. Esta activação dá início à resposta imune inata que leva à libertação de
citocinas pró-inflamatórias e fagocitose. Apesar do objectivo ser combater os efeitos
de compostos patogénicos, muitas vezes esta activação provoca a libertação de
factores tóxicos como o oxido nítrico (NO) e espécies reactivas de oxigénio (ROS) que
acabam por aumentar ainda mais os danos celulares. A microglia em estado activo
que atinge um nível tóxico é normalmente activada por receptores de reconhecimento
de padrões (PRRs), que pertencem à imunidade inata. [68]
Os receptores de tipo Toll (TLRs) são uma subfamília de PRRs que são
abundantemente expressos em várias células do SNC e com especial enfâse na
microglia e em vários tipos celulares relacionados com o sistema imune, como as
células B. [69] Os TLRs são receptores transmembranares que respondem a padrões
ligados a patogéneos. [70] TLRs amplificam a libertação de citocinas e quemocinas.
Possuem um papel importante na inflamação através da alteração da função neuronal
25
e morte. Compostos não-patogeneos endógenos activam a microglia pelos TLRs que
leva por sua vez à inflamação. [68]
As células de Kupffer são células que recobrem, junto com as células
endoteliais típicas, as placas hepatocelulares. São capazes de fagocitar sustâncias
estranhas presentes no sangue dos seios hepáticos, sangue esse que chega até aos
sinusóides pela veia porta. Possui muitos lisossomas para cumprir a sua função
fagocitica e um núcleo grande e oval. É envolto por fibras reticulares. Estudos recentes
mostraram que o uptake do HCV pelas células dendríticas plasmócitóides hepáticas e
pelas células de Kupffer podem induzir a sua produção de citocinas inflamatórias que
vão levar a um estado de inflamação. Por outro lado a infecção por HCV é tratada com
terapia baseada em interferões para combater a inflamação. Estas células estão assim
envolvidas em vários processos inflamatórios que ocorrem a nível do fígado. [71]
Estudos com metais pesados demonstraram o papel destas células no
processo de destoxificação do mercúrio. Uma possível explicação para a acumulação
destes metais nestas células foi proposta num estudo acerca da interacção do
mercúrio e do selénio em golfinhos, em que sugeriram que o Hg e o Se se difundem
através dos sinusóides, onde são absorvidos e formam complexos nestas células.
Assim sendo, acharam plausível assumir que para além de serem produtos dos
processos de desmetilação, estes complexos também existem devido à acção das
células de Kupffer, já que encontram o seu caminho para a corrente sanguínea. [72]
A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma estrutura membranar que actua
principalmente para proteger o sistema nervoso central (SNC) de substâncias
químicas presentes no sangue, permitindo ao mesmo tempo a função metabólica
normal do cérebro. É composto de células endoteliais, que são agrupadas muito
unidas. Esta é a primeira linha de defesa do cérebro contra a exposição a substâncias
nocivas. As células da glia, geralmente chamadas neuróglia, são células de suporte
dos neurónios. As principais funções das células da glia são a protecção dos
neurónios. São divididas em dois subtipos: macroglia (astrócitos, oligodendrócitos e
glioblastos) e microglia.
A sobre-activação das células da microglia está associada a vários problemas
a nível do cérebro, como é o caso dos ataques isquémicos, onde se demonstrou a
activação excessiva destas células. Esta activação resulta num desfecho pior
ressaltando ainda mais os potenciais efeitos pró-inflamatórios prejudiciais do tPA
(activador plasminogénico). [73]
26
Microglia
A microglia humana expressa o TLR1-9 que produz factores pró e anti-
inflamatórios que, por sua vez, induzem a fagocitose de elementos patogénicos. Os
astrócitos humanos também expressam vários TLRs. [74] A activação da TLR2/6 das
células endoteliais aumenta a permeabilidade da BHE. [68]
A Aβ leva à activação da microglia pelos receptores TLR2, TLR4 e CD14, que
leva à remoção da Aβ. [75] O receptor TLR4 é essencial na activação por LPS. [76] A
activação da microglia por pouco tempo é benéfica, mas se esta se estende de forma
prolongada começa a ter efeitos negativos. [68] A activação da microglia facilita a
fosforilação da tau. [77]
Outro receptor conhecido pelo seu envolvimento nos processos da microglia é
o receptor de glutamato 5 (mGluR5) que pode controlar a morte de neurónios, sendo
expresso em células da microglia e que está também envolvido nos processos
inflamatórios. [78]
O entendimento da forma e interacção destes processos inflamatórios pode ser
uma das forma de arranjar um alvo terapêutico para combater a doença de Alzheimer.
[79] Existem vários estudos que têm como intuito desenvolver mecanismos
neuroprotectores contra a neuroinflamação. A utilização de substâncias como a
arctigenina que tem a capacidade de suprimir a activação da microglia e diminuir a
expressão de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β e TNF-α é uma das opções em
estudo. A sua capacidade de modulação do local de inflamação torna este tipo de
substâncias bastante atractivas para o combate à neuroinflamação. [80] Outra linha de
estudo é o uso de retinóides que têm a capacidade de activar efeitos antioxidantes e
inibir a formação de vários aspectos associados à doença de Alzheimer, tal como a
neuroinflamação. [81]
Tanto as cascadas do complemento como as da coagulação são activadas por
astrócitos e microglia. [52] A microglia associada às placas senis expressa de forma
substancial muitos marcadores como MHC-I, MHC-II, IL-1 e TNF-α. Em adição à β-
amilóide, placas senis contém a maior parte das proteínas do complemento.
Também se sabe que funções dos oligodendrícitos sugerem que a perda do
suporte trófico que fornecem pode levar a um aumento da vulnerabilidade dos
neurónios, aumento da inflamação e ainda mais dano celular. [82]
27
Barreira Hematoencefálica (BHE)
A BHE é uma estrutura membranar que actua principalmente para proteger o
SNC de substâncias tóxicas que possam existir na circulação sanguínea. É composto
de células endoteliais agregadas de forma a impedir essa passagem. Esta densidade
aumentada restringe muito a troca de substância com o cérebro. A BHE, no entanto,
não é totalmente impermeável, havendo muitas situações em que existe transporte de
substâncias através desta barreira, mesmo de substância tóxicas. (Figura 3)
Devido ao crescente aumento de interesse na investigação dos processos de
transporte e interacção da BHE, começaram a surgir vários modelos, tanto in vivo com
in vitro.
Ao longo do tempo, várias hipóteses foram apresentadas que envolviam a BHE
na doença de Alzheimer. Algumas dessas hipóteses referiam a disrupção da barreira,
defeitos no transporte de glucose, ou mesmo libertação de substâncias tóxicas da
própria BHE. Uma das hipóteses mais recentes envolve o transporte defeituoso do
péptido Aβ para fora do cérebro, provocando a sua acumulação e consequente
toxicidade. [83] Este efluxo pensa-se ser mediado por dois transportadores: LRP-1 e
P-glicoproteina. [84] [85]
Figura 3 – Figura esquemática da BHE.
28
Outra teoria envolve o transportador RAGE, que seria responsável pelo
transporte da Aβ formada no sangue para o cérebro. [83]
Todos estes processos defeituosos parecem estar relacionados com o
envelhecimento, em que o efluxo da Aβ é diminuído; e também, com processos
inflamatórios, que parecem interferir com estes transportes. [86]
Um outro estudo estabeleceu mesmo o papel da P-glicoproteína da BHE no
efluxo da Aβ para o lúmen capilar e determinou que a regulação positiva desta
glicoproteína permite uma maior remoção da Aβ nas fases inicias da doença de
Alzheimer, fazendo com que esta possa ser uma estratégica terapêutica de combate à
doença. [87]
É conhecido o papel do Al na alteração da BHE no contexto da DA. Através da
utilização de modelos experimentais de ratos para a intoxicação crónica de alumínio
(Al), sabe-se que o alumínio tem a capacidade de formar complexos com o ácido
glutaminico e passar a BHE depositando-se no cérebro, tendo sido proposto como um
mecanismo para justificar a doença de Alzheimer, baseado na alteração da
permeabilidade da BHE, tendo em consideração que este complexo pode induzir estas
alterações. [88]
Outro factor estudado foi a dislepidemia, isto é, a presença excessiva de
lípidos. Os lípidos são considerados candidatos capazes de alterar a função da BHE e
esta condição parece ser mais prevalente em doentes de Alzheimer que apresentam
danos na BHE, sendo sugerida dessa forma, uma possível relação entre as duas
condições. [89]
Uma das formas encontradas para estudos in vitro da BHE, foi o
estabelecimento de uma linha celular de células endoteliais da microvasculatura
cerebral. As HBMECs (“human brain microvasculature endotelial cells”) é uma dessas
linhas. Estas células foram já usadas para variados estudos envolvendo as funções da
BHE.
Um estudo revelou que a indução por hipóxia de certos factores associados às
células endoteliais pode provocar a produção de IL-8, permitindo a infiltração de
leucócitos. [90] Outro estudo, usando a Streptococcus pneumoniae, que é uma das
maiores causas de pneumonia e meningite, que apesar de terapia antimicrobiana
efectiva, permanece como altamente mortal, tentou determinar as proteínas deste
microrganismo que são chave para o desenvolvimento da meningite, tentando
desenvolver uma estratégia que possa ser adaptada na identificação de genes que
contribuem para esta doença e na atenuação a sua penetração na BHE. [91] Estas
células também foram usadas para estudar a forma de transporte através da BHE de
anti-retrovirais de combate ao HIV e qual a melhor forma de transporte através da
29
barreira de maneira a obter um melhor efeito deste tipo de terapia no combate à
doença. [92] Por estas razões todas, esta linha celular está bem estabelecida como
um modelo in vitro de estudo da BHE e das suas características e interacções.
Stress oxidativo
O stress oxidativo é um desequilíbrio nos sistemas biológicos entre a produção
de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e as enzimas destoxificadoras. Estas
perturbações podem provocar a produção do anião radical superóxido, peróxido de
hidrogénio, dioxigénio singuleto e o radical hidroxilo que podem causar danos em
diferentes componentes como proteínas, lípidos e mesmo DNA.
Stress oxidativo e a doença de Alzheimer
A presença de altos níveis de enzimas antioxidantes associadas as placas
senis sugerem o envolvimento deste tipo de mecanismos na DA. [93] Uma cascata de
eventos que envolve radicais de oxigénio activos e metabolismo mitocondrial parecem
estar envolvidos nesta doença. [94] A agregação da Aβ com metais redox activos já
foram implicados na DA. A metalotionina 3 é desregulada durante a doença e foi
determinado o papel dos diferentes domínios da proteína e a sua função na protecção
do cérebro contra o stress oxidativo. [95] Vias de sinalização de factores associados a
elementos de resposta antioxidantes, como o caso de Nrf2/ARE, são considerados
importantes mediadores na neuroprotecção e possíveis alvos terapêuticos para
doenças como o Alzheimer. [96]
Desta forma, o combate ao stress oxidativo é considerado também como um
possível alvo terapêutico contra a doença de Alzheimer, através da manipulação de
enzimas e substâncias com capacidades antioxidantes.
