aÇÃo do laser de baixa potÊncia na produÇÃo de...

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA

IDÁLIA APARECIDA WALTRICK DE BRITO SIQUEIRA

DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS POROSAS À BASE DE PDLLA/NANOTUBOS DE CARBONO: nHAp PARA REGENERAÇÃO ÓSSEA

São José dos Campos, SP 2015



Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos requisitos necessários para obtenção do título de doutora em Engenharia Biomédica.

Orientador: Prof.Dr. Anderson de Oliveira Lobo Co-orientador: Prof.Dra. Fernanda Roberta Marciano

São José dos Campos, SP 2015



Tese de Doutorado apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de

Doutor em Engenharia de Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade

do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:

Presidente: Prof. Dra. Fernanda Roberta Marciano (UNIVAP)___________________

Orientador: Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo (UNIVAP) _____________________

Membro Externo: Prof. Dr. José Evaldo Corat (INPE) _________________________

Membro Externo: Prof. Dr. Irimar de Paula Posso (USP) ______________________

Membro Externo: Prof. Dr. Koshun Iha (ITA) ________________________________

Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa

Diretora do IP&D- UNIVAP

São José dos Campos, 24 de fevereiro de 2015.

Dedico o presente trabalho à minha família,

aos meus amigos e aos meus orientadores.

Agradecimentos

Agradeço a Universidade do Vale do

Paraíba pela oportunidade de

crescimento profissional.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Anderson

de Oliveira Lobo, pela confiança e

paciência, por proporcionar vivências

que contribuíram para meu

desenvolvimento profissional, pela

forma exemplar como conduziu esse

trabalho e pela oportunidade de

trabalhar ao seu lado.

Agradeço a minha co-orientadora,

Profª. Drª. Fernanda Roberta

Marciano, pela atenção, dedicação e

disponibilidade para ensinar.

Ao Prof. Dr. Evaldo José Corat, por

disponibilizar seu laboratório no

INPE para preparação dos

biomateriais.

Ao Prof. Dr. Marcus Corat, por toda

paciência e ensinamentos na cirurgia

e fisiologia de pequenos animais.

Aos Prof. Dr. Mario Ferreti Filho e

Profª. Drª. Eliane Antonioli, pela

colaboração e ensinamentos na

pesquisa para regeneração

osteocondral.

Ao Prof. Dr. Bruno das Neves

Cavalcanti, pela ajuda, colaboração e

ensinamentos nos ensaios celulares.

Ao prof. Dr. Airton Abrahão Martin,

pela ajuda e colaboração nas técnicas

de Raman Confocal e FTIR.

Aos Prof. Dr. Newton Soares da Silva

e Profª. Drª. Cristina Pacheco Soares

pela ajuda e colaboração nos ensaios

celulares e bactericidas.

Aos Profª. Drª. Rosário Elida Suman

Bretas e o Dr. Wilson Neto, pela

ajuda nas análises de Calorimetria

diferencial exploratória e revisão

dos artigos.

Ao Dr. Hudson Zanin, pela ajuda e

colaboração nos artigos

complementares a tese.

Às Profª. Drª. Luana Marotta Reis

Vasconcellos e Profª. Drª. Yasmin

Rodarte Carvalho pelos ensinamentos

de histologia.

Ao Prof. Dr. João Paulo B. Machado

pelos ensinamentos de Difração de

Raio X.

Aos Prof. MSc. José Benício de

Almeida e Profª. Drª. Emília Angela

Loschiavo Arisawa, pela oportunidade

de monitoria de docência no curso de

enfermagem da Faculdade de Ciências

da Saúde-UNIVAP.

Ao Prof. Dr. Irimar de Paula Posso,

pelo auxílio e toda colaboração na

fase inicial do doutorado.

À Profª. Drª. Maria Belén Salazar

Posso, pela amizade, pelos conselhos

pessoais e profissionais.

Aos Prof. Dr. José Carlos Cogo e

Prof. Dr. Wellington Ribeiro pela

orientação na fase inicial do

doutorado e pelos ensinamentos na

pesquisa com animais.

Às Profª. MSc. Ana Lúcia G. de G.

Sant’Anna e Profª. MSc. Vânia de

Araújo Giaretta, minhas orientadoras

na graduação, pela amizade, apoio e

incentivo sempre.

Aos Prof. Dr. Marco Antonio de

Oliveira e Profª. Drª. Josane Mittman

pela amizade e pela disponibilidade

em ensinar sempre.

Aos meus pais, Eloir e Brito (in

memorian), meu infinito

agradecimento. Foram as pessoas que

me ensinaram valores e também me

ensinaram a ousar, questionar e ter

curiosidade. Obrigada pelo exemplo

pessoal e profissional.

Ao meu amor e melhor amigo, Pablo,

por toda dedicação, por sempre estar

ao meu lado: você sabe como é

importante para mim!

Aos meus colegas e amigos da UNIVAP,

Carla, Marcele, Lívia, Felipe,

Marina, Tayra, Lilian, Tati, Aline,

Letícia, Amanda, prof. Toni, Luciana,

Roberta, Edvana, Patrícia, Ingrid,

Thiago, Cristiane, Isabela, profª.

Luciene, Ciliana, Marcos, pela

companhia e obrigada por tornarem os

meus dias de trabalho melhores.

Em especial, à minha amiga Juliana

Guerra, pela companhia, por sempre me

escutar e dividir comigo todos os

momentos. Desde o mestrado, nos

tornamos mais que amigas, somos irmãs

de coração.

À Beatriz que se mostrou uma grande

amiga, presente em todos os momentos.

E para a Nelly, que foi uma das

pessoas que eu mais gostei de

trabalhar junto, divertida, animada e

que me fez companhia até nos meus

experimentos em São Paulo.

Aos funcionários da UNIVAP, pelo

comprometimento e dedicação.

Às CAPES, FAPESP (2011/17877-7 e

2011/20345-7), CNPq (474090/2013-2) e

FVE pelo apoio financeiro.

À Purac, que gentilmente cedeu os

polímeros para a realização desta

pesquisa.

À TA Instruments, pela análise de

TGA.

“Tenha a coragem de te servir de teu próprio entendimento. Eis a divisa das luzes.”

Kant


RESUMO

O estudo da produção e aplicação biológica de materiais bioreabsorvíveis é de grande relevância, pois o emprego destes biomateriais apresenta vantagens médicas e econômicas para a prática ortopédica. Neste estudo apresentamos a incorporação de nanopartículas no polímero biorreabsorvível a fim de melhorar significativamente as propriedades de superfície, consequentemente a interação com o meio biológico e promover a osseointegração. Para tanto, as membranas porosas de estruturas "do tipo colméias" com a incorporação de hidroxiapatita/nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente alinhados superhidrofílicos (VACNT-O:nHAp) foram produzidas com condições de umidade controlada. As nanopartículas VACNT-O:nHAp dispersas no polímero foram obtidas por duas diferentes metodologias: eletrodeposição e imersão em fluido corporal simulado (SBF). Um simples e rápido tratamento de superfície com plasma de oxigênio foi realizado para melhorar as propriedades hidrofílicas. O nanocompósito foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura, perfilometria óptica, ângulo de contato e espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR). Os nanocompósitos PDLLA/VACNT-O:nHAp apresentaram modificações de superfície, como textura, aumento da rugosidade e característica hidrofílica. O método de imersão em fluido corporal simulado (SBF) foi utilizado para avaliar as propriedades de bioatividade e a biomineralização, assim como a cultura de osteoblastos humanos e defeitos ósseos foram realizados para avaliar a regeneração óssea. Os nanocompósitos de PDLLA/VACNT-O:nHAp são biocompatíveis, promovem osseointegração e melhoraram as propriedades de biomineralização. A técnica de espectroscopia Raman confocal e histologia confirmaram o alto potencial deste biomaterial como arcabouço para a regeneração óssea. Palavras-chaves: Nanotubos de Carbono. Nanohidroxiapatita. SBF. Regeneração

óssea. PDLLA e cultura de osteoblastos.

DEVELOPMENT OF POROUS SCAFFOLDS BASED IN PDLLA/CARBON NANOTUBES: nHAp FOR BONE REGENERATION

ABSTRACT

The study of production and biological application of bioresorbable materials has been important due to medical and economic advantages for the use in orthopedic practice. In this study, we produced polymer membranes with incorporation of nanoparticles in order to improve the surface properties and the interaction with the biological medium, as well as promote osseointegration. For this, PDLLA honeycomb films with incorporated hydroxyapatite/superhydrophilic vertically-aligned multiwalled carbon nanotube (VACNT-O:nHAp) composites was produced by controlled humidity. The VACNT-O:nHAp dispersed in the polymer was obtained by two different syntheses: electrodeposition and immersion in simulated body fluid. A simple and fast oxygen plasma treatment was performed to improve hydrophilic properties. The nanocomposite characterizations were performed by scanning electron microscopy, profilometry, contact angle, and attenuated total reflective Fourier transform infrared spectroscopy. PDLLA/VACNT-O:nHAp nanocomposites improve the texture and increase the surface roughness, and the oxygen plasm treatment gives the material a hydrophilic characteristic. In vitro bioactivity and biomineralization was evaluated and the Human osteoblast cell culture and bone defects were used to evaluate the bone regeneration. nHAp/carbon nanotubes/PDLLA scaffolds are biocompatible, induce bone remodeling and the increase of biomineralization properties. The confocal Raman spectroscopy and histological results, confirmed high potential as scaffolds to bone tissue regeneration Key-words: Carbon nanotubes, nanohydroxyapatite, SBF, bone regeneration,

PDLLA and osteoblast culture.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

3D - Estrutura tridimensional

Ag - Prata

ATR-FTIR – Espectroscopia de

reflexão total atenuada no

infravermelho com transformada de

Fourier

BMP- Proteínas morfogênicas do osso

BRU - Unidade de remodelamento

Ca2+ - Cátions de Cálcio

CaCO3 - Carbonato de cálcio

fosfato

CaCl2.2H2O- Cloreto de cálcio

CCD - Dispositivo de carga acoplada

CEMIB- Centro Multidisciplinar para

investigação biológica na área da

ciência em animais de laboratório

UNICAMP-Universidade Estadual de

Campinas

CH4 - Metano

CO2- Gás carbônico

CNT - Nanotubos de carbono

DSC- Calorimetria diferencial

exploratória

EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-

acético

FDA- Administração de alimentos e

medicamentos

FT-Raman-Espectroscopia Raman

com transformada de Fourier

GPa - GigaPascal

HAp – Hidroxiapatita

HCl- Ácido clorídrico

HMDS - Hexametildisilazano

nuclear

i.p- Intraperitonial

INPE-Instituto de Pesquisas Espaciais

Kappa β nuclear

LAS-Laboratório de Associado de

Sensores e Materiais

LEVB-Laboratório de Espectroscopia

Vibracional Biomédica

M-CSF- Fator estimulador de colônia

as macrófagos

MEV - Microscopia eletrônica de

varredura

MET - Microscopia de transmissão

Mg2+ - Cátions de Magnésio

MgCl2-Cloreto de magnésio

MWCVD-Microwave Plasma Assisted

Chemical Vapor Deposition

NaCL-Cloreto de sódio

NaOH - Hidróxido de sódio

NaHCO3-Bicarbonato de sódio

Na2HPO4.2H2O- Fosfato dissódico

NCP- Proteínas não colágenas

nHAp - Nanohidroxiapatita

nHAp1- Nanohidroxiapatita produzida

por eletrodeposição

nHAp2 - Nanohidroxiapatita produzida

pela imersão em SBF

INPE-Instituto de Pesquisas Espaciais

OPG - Osteoprotegerina

PBS - Solução salina tamponada com

fosfato

PDLA- Poli (D-ácido láctico)

PDLLA - Poli (DL-ácido láctico)

PDLLA/VACNT-O:nHAp - Compósitos

à base de Poli (DL-ácido láctico),

nanotubos de carbono de múltiplas

paredes e nanohidroxiapatita

PCL - Poli (ε-caprolactona)

PGA - Poli (ácido glicólico)

pH- Potencial Hidrogeniônico

PLA – Poli (ácido láctico)

PLLA - Poli (L-ácido láctico)

PLGA – Poli (ácido lactico-co-glicólico)

PTH - Paratormônios

RANK- Receptor ativado do fator

RANKL- RANK ligante

ROG - Regeneração ósseo guiada

rpm- Rotações por minuto

SBF - Fluido corporal simulado

sccm - Centímetros cúbicos padrão

por minuto

SUS - Sistema Único de Saúde

SWCNT - Nanotubos de carbono de

paredes únicas

VACNT - Nanotubos de carbono de

múltiplas paredes

VACNT-O:nHAp - nanohidroxiapatita/

Nanotubos de carbono verticalmente

alinhados de múltiplas paredes

superhidrofílicos

TGA - Análises termogravimétrica

TGβ - Fator de crescimento β

UNESP-Universidade Estadual

Paulista

UNIVAP-Universidade do Vale do

Paraíba

v.o- Via oral

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Organização do tecido lamelar. ................................................................ 23

Figura 2 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário (OP) e periósteo (P) (100x). .... 25

Figura 3 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário - osteoblastos (seta) e trabéculas com osteócitos (T) (100x). ......................................................................................... 25

Figura 4 - Lâmina mostrando Tecido ósseo primário - osteoblasto (seta) e osteóide (O) (400x). ................................................................................................................. 26

Figura 5 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário: osteoblasto (Ob) e osteócito em formação (seta) (400x). ............................................................................................. 26

Figura 6 - Lâmina mostrando osteoclasto (Oc) e osteoblasto (seta) (400x). ............. 27

Figura 7 - Desenho esquemático de uma fibra de colágeno mineralizada. Cristais de nanohidroxiapatita (verde) incorporados entre as triplas hélices de colágeno (cilindros brancos). .................................................................................................... 29

Figura 8 - Esquema simplificado de remodelamento ósseo. ..................................... 32

Figura 9 - Mecanismo de Remodelamento ósseo. .................................................... 33

Figura 10 - Mecanismo de remodelamento ósseo, ação antagonista da OPG. ........ 34

Figura 11 - Ilustração de como os conhecimentos de materiais, biologia, medicina e engenharia devem ser integrados para alcançar a regeneração de tecidos. ............ 38