30
Mercúrio
O mercúrio é um dos metais referidos na TNI. Apresenta-se no estado líquido à
temperatura ambiente e é identificado pelo elemento químico Hg, com número atómico
80 e massa atómica 200.59. É um líquido prateado e inodoro, bom condutor de
electricidade. Como estabelece liga metálica facilmente é muito usado em amálgamas
dentárias. Com o aumento da temperatura torna-se num vapor tóxico e corrosivo. É
um metal perigoso em qualquer tipo de contacto (oral, dérmico ou inalado).
Este metal vem sendo usado na indústria e na medicina há séculos. No caso
da medicina era muitas vezes utilizado, por exemplo, para tratar problemas mentais
graves, como os dois casos referidos por Chisholme em 1813; [97], para tratar casos
de inflamação, como laringite; [98], no tratamento de sífilis; [99] e como forma de
esterilização da pele [100]. Os casos de envenenamento por este metal também já
vêm de há muito tempo. [101] [102]
Devido à sua larga utilização, o mercúrio pode ser encontrado em termómetros,
medidores de pressão arterial, baterias, luzes fluorescentes, interruptores, entre
outros.
O Hg pode-se encontrar em três estados de oxidação: elemental (Hgo),
mercuroso (Hg1+) e mercúrico (Hg2+). Existem bactérias com processos de
destoxificação que reduzem os iões de mercúrio para mercúrio elemental que é volátil,
e é assim removido do sistema. [103]
Os vapores deste metal quando inalados podem facilmente atingir a circulação
sanguínea, onde é oxidado a Hg2+. Os seus efeitos biológicos vão desde citológicos a
neurológicos. A possível associação ao processos carcinogénico, bem como os efeitos
a nível genético ainda não são bem conhecidos, no entanto, existem várias evidências
do efeito do Hg ao nível do DNA.
A grande parte da exposição humana a este contaminante vem da sua forma
orgânica, normalmente metilmercurio ou etilmercurio, de onde se destaca o consumo
de peixe e alguns conservantes de vacinas. [104] Mercúrio está presente na crosta
terrestre e é metilado por bactérias, sendo introduzido na alimentação humana através
desta forma. O MeHg rapidamente atravessa a placenta e a barreira hematoencefálica
e é neurotóxico. O desenvolvimento fetal é em especial muito sensível a esta
exposição e pode causar retardação mental e paralisia cerebral. [105] Também foi
estudado a distribuição visceral deste metal em ratos através de métodos avançados
de microscopia, tendo sido determinado que a maior parte do Hg injectado
31
intraperitonealmente é capturado pelas células Kupffer e que há uma grande
concentração do metal no baço. [106]
Assim sendo, o consumo de peixe contaminado é uma das maiores
preocupações relacionadas com este metal a nível alimentar e pode-se apresentar
como um problema de saúde pública. A biotransformação do mercurio inorgânico, pela
acção de alguns microrganismos, em metilmercurio, é um problema de elevada
relevância devido à sua capacidade de bioamplificação, isto é, a sua concentração vai
aumentando conforme sobe a cadeia alimentar. O SNC é o seu principal alvo e os
sintomas podem ser ataxia (perda da coordenação dos movimentos), parestesia
(perda de sensibilidade nas extremidades), disartria (articulação das palavras), visão
em túnel, perda de audição, cegueira, coma, morte.
Por esta razão, este é um dos contaminantes ambientais mais temidos e
vigiados, especialmente na actualidade, devido a vários problemas de saúde pública
ocorridos no passado. Foi o caso do que aconteceu no Japão, onde foi descrita uma
intoxicação por mercúrio orgânico, doença de Minamata, em 1956, devido ao consumo
de peixe e crustáceos contaminados por metilmercúrio, devido a descargas de uma
fábrica química. [107]
Exposição ao mercúrio
A fonte de exposição mais habitual ao mercúrio inorgânico é através da
utilização das amálgamas dentárias, tanto durante a preparação destas, como durante
o desgaste ao longo dos anos e com a sua remoção. Amalgamas dentárias emitem
vapor de mercúrio que é inalado e entra na circulação sanguínea. [104] Esta é uma
das razões porque este tipo de amalgamas caiu em desuso, tendo sido substituídos
por resinas compostas. Este uso nos trabalhos dentários tem sido alvo de muitas
discussões e controvérsias. O perigo é apresentado não só para os utilizadores, mas
também para os dentistas e assistentes que tinham de preparar as amalgamas e eram
assim de alguma forma expostos ao mercúrio. Existe uma relação já estabelecida
entre os níveis sanguíneos de Hg e respostas do tecido oral. É recomendado, por
exemplo, no caso de mulheres grávidas o adiamento da inclusão ou remoção das
amálgamas dentárias durante a gravidez para evitar os seus efeitos prejudiciais no
desenvolvimento fetal. [108]
Existem diversos estudos acerca dos efeitos deste metal. A sua gama de acção
e efeitos são variados e podem afectar diversos constituintes celulares. Estudos
32
acerca dos efeitos celulares do mercúrio demostraram que linfócitos e linhagens
linfoblásticas celulares tinham menor capacidade proliferativa, de produção de
citocinas e imunoglobulinas. [109] O mercúrio tem a capacidade de se depositar nos
neurónios e células da glia. [110] Outros dos mecanismos pelos quais este metal induz
a neurotoxicidade é através do rearranjo do citoesqueleto de proteínas estruturais do
SNC. [111]
Mecanismo de acção
Também é conhecida a forte afinidade do mercúrio para os grupos sulfidrilo
encontrados nas proteínas. O mercúrio forma rapidamente ligações covalentes com o
enxofre na forma de sulfidrilo, que levam a mudanças de solubilidade, afinidade para
receptores, distribuição e excreção das enzimas e compostos que contêm esses
grupos sulfidrilo. [112] Um estudo acerca dos mecanismos de acção de diuréticos de
mercúrio reportou que estes mudam a permeabilidade da membrana basal das células
tubulares renais, assim levando a um aumento no movimento de iões e que os grupos
SH são importantes na permeabilidade celular aos iões Na+ e água. [113]
A sequência de afinidades, medidas pelas constantes de dissociação, reflectem
a reactividade do Hg com SH, podendo por exemplo, criar o aumento da
permeabilidade a catiões de Na e dessa forma modificar os canais de sódio. [114]
Como o mercúrio tem uma elevada afinidade pelos grupos sulfridrilo reduzidos
isso inclui os da cisteína e glutationa. MeHg-L-cisteína é estruturalmente semelhante
ao aminoácido metionina e é devido a essa semelhança que ele consegue ser
transportado através das membranas celulares. O Hg (maior parte de estudos
efectuados com metilmercúrio) parece ter a capacidade para se ligar à glutationa
formando um complexo MeHg-glutationa que parece ser um substrato para proteínas
que medeiam exportação celular. [115] Também se pensa que o mercúrio se combina
com proteínas depois de entrar no cérebro, o que dificulta depois a sua saída pela
BHE.
33
Acção a nível enzimático
O Hg origina uma depleção dos níveis de várias enzimas antioxidantes, como a
superóxido dismutase, o que por sua vez confere um défice na protecção celular com
relação ao stress oxidativo, e pela acção deste provoca a despolarização da
membrana mitocondrial, levando ao aumento de ROS. Estudos têm sido efectuados
com o objectivo de desenvolver métodos de combate ao stress oxidativo causado pelo
mercúrio, em especial MeHg, como por exemplo, através do aumento da actividade de
enzimas antioxidantes como a glutationa. [116]
Mercúrio e a doença de Alzheimer
Existe também a associação da exposição deste metal e a DA. Alguns estudos
mostraram a existência de níveis mais elevados de Hg no cérebro e sangue de
pacientes com esta doença. Estudos in vitro e experiências em animais mostraram
que mesmos níveis baixos de Hg inorgânico eram capazes de causar detiorações nos
nervos do tipo observado na DA. [117] A sua afinidade para as selenoproteínas e
selénio sugerem que tem a capacidade de induzir a neurodegeneração através da
disrupção da regulação redox. Assim existem várias teorias e suspeitas que o Hg
possa possuir um papel como co-factor para a DA. [118]
É então fácil de entender a importância atribuída a este metal que pertence ao
dia-a-dia humano e que tem tantos potenciais alvos celulares e entender não só a
forma como actua, mas também a melhor forma de combate à sua toxicidade para
minimizar os danos causados à saúde.
Metais pesados e Inflamação
Os metais pesados são compostos que possuem uma elevada relevância na
vida diária. Alguns destes metais são mencionados na TNI como possíveis
contaminantes profissionais cujos riscos devem ser controlados e monitorizados. Entre
os vários efeitos a níveis do organismo que estes provocam, encontra-se a indução de
processos inflamatórios.
34
Ensaios com arsénico demonstraram que genes relacionados com citocinas ou
factores de crescimento associados a processos inflamatórios se encontravam
elevados em situações de exposição a este metal. Através do estudo de linfócitos em
circulação de indivíduos expostos a As foi possível observar o aumento de genes
associados à inflamação. Em humanos, exposição prolongada a arsénico que
acompanha stress oxidativo persistente no sistema vascular pode provocar por sua
vez inflamação. Apesar da migração direccionada de leucócitos por quemocinas, estes
também produzem citocinas pró-inflamatórias que amplificam a resposta inflamatória
na lesão. [119]
A inflamação parece ser desta forma um efeito da exposição ao As. [120]
Várias observações sugerem que a inflamação induzida pela exposição ao As tem um
papel relevante em algumas doenças. A metilação de arsénico na formação de
hemocisteina é um potente activador dos processos inflamatórios. Colectivamente,
efeitos pró-aterogénicos do arsénico podem ser atribuídos pelo menos em certa parte
à indução da inflamação. Descobertas de estudos mecanísticos indicam que isto é
verdade. Disfunção observada em células endoteliais é possivelmente uma
consequência da indução da inflamação por parte do As. [121]
Vários trabalhos indicam que também o Hg provoca processos inflamatórios.