Figura 12 - Estereoisômeros do ácido láctico............................................................ 40

Figura 13 - Fórmula do polímero PDLLA. .................................................................. 40

Figura 14 - Rota metabólica de bioreabsorção do PDLLA. ....................................... 41

Figura 15 - Esquema de um nanotubo de parede múltiplas. ..................................... 44

Figura 16 - Micrografia de apatitas globulares produzidas pela precipitação em SBF. .................................................................................................................................. 45

Figura 17 - (a) seção transversal, detalhes de nanocristais de nHAp. (b) detalhes de nanocristais nHAp do tipo placa após o processo de eletrodeposição. ..................... 46

Figura 18 - Perspectiva da aplicação in vivo de membranas desenvolvidas nesta tese. .......................................................................................................................... 52

Figura 19 - Ilustração do conjunto do reator de microondas de alumínio anodizado.54

Figura 20 - Diagrama esquemático do reator para crescimento dos VACNT. ........... 54

Figura 21 - Reator de plasma de O2. ........................................................................ 55

Figura 22 - Montagem do anodo para eletrodeposição de HA. ................................. 56

Figura 23 - Ilustração da célula de deposição de fosfato de cálcio. .......................... 57

Figura 24 - Potenciostato utilizado no processo de eletrodeposição. ........................ 58

Figura 25 - Shaker utilizado para incubação das amostras durante o processo de biomineralização. ...................................................................................................... 60

Figura 26 - Equipamento de ultrassom (SONICS, VCX500W) utilizado na dispersão das nanopartículas. ................................................................................................... 61

Figura 27 - Esquema da produção das membranas. ................................................ 63

Figura 28 - Plaqueamento para os ensaios celulares (a) e Marcação para SRB (b). 71

Figura 29 - Ilustração de região de implante de PDLLA/VACNT-O:nHAp em osso interparietal de camundongos. .................................................................................. 74

Figura 30 - Micrografias coletadas, a partir de (a) VACNT-O, detalhes da esfoliação do VACNT-O (a.1) e VACNT-O, verticalmente alinhado (a.2); (a) micrografias coletadas por MEV. (a.1 e a.2) micrografias coletadas por MET. ............................. 78

Figura 31 - Micrografias coletadas a partir de (b) nHAp1 (eletrodepositadas), detalhes da morfologia de placas (b.1 e b.2). (b e b.1) micrografias coletadas por MEV. (b. 2) micrografias coletadas por MET. ............................................................ 79

Figura 32 - Micrografias coletadas a partir de (c) nHAp2 (imersão em SBF), detalhes da morfologia globular (c.1 e c.2). (c e c.1) micrografias coletadas por MEV. (c. 2) micrografias coletadas por MET. ............................................................................... 80

Figura 33 - Micrografias (MEV) e perfilometria das membranas antes e depois das nanopartículas incorporadas. (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que (1) perfilometria. ............................................ 82

Figura 34 - Análise de ângulo de contato de todas as membranas produzidas com e sem nanopartículas incorporadas. O PDLLA sem nanopartículas foi utilizado como controle. Os dados foram coletados a partir de 3 amostras (n=3). ............................ 84

Figura 35 - Espectros FTIR-ATR de membranas PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/ VACNT-O:nHAp2. Todos os espectros foram coletados em três pontos diferentes................................................................................................................... 85

Figura 36 - Os termogramas obtidos por calorimetria diferencial exploratória das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2........ 87

Figura 37 - Análise termogravimétrica das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. ...................................................................... 90

Figura 38 - Micrografia de varredura eletrônica de estruturas de (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após o processo de biomineralização. ...................................................................................................... 91

Figura 39 - Espectro de FTIR coletados de membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em solução que simula o fluído corporal (SBF) por 14 dias. ....................................................................................... 92

Figura 40 - Difratograma de Raios X da superfície de membranas (a) PDLLA e (b) PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O: nHAp2 imersas em SBF durante 14 dias. ...................................................................................................................... 93

Figura 41 - Análise de viabilidade celular de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que * indica p<0,05.................................................................................................... 95

Figura 42 - Análise da fosfatase alcalina de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2, sendo que *•□♦ indicam p< 0,05. ............................................................................... 96

Figura 43 - Fotomicrografia de lâminas histológicas que identificam a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) A regeneração óssea após o implante das membranas de PDLLA como controle (H&E, 40x); (a.1) detalhes em círculos (H&E, 100x); região de interface entre o primeiro e o osso (*) e seta indica fibroblastos. (b) a regeneração de osso após o implante PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (H&E, 40x); (b.1) região de interface entre o polímero e o osso (*), células gigantes fagocitárias em setas (H&E, 100x). (c) regeneração completa de defeito ósseo após a implantação de PDLLA/VANCT-O: nHAp1 (H&E, 40x). (c1) MB indica a formação de medula óssea (H&E, 100x). .................................................................................. 99

Figura 44 - Micrografias do osso na região de estudo mostram a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) a regeneração óssea após a implantação das membranas de PDLLA como controle; (a.1) detalhes em círculos da região de interface entre o polímero e oso (*) e a seta indica fibroblastos. (b) a regeneração óssea após a implantação das membranas PDLLA/VACNT-O nHAp1; (b1) detalhes de polímero parcialmente degradado. (*) e camada de hidroxiapatita carbonatada em setas. (c) regeneração óssea completa após a implantação de PDLLA/VACNT-O: nHAp2. (c1) detalhes de osteoblastos nos quadrados e a camada de hidroxiapatita carbonada indicada pelas setas. .................................................. 100

Figura 45 - Um espectro representativo de Raman coletado de seção óssea após quatro meses da implantação das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. .................................................................................... 101

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição química da solução para eletrodeposição ........................... 57

Tabela 2 - Concentrações dos reagentes para solução de SBF 5x .......................... 59

Tabela 3 - Análises da rugosidade de superfície das diferentes membranas porosas produzidas. Dados expressos em média de 3 membranas (n = 3) ........................... 82

Tabela 4 - Componentes de energia de superfície e livre interfacial de adesão das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2........ 86

Tabela 5 - Parâmetros Térmicos de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp ..................................................................................................................... 87

Tabela 6 - Relação carbonato/fosfato coletadas a partir de espectros FTIR em PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 ................................ 92

Tabela 7 - O tamanho de cristalito de nHAp formados na superfície de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em SBF durante 14 dias ....................................................................................................................... 94

Tabela 8 - Comparação de valores de picos FWHM de fosfato e carbonato com PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção osso extraído após quatro meses. Os grupos são significativamente diferentes, p <0,05 (One Way Anova) .......................................................................................... 102

Tabela 9 - Comparação da razão de fosfato/prolina; fosfato/amida III; fosfato/amida I e carbonato/amida I de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção óssea extraída após quatro meses. Os grupos são significativamente ................................................................................. 103

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19 1.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 21 1.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 21 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 22 2.1 Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos ............................ 22 2.1.2 Osseointegração ............................................................................................ 30 2.2 Biomateriais reabsorvíveis: um desafio para a aplicação ortopédica .......... 35 2.2.1 Polímeros Bioreabsorvíveis: PDLLA ............................................................ 38 2.2.2 Nanocompósitos poliméricos: PDLLA, Nanotubos de Carbono e Hidroxiapatita .......................................................................................................... 42 3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 53 3.1 Produção das nanopartículas para dispersão ................................................ 53 3.1.1 Síntese dos nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente alinhados (VACNT-O) .............................................................................................. 53 3.1.2 Síntese de VACNT-O:nHAp1 por eletrodeposição ...................................... 56 3.1.3 Síntese de VACNT-O:nHAp2 por imersão em SBF ...................................... 58 3.1.4 Dispersão de nHAp/VACNT-O em PDLLA .................................................... 60 3.1.5 Esquema da produção das membranas ....................................................... 62 3.2 Ensaio de bioatividade in vitro ......................................................................... 64 3.3 Caracterização das Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp ......................... 64 3.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura e Transmissão.................................. 64 3.3.2 Perfilometria óptica ........................................................................................ 65 3.3.3 Análise da porosidade ................................................................................... 65 3.3.4 Calorimetria diferencial exploratória ............................................................ 65 3.3.5 Termogravimetria ........................................................................................... 66 3.3.6 Espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR) ..................................................................... 66 3.3.7 Análises de ângulo de contato ...................................................................... 67 3.4 Caracterização da Bioatividade ....................................................................... 69 3.4.1 Microscopia eletrônica de varredura ............................................................ 69 3.4.2 Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier utilizando reflectância total atenuada (ATR-FTIR) ................................................................. 69 3.4.3 Difração de Raios X ........................................................................................ 70 3.5 Ensaios biológicos in vitro ............................................................................... 70 3.5.1 Cultura de células........................................................................................... 70 3.5.2 Ensaio de citotoxicidade ............................................................................... 71 3.5.3 Ensaio de fosfatase alcalina .......................................................................... 72 3.6 Estudo in vivo .................................................................................................... 72 3.6.1 Animais ........................................................................................................... 72 3.6.2 Acondicionamento dos animais ................................................................... 73 3.6.4 Anestesia e Defeito ósseo ............................................................................. 73 3.6.5 Eutanásia ........................................................................................................ 74 3.6.6 Retirada do tecido ósseo ............................................................................... 75 3.6.7 Análise espectroscópica ............................................................................... 75 3.6.8 Análise histológica ......................................................................................... 76 3.6.9 Microscopia Eletrônica de Varredura ........................................................... 76 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 77 5 CONCLUSÕES .................................................................................................... 106 6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .................................................. 107

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 108 ANEXO A –CARTA DE ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS ................................................................................................................. 130 ANEXO B- ARTIGOS PUBLICADOS ..................................................................... 131 ANEXO C- ARTIGO ACEITO ................................................................................. 132 ANEXO D - ARTIGOS E RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS SOBRE O TEMA ..................................................................................................... 133 ANEXO E - ARTIGO PREMIADO EM CONGRESSO ............................................ 135

19

1 INTRODUÇÃO

Novas tecnologias para o desenvolvimento de biomateriais tem proporcionado

uma revolução na prática médica. Atualmente, estima-se que o mercado mundial de

biomateriais envolverá aproximadamente 88,4 bilhões de dólares em 2017, com uma

taxa de crescimento anual média de 15%, estes dados são resultado do aumento de

incentivos governamentais, avanços tecnológicos e o aumento das atividades de

pesquisa nesta área (MARKETS; MARKETS, 2013).

Pesquisas apontam que no Brasil, o mercado de biomateriais atingirá a 1,7

bilhões de dólares em 2015, sendo somente na área de materiais ortopédicos uma

progressão estimada de 17,2% de 2010 para 2015 (MARKETS; MARKETS, 2013).

Segundo os dados obtidos pelo DATASUS, são altos os gastos com órteses,

próteses e materiais especiais em 2014, até o mês de novembro (BRASIL, 2014).

Estes valores refletem a necessidade de pesquisas para o desenvolvimento de

materiais com melhor custo e efetividade.

Dentre os biomateriais, as membranas poliméricas têm sido pesquisadas como

substitutos ósseos devido às vantagens da biocompatibilidade, reabsorção,

bioestimulação do osso e também porque não há a necessidade de uma intervenção

cirúrgica para a remoção do implante (AN; WOOLF; FRIEDMAN, 2000; MEROLLI et.

al, 2001; LIM, AURAS; RUBINO, 2008; BEACHLEY; WEN, 2010; TIAN et al., 2012).

O Poli (DL-ácido láctico) (PDLLA) é um polímero biocompatível e biodegradável,

com um tempo de degradação rápido e controlável (MEROLLI et. al, 2001;

BEACHLEY; WEN, 2010; ZOU et. al, 2012). No entanto, este polímero tem

propriedade hidrofóbica (CHEN et al, 2003; ALVES et al, 2008), que compromete as

interações primárias com o meio biológico. Além disso, o polímero tem uma baixa

resistência mecânica (NAIR; LAURENCIN, 2007), o que limita a aplicação na

medicina regenerativa óssea, por conseguinte, a formação de nanocompósitos

poliméricos podem melhorar a interação de células e as propriedades mecânicas.

A resposta fisiológica aos biomateriais depende das propriedades físico-

químicas, bem como o local de implante e a interação com o meio biológico. Durante

este processo, o tecido conjuntivo pode ser formado na superfície do material e este

tecido pode comprometer a formação de osso, portanto faz-se necessário a

20

implantação de um biomaterial osteocondutor que promova a osseointegração

(EGGERS; MEEDER, 1994; NADE, 1994).

Com o objetivo de promover a osseointegração, vários estudos investigaram

como implementar propriedades osteocondutoras nos biomateriais, tais como a

incorporação de nanopartículas osteoindutivas e tratamentos de superfície, sendo

que a dispersão de nanotubos de carbono (CNT) e hidroxiapatita (HAp) na matriz

polimérica é uma alternativa para melhorar as características físico-químicas do

polímero e biomimetizar o tecido ósseo (URAL et al., 2000; ZHENG et al., 2006;

FENG et al., 2008; SPITALSKY et al., 2010; SHAO et al., 2011; LIU et al., 2012).

Lobo et al. (2010) desenvolveram nanopartículas biomiméticas e estas foram

avaliadas em cultura de células. Por exemplo, nanotubos de carbono

superhidrofilicos verticalmente alinhados (VACNT-O) são promissores para

aplicações biomédicas, por suas propriedades de resistência mecânica, elevada

estabilidade química e funcionalização (FENG et al., 2008; SPITALSKY et al., 2010;

SHAO et al., 2011). A produção de nanofibras com CNT dispersos em matriz de Poli

(L-ácido láctico) (PLLA) resultou em um arcabouço condutor elétrico que melhorou a

interação com osteoblastos (SHAO et al., 2011). Além disso, as nanopartículas

osteoindutivas como nanohidroxiapatita (nHAp) podem ser depositadas sobre

VACNT-O por métodos de baixo custo, tais como a eletrodeposição e a imersão em

solução de SBF (LOBO et al., 2010; LOBO et al., 2011b), afim de melhorar as

propriedades osteoindutoras e de bioatividade. Um método rápido e homogêneo

para produzir nanocompósitos de VACNT-O:nHAp foi demonstrado por Lobo et al.

(2010), este biomaterial apresentou propriedades interessantes de biomineralização

e de adesão dos osteoblastos humanos assim como a formação de osso lamelar in

vivo (LOBO et al., 2010; LOBO et al., 2011a; LOBO et al., 2013).

O processo de biomineralização de VACNT-O foi investigado por Marsi et al.

(2012), como resultados foram obtidos nanocristais de apatita sobre a superfície dos

VACNT-O após a imersão em solução de fluido corporal simulado (SBF) (MARSI et

al., 2012; BARRERE et al., 2002a). Os dados mostraram a formação de uma

camada densa de nHAp com uma morfologia semelhante a nHAp globular biológica,

além da adesão e proliferação celular na superfície (MARSI et al., 2012). Também

foi demonstrado que nHAp obtidas pelo método de eletrodeposição são

21

biocompatíveis, bioativas e ainda melhoram a adesão de osteoblastos, por

consequente a regeneração óssea in vivo (LOBO et al., 2013).

Neste estudo, apresentamos duas novas metodologias simples e de baixo custo

para obtenção de membranas porosas parcialmente hidrofílicas de PDLLA, ambas

apresentaram o aumento de rugosidade a partir da incorporação de nanopartículas

de VACNT-O:nHAp na matriz polimérica. Para tanto, o método para obter estruturas

do “tipo colmeias” (do inglês honeycomb) com condição de umidade controlada foi

utilizado para produção de poros na superfície das membranas. Estes novos

nanocompósitos foram funcionalizados por tratamento com plasma de oxigênio para

obtenção das propriedades de hidrofilicidade em sua superfície. Estas propriedades

foram relacionadas com a bioatividade in vitro, com o processo de biomineralização,

adesão das células e a osseointegração.

1.1 Objetivo Geral

O objetivo principal dessa tese é o desenvolvimento de membranas porosas

biocompatíveis a base de PDLLA/VACNT-O:nHAp com propriedades de bioatividade

para a osseointegração.

1.2 Objetivos Específicos

-Produzir e caracterizar membranas porosas parcialmente hidrofílicas de

PDLLA/VACNT-O:nHAp.

-Verificar a citocompatibilidade e biomineralização das membranas porosas de

PDLLA/VACNT-O:nHAp utilizando osteoblastos humanos. -Avaliar a osseointegração das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp

no processo de reparo do tecido ósseo em um modelo de defeito na calvária de

camundongos por meio da espectroscopia Raman e Histologia.

-Caracterizar por meio de espectroscopia Raman os componentes minerais e

orgânicos do preenchimento do tecido ósseo após implante do biomaterial em

modelo de defeito na calvária de camundongos.

22

2 REVISÃO DE LITERATURA

Neste capítulo é apresentada a fundamentação teórica referente ao presente

estudo, abordando seções teóricas sobre o sistema esquelético e tecido ósseo, sua

morfologia e estrutura, remodelamento e osseointegração, assim como a motivação

para o estudo e aspectos relacionados ao desenvolvimento do biomaterial.

2.1 Tecido ósseo: aspectos morfológicos e histofisiológicos

O tecido ósseo possui grande capacidade regenerativa, composto de células

ativas e matriz mineralizada, apresenta funções de sustentação, auxílio na

mobilidade física, depósito de cálcio e fósforo, hematopoiese e proteção para os

tecidos moles (DÂNGELO; FATTINI, 2006; LAFITA, 2003; PARK et al., 2009). O

conjunto de ossos e cartilagens denominado esqueleto, possui um sistema de

alavancas que associado ao sistema muscular permite o deslocamento (DÂNGELO;

FATTINI, 2006).

A renovação óssea não acontece de maneira uniforme em todo o esqueleto, este

é dividido em apendicular e periférico. O esqueleto apendicular é constituído

principalmente de ossos corticais compactos, que formam os membros do corpo,

enquanto que o esqueleto axial é composto por ossos da cabeça, pescoço e tronco

(tórax e abdome), que contém trabéculas dentro de um córtex fino (DÂNGELO;

FATTINI, 2006).

O osso trabecular lembra a forma de uma colmeia, a medula óssea e lipídeos

estão entre interstícios intratraberculares, o tecido ósseo é revestido por uma

camada de tecido conjuntivo e células pavimentosas denominada endósteo. A

renovação celular no osso axial é facilitada devido à superfície mais densa e a

presença de células precursoras da medula óssea (GILMAN et al., 2006; DÂNGELO;

FATTINI, 2006; KIERSZENBAUM, 2004).

O tecido ósseo é classificado macroscopicamente em esponjoso ou compacto. O

osso esponjo é a região trabecular enquanto o osso compacto aparece como uma

massa sólida. Microscopicamente, a matriz extracelular é dividida em osso lamelar

(secundário) maduro com lamelas concêntricas dispostas ao redor de um canal

vascular e osso não lamelar (primário) em desenvolvimento, com disposição

23

irregular, não organizada das fibras colágenas e menor quantidade de cristais de

hidroxiapatita (KIERSZENBAUM, 2004; COTRAM; KUMAR; COLLINS, 2005;

SOLTAN; SMILER; CHOI, 2009).

Na figura 1, observa-se o osso lamelar que é constituído por matriz óssea e

osteócitos, apresenta os sistemas harvesianos ou osteons consistem em um

conjunto de lamelas dispostas ao redor de um canal vascular. Estes canais

vasculares podem ter duas orientações, quando transversais são denominados

canais de Volkmann (KIERSZENBAUM, 2004; SOLTAN; SMILER; CHOI, 2009).

As fibras colágenas mineralizadas formam as lamelas (3-7mm de largura), estas

podem se agrupar em arranjos de 3-8 lamelas em camadas concêntricas em torno

do sistema harversiano. Este sistema aparece como um cilindro de 200-250mm de

diâmetro. As lamelas também podem revestir o osso em arranjos de camadas

espessas circunferenciais externas em empilhamento (150-300mm) (RHO; KUHN-

SPEARING; ZIOUPOS, 1998).

Figura 1 - Organização do tecido lamelar.

Fonte: Adaptado de Kierszenbaum, 2004.

24

O osso é revestido pelo periósteo composto por duas camadas, interna

osteogênica e externa de fibras colágenas, vascularizadas e fibras colágenas que

penetram até as lamelas circunferenciais externas, as chamadas fibras de Sharpey,

conforme pode ser visto na figura 1 (KIERSZENBAUM, 2004).

O tecido ósseo é um tecido conjuntivo especializado formado por três tipos

celulares e um material mineralizado, a matriz óssea. Este conjunto forma um tecido

de sustentação resistente à pressão resultante dos componentes da matriz óssea

(STEVENS; LOWE, 2000).

Os tipos celulares osteoblastos, osteócitos, osteoclastos, as células progenitoras

de tecido ósseo e a matriz óssea mineralizada são constituintes do tecido ósseo

(LAFITA, 2003). Descritos cada um a seguir:

Osteoblastos: Células mononucleadas, núcleo esférico e citoplasma basófilo. São

as células responsáveis pela formação de colágeno, proteoglicanas e glicoproteínas,

formam o osteóide da matriz óssea e bem como sua mineralização. Também são

precursores dos osteócitos e participam ativamente no processo de remodelamento

ósseo (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009), conforme Figuras 2, 3 e 4.

Após a formação da matriz orgânica pelos osteoblastos, os osteoblastos fixos

nesta matriz emitem vesículas, estruturas arredondadas produzidas a partir da

membrana plasmática dos osteoblastos, liberadas e aderidas na matriz orgânica.

Estas vesículas são os sítios de nucleação da nHAp, são encontradas isoladas na

matriz, contém glicoproteínas e apresentam marcação para fosfatase alcalina.

Entende-se que a fosfatase alcalina hidrolisa os fosfatos disponibilizando para o

interior das vesículas e a concentração de cálcio aumenta através dos fosfolipídios

de membrana. Assim quando estas vesículas se rompem, ocorre a mineralização

extensa da matriz orgânica (MANOLAGAS, 2000; KATCHBURIAN; CERRI, 2002).

25

Figura 2 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário (OP) e periósteo (P) (100x).

Fonte: Rheingantz e Machado, 2015.

Figura 3 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário - osteoblastos (seta) e trabéculas com osteócitos (T) (100x).


Osteócitos: Células derivadas dos osteoblastos, que se comunicam entre si,

localizadas nas trabéculas, responsáveis pela secreção de substâncias para a

manutenção do tecido (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009), conforme Figuras.3,

4 e 5.

Os osteócitos são o tipo celular mais encontrado no tecido ósseo, são menores e

tem formato elíptico, tem prolongamentos que situam nos canalículos ósseos e

26

estabelecem junções do “tipo gap” entre as células. Estas junções permitem a

sinalização celular das células da superfície e a manutenção do tecido ósseo

(MANOLAGAS, 2000; KATCHBURIAN; CERRI, 2002; CERRI, 2005).

Estas são células essenciais para a manutenção óssea e o remodelamento, já

que a apoptose dos osteócitos pode estimular a atividade de osteoclastos

(BOABAID; CERRI; KATCHBURIAN, 2001; CERRI, 2005).

Figura 4 - Lâmina mostrando Tecido ósseo primário - osteoblasto (seta) e osteóide (O) (400x).


Figura 5 - Lâmina mostrando tecido ósseo primário: osteoblasto (Ob) e osteócito em formação (seta) (400x).


27

Osteoclastos: Células multinucleadas com atividade fagocitária, responsáveis pela

degradação do tecido ósseo, formam as lacunas de Howship, área de reabsorção

óssea (ROSS; ROMRELL, 1993; SILVA, 2009; KOLLET; DAR; LAPIDOT, 2007). Os

osteoclastos emitem uma borda pregueada adjacente ao osso, secretam enzimas e

ácidos dissolvendo a matriz óssea e os sais, englobando os fragmentos e

devolvendo-os como produtos no sangue (SALGADO; COUTINHO; REIS, 2004;

GUYTON; HALL, 2011), Figura.6.

Os osteoclastos formam escavações na superfície óssea, denominadas lacunas

de Howship, a membrana celular exibe invaginações que são compartimentos com

borda em escova e zona clara, que promovem a desmineralização através da

liberação de enzimas em ambiente ácido (MANOLAGAS, 2000, KATCHBURIAN;

CERRI, 2002; KIERSZENBAUM, 2004; NOVACK; TEITELBAUM, 2008). Além disso,

alguns estudos sugerem que os osteoclastos tem atividade fagocitária de restos

celulares e/ou de osteócitos e osteoblastos em apoptose (BOABAID; CERRI;

KATCHBURIAN, 2001; CERRI; BOABAID; KATCHBURIAN, 2003).

Figura 6 - Lâmina mostrando osteoclasto (Oc) e osteoblasto (seta) (400x).


A matriz óssea é constituída de duas partes: região mineralizada e região

orgânica (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A fase mineral do osso compreende

aproximadamente 60 a 70% do peso total do osso seco, enquanto que o restante é

constituído por matéria orgânica (POSNER et al., 1984).

28

Da matriz orgânica, cerca de 90% a 95% são fibras colágenas, constituída de

colágeno tipo I, e o restante é substância fundamental composta principalmente de

glicoproteínas, proteoglicanas, condroitinos e ácido hialurônico. A matriz óssea

possui depósitos de grandes quantidades de sais de cálcio. O cálcio e o fosfato dão

origem aos cristais semelhantes à HAp cuja fórmula é Ca10(PO4)6(OH)2,

predominantes na matriz óssea, porém há presença de outros íons como potássio,

sódio, citrato, magnésio e potássio, em menor proporção conjugados aos cristais de

hidroxiapatita. (SILVA, 2009; GUYTON; HALL, 2011).

Os cristais de HAp são unidos à fibra colágena e conferem ao osso a força tensil

e compressível (NIG; GRIMSTRON, 1994; GUYTON; HALL, 2011), conforme figura

7.

A nanoestrutura do osso, compreende o colágeno fibrilar e os cristais

incorporados. O tamanho dos cristais de nHAp carbonatada variam de 50nm de

comprimento e 25nm de largura, e alguns são 2-3nm de espessura enquanto que as

várias formas de colágeno são fibrilas 1,5-3,5nm e fibras de 50-70nm (ZIV; WEINER,

1994; RHO; KUHN-SPEARING; ZIOUPOS, 1998).

Os cristais de nHAp são em formato de placas e podem estar dispostos dentro

dos espaços entre as fibrilas de colágeno. A primeira mineralização é intrafibrilar e

posteriormente interfibrilar, ou seja, entre as fibras, o colágeno é mineralizado até

preencher um espaço de 50 a 60% nos ossos humanos (LEES; DAVIDSON, 1977).

29

Figura 7 - Desenho esquemático de uma fibra de colágeno mineralizada. Cristais de nanohidroxiapatita (verde) incorporados entre as triplas hélices de colágeno (cilindros brancos).

Fonte: Adaptado de: Rho, Kuhn-Spearing e Zioupos, 1998; Huster e Pretzsch, 2008.

Existem proteínas não colágenas (NCPs) na matriz óssea, secretadas pelos

osteoblastos e incluídas na mesma. A função destas proteínas ainda não é bem

conhecida, porém acredita-se que desempenham função na sinalização celular,

interação com fatores de crescimento e citocinas. A proteína osteonectina tem

função específica por ter afinidade com o colágeno, ligando-se à apatita óssea

participando da mineralização da matriz óssea na presença de colágeno

(MACDONALD; GOWEN, 1993; SOMMERFELDT; RUBIN, 2001; BOIVIN;

MEUNIER, 2003).

Estas proteínas, incluindo fosfoproteínas, tais como osteopontina, sialoproteína,

osteonectina, e osteocalcina, podem ter um papel na regulação do tamanho, da

orientação e da cristalinidade da hidroxiapatita. Por meio destas proteínas, pode

ocorrer a quelação de cálcio ou a liberação enzimática de fósforo, ou seja estas

proteínas podem servir como um reservatório de cálcio ou fosfato de íons para

formação mineral (RHO; KUHN-SPEARING; ZIOUPOS, 1998).