Indivíduos que apresentam uma resposta inflamatória mais elevada encontram-se em
maior risco de contrair certas doenças devido ao aumento da inflamação pela
exposição ao Hg. Especula-se que indivíduos com certas susceptibilidades genéticas
estão mais propensos e em risco a patofisiologias pela exposição ao Hg. [122]
Também foi demonstrado que a exposição a HgCl2 induz a activação de
processos inflamatórios. Em ratos A.SW machos tratados com este metal isto foi
observado. [123]
Estudos em células de mastócitos também mostraram que a exposição a este
metal pesado induz a produção mediadores inflamatórios. [124]
Alterações histopatológicas nos rins e fígados são observadas devido à
exposição a Cd e Pb. Cd ambiental activa vários processos inflamatórios e o
tratamento com Cd produz degeneração e inflamação nos rins. [125]
35
Metais, inflamação e cancro
Os metais pesados são um dos contaminantes que mais preocupam a
sociedade a nível ambiental, representando um risco considerável para a saúde
humana. Nos EUA, a FDA considerou o seguinte: “amalgámas dentárias que contém
mercúrio, que podem ter efeitos neurotóxicos” e desaconselha o seu uso, em especial
em casos de gravidezes e certas doenças. [126] [127] Vários estudos têm sido
efectuados com o intuito de relacionar a exposição a estes contaminantes a certas
doenças, em especial, a cancros. Os mecanismos de acção destes metais variam,
mas parecem existir alguns pontos em comum em relação aos seus efeitos. Doenças
neurológicas também se encontram associadas à exposição a metais pesados, em
especial ao mercúrio, mas existem outros metais que também são suspeitos da
mesma situação, como é o caso do Cd. [128]
A inflamação, é regra geral, uma reacção do organismo no intuito de combater
uma situação adversa, requerendo vários tipos celulares e mediadores. O problema é
quando esta reacção se prolonga por mais tempo que o necessário podendo vir a
causar danos sérios a nível celular. Existem vários tipos de compostos que exercem
este desfecho no organismo, entre agentes biológicos e químicos.
A presença de metais pesados activa muitas vezes factores inflamatórios e
substâncias mediadoras de processos inflamatórios. A persistência da inflamação
pode por sua vez levar a uma situação crónica. A expressão de MT é
induzida/aumentada em vários tecidos por vários mediadores. A acumulação celular
da MT depende da disponibilidade do zinco celular derivado da dieta diária do
individuo. MT modula a ligação e troca/transporte de metais pesados como o cádmio.
As metalotioninas (MT) são induzidas pelo stress da inflamação, os seus papéis na
inflamação são dessa forma óbvios. [129]
O Pb, por exemplo, encontra-se associado a doentes de hemodialise e a
processos crónicos de inflamação. [130] Estudos com As levaram à conclusão que
existe o aumento de genes associados à inflamação.[119] Também o Hg leva à
indução de processos inflamatórios. [119] O Cd também causa este mesmo tipo de
efeitos. [125] Diversos estudos efectuados com o Cd demonstrou que em
concentrações micromolares tem efeitos pró-inflamatórios, através da regulação de
vários marcadores e mediadores. [131]
36
Isto quer dizer que a maior parte dos metais testados causam de uma forma ou
de outra efeitos pró-inflamatórios, seja pela activação de determinados genes, seja
pela excitação de tipos celulares envolvidos na inflamação.
Também se sabe que processos inflamatórios persistentes levam à produção
de ROS, que por sua vez, leva ao stress oxidativo. Esta situação potencialmente pode
danificar moléculas importantes, como é o caso do DNA. Daqui desenrola-se uma
cascata de eventos que vão danificar moléculas e células, podendo levar a graves
alterações do funcionamento do organismo. Em muitas situações, os factores
inflamatórios agravam ainda mais os danos causados pelo ROS. [132] Stress oxidativo
leva à abertura de junções inter-endoteliais e promove a passagem de mediadores
inflamatórios e possível lesão tecidular. [133]
É aceite o facto de a exposição persistente a certos metais ter efeitos
carcinogénicos. [134] Durante os últimos tempos tem-se dado cada vez mais atenção
aos efeitos dos poluentes na saúde humana. Assim a influência deste tipo de metais
em carcinomas tem ganho cada vez mais ênfase. Os efeitos sistémicos dos poluentes
inalados pelo ar são mutagénicos, cancerinogénicos e tóxicos e podem ocorrer vários
distúrbios do sistema imunológico. [135]
A incidência de tumores do rim nos EUA e Europa (em particular, na Europa
Central e Itália) aumentou de forma exponencial na última década levando ao
despertar do interesse dos possíveis factores envolvidos nesta situação. Factores
ambientais têm sido considerados responsáveis pela maior parte das situações
encontradas. Para lançar alguma luz neste assunto foram efectuados vários estudos
que tentaram relacionar a presença de certos metais pesados com estas doenças.
Elevadas concentrações de Cd e Pb em partes adjacentes de rins com estes tumores
sugerem uma forte ligação entre as duas situações. A detecção de metalotioninas,
associadas ao cádmio, indica uma forte relação entre a intoxicação por este metal e o
aparecimento de tumores.
Cádmio é um dos metais pesados mais tóxicos existentes como contaminantes
ambientais. Este metal parece ser responsável por doenças renais, tendo mesmo um
cancro a nível dos rins sido considerado uma doença profissional devido a este facto.
[136]
O cádmio induz nas células tubulares proximais a via de Wnt. Os Wnts são
secretadas para modular a proliferação celular. Este metal causa a carcinogénese
devido à possibilidade de permitir a sobrevivência de células neoplásicas. [137] As
metaloestrogénios são definidas como um grupo de metais pesados que mimicam as
acções do estrogénio. Algumas evidências levam a crer que o cádmio causa
37
carcinogénese da glândula mamária através da via do estrogénio. Vários
investigadores tentaram mapear o domínio do cádmio com o receptor desta hormona
para melhor entender esta relação, tendo-se levantando duas hipóteses: cádmio liga-
se ao ligando do domínio de ligação (LBD); e cádmio pode substituir os iões de zinco
no DNA. Num estudo, aminoácidos específicos do LBD, incluindo alguns muito
estudados, pareciam ser zonas de interacção com este metal. Contudo, uma melhor
análise identificou vários resíduos de cisteína como possíveis alvos. Existe também a
hipótese da ligação dos metais a proteínas e não a receptores de estrogénio. [138]
O cádmio pode induzir a apoptose dependente da p53 nas células epiteliais da
próstata podendo ser um factor de resistência neste tipo de cancro. [139]
Cádmio (Cd), um metal pesado tóxico encontra-se presente nos cigarros.
SLC39A8 (ZIP8), um transportador de zinco, é um portal para a incorporação do metal
no organismo. Foi identificado recentemente que a expressão deste transportador é
controlada pela via NF-kB. Tendo isto como base, foi posta a hipótese que a
inflamação provocada por este metal leva a uma maior absorção do Cd. Foi reportado
que este transportador é um elemento fulcral neste processo de toxicidade.
Tratamento com TNF-α do epitélio primário do pulmão humano e de células A549
induziam a expressão do transportador levando a uma maior morte celular. Inibição da
via NF-kB e da expressão do transportador provocava uma menor toxicidade. Zinco
(Zn), um citoprotector conhecido, previne esta toxicidade. Consistente com
descobertas em culturas celulares, um aumento da expressão deste transportador foi
determinado nos fumadores. A partir destes estudos, foi determinado que a exposição
ao Cd provoca mais morte celular. A partir disto puseram a possibilidade que este
transportador tem um papel importante na exposição ao Cd do fumo do tabaco. [140]
Vários estudos remeteram-se para a possível relação entre certos metais
pesados e a incidência de cancro do pulmão. Exposição a Pb pode afectar o sistema
neuropático central e reprodutivo.
Um estudo sugeriu que mineiros expostos a mercúrio tinham mais propensão
para desenvolver este tipo de cancro. Outro estudo indicou que a razão de incidência
de cancro do pulmão de trabalhadores expostos ao mercúrio também era mais
elevada. Assim parece haver uma relação entre a dose e a resposta de certos metais
pesados e este tipo de cancro. [141]
O Hg parece exercer algumas mudanças especificas nos padrões de excreção
de porfirinas urinárias em animais e humanos. Num estudo, as concentrações de
porfirinas urinárias foram examinadas em crianças com amalgamas dentárias e
observaram uma relação entre a acumulação de Hg e as alterações das porfirinas
38
urinárias com o fardo do corpo de Hg (pentacarboporfirina, precoporfirina, entre
outras). Isto mostra que o Hg é um factor crónico no fardo do organismo. [142] Os
efeitos do Hg em células da microglia foram analisados em termos de viabilidade
celular, formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e certos factores. Este tipo
celular parece ser bastante sensível à exposição com maior produção de ROS em
comparação com astrócitos. Nrf2 e os seus genes downstream foram regulados mais
rapidamente nestas células que deve ter a ver com os seus grupos tiois. [143]
A exposição aos compostos de arsénio leva a alterações pós-translacionais
das histonas e afectam as enzimas que as modulam. [144] [145] As associações de
metais pesados a processos de inflamação e ao desenvolvimento de cancros tem
ganho cada vez mais força e é um campo de investigação em expansão a nível
cientifico.
Enzimas antioxidantes / Selénio
O metabolismo normal do organismo produz constantemente os chamados
radicais livres, que também ocorrem durante processos inflamatórios e em várias
doenças. Estes radicais têm o potencial danoso de modificar moléculas importantes
como é o caso do DNA e esta alteração pode aumentar o risco de desenvolver
doenças cancerígenas.
Os antioxidantes são moléculas capazes de inibir os processos de oxidação
que dão origem aos radicais livres. Níveis baixos destas moléculas ou mesmo a
inibição das enzimas antioxidantes dão origem a um estado de stress oxidativo que
pode danificar ou mesmo matar as células. Como o stress oxidativo parece ser um
componente fundamental de muitas doenças, entre elas, a doença de Alzheimer, o
estudo e a utilização de antioxidantes como forma de combate tem ganho elevada
importância.
No entanto, a função dos antioxidantes não é a de eliminar por completo a
presença de ROS, pois estas moléculas têm também uma função importante no
desenrolar normal dos metabolismos, como sinalizadoras. As espécies reactivas de
oxigénio produzidas nas células incluem o peróxido de hidrogénio, que é um poderoso
oxidante.
Os antioxidantes podem ser classificados em: antioxidantes enzimáticos,
solúveis, nutricionais e sequestradores de metais de transição.
39
Os antioxidantes enzimáticos são considerados a primeira linha de defesa e
contam com a superóxido dismutase (SOD), catálases e glutationa peroxidase (GSH-
Px). A SOD encontra-se no citosol e na mitocôndria; as catálases nos peroxissomas; e
a GSH-Px no citosol, mitocôndria e meio extracelular. Esta última é de especial
interesse. Contém selénio e necessita de selénio proveniente da dieta. Tem como
função converter o peróxido de hidrogénio em água e hidroperóxidos em álcoois
estáveis.