Os osteoblastos secretam moléculas de colágeno e proteoglicanos, gerando o

tecido osteóide, o qual os sais de cálcio se precipitam formando os cristais de

hidroxiapatita. Os primeiros cristais são amorfos e por reações de adição de átomos,

reabsorção e reprecipitação dão origem aos cristais de hidroxiapatita (HEIMANN,

2002; GUYTON; HALL, 2011).

30

2.1.2 Osseointegração

O tecido ósseo tem grande potencial regenerativo porque os osteoblastos e

osteoclastos mantêm atividade permanente. O processo ósseo regenerativo

apresenta a fase temporária de trabéculas imaturas onde as fibras colágenas se

entrelaçam, após ocorre à modelação do osso primário que dá origem ao osso

lamelar. Vários fatores de crescimento estão envolvidos neste processo, como por

exemplo: a proteína morfogênica do osso (BMP) que induz a diferenciação celular

do tecido conjuntivo em células osteoprogenitoras que formam o tecido ósseo

(MONTENEGRO; FRANCO, 2004; HERNÁNDEZ et al., 2012).

O processo de regeneração óssea visa o estabelecimento da organização da

anatomia e funcionalidade do tecido lesado. Este processo depende de diversos

fatores como a migração de células osteoprogenitoras, a liberação de fatores de

crescimento que induzem o remodelamento ósseo, a angiogênese, fatores físicos e

mecânicos (ALDECOA, 2001; HERNÁNDEZ et al., 2012). A principal estratégia da

engenharia de tecidos compreende a utilização de suportes para crescimento celular

e/ ou a associação de fatores de crescimento (CARANO; FILVAROFF, 2003).

A osteogênese está relacionada à angiogênese, sendo que o tecido ósseo é um

tecido altamente vascularizado. No processo de angiogênese, os macrófagos e

células gigantes nucleadas secretam os fatores pró-angiogênicos, na resposta

imediata após implantação do biomaterial. Por meio da vascularização, as células

recebem os fatores de crescimento, portanto o comprometimento na angiogênese

limita a regeneração óssea (SANTOS; REIS, 2010; GHANAATI et al., 2011).

As BMPs são glicoproteínas responsáveis pela sinalização de células

osteoprogenitoras para as regiões de formação óssea. São proteínas reguladoras da

reparação óssea da família do fator de crescimento transformador β (TGFβ),

estimulam a diferenciação de células mesenquimais em células especializadas

(WOZNEY, 1998; SOMMERNAN et al., 1983; SANTOS et al., 2005).

Na reparação de um defeito ósseo, o tecido conjuntivo pode dificultar a formação

óssea, neste caso é indicado o tratamento com enxertia óssea, que consiste no

preenchimento do defeito com material osteoindutivo (EGGERS; MEEDER, 1994;

NADE, 1994). E o implante com osso autógeno possui desvantagens como

comprometimento da região doadora e da recuperação do paciente, assim como

31

escassez de fonte (OHTSUKI; KAMITAKAHARA; MIYASAKI, 2007; MACHADO,

2008). Devido a estas desvantagens, os biomateriais tem sido a alternativa mais

promissora para reconstrução de tecidos e órgãos afetados por alguma doença,

atualmente as técnicas de produção permitem a manipulação da estrutura e das

características de superfície para melhorar a interação do biomaterial com os

sistemas vivos (ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).

Bränemark (1983) estudando implantes de titânio definiu o conceito de

osteointegração como a região de adesão entre o tecido ósseo e a superfície de um

bioimplante.

O mecanismo de reparação do tecido ósseo pela osteointegração é dividido em

três fases: osteoindução, neoformação e remodelamento. A osteoindução baseia-se

na migração para diferenciação das células na superfície do implante. A

neoformação resulta em uma matriz mineralizada disposta sobre a superfície do

implante. A capacidade de ancoragem, ou seja, da adesão celular depende das

propriedades do bioimplante. E a remodelação cria a interface osso-implante que

consiste na formação do novo tecido ósseo (DAVIES, 1998).

Após a implantação do biomaterial, uma série de eventos ocorrem na superfície

do implante. A interação inicial e a formação óssea dependem das características de

superfície do biomaterial (LEMONS, 2004).

Primeiro ocorre à interação do implante com o sangue, as proteínas são

dinamicamente adsorvidas e inicia um processo inflamatório, que é seguido pela

formação óssea, por meio do recrutamento e migração de células osteogênicas para

a superfície do implante (DAVIES, 2003; WILSON et al., 2005; DAVIES, 2007).

A cascata biológica inicia na osteocondução, a superfície do implante deve

promover a estabilização de um coagulo de fibrina que garante a fixação das células

osteoprogenitoras. A formação óssea ocorre quando estas células diferenciam e

secretam a matriz formando um osso novo. A última fase, o remodelamento é uma

fase mais lenta e organiza o tecido ósseo que teve a formação aleatória (DAVIES,

2003; DAVIES, 2007).

Os osteoblastos sintetizam e depositam a matriz extracelular à matriz orgânica

não mineralizada do osso e controlam a mineralização do osteóide. Com isso, seus

principais produtos são colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, sialoproteína e

fatores de crescimento membros da família das BMPs. Este tipo celular em atividade

32

de formação óssea é reagente para fosfatase alcalina, esta reação cessa quando se

encontra na forma de osteócitos na matriz (KIERSZENBAUM, 2004).

O processo de remodelamento ósseo consiste na renovação do tecido ósseo,

com participação dos osteoblastos e osteoclastos, exercendo funções antagônicas.

(MANOLAGAS, 2000; KODAMA et al., 1991; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003;

GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; CHAPPARD et

al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009).

Os osteoclastos são originados da diferenciação de monócitos provenientes de

vasos sanguíneos, esta diferenciação é regulada por fatores liberados pelos

osteoblastos e pelas células do estroma da medula óssea. Estas células são

responsáveis pelo ambiente ácido de reabsorção, que favorece a dissolução de

componentes inorgânicos por ação enzimática (trifosfatase de adenosina) e pela

degradação da matriz orgânica pela ação da protease lisossomal, a catepsina K,

seguida da substituição com um novo tecido ósseo pelos osteoblastos

(KIERSZENBAUM, 2004; NOVACK; TEITELBAUM, 2008), conforme figura 8.

Figura 8 - Esquema simplificado de remodelamento ósseo.

Fonte: Adaptado de Seeman e Delmas, 2006.

O processo de remodelamento ocorre em regiões denominadas BRUs, acrônimo

do idioma inglês, cuja sigla significa Bone Remodeling Units, nas superfícies ósseas

(MANOLAGAS, 2000; KODAMA et al., 1991; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003;

GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; CHAPPARD et

al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009). Células

33

osteoblásticas produzem o fator M-CSF (Fator estimulador de colônias de

macrófagos) que atua na diferenciação dos monócitos em osteoclastos (BOYLE;

SIMONET; LACEY, 2003).

O receptor ativado do fator Kappa β nuclear (RANK) está presente na superfície

dos osteoclastos e o ligante deste fator (RANKL) é encontrado em osteoblastos.

Com a ativação da ligação RANK com RANKL, ocorre à maturação dos precursores

de osteoclastos e a migração para a formação de lacunas de Howship, onde ocorre

a reabsorção óssea. A ligação do fator e receptor estimula a função dos osteoclastos

e a diferenciação destes (Figura 9) (KODAMA et al., 1991; GILMAN et al., 2006;

YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; MANOLAGAS, 2000; FIRESTEIN,

2003; LAFITA, 2003; CHAPPARD et al., 2003; RAISZ; RODAN, 2003; TANAKA et

al., 2005; SILVA, 2009).

Figura 9 - Mecanismo de Remodelamento ósseo.

Fonte: Adaptado de Souza, 2009.

A proteína osteoprotegerina (OPG) sintetizada pelos osteoblastos é um regulador

antagonista das ações da ligação RANK-RANKL, é uma proteína com afinidade para

RANKL e impede a interação RANK-RANKL, inativando os osteoclastos (Figura.10).

Sendo que as interleucinas, a prostanglandina e fator de necrose tumoral estimulam

34

as atividades de reabsorção óssea, enquanto que o fator de crescimento β (TGβ)

aumenta a apoptose dos osteoclastos. E os hormônios tireoidianos inibem a

secreção de OPG, enquanto o estrógeno aumenta os níveis de OPG, inativando

osteoclastos e aumentando a produção de TGβ, enquanto que a calcitonina também

participa da regulação do processo, inibindo os osteoclastos. Além disso, os

paratormônios (PTH) regulam a concentração de cálcio no líquido extracelular,

recrutam células precursoras de osteoclasto para formar as BRUs e aumentam a

expressão do RANKL favorecendo a osteoclastogênese (KODAMA et al., 1991;

GILMAN et al., 2006; YASUDA et al., 1998; HOFBAUER et al., 1999; MANOLAGAS,

2000; FIRESTEIN, 2003; LAFITA, 2003; CHAPPARD et al., 2003; RAISZ; RODAN,

2003; KIERSZENBAUM, 2004; TANAKA et al., 2005; SILVA, 2009).

Figura 10 - Mecanismo de remodelamento ósseo, ação antagonista da OPG.

Fonte: Adaptado de Souza, 2009.

Há a necessidade de mais estudos para compreensão do processo de

osteointegração, pois se acredita que as propriedades de um biomaterial interfiram

diretamente na qualidade do osso formado, ou seja, as características de superfície

como hidrofilicidade, rugosidade, porosidade e bioatividade são fatores que

35

determinam a formação óssea, assim como o metabolismo do paciente também

interfiram neste processo (MACHADO, 2008; THELEN; BARTHELAT; BRINSON,

2004; VANDROVCOVÁ; BAČÁKOVÁ et al, 2011; BACAKOVA et al., 2011; BAUER

et al., 2013; WU et al., 2014).

2.2 Biomateriais reabsorvíveis: um desafio para a aplicação ortopédica

A substituição total ou parcial de tecidos vivos por biomateriais depende das

interações físicas, químicas e biológicas. Sendo assim, o desenvolvimento de um

biomaterial reabsorvível implica no ajuste das características e propriedades de

superfície para obter uma interface biologicamente ativa. Este ajuste é um desafio

para a ciência dos materiais, visto que há uma série de fatores que interferem no

processo de regeneração do tecido biológico, como a composição do biomaterial,

características físico-químicas, propriedades de superfície e arquitetura do

arcabouço (BACAKOVA et al., 2011; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).

Porém, a principal dificuldade para osseointegração consiste no acúmulo de

tecido conjuntivo na região lesada, impedindo a osteogênese, além do que a maioria

dos biomateriais desenvolvidos não tem a capacidade de promover a vascularização

e maturação osteogênica, assim como a baixa resistência mecânica para aplicação

óssea (CAFFESSE et al., 1990; ARMENTANO et al., 2009; SANTOS; REIS, 2010;

BOSE; ROY; BANDYOPADHYAY, 2012).

O implante ósseo ideal deve ser biocompatível, biorreabsorvível e mimetizar a

estrutura porosa do osso esponjoso para facilitar a rápida vascularização e

substituição progressiva do tecido recém-formado e deve-se moldar as dimensões

da lesão e manter o formato até a reabsorção total (TATAKIS; PROMSUDTHI;

WIKESJÖ, 1999; BRYDONE; MEEK; MACLAINE, 2010; HANNOUCHE; PETITE;

SEDEL, 2001).

Com isso, estratégias têm sido utilizadas para biomimetizar a composição

orgânica e inorgânica do osso, e obter os processos de mineralização naturais (LIU

et al., 2012). Pesquisas com materiais poliméricos mostraram que os mesmos

apresentam biocompatibilidade, neoformação óssea, além das vantagens de

reabsorção com transferência gradual de carga, sendo desnecessária uma segunda

cirurgia para remoção do implante (LIM et. al, 2008; MEROLLI et al., 2001;

36

BEACHLEY; WEN, 2010; JIN et al., 2013). Os substitutos ósseos devem preencher

o espaço e promover uma degradação controlada com a recuperação do tecido

lesionado, garantindo a estabilidade, a arquitetura e a função fisiológica (DAMIEN et

al., 2003; WALSH et al., 2003).

Materiais poliméricos são amplamente utilizados como biomateriais devido à

composição química e estrutura bem definidas. Materiais não degradáveis são

vantajosos porque podem manter sua integridade estrutural e suportar altas cargas

mecânicas, porém podem apresentar uma resposta fibrótica devido a incapacidade

de interagir com o tecido biológico e sofrer a longo prazo a deterioração natural que

pode acarretar resposta inflamatória. Em contraste, materiais bioreabsorvíveis são

vantajosos porque a degradação pode ser controlada, porém ainda assim os

subprodutos podem gerar resposta inflamatória que deve ser avaliada inclusive para

as células vizinhas (TAYLOR et al., 1994; LAGARON; LOPEZ-RUBIO, 2011;

HALLAB, 2012; JIN et al., 2013).

Materiais poliméricos degradáveis que mantêm as propriedades por períodos

prolongados, possuem degradação in vivo muito lenta, em geral, mais de três anos,

este é o aspecto desfavorável, pois não há evidências de que, depois de tanto

tempo, o espaço ocupado pelo bioimplante será substituído por osso recentemente

formado. Um bioimplante polimérico ideal seria aquele que degrada em poucos

meses (MEROLLI et al., 2001; WILDEMANN et al., 2005).

Os tratamentos cirúrgicos também incluem o transplante de osso autógeno, que

apesar da ausência de reações inflamatórias, compromete a recuperação do

paciente e tem uma alta taxa de complicações pós operatórias (MISCH, 2006).

Outros dispositivos para próteses compreendem os materiais metálicos e cerâmicos,

que não modelam com o tempo, não podem acompanhar o crescimento do paciente

e nem mudar a forma de acordo com a carga aplicada no local (PUPPI et al., 2010).

Biomaterial reabsorvível são totalmente eliminados por vias metabólicas e geram

subprodutos que não causam citotoxidade (VERT; LI; GARREAU, 1992). Este

conceito foi introduzido a partir das primeiras suturas biodegradáveis na década de

40 e a partir disto têm sido constantes as pesquisas para substituição de tecidos

biológicos por estes materiais.

Atualmente polímeros reabsorvíveis são utilizados para diversas aplicações

biológicas, como fios de sutura, arcabouços para engenharia de tecidos, implantes e

37

revestimentos em cirurgias ortopédicas e odontológicas e mais recentemente como

membranas para regeneração ósseo guiada (ROG).

Os primeiros estudos sobre regeneração ósseo guiada foram conduzidos por

Campbell e Basset, tratava-se da separação dos espaços lesionados para

regeneração seletiva de nervos periféricos por meio de materiais filtros (CAMPBELL;

BASSETT, 1956). Esta técnica compreende a aplicação de uma barreira de

membrana entre o tecido ósseo e o periósteo a fim de isolar o crescimento de tecido

conjuntivo e selecionar as células do endósteo para promover a osteogênese no

interior da membrana, esta técnica é possível para cirurgias de reconstrução óssea

(DAHLIN et al., 1990 SILVA, 2005; LACERDA; LACERDA, 2010).

Para a regeneração óssea bem sucedida, faz-se necessário que o biomaterial

promova além da seleção tecidual, a ausência de resposta inflamatória e promoção

da angiogênese (DAHLIN et al., 1988; SCHENK et al., 1994; HERNÁNDEZ et al.,

2012). Biomateriais poliméricos devem apresentar interação biológica, viabilidade

celular, biocompatibilidade, favorecer a regeneração tecidual e manuseio clínico

adequado (SCANTLEBURY, 1993; ZHANG et al., 2014).

Recentes avanços no desenvolvimento e funcionalização de materiais poliméricos

biocompatíveis, consistem em tecnologias de processamento capazes de produzir

uma estrutura com características específicas, como porosidade e

biodegradabilidade, bem como os requisitos específicos associados com local do

implante, como forma e tamanho (PUPPI et al., 2010).

Para o desenvolvimento de um biomaterial, diversas disciplinas como ciências

dos materiais, engenharia, ciências biológicas e medicina unem-se para garantir

todas as características apropriadas que devem integrar o projeto do novo

biomaterial, estes fatores são mostrados na figura 11 (SEAL; OTERO; PANITCH,

2001).

38

Figura 11 - Ilustração de como os conhecimentos de materiais, biologia, medicina e engenharia devem ser integrados para alcançar a regeneração de tecidos.

Fonte: Adaptado de Seal, Otero e Panitch, 2001.

Do ponto de vista tecnológico, o grande desafio consiste em projetar um

arcabouço com porosidade e estrutura adequada para substituir o tecido por um

período prolongado até a regeneração total. Em particular, polímeros reabsorvíveis

com cerâmicas bioativas em estruturas 3D são promissores para atender estes

requisitos (PUPPI et al., 2010; PINA; OLIVEIRA; REIS, 2015).

2.2.1 Polímeros Bioreabsorvíveis: PDLLA

Polímeros são macromoléculas formadas por cadeias longas de meros que são

unidades repetidas e que são unidas por ligações covalentes, apresentam

sequências de átomos de carbono com ou sem heteroátomos de oxigênio e

nitrogênio em sua estrutura (CALLISTER JUNIOR, 2002; ORÉFICE; PEREIRA;

MANSUR, 2012).

O peso molecular, a cristalinidade e as transições térmicas são as características

primordiais para caracterização. A cristalinidade dos polímeros influencia

diretamente na aplicação e pode ser obtida por diferentes métodos: calorimetria

diferencial exploratória, difração de raio X e espectroscopia de infravermelho

(MANO; MENDES, 2001; CARNEVAROLO JUNIOR, 2003; ARMENTANO et al.,

2010; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2012).

39

O polímero cristalino é utilizado para a prática ortopédica, pela resistência

mecânica mais elevada do que os polímeros amorfos que geralmente tem função na

liberação de fármacos (MANO; MENDES, 2001; ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR,

2012).

Nos últimos anos, polímeros biodegradáveis tais como poli (ácido glicólico), poli

(L-ácido láctico) e copolímeros como poli (ácido L-láctico-co-glicólico) tem sido

pesquisados para aplicações como matriz extracelular em implantes (HUTMACHER

et al., 2000; AGRAWAL; RAY, 2001; BARBER; DOCKERY; COWDEN, 2013; LI et al,

2013; PATRASCU et al., 2013; BAO et al., 2014).

O copolímero PDLLA pertence à família dos poliésteres alifáticos da classe dos

poli (alfa hidroxiácidos) (BARBANTI; ZAVAGLIA; DUEK, 2005; SARAVIN et al.,

2008).

O PDLLA foi aprovado como implante pelo FDA (Food and Drug Administration)

nos Estados Unidos, trata-se de um polímero racêmico que não mostra atividade

óptica, totalmente amorfo, apresenta Tg na faixa de 50º a 60ºC, módulo de

elasticidade de 1,9 GPa e tempo de degradação de 12-16 meses (MIDDLETON;

TIPTON, 2000; ELKE; ROLF-JOACHIM; WOLF-DIETER, 2003; GUPTA; KUMAR,

2007; OKAMOTO; JOHN, 2009; REDDY et al., 2013). As propriedades mecânicas

são inferiores em relação ao PLLA, um polímero semicristalino. Devido à estrutura

amorfa do PDLLA, a água tem maior facilidade de difusão e absorção, resultando

em degradação mais rápida do que a do PLLA (MIDDLETON; TIPTON, 2000;

GUTWALD et al, 2002).

Este copolímero possui dois isômeros (L e D) estes dois homopolímeros formam

o copolímero poli (ácido D,L-Láctico), na figura 12, esta mistura racêmica não forma

uma estrutura organizada cristalina e consequente este polímero é amorfo (DOI;

STEINBÜCHEL, 2002; GUPTA; KUMAR, 2007).

40

Figura 12 - Estereoisômeros do ácido láctico.

Fonte: Adaptado de Textos Científicos, 2015.

O PDLLA pode ser obtido por policondensação direta do dímero cíclico do ácido

lático levando a formação de produto de baixo peso molecular ou por polimerização

por abertura do anel do dímero cíclico do ácido láctico, que resulta em um produto

de alta massa molecular, o produto obtido tem a fórmula apresentada na figura 13

(LUNT, 1998; GARLOTTA, 2001). Figura 13 - Fórmula do polímero PDLLA.

Fonte: Barbanti, Zavaglia e Duek, 2005.

O tempo de biodegradação depende do peso molecular, cristalinidade e tamanho

do material. A degradação do PDLLA ocorre por hidrólise, sendo que polímeros

amorfos degradam com mais facilidade, mas também apresentam propriedades

mecânicas inferiores (MIDDLETON; TIPTON, 2000; GUTWALD et al, 2002).

Inicialmente o PDLLA sofre hidratação, em seguida ocorre hidrólise das ligações

ésteres originando monômeros solúveis atóxicos. O ácido lático é um produto

gerado da degradação hidrolítica do poli (L-ácido láctico), este produto é

metabolizado pelo ciclo do ácido carboxílico. Após a hidrólise segue o processo de

oxidação do ácido lático que são convertidos a ácido pirúvico. Na presença de Acetil

41

Coenzima A, ocorre a liberação de CO2 e a decomposição de citrato que será

incorporado no ciclo de Krebs e eliminado como dióxido de carbono e água,

conforme demostrado na figura 14 (ALI et al., 1993; MANO; MENDES, 2001; ELKE;

ROLF-JOACHIM; WOLF-DIETER, 2003; ARMENTANO et al., 2010). Figura 14 - Rota metabólica de bioreabsorção do PDLLA.

Fonte: Adaptado de Barbanti, Zavaglia e Duek, 2005.

As propriedades de superfícies de biomateriais influenciam diretamente o

comportamento celular, uma estrutura 3D promove uma regeneração diferenciada

sendo comprovada na organização da estrutura da neoformação e influencia

diretamente na vascularização (BERNER et al., 2014).

Poliésteres, incluindo poli (ácido D, L-láctico) (PDLLA) e poli (ácido glicólico)

(PGA), são amplamente utilizados na Engenharia de tecidos, principalmente por

causa de sua boa biodegradabilidade (SAHOO; PANDA; LABHASTWAR, 2005;

BARBER; DOCKERY; COWDEN, 2013; LI et al, 2013; PATRASCU et al., 2013; BAO

et al., 2014). Polímeros derivados a partir de ácido láctico têm mostrado, uma

resposta clínica melhor do que os derivados de ácido glicólico, uma das primeiras

substâncias a serem testadas clinicamente e para o qual havia sido documentada

uma série de reações inflamatórias adversas (BÖSTMAN, 1992). No entanto,

devido à sua natureza hidrofóbica, a biocompatibilidade destes materiais ainda

permanece como um problema para aplicação biológica (CHEN et al., 2003).

42

Uma eficiente abordagem para regeneração óssea consiste no desenvolvimento

de scaffolds poliméricos com cerâmicas osteoindutoras biomiméticas, com nano a

microporosidade, bioativas e bioreabsorvíveis (WOODRUFF et al., 2007; RAI et al.,

2010; LAGARON; LOPEZ-RUBIO, 2011).

2.2.2 Nanocompósitos poliméricos: PDLLA, Nanotubos de Carbono e

Hidroxiapatita

A regeneração de tecidos implica a interação bem sucedida entre células,

sinais biológicos e biomateriais. Com o advento da nanotecnologia, avanços têm

sido feitos no campo de biomateriais, vários biomateriais incluindo nanocristais,

nanofibras, nanoesferas e nanoporos, têm sido desenvolvidos para as mais diversas

aplicações biológicas. Nanocompósitos que mimetizam a composição e estrutura de

tecidos mineralizados e simulam a estrutura da matriz extracelular, tem sido

estudados para proporcionar a regeneração tecidual. Nanopartículas quando

incorporadas em polímeros em estruturas 3D oferecem uma liberação controlada de

moléculas osteoindutoras que são responsáveis pela sinalização celular para o

reparo tecidual (SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN, 2007; WEI; MA, 2008; LAGARON;

LOPEZ-RUBIO, 2011).

Pesquisas vêm sendo realizadas visando modificações de características dos

biomateriais poliméricos, tais como propriedades mecânicas, tempo de degradação,

molhabilidade e topografia após a incorporação de nanopartículas em matriz

polimérica (ZHENG et al., 2006; HABRAKEN; WOLKE; JANSEN, 2007; JENSEN et

al., 2010; LIUYUN et al., 2012; PÉREZ et al., 2013). As características da superfície

do material podem contribuir de forma eficaz para a adesão celular e a superfície

porosa favorecem as interações celulares (HUTMACHER, 2001; ZHAO et al., 2009;

PÉREZ et al., 2013), que também dependem da rugosidade de superfície (ENGEL et

al., 2008; BAUER et al., 2013; WU et al., 2014).

O PDLLA tem sido muito pesquisado para arcabouço celular devido à sua

biocompatibilidade e rápida degradação in vivo (SACHLOS; CZERNUSZKA, 2003;

HASEGAWA et al., 2005; ZHANG et al., 2006; ALVES et al., 2008; WU et al., 2008;

HELEN; GOUGH, 2008; YUNOS et al., 2013).

43

No entanto, a interação célula com o biomaterial é limitada pela hidrofobicidade

dessas membranas (CHEN et al., 2003; NAIR; LAURENCIN, 2007).

Estudos recentes de nanocompósitos a base de PDLLA e nanopartículas

apresentaram bons resultados como arcabouço para a regeneração de osso e

cartilagem (HASEGAWA et al., 2005; WU et al., 2008; HELEN; GOUGH, 2008;

YUNOS et al., 2013). A incorporação de nanopartículas, tais como nanotubos de

carbono (CNT) e nHAp na matriz polimérica pode ser uma alternativa para melhorar

as características físicas do PDLLA.

Os CNT são estruturas estáveis que podem ser associadas a outras moléculas e

apresentam várias aplicações, devido às suas propriedades físico-químicas

(WEBSTER et al., 2004; KLUMPP et al., 2006; SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN,

2007; HARRISON; ATTALA, 2007; AOKI et al., 2008; ABARRATEGI et al., 2008;

LAREDO et al., 2010; LOBO, 2011).

Alguns autores relataram efeito citotóxico dos CNT, este efeito deve-se a

hidrofobicidade e presença de componentes metálicos no processo de produção

(HURT; MONTHIOUX; KANE, 2006). Os CNT desenvolvidos por Lobo, 2011, pela

técnica de deposição química a partir da técnica de fase de vapor assistida por

microondas (MWCVD) são biocompatíveis e não apresentam citotoxicidade. A

característica hidrofílica dos nanotubos de carbono, desenvolvidos por Lobo, 2011,

facilita a superfície de contato com as proteínas de adesão devido à molhabilidade,

sendo esta característica importante para os processos de adesão, proliferação e

diferenciação celular (LOBO, 2011). Estas nanopartículas são uma forma alotrópica

do carbono, a alotropia é definida como a capacidade de um átomo apresentar

várias estruturas cristalinas. Existem 4 formas alotrópicas do carbono: diamante,

grafite, fulerenos e nanotubos (SCHUCH; BEVILAQUA; FAGAN, 2007;

NASCIMENTO, 2008).

Existem dois tipos de CNT: de paredes múltiplas (MWCNT) com diâmetros de 2–

100 nm e de paredes simples (SWCNT) com diâmetros de 0.4–2 nm (IIJIMA, 1991;

WANG et al., 2000; LIN et al., 2004; CHEN et al., 2006). Os MWCNT mostrados na

figura 15, possuem duas ou mais camadas simples de grafite fechadas nas

extremidades, garantindo estabilidade (LOBO, 2011).

44

Figura 15 - Esquema de um nanotubo de parede múltiplas.

Fonte: Ferreira e Rangel, 2009.

Lobo et al. (2011) apresentaram a adesão celular e o teste imunocitoquímico de

fibroblastos cultivados sobre VACNT-O, estas nanopartículas favorecem a adesão e

espalhamento celular, assim como a formação de monocamada em seis dias de

cultura.

Em estudo comparativo sobre o tamanho das nanopartículas e os efeitos

celulares, os osteoblastos tiveram uma melhor resposta de adesão e proliferação

celular em CNT do que em grafeno, porque os CNT apresentam uma estrutura de

nanomalha porosa onde as células podem receber fatores de crescimento e

nutrientes com facilidade (WATARI et al., 2009).