Existem outros factores que parecem também ter efeitos na presença de stress
oxidativo nos tecidos, como é o caso de uma dieta rica em ácidos gordos
polinsaturados, o que indica que os mecanismos antioxidantes podem ser afectados
pela dieta. Elementos de resposta antioxidante possuem a capacidade de mediar a
expressão de genes em células tumorais. [146] Estes elementos regulam vários
antioxidantes e enzimas. Sabe-se também que a expressão da proteína cinase
activada mitogene (MAP) pode induzir respostas antioxidantes. [147]
Tal como referido anteriormente, também existe uma forte ligação entre o
stress oxidativo e várias doenças, em especial neurodegenerativas, e entre estas, a
doença de Alzheimer. A Aβ liga-se a Zn2+, Cu2+ e Fe3+; o Cu interage com estes
depósitos causando parte da neurotoxicidade, originando a redução do metal e a
geração de peróxido de hidrogénio. Por sua vez, o Zn2+ parece ter um papel de
protecção, activando a resposta antioxidante. [148] [149]
Figura 4 – Imagem ilustrativa dos vários factores que podem causar a formação de radicais livres. Luz ultravioleta, radiação ionizante, fumo de tabaco, poluição do ar, processos inflamatórios e a própria respiração. Todas estas circunstâncias levam à produção destes radicais e podem ter como consequência o dano do material genético.
40
Estudos em fungos acerca da indução dos sistemas de defesa contra a
exposição de metais, como o cádmio (Cd) e o Hg foram efectuados, através da análise
de enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase (SOD) e catálase e a GSH.
As concentrações dos metais elevadas correspondiam a concentrações elevadas
destas enzimas. Também determinaram uma correlação negativa significativa entre a
GSH e o Cd e Hg, o que indicava um consumo desta enzima em resposta à exposição
dos metais a um nível que excedia a sua síntese. A GSH também funciona como um
forte agente complexante para Hg2+. [150]
No caso de stress induzido por metais, os compostos que se ligam a metais e
mecanismos de sequestração são a primeira linha de defesa. A segunda linha incluiu
um leque de mecanismos indirectos como o caso dos antioxidantes. Existem cada vez
mais evidências que apontam para o envolvimento de ROS nos mecanismos de
toxicidade do Hg A exposição a Hg é conhecida por estar associada com o aumento
do dano oxidativo e aumento de ROS. [151]
Selénio
O selénio é um elemento químico de símbolo Se, número atómico 34 e massa
atómica 78. Encontra-se normalmente no estado sólido, sendo um micronutriente
considerado essencial para a vida. É antioxidante e ajuda a neutralizar os radicais
livres, estimula o sistema imunológico e encontra-se no aminoácido selenocisteína.
Como referido acima é um constituinte da enzima antioxidante GSH.
Os efeitos fisiológicos deste elemento já vêm sendo estudados há muito tempo.
Um dos primeiros estudos encontrados é acerca dos seus efeitos no glicogénio e nos
níveis de açúcar dos tecidos. [152]
O nível considerado aceitável deste micronutriente é de 400 µg /dia, que
corresponde a cerca de 7.5 µg/Kg de peso corporal. O seu excesso provoca uma
doença conhecida por selenosis. Os sintomas podem ser variados, como um odor a
alho na respiração, distúrbios gastrointestinais, fadiga, e em casos mesmo graves,
cirrose do fígado, edema pulmonar e morte. No entanto, os casos de intoxicação
humana são muito raros.
Existem alguns casos reportados, em especial nos EUA, de casos de
intoxicação de gado durante os anos 40. A razão desse envenenamento estava
associado às plantas que absorviam o Se do solo e eram depois fonte de alimentação
41
dos animais. [153] [154] Também se estudaram malformações causadas em embriões
de galinhas provocadas pela exposição ao Se. Existem alguns trabalhos que apontam
para a ligação entre o Se e o desenvolvimento de cáries. [155]
Mas os casos de problemas e síndromes associados a este antioxidante só se
dão em situações extremas em que ocorre exposição excessiva do mesmo. Tal como
em todas as coisas, o problema encontra-se na dose.
Os benefícios do Se foram também largamente estudados desde há vários
anos. Foi verificado que vários compostos de Se têm uma função de protecção contra
várias doenças e que previnem a necrose do fígado, degeneração necrótica crónica
em ratos e a peroxidação dos rins. Em casos de malnutrição proteica, por exemplo no
porco, quando associados à deficiência de Se e vitamina E, observa-se uma
cicatrização severa pós-necrótica no fígado. [156] Outra característica é a prevenção
de distrofia em animais com dietas baixas em metionina e vitamina E, e prevenção de
lesões neste tecido em animais deficientes em Se e ou vitamina E. [157] [158] Testes
em leitões acerca dos efeitos da deficiência de Se e vitamina E mostraram lesões nos
componentes não musculares e tecido conjuntivo do tecido cardíaco. Alterações nos
fibroblastos, dano vascular progressivo e alterações neuronais. [159] Também em
cordeiros e galinhas se detectou o mesmo tipo de lesões nos tecidos musculares. Em
estudos com ratos provou-se o papel importante do Se na reprodução, pelugem e
desenvolvimento dos olhos. Também parecem haver síndromes associadas ao Se
observadas na presença de vitamina E. Estas deficiências também provocam
problemas a nível da função testicular, com a presença de poucos espermatozóides,
pouca mobilidade e nem mesmo com suplementação de vitamina E ou antioxidantes
existiu uma melhoria, dando força à hipótese de que o Se tem um papel importante na
espermatogénese. [160]
Estudos relativos à função da selenite provaram que este composto é
catalisador da oxidação de compostos sulfidrilo, o que significava que na sua presença
a enzima antioxidante glutationa estava dependente da concentração da selenite e
que quando existem baixos níveis de Se isso corresponde a baixos níveis de GSHPx.
[161] [162] Determinou-se que a forma activa no fígado de rato do Se é o selenido que
se encontra ligado a proteínas na mitocôndria e reticulo endoplasmático liso e que a
presença de elevadas quantidades deste composto estão intimamente associadas à
vitamina E. O selenido faz parte do centro activo de uma proteina microssomal não-
heme contendo ferro e que a vitamina E protege da oxidação. [163] Os antioxidantes
aumentam a utilização de Se da dieta sem afectar as funções antioxidantes da
vitamina E. [164] Também se sabe que o Se é importante para a protecção e
estabilização das membranas biológicas. [165] A importância do Se é reconhecida
42
desde há muito tempo. Pensa-se que tenha um possível papel de protecção contra o
cancro. Também parece existir uma associação entre a deficiência de Se e certas
doenças cardiovasculares. Em porcos com deficiência em vitamina E e Se existe dano
vascular que pode levar à morte. Ratos alimentados com rações deficientes em Se
desenvolvem electrocardiogramas anormais. Se também pode proteger contra a
hipertensão. [162]
Existem também várias teorias em relação à sua função na
prevenção/tratamento de certos cancros. Alguns estudos apontam para as suas
capacidades protectoras, enquanto outros parecem dizer o contrário. O sulfito de
selénio foi testado e determinou-se ser carcinogénico para os ratos F344 e fêmeas
B6C3F1, originando vários tipos de carcinomas. No entanto não foi carcinogénico no
caso dos machos. [166] Mais recentemente, em 2011, um ensaio clinico relativo ao
cancro da próstata foi cancelado devido aos resultados apontarem para um maior risco
de desenvolvimento com a suplementação de Se. [167]
No entanto estudos indicam que os baixos níveis de Se no plasma cria um
risco elevado para o cancro do pulmão e próstata. [168] E que o ácido metilselenico
(MAS) causa a inibição do crescimento de células do cancro da próstata e invasão
celular e ajuda na reparação de DNA. [169]
Claro que um dos aspectos mais relevantes para o presente trabalho é a
capacidade protectora que o Se revela em relação a intoxicações por metais pesados.
Existem estudos utilizando o arsénio (As), em que se verificou que a
administração de amoniato de selénio em dose diária de 0.2mg/kg em ratos expostos
a este metal permitia o aumento da aceleração da eliminação do As do organismo.
[170] Foi também efectuado um estudo para estudar os efeitos do selénio (Se) no
uptake e translocação do Cd na Oryza sativa L. Selénio podia aliviar/agravar a
toxicidade do Cd no arroz dependendo da dose de ambos. Quando o nível de
tratamento de Cd tão baixo quanto 35.6µM inibia o uptake do Cd, mas a níveis mais
elevados, o Se tinha o efeito contrário. [171]
Utilizando o sódio selenite, em situações de intoxicação por mercúrio, foi
determinado que este composto permitia o crescimento, alteravam os níveis de Hg e a
sua distribuição e ainda protegiam contra a mortalidade e a neurotoxicidade de
intoxicações tanto por mercurio orgânico como inorgânico. [172] O Se parece proteger
o fígado e rins de ratos contra a exposição de HgCl2. [173] A razão molar de 1:1 de
mercúrio e selénio incrementada em várias espécies sugere uma relação próxima
entre os dois metais. Esta co-acumulação pode ser uma forma de compensar a
diminuição do Se, aquando a exposição ao Hg em que este se acumula e se liga ao
43
selénio já presente – uma regulação homeostática. A abilidade do Se diminuir a
toxicidade do Hg é conhecida. [174]
A dinâmica da relação in vivo entre Hg e Se é a da formação de complexo
estável entre os dois metais. Estudos efectuados in vivo no fígado de ratos
demonstraram que maior formação destes complexos dá-se se o Se for administrado
anteriormente ao Hg, embora também se vejam no caso da administração conjunta.
Estes complexos ligam-se à superfície dos eritrócitos e dessa forma o Se actua de
forma a contrariar a toxicidade do Hg. [175]
44
2. Materiais e Métodos
Materiais
A linha celular HBMEC foi cedida pelo Dr Kim do Johns Hopkins Children’s
Center. Os metais utilizados HgCl2 (429725) e Na2SeO3 (214485) foram obtidos da
Sigma-Aldrich. Ratos BALB/C foram obtidos da Charles River, Barcelona.
Esta parte do protocolo experimental foi realizada no laboratório de Imunologia
do Instituto de Ciências Biomédicas Dr. Abel Salazar, Porto.
Cultura da linha celular
Descongelamento da linha celular
O criotubo contendo as células manteve-se guardado a uma temperatura de -
80ºC. Para se proceder à sua utilização, estas mesmas células foram diluídas em 10
ml de meio próprio para HBMECs sendo depois centrifugadas a 500g durante 5 min. O
sobrenadante foi rejeitado. Adicionou-se ao precipitado 1ml de meio para a
ressuspensão das células e de seguida mais 8 ml de meio e 1 ml de soro fetal bovino
(perfaz 20% de soro). Colocou-se os 10 ml de suspensão celular num frasco
colagenizado e fez-se a mudança de meio de três em três dias.
Subcultura da linha de células HBMEC
Removeu-se o meio de cultura do frasco a tripsinizar e lavou-se a superfície
revestida de HBMECs, adicionou-se tripsina-EDTA (0.25%) durante 5 min a 37ºC.
Adicionou-se ao frasco o equivalente a 3x o volume de RPMI com 10% SFB.
Ressuspendeu-se as células destacadas e centrifugou-se durante 10min a 500g.