Estas nanopartículas tem capacidade de biomimetizar os tecidos por serem

análogos aos compostos da matriz extracelular e são promissoras alternativas para

medicina regenerativa (KLUMPP et al., 2006; HARRISON; ATTALA, 2007;LAREDO

et al., 2010; LEE et al., 2011; LOBO et al., 2011). A associação de HAp e CNT tem

sido pesquisada, devido às suas propriedades de condutividade elétrica

(MACDONALD et al., 2005; HARRISON; ATTALA, 2007; LOBO et al., 2011) a

capacidade de ancoragem e sustentação celular que influência a regeneração (LEE

et al., 2011; LOBO et al., 2011).

A nHAp é um mineral biocompatível, que é bioativo na formação de matriz

mineralizada em tecido ósseo. A imersão de VACNT-O em fluido corporal simulado

(SBF) a 37°C, promove o desenvolvimento de apatitas biológicas na superfície do

45

material, com características de formato globulares, conforme visto na figura 16

(LOBO et al., 2010; IRINEU et al., 2012).

Figura 16 - Micrografia de apatitas globulares produzidas pela precipitação em SBF.

Fonte: Marsi, 2012.

O método de imersão em SBF imita a formação in vitro da apatita biológica em

camada que atua como uma ponte para a fixação e crescimento das células no

biomaterial (KOKUBO; TAKADAMA, 2006). Por conseguinte, a capacidade para

formar apatita sobre a superfície é um resultado significativo na determinação do

grau de bioatividade do material como um implante ósseo. O processo de

biomineralização é acelerado por imersão das amostras em solução de SBF (5×) a

pH 7,4 (BARRERE et al., 2002b), mas este método pode favorecer a precipitação de

carbonato de cálcio (OYANE et al., 2003). A concentração de magnésio na solução

proposta por Barrere et al. (2002b) minimiza tal precipitação e favorece o

revestimento homogêneo. Os resultados demonstraram a formação de uma camada

globular nanométrica indicando uma apatita nanocristalina amorfa e carbonatada na

superfície dos VACNT-O. Resultados semelhantes foram obtidos por Barrere sobre

substratos de revestimento de titânio. A nucleação da apatita é obtida pela

hidrofilicidade dos VACNT-O, pela técnica de plasma de superfície (WANG et al.,

2009a; PRASERTSUNG et al., 2010) que incorpora grupos carboxílicos polares na

superfície do material. Os íons catiônicos são atraídos para a superfície dos VACNT;

Íons Ca2+ são combinados com grupos de ácido carboxílico polares (LI et al., 2010),

46

tais como grupos COOH, que estão expostas na superfície do material, favorecendo

a deposição de hidroxiapatita. Os íons Mg2+, inibem a formação de cristais maiores

(BARRERE et al., 2002a) e promovem a deposição homogênea de estruturas

globulares de tamanho nanométrico.

Os íons Ca2+ liberados a partir de partículas CaCO3- reage com e

para formar nHAp e agem como sítios ativos para a formação de cristais de calcita.

Esta camada é produzida por uma reação de dissolução-precipitação que promove a

nucleação de cristais, por conseguinte, estas nHAp promovem a adesão das células

na superfície do biomaterial (ABBONA; BARONNET, 1996; GUO et al., 2009).

Diversos métodos foram descritos para a produção de HAp na superfície de

nanotubos de carbono como revestimentos por eletroforese, deposição

eletroquímica, imersão em SBF, sol-gel, aerossol e pulverização de plasma spray.

Ainda assim, com todas estas técnicas, há uma dificuldade descrita na literatura

sobre a produção de HAp cristalina, estequiométrica (Ca/P de 1,67) e homogênea

(KAR; RAJA; MISRA, 2006).

Lobo et al. (2010) relataram um novo método para obter cristais nHAp em forma

de placa sobre VACNT-O usando a eletrodeposição direta e demonstraram que

osteoblastos humanos proliferam para a formação de osso na superfície dessas

amostras. As vantagens deste método de produção consistem na obtenção de um

filme fino, cristalino e uniforme por meio de um processo rápido, eficiente e de baixo

custo. A figura 17 mostra a morfologia dos nanocristais obtidos por Lobo et al.

(2013).

Figura 17 - (a) seção transversal, detalhes de nanocristais de nHAp. (b) detalhes de nanocristais nHAp do tipo placa após o processo de eletrodeposição.

Fonte: Lobo et al., 2013.

47

Nesta tese avaliamos o comportamento das nHAp produzidas por eletrodeposição

e imersão em SBF em matriz polimérica objetivando um material que ofereça uma

regeneração óssea mais rápida com total reabsorção do polímero. Além disso, este

biomaterial foi produzido por meio de uma técnica de produção simples, baixo custo

e flexível para utilização em diversas situações ortopédicas e com aplicação em

larga escala pela indústria.

O maior componente inorgânico do osso é a HAp, mas apenas biocerâmicas ou

polímeros isolados parecem não atender todos os requisitos para regeneração

óssea principalmente em grandes perdas ósseas. Sendo assim, uma alternativa

promissora é um nanocompósito de polímeros com HAp, porque a HAp tem

propriedade de osteocondutividade e o polímero oferece a estrutura porosa ideal

para a ancoragem das células. A nHAp quando incorporada na matriz polimérica

oferece um aumento de rugosidade de superfície e hidrofilicidade que favorecem a

adesão e proliferação celular (WEBSTER et al., 2000; LEGEROS, 2002;

LEWANDROWSKI et al., 2000; WOODRUFF et al., 2007; RAI et al., 2010; WANG et

al., 2011; PÉREZ et al., 2013; KHOULENJANI et al., 2013; WU et al., 2014).

De fato, estes biomateriais têm mostrado excelentes resultados na aplicação

biológica in vitro e in vivo.

Moreira et al. (2008) relataram, em estudo in vivo utilizando ratos, que os

osteoblastos interagem com a HAp sintética, preenchendo os espaços destinados à

aplicação do biomaterial. Além disso, diversos estudos empregando diferentes

modelos experimentais relataram que há adesão e proliferação celular sob CNT

(DUARTE et al., 2004; GABAY et al., 2005; MACDONALD et al., 2005; GIANNONA

et al., 2007; ZANELLO; ZHAO; HADDON, 2006).

Recentemente, Lobo et al. (2013), demostraram que os condrócitos cultivados

sobre membranas de VACNT-O/poli (metacrilato de metilo) mantiveram o nível de

expressão de RNAm, Agrecan, Colágeno tipo II e do fator de transcrição SOX-9.

Todos estes são considerados marcadores de função celular (ANTONIOLI et al.,

2013).

A incorporação de HAp e CNT na matriz de polímero PDLLA é uma característica

importante para induzir a diferenciação de células e ossificação. Estudos recentes

do nosso grupo de pesquisa mostraram a biocompatibilidade de nHAp obtida pelo

método de imersão em SBF e eletrodeposição (MARSI et al., 2012; LOBO et al.,

48

2013). Nosso estudo recentemente publicado, mostrou que nHAp promove a

regeneração óssea com formação de osso lamelar após nove semanas (LOBO et

al., 2013).

O arcabouço polimérico deve ter permeabilidade para permitir a migração de

fatores de crescimento e citocinas a partir de fluido biológico para a regeneração de

tecidos, que promove a diferenciação das células (PONTE et al., 2007; RINGE et al.,

2007), permitindo a adesão de células, a morfologia e função das células

(GOESSLER; HÖRMANN; RIEDEL, 2004).

Pesquisas sobre nanocompósitos de PDLLA/HAp foram desenvolvidas por

diferentes processos de síntese (IKADA, 1994; TENG; REN; GU, 2007; REN et al.,

2008; ZOU et al., 2012; DEPLAINE et al., 2013; RONCA; AMBROSIO; GRIJPMA,

2013); bem como de Wang e Wang (2012), desenvolveram um arcabouço de PDLLA

incorporando Ca-P e BMP-2, e foram capazes de demonstrar efeito osteoindutor e

osteocondutor com a degradação controlada dos polímeros. Ronca, Ambrosio e

Grijpma (2013) produziram arcabouços de PDLLA/nHAp por dispersão em

sonicação para aplicação em micro-estereolitografia afim de obter um biomaterial

poroso com melhores características mecânicas e térmicas.

Zou et al. (2012) relataram a produção de nanofibras de PDLLA preparadas por

eletrofiação e a modificação de superfície com enxertos de gelatina para controlar a

nucleação e o crescimento de HAp.

Teng et al. (2007) preparam um biomaterial poroso de PDLLA/HAp com a técnica

polimerização in situ e o agente porogênico foi NaCl utilizado em reator de CO2.

Todas estas tecnologias tem sido empregadas para melhorar as características

físico-químicas do PDLLA, a fim de imitar a estrutura óssea. No entanto, apenas a

presença de HAp na estrutura do polímero não é suficiente para melhorar a

resistência mecânica igual ao osso. Por conseguinte, a incorporação de CNT pode

ser uma solução para melhorar a resistência mecânica. Com isso, a incorporação de

HAp e CNT na matriz de polímero PDLLA é uma característica importante para

induzir a diferenciação de células e ossificação e proporcionar resistência mecânica

ao novo tecido (LOBO et al., 2010).

Devido às forças de Van der Waals é difícil obter dispersões homogêneas de CNT

e HAp na matriz polimérica. Uma alternativa é a técnica de “melt mixing”, que

49

melhora a dispersão das nanopartículas e consiste em uma técnica de baixo custo e

que pode ser empregada em larga escala na indústria (ARJMANDA et al., 2011).

Pitois e François (1999a) mostraram que os filmes porosos podem ser obtidos

pela condensação do vapor de água induzida pela rápida evaporação dos solventes

voláteis que resulta na formação de gotículas de água encapsuladas no polímero,

comportamento semelhante ocorre com partículas sólidas. Vários autores relataram

que as soluções homogêneas de solvente orgânico imiscível, tal como clorofórmio,

na presença de umidade elevada favorece a formação de estruturas do tipo

colmeias (honeycomb). Karthaus et al. (2000), relataram que as estruturas

hexagonais constituídas sobre a superfície polimérica não é devido à presença de

uma solução de polimérica, mas pelo uso do clorofórmio que origina estruturas

hexagonais, atribuído à presença de vapor de água em condições experimentais.

Desde então, a utilização de água por evaporação em umidade controlada e de

arrefecimento para a produção de membranas porosas foi estudada para polímeros,

devido à ampla aplicabilidade destas estruturas (PITOIS; FRANÇOIS, 1999b;

KARTHAUS et al., 2000; NISHIKAWA et al., 2002; SUNAMI et al., 2005; XU; KADLA,

2013). Sunami et al. (2005) relataram sobre o comportamento celular na superfície

de uma estrutura honeycomb, a superfície modula positivamente e influencia o

comportamento celular sobre o biomaterial.

Interações com o ambiente biológico ocorrem na superfície biomaterial; portanto,

qualquer alteração na superfície pode influenciar na resposta celular. A literatura

descreve que uma superfície porosa contribui para uma melhor interação com o

meio biológico (HUTMACHER, 2001; SACHLOS; CZERNUSKA, 2003; CHEN et al.,

2003; JI et al., 2012).

Porém outro fator que interfere na adesão e proliferação celular é a molhabilidade

do biomaterial. Tal análise é importante por causa do comportamento de uma célula,

quando em contato com a superfície do biomaterial (BUSER et al., 2004; RUPP et

al., 2006; KENNEDY et al., 2006). Quanto menor for o ângulo de contato, maior é a

capacidade de molhabilidade, em outras palavras, o ambiente biológico tem uma

maior capacidade de se espalhar sobre a superfície do material.

Estudos demonstraram que a molhabilidade da superfície e a porosidade

influencia no comportamento de adesão celular e rediferenciação celular (ELBERT;

HUBBELL, 1996; PHAM; SHARMA; MIKOS, 2006; LI; JIANG; TUAN, 2006;

50

YAMANE et al., 2007; LIEN; KO; HUANG, 2009). Essa interação de células com o

biomaterial é um resultado de um reconhecimento específico entre os receptores de

adesão da superfície celular, que são integrinas e proteínas (ECM) da matriz

extracelular (fibronectina, vitronectina, colágeno) (DOBKOWSKI et al., 1999).

A hidrofilicidade do material melhora a interação com o meio biológico, porém a

obtenção desta propriedade com métodos químicos é muito difícil porque grupos

funcionais estão ausentes no PDLLA e a única técnica que não modifica as

propriedades de massa do polímero consiste no tratamento a plasma. A técnica de

plasma trata as superfícies incorporando grupos funcionais, isto melhora a afinidade

celular (WADE; MAMMODE; BINDER, 1991; LOH, 1999; FAVIA; D´AGOSTINHO,

1998; YANG; BEI; WANG, 2002).

Desta forma, Cai et al. (2002) mostraram que a hidrofilicidade favorece a

biocompatibilidade e a aplicação de membranas de PDLLA como suporte para

cultura de células, com bons resultados como arcabouço para tecido ósseo.

Nesta tese, apresentamos duas novas metodologias para obtenção de

membranas porosas de PDLLA parcialmente hidrofílicas com estruturas honeycomb

e com aumento de rugosidade superficial por meio da incorporação de

nanopartículas de VACNT-O e nHAp. Uma correlação entre as nanopartículas e a

umidade foi apresentada para melhorar as características de superfície. Estas novas

metodologias propostas consistem em: (i) nanocristais de nHAp diretamente

eletrodepositados em VACNT-O (nHAp1) e depois dispersos em solução de PDLLA

com umidade controlada; (ii) VACNT-O imersos em solução de SBF para produzir

nanocristais de nHAp (nHAp2) e em seguida dispersos em solução de PDLLA em

umidade controlada para a produção de membranas com estruturas honeycomb.

Propriedades de hidrofilicidade foram obtidas por tratamento com plasma de

oxigênio, anteriormente descrito por Lobo et al. (2010).

A Figura 18 mostra uma possibilidade para aplicação biológica do biomaterial

desenvolvido nesta tese como implante ósseo. As membranas poliméricas podem

envolver os ossos longos para promover a osseointegração. O osso fraturado é

envolvido com a membrana polimérica e fixado por uma haste de metal e parafusos

nas extremidades, que garante a sustentação (1). Esta membrana tem a função de

promover a regeneração óssea, a partir de nanopartículas osteoindutoras que

favorecem a liberação de fatores que promovem a regeneração óssea (2).