45
Rejeitou-se o sobrenadante e recuperou-se o precipitado em meio de cultura. Contou-
se as células com azul de tripano numa diluição de 1:10 e colocou-se a suspensão à
densidade de 1,0x105 células/ml, em frascos de cultura T75 cm2. As culturas foram
colocadas na estufa a 37ºC com 5%CO2 e o meio foi mudado a cada 2/3 dias.
Estimulação com HgCl2
Após o descongelamento da linha celular, esta tem de ser submetida a uma
passagem, antes de poder ser utilizada para a estimulação. Depois da segunda
passagem, as células HBMECs são recolhidas pelo método descrito acima e passadas
para uma placa de 24 poços a uma densidade de 1,5x105 células/poço, cada poço
com 0,5ml. As células atingem o estado de confluência ao fim de 24horas. O meio é
removido, os poços são lavados com RPMI e adicionado novo meio RPMI completo
com as respectivas concentrações de HgCl2. A Cb é a concentração padrão
correspondente ao valor estipulado pela EU: 7.73x10-11M. O primeiro ensaio foi
desenhado para se estabelecer o efeito baliza do composto, HgCl2. Os poços são
observados no microscópio de contraste de fase para determinar a alteração do
estado morfológico das células devido à estimulação.
Ensaio de viabilidade
Este teste baseia-se na capacidade das células incorporarem e de se ligar ao
corante nos lisossomas.
Das placas de 24 poços retirou-se o meio e lavou-se com RPMI. Adicionou-se
0,5ml do corante Neutral Red e deixou-se a incubar a 37ºC durante 3horas. Retirou-se
o corante e lavou-se duas vezes com PBS aquecido. Adicionou-se 0,5ml de 50%
etanol, 49% de água desionizada e 1% ácido acético glacial durante 10min à
temperatura ambiente. Retirou-se 200µl para ler a absorvância a 540nm.
Esta parte do protocolo experimental foi realizada no laboratório de
Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas Dr. Abel Salazar.
46
Cultura de células da microglia
Culturas primárias de células astrogliais foram preparadas a partir dos
descendentes de ratos Winstar. Os cérebros foram colocados num tampão DPBS frio
contendo 0,2% de glucose. Os hemisférios foram libertados das meninges e vasos
sanguíneos, e lavadas duas vezes com DPBS frio, cortados em pedaços pequenos em
meio de cultura (méio Dulbecco modificado Eagle contendo 3,7g/L NaHCO3, 1,0g/L D-
glucose e glutamina estável, suplementado com 50U/ml de penincilina e 50µg/ml de
streptomicina. Tecido dos dois hemisférios foi dissociado pela trituração em 10ml de
meio de cultura. A suspensão celular obtida foi passada por uma rede nylon de poros
40µm e centrifugada a 200xg durante 5 minutos e o sobrenadante foi descartado.
Centrifugação seguida pela suspensão celular foi repetida duas vezes, e o pellet foi
suspendido em meio de cultura suplementado com 10% FBS e cultivadas a uma
densidade de 2x105células/ml. Culturas foram incubadas a 37ºC numa atmosfera
humificada de 95%ar, 5% CO2 e o meio foi substituído um dias após a preparação e
subsequentemente duas vezes por semana.
As culturas altamente enriquecidas em astroglia foram obtidas pelo tratamento
de culturas confluentes, depois de 20 dias in vitro (DIV), com 8µM Ara-C durante 4
dias, seguida pelo tratamento com 50mM de L-LME durante 90min. A DIV28, dois
tipos de culturas foram obtidas: co-culturas de astrócitos e microglia, quando nenhum
tratamento foi aplicado e culturas altamente ricas de astroglias, quando as culturas
foram tratadas com Ara-C mais LME. Em ambos os tipos de culturas, astrócitos foram
o principal tipo celular, mas o número de células da microglia presentes diferiam entre
os dois tipos de cultura. Culturas foram sincronizadas para uma fase quiescente do
ciclo celular, pela mudança da concentração do soro para 0,1%FBS durante 48h,
sendo usadas em experiências a DIV30.
As culturas da microglia foram obtidas de co-culturas confluentes que foram
agitadas durante a noite a 200rpm. Os sobrenadantes continham células descoladas
foram centrifugados a 290xg durante 10min. O pellet foi suspendido em meio de
cultura contendo 10%FBS a uma densidade de 3x104células/ml. As células foram
plaqueadas em placas de 24poços, e o meio foi mudado uma hora depois, permitindo
uma ligação selectiva da microglia. Depois da sincronização celular durante 48h, as
culturas da microglia e co-culturas foram tratadas com solvente ou ADPβS (0,1mM)
durante 8h. Depois deste período de incubação, o meio foi descartado e substituído
por meio fresco, que foi recolhido 24h depois para ser testado em culturas
enriquecidas de astroglia. Este meio foi chamado de MCM ou CCCM. O meio
47
condicionado obtido das células tratadas com solvente (MCM-S ou CCCM-S) ou MCM-
ADPβS foram testados em ensaios de proliferação de culturas altamente enriquecidas
de astroglias. [176]
48
3. Resultados
Partindo do valor referenciado pela União Europeia, 1.6µg/Kg de peso corporal,
determinou-se o valor em concentração molar correspondente. A partir desse valor,
testaram-se diferentes concentrações de mercúrio inorgânico, HgCl2.
Após as células atingirem o estado de confluência nas placas de 24 poços, o
meio de cultura foi substituído por meio com HgCl2 com as respectivas concentrações,
em triplicado. As culturas foram a incubar a 37ºC.
As observações das alterações morfológicas celulares foram feitas através de
microscopia de contraste ao fim de 30 min, 1h, 2h, 3h, 24h, 48 e 72h. As comparações
entre as alterações foram feitas tendo como padrão os poços controlo.
3.1.A
Na primeira experiência, as concentrações testadas foram um leque mais
abrangente: -10X, Cb, 10X, 100X e 500X. Ao fim de 30 min os poços com as
concentrações 100X e 500X apresentavam morte celular. Todas as outras
concentrações aparentavam manter a morfologia. Ao fim de 72 horas efectuou-se o
teste de viabilidade através de Neutral Red. As percentagens de viabilidade obtidas
para as três concentrações restantes foram de 97,2% para -10X, 86,57% para C0 e
95.8% para 10X. (Tabela 1)
Tabela 1- Tabela elucidativa do ensaio 3.1, com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações -10X, Cb, 10X e 100X.
Concentrações Estado celular
30min
Viabilidade (%)
72h
-10x Viáveis 97,2
Cb Viáveis 86,57
10X Viáveis 95,8
100X Morte celular
500X Morte celular
49
50
Imagem 1 – 1. Foto das células HBMECs na concentração base no tempo 0; 2. Foto das células controlo, sem adição de Hg no tempo 0; 3. Células com concentração base após T 1.45h; 4. Células controlo após T1.45h; 5. Células expostas a 10X Hg a T4h; 6. Células controlo após T4h; 7. Células expostas a 10x após T24h; 8. Células controlo após T27.5h; 9. Células a 10X após T48h; 10. Células com concentração base a T48h; 11. Células controlo T48h; 12. Concentração base a T72h
51
3.2
Na segunda experiência testaram-se as concentrações: Cb, 20X, 50X e 70X.
Ao fim de 72h todas as células aparentavam estar viáveis e os testes deram
viabilidades de 82.1% para C0, 112.4% para 20X, 123.58% para 50X e 104.19% para
70X. (Tabela 2)
Tabela 2- Tabela elucidativa do ensaio 3.2 com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações Cb, 20X, 50X e 70X.
Concentrações Estado celular
72h
Viabilidade (%)
72h
Cb Viáveis 82.1
20X Viáveis 112.4
50X Viáveis 123.58
70X Viáveis 104.19
52
3.3
Na terceira experiência testaram-se as concentrações 25X, 50X, 75X e 100X,
em que contrariando os resultados obtidos anteriormente, em relação à concentração
100X, nenhum dos poços mostrou quaisquer sinais de morte celular. Depois destas
três experiências, procedeu-se ao descongelamento de uma nova ampola da linha
celular. (Tabela 3)
Imagem 2 – 1. Células controlo no T0; 2. Células expostas a concentração base no T0; 3. Células controlo a T1.30h; 4. Células a 70X no T2.30h; 5. Células a 50X no T3.30h; 6. Células expostas a concentração base no T3.30h; 7 e 8. Células controlo a T3.30h.
53
Tabela 3 - Tabela elucidativa do ensaio 3.3, com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações 25X, 50X, 75X e 100X
Concentrações Estado celular
30min
25X Viáveis
50X Viáveis
75X Viáveis
100X Viáveis
3.4.B
Estes novos ensaios foram elaborados com uma nova ampola da linha celular
HBMEC.
Testaram-se as concentrações 25X, 50X, 75X, 100X e 500X, e neste caso dois
poços da concentração 500X apresentavam morte celular, e todos os restantes
permaneciam viáveis. (Tabela 4)
Tabela 4- Tabela elucidativa do ensaio 3.4 com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações 25X, 50X, 75X, 100X e 500X.
Concentrações Estado celular
30min
25X Viáveis
50X Viáveis
75X Viáveis
100X Viáveis
500X Morte celular em dois poços
54
3.5
Noutra experiência utilizaram-se as concentrações: Cb, 10X, 25X, 50X, 75X,
100X e 500X. Ao fim de 1h as células sujeitas à concentração mais elevada
apresentavam morte celular. Ao fim de 48h, o meio foi refrescado e após esta
mudança, todas as células a partir da concentração 25X apareceram mortas. (Tabela
5)
Tabela 5 - Tabela elucidativa do ensaio 3.5, com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações Cb, 10X, 25X e 75X.
Concentrações Estado celular
1h
Estado celular
48h
Cb Viáveis Viáveis
10X Viáveis Viáveis
25X Viáveis Morte celular
50X Viáveis Morte celular
75X Viáveis Morte celular
100X Viáveis Morte celular
500X Morte celular Morte celular
Nota: este resultado é apresentado devido à elevada variâncias de todos os
resultados no geral, embora o autor pondere que no caso deste ensaio especifico
possa ter havido algum erro ou problema durante o refrescamento do meio de cultura.
3.6
Numa nova experiência testaram-se as concentrações 100X, 250X e 500X, em
que nenhuma delas demonstrou sinais de alterações celulares. (Tabela 6)
55
Tabela 6 - Tabela elucidativa do ensaio 3.6, com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações 100X, 250X e 500X.
Concentrações Estado celular
30min
100X Viáveis
250X Viáveis
500X Viáveis
3.7
Em nova experiência, com todas as concentrações referidas até agora, com
excepção da 250X, determinou-se a existência de morte celular a partir da
concentração 50X. Este resultado foi obtido em duplicado. Para estes resultados
efectuou-se o teste de viabilidade, em que se obtiveram os valores: 81% e 87.55%
para C0; 89.4% e 75.2% para 10X; 64% e 80.5% para 25X. (Tabela 7)
Tabela 7 - Tabela elucidativa do ensaio 3.7, com os testes de toxicidade de HgCl2
nas concentrações Cb, 10X, 25X, 50X, 75X, 100X e 500X.