51

A membrana polimérica promove a formação de uma camada de apatitas

biológicas pelo processo de biomineralização, a adesão e proliferação celular,

enquanto que a matriz orgânica é mimetizada pela estrutura do polímero. Este

biomaterial promove a completa e organizada osseointegração do osso fraturado (3).

52

Figura 18 - Perspectiva da aplicação in vivo de membranas desenvolvidas nesta tese.

Fonte: Autora.

53

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Produção das nanopartículas para dispersão

3.1.1 Síntese dos nanotubos de carbono de múltiplas paredes verticalmente

alinhados (VACNT-O)

A técnica de produção de VACNT utilizada nesta tese foi descrita por Lobo

(2011), o procedimento foi realizado no Laboratório Associado de Sensores e

Materiais (LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do

nosso colaborador professor Dr. Evaldo José Corat. Para a produção dos VACNT, foram utilizadas amostras de titânio quadradas de

10mmx10mmx1mm, lixadas e colocadas em banho de ultrassom com álcool

isopropílico, por 5 minutos. Após, as amostras foram aquecidas a uma temperatura

de 400ºC ao ar para a formação de uma camada de nitreto/óxido de titânio

(TiN/TiO2). Estas amostras foram dispostas em evaporadora de feixe de elétrons

(Auto 306-EB3 Mutlihearth Electron Beam Source), para deposição de uma camada

de 10nm de catalisador (Fe) (LOBO et al., 2010).

Os VACNT foram produzidos pela técnica de deposição química via fase vapor

assistida por plasma de microondas (MWCVD, acrônimo do idioma inglês, cuja sigla

significa Microwave Plasma Assisted Chemical Vapor Deposition). A figura 19 mostra

o esquema do conjunto do reator de microondas, cuja câmara é de alumínio

anodizado e pode-se observar que existem janelas de quartzo na altura do porta

amostra para visualização da amostra e do plasma. O reator é conectado a uma

bomba mecânica de Edwards e aos sistemas de tubulações de gases utilizados no

processo de crescimento dos VACNT. O controle de pressão procede-se pelo

sensor Barocel e a entrada de gases é monitorada por um controlador de fluxo de

massa (MKS-247C), conforme pode ser visto na figura 20 (LOBO et al., 2010; LOBO

et al., 2011b).

54

Figura 19 - Ilustração do conjunto do reator de microondas de alumínio anodizado.

Fonte: Lobo, 2011b.

Figura 20 - Diagrama esquemático do reator para crescimento dos VACNT.

Fonte: Lobo, 2011b.

O processo de crescimento de VACNT em reator MWCVD ocorre após a

preparação da amostra com uma camada de catalisar metálico particulado e numa

atmosfera de gases de hidrocarbonetos em temperaturas elevadas.

55

A deposição ocorre em duas etapas, pré-tratamento e deposição. Na primeira

etapa criam-se nanoilhas do material catalisador, a partir dos quais os VACNT foram

nucleados, em que ocorre a inserção dos gases H2/N2 (10/90 sccm), em pressão

constante e aquecimento do porta-amostra de 760ºC, com duração de 5 minutos. Na

etapa de deposição, o gás CH4 (14 sccm) é adicionado, como fonte de carbono, e a

temperatura atinge cerca de 800ºC, esta etapa tem duração de cerca de 1 a 2

minutos, com uma pressão controlada de 30 Torr.

A superhidrofilicidade do biomaterial é adquirida por tratamento em reator de

plasma de O2, o reator pode ser visto na figura 21. Este reator foi ajustado para

utilizar a técnica de plasma de descarga de corrente pulsada, onde uma fonte

chaveada pulsada e bipolar com características especiais de pulsos de saída é

utilizada para geração do plasma. O tempo de tratamento a plasma teve duração de

2 minutos, com uma tensão aplicada de -700 V, taxa de fluxo de 1sccm e pressão de

85 mTorr, com frequência de 20kHz, sendo que a hidrofilicidade da superfície foi

adquirida pela a incorporação dos grupos carboxílicos polares na superfície do

material (LOBO et al., 2011a). Figura 21 - Reator de plasma de O2.

Fonte: Autora.

56

3.1.2 Síntese de VACNT-O:nHAp1 por eletrodeposição

A eletrodeposição de nHAp1 foi realizada no laboratório de Nanotecnologia

Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do

professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. Como anodo foi utilizado amostras de VACNT-O2 crescidos sobre substrato de

Ti. As dimensões de cada anodo foram de 10mm x10mm x1mm. A Figura 22 mostra

a montagem do anodo, em cachimbo porta-eletrodo de teflon, a área exposta para

deposição é um círculo de 0,27cm2.

Figura 22 - Montagem do anodo para eletrodeposição de HA.

Fonte: Autora.

Como eletrólito utilizou-se a mistura de soluções nas quantidades mostradas na

tabela 1. Durante o processo o pH da solução permaneceu a 4,8, sob agitação

contínua, com auxílio de agitador magnético.

57

Tabela 1 - Composição química da solução para eletrodeposição

REAGENTE CONCENTRAÇÃO QUANTIDADE

Ca(NO3)2 .4.H2O 2,5mM 50mL

NH4H2PO4 1,5mM 50mL

Fonte: Autor.

A eletrodeposição é um método não espontâneo e necessita de uma fonte de

corrente contínua para direcionar o fluxo de íons. O sistema tende a manter-se

termodinamicamente estável e para isto, ocorre o fluxo de íons positivos contidos no

eletrólito para a superfície do anodo (cargas negativas). Além desta, outra camada

de íons envolvidos por moléculas de água se aproxima por atração eletrostática da

superfície do anodo, a chamada camada externa de Helmholtz. O processo promove

o aumento do pH no local, que favorece a precipitação de íons cálcio e fosfato que

revestem a superfície (LOBO, 2011a), conforme figura 23.

Figura 23 - Ilustração da célula de deposição de fosfato de cálcio.

Fonte: Lobo, 2011a e Adaptado de Groove, 2002.

58

A figura 24, mostra o potenciostato da marca AUTOLAB, modelo PGSTAT302

que foi utilizado no procedimento, o eletrodo de referência de Ag/AgCl e o contra-

eletrodo utilizado foi de platina. Os nanocristais de nHAp1 foram produzidos pela

aplicação de um potencial constante de -2.0 V durante 30 minutos e a temperatura

da solução foi mantida a 70°C em um agitador magnético, conforme Lobo et al.,

2011a. Figura 24 - Potenciostato utilizado no processo de eletrodeposição.

Fonte: Autora.

3.1.3 Síntese de VACNT-O:nHAp2 por imersão em SBF

A biomineralização das amostras de VACNT-O foi realizada no laboratório de

Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob

responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo.

59

As amostras de VACNT-O foram biomineralizadas por imersão em solução de

SBF (5x). A solução consiste em uma mistura de íons em água destilada, preparada

sob a agitação, com pH 7,4 em temperatura de 28°C. O ajuste do pH foi realizado

com adição HCl e NaOH, sendo que os reagentes estão indicados na tabela 2

(BARRERE et al., 2002).

Tabela 2 - Concentrações dos reagentes para solução de SBF 5x

Reagentes Concentrações

NaCl 40g/L (733,5 mM)

MgCl2 1,52g/L (7,7 mM)

CaCl2.2H2O 1,84 g/L (12,5 mM)

Na2HPO4.2H2O 0,89 g/L (5,0 mM)

NaHCO3 1,76 g/L (21,0 mM) Fonte: Barrere et al., 2002b.

As amostras de VACNT-O foram dispostas em placas Petri e levadas à câmara de

fluxo laminar com irradiação ultravioleta (UV) (modelo BioProtector-12 Plus VECO)

por 30 minutos. Após este período, com o auxílio de uma pinça, todas as amostras

foram colocadas em tubos corning separadamente, onde foram adicionados 13

mLde SBF (5x) e acondicionadas em incubadora refrigerada de bancada (marca

Cientec, modelo CT-713), visto na figura 25.

60

Figura 25 - Shaker utilizado para incubação das amostras durante o processo de biomineralização.

Fonte: Autora.

Os tubos foram agitados na incubadora à 75 rpm, em temperatura de 36,5°C pelo

período de 21 dias. Após a incubação, as amostras foram retiradas da solução de

SBF, lavadas em água deionizada a 80ºC e levadas à estufa (modelo sp400

SPLABOR) a 50°C para secagem por 1 h. Estas amostras foram nomeadas como

VACNT-O:nHAp2

3.1.4 Dispersão de nHAp/VACNT-O em PDLLA A produção das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foi realizada no

laboratório de Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do Paraíba

(UNIVAP) sob responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. As amostras foram removidas dos respectivos substratos e misturadas em

solução de copolímero L-Lactide/D-Lactide (PDLLA), Purasorb® PLD-9655; Purac

biochem, Holland, diluído em clorofórmio 10% m/v sob agitação constante por 120

min (CAI et al., 2002). A dispersão dos nanocompósitos foi realizada em ultrassom

de ponta (SONICS, VCX500W), conforme figura 26, com energia de 819 J mL-1 e P

16W para VACNT-O:nHAp1, 1210J mL-1 e P 16W para VACNT-O:nHAp2 e

temperatura da suspensão mantida sempre abaixo de 40°C. Em cada 20ml de

61

clorofórmio, 10% (m/v) de PDLLA em solução com o teor de 0,3% (m/v) de nHAp1 e

nHAp2, a dispersão com sonificação teve duração de 3 min. As soluções foram

inseridas em formas circulares de 0,5 mm de diâmetro e mantidas em temperatura

ambiente para evaporação lenta com umidade controlada do ar 70% a 80%

(SUNAMI et al., 2005) por 12 horas.

Figura 26 - Equipamento de ultrassom (SONICS, VCX500W) utilizado na dispersão das nanopartículas.

Fonte: Autora.

A hidrofilicidade do biomaterial foi adquirida por tratamento em reator de plasma

de O2, com os seguintes parâmetros: tempo de tratamento a plasma: 2 minutos,

tensão aplicada: - 700 V, taxa de fluxo: 1sccm, e pressão: 85 mTorr, frequência de

20kHz, a hidrofilicidade da superfície foi adquirida pela a incorporação dos grupos

62

carboxílicos polares (LOBO et al., 2010). Membranas porosas sem tratamento a

plasma foram utilizadas como controle.

3.1.5 Esquema da produção das membranas

A figura 27 mostra um esquema da produção das membranas. Número (1)

descreve a produção dos nanotubos de carbono verticalmente alinhados (VACNT) e

funcionalização. Número (2) descreve a eletrodeposição de cristais de nHAp em

VACNT-O (nHAp1). Número (3) mostra a produção de VACNT-O: nHAp pelo método

de imersão em fluido corporal simulado (nHAp 2). As nanopartículas (nHAp 1 e

nHAp 2) foram removidas de seus respectivos substratos e transferidas para uma

solução de clorofórmio (4). Número (5) mostra as nanopartículas nHAp1 nHAp2

dispersas sob irradiação de ultra-som em clorofórmio, e em seguida, a solução

polimérica foi homogeneizada sob agitação constante durante 120 min (6). O

número (7) mostra a solução polimérica inserida no molde redondo com 0,5 mm de

diâmetro e a evaporação lenta do solvente em temperatura ambiente por 12 h em

umidade controlada de 70-80%. Número (8) mostra o tratamento com plasma de

oxigênio para incorporação de grupos carboxílicos polares.

63

Figura 27 - Esquema da produção das membranas.

Fonte: Autora.

64

3.2 Ensaio de bioatividade in vitro

O ensaio de bioatividade das membranas porosas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foi

realizado no laboratório de Nanotecnologia Biomédica na Universidade do Vale do

Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor Dr. Anderson de Oliveira Lobo. Avaliou-se a precipitação nHAp carbonatada em membranas de PDLLA/VACNT-

O:nHAp em imersão em solução SBF (5x) (pH = 7,4) por 14 dias. Para a preparação

da solução SBF (5x) foram utilizados os reagentes: NaCl: 733,5 mM; MgCl2.6H2O:

7,5 mM; CaCl2.2H2O: 12,5 mM; Na2HPO4.2H2O: 5,0 mM; NaHCO3: 21,0 mM)

(BARRERE et al., 2002b). As membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp foram

colocadas em tubos de ensaio e expostas à luz ultravioleta na câmara de fluxo

laminar (bioprotetor-12 Plus VECO) durante 30 min. Em seguida, foram adicionados

13 ml de uma solução de SBF nos tubos de ensaio e armazenados numa

incubadora refrigerada (Cientec, CT-713), em agitação constante a 75 rpm e a

36,5°C por 14 dias. Após o tempo de incubação, lavou-se as amostras com água

deionizada e as amostras foram secas em estufa (SP400, SPLABOR) a 50°C por 1h.

3.3 Caracterização das Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp

3.3.1 Microscopia eletrônica de Varredura e Transmissão

As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e transmissão foram

utilizadas para caracterização morfológica dos biomateriais, sendo que a

microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para apresentar os detalhes das

nanopartículas (CARNEVAROLO JUNIOR, 2003; ORÉFICE, PEREIRA, MANSUR,

2012).

Neste estudo, as micrografias foram obtidas pelos Microscópio Eletrônico de

Varredura de alta resolução e um Microscópio Eletrônico de Transmissão (EVO

MA10 Carl Zeiss e HR-TEM, JEOL 3010, localizados na Universidade do Vale do

Paraíba e na Universidade Federal de São Carlos, respectivamente) para

caracterizar as propriedades morfológicas e estruturais das amostras.

65

3.3.2 Perfilometria óptica

A técnica de perfilometria é utilizada para medir as dimensões, profundidade e

rugosidade de superfícies (COSTA, 2008).

O perfilômetro óptico (WYKO NT 1100 series Optical Profiling System) foi usado

para topografia e medições de rugosidade, este equipamento está localizado no

Instituto de Pesquisas Espaciais.