Concentrações
Estado
celular
30min
Placa 1
Estado
celular
30min
Placa 1
Viabilidade
(%)
72h
Viabilidade
(%)
72h
Cb Viáveis Viáveis 81 87.55
10X Viáveis Viáveis 89.4 75.2
25X Viáveis Viáveis 64 80.5
50X Morte celular Morte celular
75X Morte celular Morte celular
100X Morte celular Morte celular
500X Morte celular Morte celular
3.8
56
Decidiu-se efectuar testes de toxicidade e de protecção ao mesmo tempo.
Assim sendo aplicaram-se as concentrações 10X, 25X e 50X com Hg e com Hg e Se.
As células mantiveram-se viáveis durante as 72h. (Tabela 8)
Tabela 8 - Tabela elucidativa do ensaio 3.8, com os testes de toxicidade de HgCl2
e de protecção com Na2SeO3 nas concentrações 10X, 25X e 50X.
Concentrações
Estado celular
72h
Hg
Estado celular
72h
HgSe
10X Viáveis Viáveis
25X Viáveis Viáveis
50X Viáveis Viáveis
3.9
Testaram-se então as concentrações 25X, 50X e 100X com os mesmos
parâmetros. Ao fim de 30min todos os poços que continham só Hg estavam mortos,
assim como os poços de 100X de HgSe. Os restantes apresentavam-se viáveis.
(Tabela 9)
Tabela 9 - Tabela elucidativa do ensaio 3.9, com os testes de toxicidade de HgCl2
e de protecção com Na2SeO3 nas concentrações 25X, 50X e 100X.
Concentrações
Estado celular
30min
Hg
Estado celular
30min
HgSe
25X Morte celular Viáveis
50X Morte celular Viáveis
100X Morte celular Morte celular
57
3.10
Na repetição dos parâmetros anteriores, as células mantiveram-se viáveis em
todas as circunstâncias. (Tabela 10)
Tabela 10 - Tabela elucidativa do ensaio 3.10, com os testes de toxicidade de
HgCl2 e de protecção com Na2SeO3 nas concentrações 25X, 50X e 100X.
Concentrações
Estado celular
30min
Hg
Estado celular
30min
HgSe
25X Viáveis Viáveis
50X Viáveis Viáveis
100X Viáveis Viáveis
3.11
Novas experiências utilizando as concentrações 25X, 50X e 75X com Hg e Hg
e Se resultaram em células viáveis durante as 72h. (Tabela 11)
Tabela 11 - Tabela elucidativa do ensaio 3.11, com os testes de toxicidade de
HgCl2 e de protecção com Na2SeO3 nas concentrações 25X, 50X e 75X.
Concentrações
Estado celular
30min
Hg
Estado celular
30min
HgSe
25X Viáveis Viáveis
50X Viáveis Viáveis
75X Viáveis Viáveis
58
3.12
Suspeitando-se que pudesse existir algum problema com as soluções
utilizadas de HgCl2, procedeu-se a soluções novas e testou-se em concentrações de
75X, 100X e 500X, mas não houve morte em nenhuma destas. (Tabela 12)
Tabela 12 - Tabela elucidativa do ensaio 3.12, com os testes de toxicidade de
HgCl2 nas concentrações 75X, 100X e 500X.
Concentrações
Estado celular
30min
Hg
75X Viáveis
100X Viáveis
500X Viáveis
3.13
Com novas soluções testou-se unicamente a concentração 500X, na qual
deveria observar-se morte celular, mas isto não se verificou. (Tabela 13)
Tabela 13 - Tabela elucidativa do ensaio 3.13, com os testes de toxicidade de
HgCl2 na concentração 500X com diferentes soluções base.
Concentrações Estado celular
30min
500X Viáveis
3.14.C
Procedeu-se ao descongelamento de uma nova ampola de um batch diferente.
Assim com uma cultura de células fresca testaram as concentrações 25X, 50X, 75X e
100X com e sem Se, em duplicado. Ambas as placas apresentaram os mesmos
59
resultados. Na concentração 100X todos os poços estavam mortos, na concentração
75X com adição de Se havia um poço morto. Ao fim das 72 horas fez-se o teste de
viabilidade celular por Neutral Red: 25X, 115% e 99% e com Se, 94% e 164%. Para a
concentração de 50X, só com a adição de Hg, 108% e 98%, e com Se, 87% e 99%;
75X, 97% e 145%, e com Se, 99.8% e 96%. (Tabela 14)
Tabela 14 - Tabela elucidativa do ensaio 3.14, com os testes de toxicidade de
HgCl2 e de protecção do Na2SeO3 nas concentrações 25X, 50X, 75X e 100X.
Concentrações
Estado
celular
30min
Hg
Placa
1
Estado
celular
30min
HgSe
Placa 1
Estado
celular
30min
Hg
Placa
2
Estado
celular
30min
HgSe
Placa 2
Viabilidade
(%)
72h
Hg
Placa 1
Viabilidade
(%)
72h
HgSe
Placa 1
Viabilidade
(%)
72h
Hg
Placa 2
Viabilidade
(%)
72h
HgSe
Placa 2
25X Viáveis Viáveis Viáveis Viáveis 115 94 99 164
50X Viáveis Viáveis Viáveis Viáveis 108 87 98 99
75X
Viáveis
Viáveis,
um
poço
com
morte
celular
Viáveis
Viáveis,
um
poço
com
morte
celular
97
99.8
145
96
100X Morte
celular
Morte
celular
3.15
Repetição de novos ensaios duplicados com as mesmas concentrações
demonstrou numa das placas morte a partir da concentração 50X, enquanto na outra
só um poço estava morto nesta concentração, os de 75X estavam viáveis e os de
100X mortos. (Tabela 15)
60
Tabela 15 - Tabela elucidativa do ensaio 3.15, com os testes de toxicidade de
HgCl2 e de protecção de Na2SeO3 nas concentrações 25X, 50X, 75X e 100X.
Concentrações
Estado
celular
30min
Hg
Placa 1
Estado
celular
30min
HgSe
Placa 1
Estado celular
30min
Hg
Placa 2
Estado
celular
30min
HgSe
Placa 2
25X Viáveis Viáveis Viáveis Viáveis
50X Morte
celular
Morte
celular
Viáveis, um poço com
morte celular
Viáveis
75X Morte
celular
Morte
celular
Viáveis Viáveis
100X Morte
celular
Morte celular Morte
celular
3.C Ensaios com Microglia de rato
Foram efectuados dois ensaios com células da microglia de ratos neonates
com o intuito de cultivar estas células até a um estado mais envelhecido de modo a
ser mais representativo do estado natural nos casos da doença de Alzheimer. Como é
óbvio, os doentes de Alzheimer são pacientes com idades mais avançadas em que o
estado fisiológico celular não é igual a indivíduos mais novos. Assim para os testes
serem o mais próximos da realidade, era imperativo conseguir manter as células
viáveis por mais tempo de modo a alcançarem uma maior maturidade.
As células foram recolhidas de ratos neonates e mantidas de acordo com o
protocolo descrito acima. Das três tentativas feitas não foi possível manter as células
em cultura por mais de duas semanas. Determinou-se que com este protocolo não é
possível cultivar células propicias para realizar estudos sobre doenças associadas ao
envelhecimento. O grande interesse nestes testes seria exactamente verificar os
efeitos do mercúrio e selénio em células com características semelhantes ao que
acontece in vivo. Não sendo possível manter as células da microglia em cultura tempo
suficiente para atingirem a maturidade pretendida, foi concluído que não havia
interesse em proceder aos testes com os metais.
61
4. Discussão
O objectivo deste trabalho experimental era observar os efeitos do mercúrio
inorgânico (HgCl2) em diferentes concentrações em culturas de células endoteliais do
cérebro e o possível efeito protector e terapêutico da selenite de sódio (Na2SeO3).
O mercúrio é um dos maiores contaminantes ambientais e por isso levanta
sérios problemas a nível de saúde pública e suscita interesse em termos de
investigação acerca dos seus efeitos. Muitas vezes não é sequer possível detectar
com rapidez e eficácia a existência deste poluente. Um dos casos mais documentados
é a contaminação de peixe por este metal. Foi o caso de Minamata, no Japão, onde
várias pessoas ingeriram peixe com mercurio, com graves consequências na sua
saúde. [107] Outro caso foi o da utilização do mercúrio para a extracção de ouro na
Indonésia, que levou a um estudo acerca do impacto a nível do ecossistema. [177]
A indústria é uma das maiores contribuintes para esta situação, embora cada
vez haja maior regulação acerca da eliminação de metais pesados para o ambiente.
De todos os metais pesados, o mercúrio é talvez o que se encontra mais espalhado a
nível mundial. Mas isto não quer dizer que outros metais pesados não se encontrem
também em grandes quantidades no ambiente.
Este metal está presente em muitas actividades humanas, sendo um factor de
risco em várias profissões e encontrando-se contemplado na TNI no que diz respeito a
doenças profissionais causadas pela sua exposição. A gravidade de cada exposição
tem sempre em consideração quer as concentrações do metal como o período de
exposição, e estes factores vão assim determinar os efeitos e a gravidades dos
mesmos na saúde humana.
Ironicamente, no fim do século XIX e início do século XX vários compostos à
base de mercúrio eram usados a nível medicinal para tratar maleitas do foro físico e
psíquico. Mas rapidamente se entendeu que os problemas associados à exposição
deste metal eram demasiado danosos para se ignorar. Vários casos foram reportados
devido a problemas de saúde devido a este uso.
Existem já várias evidências que parecem relacionar a possível exposição ao
mercúrio inorgânico e o desenvolvimento da doença de Alzheimer. [118] Vários
estudos, em diferentes aspectos, demonstraram que a exposição ao Hg leva a certas
reacções características desta doença. Por exemplo, certas experiências
demonstraram que a exposição in vitro a este metal promove a agregação da proteína
62
Tau, uma das proteínas associadas à doença de Alzheimer. [178] Para além disso,
vários pacientes com esta doença também revelam valores mais elevados de Hg no
plasma. [179] E também se sabe que o mercúrio, mesmo em baixas concentrações,
pode causar mudanças nas células nervosas, outra característica típica desta doença.
[180]
É do conhecimento científico que este metal pesado tem a capacidade de
passar a barreira hemato-encefálica e de se acumular no cérebro com graves
consequências, tanto a nível de formação do feto durante a gravidez, como na vida
adulta. [105] Os efeitos neurológicos da exposição ao mercúrio são vastos, e vão de
lesões leves até à morte. O sistema nervoso central é o órgão mais vulnerável à sua
toxicidade, embora não seja o único. Assim a associação da acumulação de mercúrio
no cérebro a efeitos de neurodegeneração que, por sua vez, possam conduzir a
doenças como a doença de Alzheimer foi considerada como uma hipótese lógica a
ponderar e tem sido alvo de diversos estudos.
Além das doenças neurodegenerativas e dos efeitos a nível do SNC, a
exposição a metais pesados também se encontra associada ao desenvolvimento de
carcinomas. A associação de Cd e Pb a carcinomas do rim tem sido largamente
investigada e cada vez mais evidências apontam exactamente nesta direcção, em
especial, devido ao facto de este tipo particular de carcinoma se estar a tornar cada
vez mais frequente. [136] Também se associou à carcinogénese da glândula mamária
e da próstata.[138] [139] Como o Cd também se encontra presente nos cigarros, a sua
associação ao cancro do pulmão foi outro passo óbvio na investigação cientifica
acerca dos seus efeitos. Assim, é fácil de entender a importância que estes metais têm
na nossa vida.
Como a linha celular HBMEC tem a propriedade de mimetizar a barreira
hemato-encefálica, isso fez destas células um alvo indicado para estudos de
toxicidade, de modo a se tentar relacionar os possíveis efeitos do Hg a nível da BHE e
dessa forma tentar contribuir com mais um esclarecimento na direcção do seu papel
no desenrolar da DA, conciliando os conhecimentos dos danos celulares causados por
este metal e a sua capacidade de passar a barreira.
O stress oxidativo é outra característica importante tanto na doença de
Alzheimer como na exposição ao mercúrio, sendo um marcador quase constante em
ambos. [93] [116]
Uma das formas mais eficazes de combate ao stress oxidativo é através da
utilização de substâncias antioxidantes, como é o caso de compostos à base de
selénio, cujo poder antioxidante é já largamente conhecido. [161] [162]
63
Experiências anteriores provaram que o Se se combina com o Hg, formando
compostos estáveis que dessa forma diminuem a toxicidade deste metal. O Se quando
adicionado previamente à exposição ao Hg tem um elevado potencial protector. Estes
estudos foram efectuados in vivo em ratos em relação aos efeitos a nível de danos no
fígado. [175] O selénio apresenta-se desta forma como uma possibilidade de combate
aos efeitos nefastos do mercúrio, pelo menos, no referente ao fígado. Assim sendo é
um forte candidato ao papel de potencial terapêutico à intoxicação por este metal
pesado.
Assim seria de elevado interesse determinar se esta formação de complexos e
consequente protecção também ocorreria a nível do cérebro, podendo dessa forma
ser uma maneira de proteger e mitigar os efeitos nefastos do Hg a nível da BHE e de
proteger o cérebro contra a estimulação da doença de Alzheimer causada pela
intoxicação do metal. Foi com esse objectivo que este trabalho experimental foi
elaborado.
Assim o primeiro objectivo deste trabalho teve como propósito expor culturas
HBMECs a diferentes concentrações de HgCl2 de modo a se determinar a partir de
que níveis estas seriam letais, estabelecendo dessa forma “o efeito baliza” da sua
acção.
Os resultados obtidos desses ensaios foram incongruentes e instáveis, como é
possível ver na secção de resultados anteriormente mostrados. O operador dos
ensaios foi sempre o mesmo, a autora. Ao fim de várias tentativas pôs-se a hipótese
de existir algum problema com a linha celular. Por isso, por duas vezes, se procedeu
ao descongelamento de nova ampola, mas esta solução provou não ser a resposta,
eliminando-se dessa forma essa dúvida e possibilidade.
Era de esperar que as células expostas ao HgCl2 levasse a uma diminuição da
viabilidade celular, quanto maior a concentração do metal assim menor seria a
viabilidade celular. Ao mesmo tempo era de esperar que o Se exercesse um efeito de
protecção. Não era de estranhar que a partir de uma certa concentração este efeito
deixasse de existir, devido a um efeito demasiado tóxico do mercúrio; no entanto, não
foi isso que se verificou.
Outra das opções consideradas foi a possibilidade das soluções de HgCl2 não
estarem em perfeitas condições. De modo a eliminar essa opção foram feitas novas
soluções de metal, que foram testadas em diferentes concentrações, mas mesmo com
essas novas soluções, os resultados continuaram a ser inconstantes. A conclusão
chegada foi de que a alternância de resultados também não se devia às soluções de
mercúrio utilizadas.
64
O estabelecimento do modelo in vitro com a linha celular HBMEC deve
obedecer a certas características que são indicadoras do bom funcionamento do
modelo. Existem duas características que são mencionadas em vários artigos como
baselines para a determinação do estado celular da linha, que são a resistência
eléctrica transendotelial e a permeabilidade paracelular. [181] [182]
A impermeabilidade da BHE pode ser avaliada pela permeabilidade a certas
substâncias ou pela medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER). A
permeabilidade paracelular é outra das características que revela o estado das
propriedades do modelo. Normalmente, a redução da TEER e o aumento da
permeabilidade paracelular são sinais da perda de propriedades da barreira. Tanto
uma característica como a outra exigem equipamentos específicos, como os Transwell
e leitores de fluorescência como FLUOstar Omega. [183]
Existem alguns autores que não utilizam esta linha celular a não ser que esta
se encontre dentro de um específico intervalo de TEER, [184] podendo esta ser uma
possível razão para se obter resultados tão díspares na presença do Hg. Se as células
não se encontrarem dentro desse intervalo, isso significa que estas perderam algumas
das propriedades características da BHE. O ideal para essa situação seria cultivar as
células num Transwell, sendo esta a única forma de medir a TEER, mas devido às
limitações financeiras do financiamento do trabalho de mestrado, isso seria impossível.
Dessa forma, uma das possíveis conclusões em relação aos resultados obtidos é a
possibilidade de as células em certos ensaios não se encontrarem em suas plenas
capacidades fisiológicas, o que levaria à obtenção de resultados contraditórios.
Outra hipótese a considerar é que a membrana das células endoteliais não se
encontre nas melhores condições fisiológicas, alterando a actividade dos receptores
SH, já que estes são um dos alvos do mecanismo de acção do Hg. [185] Se os
receptores SH não estiverem na conformação correcta, o metal não será capaz de se
ligar e assim exercer a sua toxicidade, o que explicaria porque em alguns ensaios as
concentrações mais elevadas causavam morte celular num curto espaço de tempo e
em outros, nem ao fim de 72 horas se viam os efeitos tóxicos.
Como os ensaios com as HBMECs não apresentavam resultados uteis,
decidiu-se aplicar os mesmos parâmetros com outro tipo celular, as células da
microglia. Estas células também têm um papel de extrema importância na doença da
Alzheimer, sendo as principais responsáveis pelos processos inflamatórios que
ocorrem na doença. Mas para se poder aplicar esses ensaios à doença de Alzheimer,
seria necessário cultivar células da microglia de ratos adultos e não neonates. Todos
os protocolos existentes para a cultura da microglia são referentes e aplicados a ratos
neonates. No entanto, considerando que a doença de Alzheimer é uma patologia
65
associada ao envelhecimento, a utilização de células jovens é de pouco valor cientifico
para obter resultados que possam ser considerados representativos da situação em
estudo. O que se fez foi aplicar o protocolo de neonates a ratos adultos. O problema
foi que não foi possível manter a cultura de células, perdendo estas a viabilidade e
tornando impossível fazer os ensaios com o HgCl2. Desta forma não foi viável o estudo
dos efeitos deste metal em células da microglia como modelo de estudo para a doença
de Alzheimer.
Entretanto foi publicado um novo protocolo experimental com o propósito de
cultivar células da microglia de animais adultos. [186] A questão relacionada com este
novo protocolo é que exigia reagentes e materiais mais caros e ainda não estava
implementado no laboratório. Segundo os autores, este novo método permitirá a
recolha e cultura deste tipo celular especifico sem perda das suas características.
Dessa forma, a aplicação deste protocolo ficará para uma oportunidade futura.
Embora não se tenham obtido resultados viáveis, este trabalho experimental
permitiu levantar e pôr algumas hipóteses acerca dos efeitos do mercúrio em células
humanas do cérebro e abrir caminho para uma futura investigação mais aprofundada.
66
5. Perspectivas Futuras
Numa investigação futura seria de elevado interesse, em primeiro lugar,
verificar se a inconsistência de resultados com a linha celular HBMEC se deve mesmo
à variação do estado fisiológico das células, através da medição dos potenciais
membranares com a utilização de Transwells como suporte.
Por outro lado, também seria interessante verificar o estado de alguns
receptores membranares cuja existência afecta a forma como o mercúrio se liga e
actua na célula.
Claro que depois da certificação dos dados acima referidos, o ideal será a
realização de novos ensaios com todos esses parâmetros controlados e determinar o
efeito do mercúrio e o possível papel protector do selénio na sua toxicidade.
Por fim, a aplicação do novo protocolo para a cultura de células da microglia
adulta é muito relevante num projecto futuro devido ao papel destas células na doença
de Alzheimer e através deste método verificar também o efeito do mercúrio na
produção, por exemplo, de citoquinas inflamatórias e também do efeito protector que o
selénio poderá ter na sua acção.
O objectivo de tentar relacionar a intoxicação por mercúrio com a indução da
doença de Alzheimer e também os possíveis efeitos protectores do selénio neste
mecanismo, mesmo assim, a importância deste metal na saúde humana é indiscutível.
Uma das áreas de maior investigação neste momento é acerca dos seus efeitos no
desenvolvimento de certos tipos de cancros. Um desses cancros é o cancro do rim já
que tem ganho bastante ênfase a nível médico e que por isso tem sido alvo de
variadas pesquisas.
O cádmio, em termos de estudos acerca de cancro renal, tem sido o metal
mais estudado. Os mecanismos por detrás ainda são alvo de muitos estudos e
actividades de investigação. Enquanto interacções directas com o DNA parecem ser
de menor importância, elevados níveis de ROS mostram ter efeitos nestes processos.
Existem outros processos para além destes envolvidos, como é o caso da resistência
aos processos apoptóticos. Dentro deste contexto, este metal parece ter efeitos por
exemplo, a nível da reparação de nucleótidos. Os mecanismos na sua totalidade ainda
não são totalmente claros, mas a ligação entre estes dois factores ganha força a cada
estudo. É de supor que outros metais que partilhem dos mesmos efeitos.
67
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82
Anexo
Protocolo de von Bernhardi R, Tichauer J, Eugenín-von Bernhardi L.
“Proliferating culture of aged microglia for the study of neurodegenerative diseases.” J
Neurosci Methods. 2011;202(1):65-9
I. Aged Microglia Proliferation Culture Protocol.
Microglial Cell Isolation (Steps 1-14)
1. Prepare digestion cocktail (10 ml per brain): HBSS (Ca/Mg free), with 0.05%
collagenase D and 2,400 U Kunnitz DNase I.
2. Prepare an isotonic percoll solution (SIP) at 70%, 37% and 30%.
3. Anesthetize mice with 120 mg/kg ketamine / 20 mg/kg xylazine and perfuse them
through the left ventricle with 30 ml of ice-cold HBSS. The brains are collected
immediately after perfusion in ice-
cold HBSS.
4. Cut brains in 1mm3 pieces and then strain them through 150 and 60 μm steel mesh
filters. Brain homogenates from 2 or 3 mice are transferred to a 50 ml conical tube,
washed with HBSS + 3% FBS, and centrifuged at 170g, at 25ºC for 10 min.
5. Remove supernatant. Resuspend pellet in 10 ml of digestion buffer.
6. Gently agitate cell suspension at 37ºC for 30 min.
7. Stop digestion by adding 40 ml of HBSS + 3% FBS. Gently resuspend the cells.
8. Centrifuge at 170g, at 25ºC for 10 min. Gently discard supernatant.
9. Resuspend pellet in 4 ml of 37% SIP (Percoll - Sigma, St. Louis, MO).
83
10. Transfer the cell suspension with 4 ml of 37% SIP to 15 ml conical tubes and slowly
underlay 4 ml of 70% percoll. On top of the 37% layer slowly pipette 4 ml of 30%
percoll, followed by 2 ml of
HBSS.
11. Centrifuge gradient at 1,410 g for 20 min without braking.
- The gradient should be kept at 15–18 ºC during centrifugation.
- Centrifuge must stop without brake to avoid disturbance of the interphase.
- The 70%-37% interphase should have a defined white halo containing the microglial
cell fraction.
12. Using a transfer pipette, gently remove the layer of debris (to decreased
contamination of the cell fraction by debris) and collect 2.0–2.5 ml of the 70%–37%
interphase into a clean 50-ml conical tube.
13. Rinse the cell fraction by adding 45 ml of HBSS + 3% FBS to reduce the percoll
contained in the interphase. Mix gently by inversion (10 times). Centrifuge at 400g for
10 min. Eliminate the supernatant
14. Rinse the pellet with 10 ml of complete culture medium (DMEM supplemented with
10% FBS and 20% LADMAC conditioned medium with penicillin + streptomycin. Mix
gently by inversion (10 times). Centrifuge at 400g for 10 min. Eliminate the
supernatant.
Proliferation Culture of Microglial Cells (Steps 15-22)
15. Resuspend pellet in 1.2 ml of Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM,
GIBCO) supplemented with 10% FBS and 20% LADMAC conditioned medium with 100
units/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (GIBCO, Life Technologies, USA)
(preparation of conditioned medium in supplementary methods). Mix gently.
84
16. Plate 200 μl of the resulting cell suspension per well in a 24-well flat bottom tissue
culture plates.
- Wells have to be previously coated with poly-l-lysine (SIGMA) overnight. After
coating, rinse several times with abundant sterile distilled water.
- Add 200 μl of complete culture medium to each well and let it equilibrate in the
incubator at least for 30 min before adding the cell suspension.
- NOTE: Cells can be also seeded on 35 mm-Petri dish. In this case, plate 600 μl of cell
suspension on a poly-l-lysine coated Petri dish containing 600 μl of previously
equilibrated complete culture media. Further treatment is similar to the protocol
described for the 24-well plate, after correcting for the corresponding volumes.
17. Incubate at 37°C, 5% CO2 in a water saturated atmosphere.
18. At day 2 after plating, remove 200 μl and add 300 μl of complete culture medium.
During the first week, change half the media every other day. After the first week media
replacement is done twice a week.
19. Check for appearance of cell foci. There are isolated extended cells by day 3. Big
cell foci with poorly attached round cells are abundant by week 3-5. Plates with big foci
rich in loose cells are adequate for cell expansion.
20. To expand the cultures, remove the culture media (save the media, it will be used
to seed the sub cultured cells). Tripsinize the cultures with trypsin-EDTA 0.25% and
0.01% DNAse for 15 min. Stop digestion with complete culture media. Centrifuge at
400g for 10min. Eliminate the supernatant.
21. Resuspend the pellet in the previously saved conditioned media + complete culture
media. Cells obtained from each well of the 24-well plate can be expanded into 6 wells
of the same size or into one 35 mm-Petri dish. It is not necessary to coat the well with
poly-l-lysine. Change half the culture media every 2 days until reaching the desired
density. Normally the cultures will be nearly confluent at around 2-3 weeks.
22. Add 500 μl of fresh media to the original cultures and replace half the culture media
twice a week. Cells can be harvest again in 2-3 weeks (Step 18).
85
II. LADMAC Conditioned Medium Preparation Protocol.
1. Prepare Complete LADMAC growth medium: α Minimal Essential medium (α MEM;
GIBCO 11900-024) supplemented with 3.7 gr/L NaHCO3 (final pH 7.2), 10% heat
inactivated FBS, 2 mM L-Glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM Sodium
Piruvate, 100 units/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
2. Seed LADMAC cells at a density of 1 x 106 viable cells/ ml in a T75 flask containing
15 ml of complete growth medium.
3. Culture the flask in an upright position. Check cell concentration every 2 days,
adding enough media to maintain the cell concentration at 1 x 106 viable cells/ ml.
Usually 10 ml of complete LADMAC growth medium are needed every 3 days.
4. After 7-9 days, collect all medium (including LADMAC cells, which are mostly non-
adherent) to a 50 ml conical tube.
5. Centrifuge at 200g for 10 min. Collect supernatant and reserve the cell pellet.
6. Filter the conditioned media with a 0.2 μm pore, low protein adhesion filter and keep
under sterile conditions at 4ºC.
NOTE: Pool several batches of conditioned media for more consistent results. Aliquot
in 50 ml tubes and store at –20 ºC.
7. Resuspend the cell pellet in 10 ml of complete medium. Count the cells in a
hemocytometer.
8. Adjust the cell density of the suspension to 2 x 105 viable cells/ ml and start the
preparation of conditioned medium again (step 2).
III. Functional Evaluation of Aged Microglia in Culture.
2.3 a. Microglial cell cultures obtained from neonatal animals -Neonatal microglia were
isolated as previously described (von Bernhardi et al. 2007) from the brains of 2-3-day-
old mice. Cortices were minced and incubated in trypsin-EDTA and DNAse and
86
subjected to mechanical disruption. The cell suspension was plated in 75 cm2 1%
penicillin/streptomycin, GIBCO). After 14-28 days of culture, microglial cells were
isolated and purified. After 15 min of seeding, non-attached cells were removed by
extensive washing. Cell identity was confirmed by cytochemistry, using an isolectin B4
from Griffonnia simplicifolia (Sigma St. Louis, MO), which recognizes microglia and a
polyclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP; DAKO Z0334 A/S, Denmark) to
identify astrocytes.
Activation of microglia was evaluated through their response to 1 μg/ml
lipopolysaccharide (LPS) stimulation, assessing cell identity by immunocytochemistry
and expression of GFP, morphological changes, production of nitrites, respiratory burst
and induction of phagocytic activity by TGFβ (methods described in supplementary
information). Lack of labeling for GFAP indicated the absence of astrocyte
contamination.
2.3b Indirect Immunocytochemistry - Cells were plated at a density of 1.5-2 x 104
glass cover slips in 24 multiwell plates. After exposure to LPS, cells were washed in
PBS and fixed in 4% Para-formaldehyde in PBS for 30 min. Cells were permeabilized
when required with PBS-0.2% Triton X-100, blocked with 10% goat serum in PBS and
then incubated at 4ºC overnight with one of the following antibodies: rabbit anti GFAP
serum (1:400, DAKO, Denmark), mouse anti-MHC-I (1:400, Santa Cruz Biotech),
mouse anti-MHC-II (1:400, Pharmingen BD) or fluorescein isothiocyanate (FITC)-
conjugated lectin Griffonnia simplicifolia (1:200; Sigma). With the exception of the
samples labeled with lectin, cover slips were incubated with the corresponding
fluorochrome-conjugated secondary antibody (Molecular Probes, USA), in the dark at
room temperature for 2-4 cell culture flasks in complete media (DMEM/F12, 10% FBS,
and grown on h. Nuclei were stained with 0.1 μg/ml Hoechst 33258 (SIGMA B2883).
Cover slips were washed in PBS after each antibody incubation step. Before mounting
in Fluorescent Mounting Media (Dako, Carpinteria, CA) samples were rinsed with PBS
and water. As standard practice, to discard the possibility of non-specific binding,
control assays, where the primary antibody was omitted, were run in parallel. Cells
were viewed and photographed with an immunofluorescence inverted microscope
(Leica DMIL, Germany).
2.3c Determination of Nitrites - NO2
87
brief, 100 μL of cell incubation media was mixed with 10 μL of H2O and 10 μl of an
EDTA solution (0.5 M, pH 8.0), followed by addition of 0.12 ml of freshly prepared
Griess reagent (20 mg N-(1-
naphtyl)-ethylendiamine and 0.2 g sulphanilamide dissolved in 20 ml of 5% (w/v)
phosphoric acid).
Absorbency was measured at 570 nm in a micro plate auto reader (BIO-TEK
Instruments, USA).
Calibration curves were established with 1 - 80 μM of NaNO2.
2.3d Respiratory burst assay - Production of O2
tetrazolium (NBT assay) into a blue precipitate (Rook et al. 1985). Cells were cultured
in fresh medium or hippocampal-Cm. Inflammatory glial cell activation was elicited by
addition of 1μg/ml LPS, for 24 h at 37°C. After this time the culture medium was
replaced with NBT, 1 mg/ml, in phenol-red-free DMEM/F-12 containing 1mg/ml BSA.
Respiratory burst was triggered with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 150 ng/ml
(Sigma) for 1 h. Next, glial cell cultures were fixed with 100% methanol at room
temperature. The crystals were dissolved with 50 µl 1:1.15 2M KOH/ DMSO (Sigma)
and absorbency was read at 645 nm in a micro plate auto reader (ANTHOS 2010,
Anthos Labtec).
2.3e Phagocytosis assays – 2 x 104 microglial cells were plated on glass cover slides
and incubated for up to 2 days at 37 ºC. For the assessment of phagocytic activity,
cells were exposed to Cy3-Aβ for 3 h. Cells were fixed with 4% Para-formaldehyde at
room temperature for 30 min, nuclei were stained with 0.1 μg/ml Hoechst 33258
(SIGMA B2883). Cells were viewed and photographed with was determined by the
Griess assay (Pfeiffer et al. 1997). In was assessed by the reduction of nitro blue an
immunofluorescence inverted microscope (Leica DMIL, Germany). Analysis of the
number of phagocytic cells as well as Aβ uptake were assessed with the ImageJ (NIH).
2.3f Statistical Analysis - The significance of the differences in nitrite and super oxide
production, and phagocytosis at the different ages was obtained by a Kruskal-Wallis
one-way ANOVA. Once determined as significant, the statistical significance of the
differences among different microglial cellage was analyzed with the Mann-Whitney U-
88
test. Relevance of both age and stimuli condition was evaluated by a two-way ANOVA.
Statistical significance was established for p<0.05.