3.3.3 Análise da porosidade

Análises de porosidade foram realizadas com o método de imersão, esta análise

foi realizada no Laboratório de Nanotecnologia Biomédica (UNIVAP). Para tal

análise, as membranas foram imersas em n-butanol durante 2h. Depois o excesso

de reagente foi removido com papel filtro e as amostras foram pesadas em balança

de precisão (WANG et al., 2009b). Calculou-se a porosidade usando a equação 1:

, (Equação 1)

Onde, ∈ é a porosidade, mb é a massa absorvida de n-butanol, mp é a massa da

membrana e ρb é a densidade de n-butanol e ρp é a densidade de PDLLA (WANG

et al., 2009b).

O Image J® foi utilizado para calcular o número de poros na superfície das

membranas poliméricas.

3.3.4 Calorimetria diferencial exploratória

A análise de calorimetria diferencial exploratória foi realizada Departamento de

Engenharia de Materiais da Universidade de São Carlos (DEMA-UFSCAR) sob

responsabilidade da professora Dra. Rosário Elida Suman Bretas. O comportamento térmico de 5 mg de cada amostra foi estudado por calorimetria

diferencial exploratória (DSC) (TA Instruments, modelo Q100). O aquecimento foi

realizado a partir de 25 a 200°C, a 10°C min-1, para todas as amostras. A partir do

66

calor de fusão, a quantidade de cristalinidade (% C) foi calculada pela seguinte

equação:

0

%H

HHC ccm

∆∆−∆

= , (Equação 2)

onde ΔHcc é a entalpia de cristalização a frio (quando presente), ΔH m é a entalpia

de fusão da amostra e ΔH 0 é a entalpia de fusão de uma amostra 100% cristalina.

Para o PDLLA, ΔH0 foi 93 J.g-1 (RIBEIRO NETO et al., 2012).

A quantidade de solvente residual (quando presente) foi calculada a partir da

equação 3:

).( LTcmHV +∆=∆ , (Equação 3)

onde ΔHv é a endotérmica de vaporização, m é a massa do solvente residual

vaporizado (kg), c é o calor específico do solvente, Δ T=(temperatura final

vaporização - temperatura inicial vaporização) e L é o calor latente de vaporização

do solvente. A porcentagem de solvente residual (%SR) foi calculado a partir da

equação 4 (RIBEIRO NETO et al., 2012):

100.%Tm

mSR = , (Equação 4)

onde a massa, mT = massa da amostra DSC (kg).

3.3.5 Termogravimetria

As análises termogravimétricas (TGA) foram realizadas pela empresa TA

Instruments, utilizando um analisador térmico (TA instruments, modelo TGA Q500).

As análises foram realizadas em 20°C min-1-800,0 °C. As medições foram feitas

usando uma massa de amostra de ± 5 mg para todas as membranas produzidas.

3.3.6 Espectroscopia de reflexão total atenuada no infravermelho com

transformada de Fourier (ATR-FTIR)

Esta análise foi realizada no laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica

na Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) sob responsabilidade do professor

Dr. Airton Abrahao Martin.

67

A Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier por reflectância

total atenuada (ATR-FTIR) foi utilizada para confirmar a hidrofilicidade do material

antes e após a funcionalização com plasma de O2 e a biomineralização. Coletamos

os dados no intervalo de 4000-700 cm-1, 3 pontos para cada amostra, utilizando um

espectrofotômetro equipado com detector MCT operando em refrigeração por

nitrogênio líquido (Spotlight Spectrum 400 FT-IR, Perkin Elmer).

3.3.7 Análises de ângulo de contato

Esta análise foi realizada no Laboratório Associado de Sensores e Materiais

(LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do nosso

colaborador professor Dr. Evaldo José Corat.

As propriedades de superfície do material e a interação com o meio biológico são

fatores determinantes para o sucesso do implante. A primeira interação do meio

biológico com o implante corresponde à adsorção de proteínas, a adesão e o

espalhamento celular, sendo que a molhabilidade, energia superficial e força

interfacial de adesão são determinantes para a interação biológica (VAN OSS;

GOOD; CHAUNDHURY, 1986; SCHENDER, 1996; ELIAS et al., 2008).

Para as medidas de ângulo de contato (AC) foi utilizado o método de Gota séssil

com água deionizada (2 µL) e diiodometano (2 µL) em temperatura e pressão de

atmosfera controlada. O goniômetro KrÜss, modelo EasyDrop Contact Angle

Measuring Instrument (EasyDrop DSA 100) foi utilizado para aquisição das medidas

de ângulo de contato. Neste equipamento há uma câmera que grava a imagem da

gota, que por meio de um tratamento algoritmo determina o ângulo de contato.

Foram realizadas medidas, imediatamente após a deposição de gotas sobre a

superfície para evitar perturbações por evaporação ou adsorção. Como método de

aquisição utilizou-se o método de gota séssil. Para a interpretação dos resultados

utilizou-se o software Drop Shap Analysis 4 (KRÜSS) para o ajuste do método

variável do ângulo de contato, utilizando como linha de base o método de

Young-Laplace. Os dados foram apresentados na forma de média e desvio padrão

e foram coletados com um intervalo de confiabilidade de 99,1% baseado no valor da

medida de tensão superficial da água e do diiodometano. Depois disso, calculou-se

a energia de superfície de cada grupo de amostras, pela metodologia proposta por

68

Owens (OWENS; WENDT, 1969). Esta energia de superfície descrita como a soma

das componentes dispersiva (d) (associada a grupos não polares presentes) e polar

(p) (associada aos grupos polares presentes na superfície). O caráter hidrofóbico ou

hidrofílico pode influenciar a adesão celular no biomaterial.

A estatística para comparação entre os grupos foi realizada usando Origin®

versão 8.5, para rugosidade, porosidade e hidrofilicidade, teste de Tukey (n=3).

A energia de superfície é composta por componentes polares e dispersivas das

amostras avaliadas pela medição de AC. A tensão interfacial entre as duas fases

condensadas pode ser determinada pela equação de Young, conforme equação 5:

SLSVLV cos γγθγ −= , (Equação 5)

onde θ é o Angulo de contato mensurado entre o líquido e o sólido, γLV, γSV, e γSL

são energias interfaciais de líquido/vapor, sólido/vapor e inferfaces sólido/líquido,

respectivamente. Esta equação pode ser reescrita como a equação de Young-Duprè

(Equação 6):

( ) SLSVLVa cos1W γγθγ −=+= , (Equação 6)

onde Wa é a energia de adesão por unidade de área das superfícies sólidas e

líquidas. Sob a forma geral da equação (5), (6), em seguida, pode ser escrita

(Equação 7):

( ) DS

DL

pS

pLLV cos1 γγγγθγ 22 +=+ , (Equação 7)

onde γpL e γp

S são os componentes polares da energia superficial de líquidos e de

fase em fase sólida, respectivamente, enquanto γDL e γD

S são os componentes

dispersivos da energia de superfície da fase líquida e sólida, respectivamente.

Desde γDL e γp

L foram publicados para muitos líquidos, é possível aproximar γDS e

γpS a partir de uma única medida de θ pela utilização da equação (6). Assim, por

meio da medição dos ângulos de contato de dois líquidos diferentes (água destilada)

e diiodometano, componentes polares e dispersivas da energia de superfície.

Termodinamicamente, a adesão de bactérias e de células numa superfície sólida

pode ser descrito por meio do equilíbrio de energia livre interfacial pela seguinte

equação 8 (VAN OSS; GOOD; CHAUNDHURY, 1986):

, (Equação 8)

69

Onde, ΔFAdh é a energia livre interfacial de adesão, SC é a energia livre interfacial

de células sólida, e SL é a energia livre interfacial sólido-líquido, e CL é a energia

interfacial da célula-líquido.

A força de adesão é termodinamicamente favorável quando o resultado é positivo. A

energia livre interfacial de adesão é determinada pela seguinte equação 9 (VAN

OSS; GOOD; CHAUNDHURY, 1986; SCHENDER, 1996):

−−−−

+++

++

=∆

Lp

CDS

DC

pS

LWC

LWS

pL

DC

DL

pC

LWL

LWC

pL

DS

DL

pS

LWL

LWS

AdhF

γγγγγγγ

γγγγγγ

γγγγγγ

2 , (Equação 9)

3.4 Caracterização da Bioatividade

3.4.1 Microscopia eletrônica de varredura

Neste estudo, as micrografias foram obtidas pelo Microscópio Eletrônico de

Varredura de alta resolução, modelo EVO MA10 Carl Zeiss, para caracterizar as

propriedades morfológicas e estruturais das amostras. Este microscópio está

localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento na Universidade do Vale do

Paraíba.

3.4.2 Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier utilizando

reflectância total atenuada (ATR-FTIR)



Dr. Airton Abrahao Martin. Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier no modo de

reflectância total atenuada (ATR-FTIR) foi utilizada para caracterizar grupos de

carbonato e fosfato, formados na superfície das membranas poliméricas após

biomineralização de 14 dias. Os espectros foram obtidos no intervalo de 1000-700

70

cm-1, técnica pontual (n=3), utilizando Thermo Scientific (Nicolet modelo IS 5)

equipado com resolução 4 cm-1.

3.4.3 Difração de Raios X

Esta análise foi realizada no Laboratório Associado de Sensores e Materiais

(LAS) no Instituto de Pesquisas Espaciais (INPE) sob responsabilidade do nosso

colaborador professor Dr. João Paulo Barros Machado.

O equipamento utilizado para a caracterização estrutural das amostras foi o

difractômetro de Raio-X de alta resolução utilizando radiação Cu K-α gerada a 40 kV

e 50 mA (Marca Philips X´Pert MRD). As medidas foram realizadas no modo de

ângulo rasante quando necessário; o espectro de refletividade foi ajustado com uma

varredura de w/2Q entre w=0,05º e w=7º.

As indexações dos picos de difrações e análises foram realizadas com o software

X´pert highscore (disponível em: www.panalytical.com) e as fichas cristalográficas da

base de dados do Joint Commitee on Power Diffraction Standards. Todos os

resultados foram comparados com padrão da amostra de HAp (ficha cristalográfica

00-019-0272 para hidroxiapatita carbonatada) e sendo a equação de Scherrer foi

aplicada para a determinação do tamanho médio dos cristalitos.

3.5 Ensaios biológicos in vitro

Os experimentos in vitro foram realizados no Departamento de Odontologia

Restauradora da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP)

sob responsabilidade do professor Dr. Bruno das Neves Cavalcanti.

3.5.1 Cultura de células

Todos os experimentos foram realizados sob a aprovação do Comitê de Ética e

Pesquisa da Unesp (nº46420) e foram repetidos 3 vezes para assegurar a

reprodutibilidade. Osteoblastos humanos normais foram obtidos de Lonza (CC-2538,

Lonza, Walkersville, USA) e cultivados em meios de crescimento específico (OGM,

71

CC-3207, Lonza). As células foram utilizadas entre o terceiro e quinto dia de

diferenciação em todos os experimentos.

3.5.2 Ensaio de citotoxicidade

O teste de SRB baseia-se na coloração das proteínas pelo corante sulforodamina

B, este possui dois grupos sulfônicos que se ligam as proteínas das células fixadas

na placa, precipitadas pelo ácido acético, de modo que fornece uma correlação

direta entre a quantidade de proteínas e do número de células.

As células foram semeadas em placas de 24 poços (1x104 células/poço),

conforme figura 28a. Os grupos de controles foram estabelecidos: um controle

negativo (apenas meio de cultura de células, sem células) e um controle positivo

(células cultivadas em meio de cultura normal). As amostras foram colocadas

diretamente no meio, sem contato com as células, a fim de que os seus produtos de

degradação fossem capazes de induzir citotoxicidade. Após 5 dias, as membranas

foram removidas, as células foram lavadas em solução salina tamponada com

fosfato (PBS, Gibco, Carlsbad, EUA) e fixadas com ácido tricloroacético a 10% (1

hora a 4 °C). Após lavagem e secagem, as células foram coradas com uma solução

sulforodamina B 0,4% em ácido acético a 1% (SRB, Sigma, St. Louis, EUA) durante

30 minutos à temperatura ambiente, conforme figura 28b.

Figura 28 - Plaqueamento para os ensaios celulares (a) e Marcação para SRB (b).

Fonte: Autora.

As células foram lavadas com ácido acético a 1% para remover o corante não

ligado e secas. O corante ligado foi solubilizado em 1 mM de base Tris (Sigma), e a

solução foi agitada e transferida para uma placa de 96 poços, de modo a ser lida a

72

570 nm. Os dados foram normalizados pelo grupo controle positivo. Os dados foram

normalizados conforme a fórmula especificada na equação 10:

( )100Branco do aAbsorbânci– Positivo Controle Células de aAbsorbânci

branco do aAbsorbânci– amostras das Células das aAbsorbânci=celular eViabilidad %

(Equação 10)

3.5.3 Ensaio de fosfatase alcalina

Mineralização funcional foi observada pela atividade da fosfatase alcalina (ALP).

Esta atividade foi avaliada utilizando fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) como o

substrato colorimétrico nº 83369, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Os grupos de

controle foram estabelecidos como descrito para o ensaio de citotoxicidade e a

eficácia do ensaio foi avaliada pela adição de um grupo experimental com meios

regularmente suplementados por dexametasona e beta-glicerophosphate (CC-4194,

Lonza), bem conhecido por induzir a mineralização. Após incubação durante cinco

dias, o sobrenadante foi recolhido e adicionado (50 µL) em triplicata, numa placa de

96 poços. O substrato foi adicionado a cada poço e foram preparados para leitura

num leitor de microplacas a 405 nm. Os dados foram apresentados como nmol de

atividade por poço, de acordo com os valores obtidos para a curva padrão. Utilizou-

se o controle negativo para normalização dos dados. Os dados foram analisados

usando o software Origin 8.5® por one-way Anova e Tukey (p <0,05).

3.6 Estudo in vivo

Os procedimentos cirúrgicos e o processamento histológico foram realizados no

Centro Multidisciplinar para investigação biológica na área da ciência em animais de

laboratório (CEMIB/UNICAMP) sob responsabilidade do professor Dr. Marcus

Alexandre Finzi Corat

3.6.1 Animais

Camundongos C57BL/6/JUnib, adultos (12 semanas), machos com 22-28 g de

peso corporal, provenientes do CEMIB/UNICAMP, Campinas, Brasil, foram utilizados

73

neste estudo. Todos os procedimentos com animais estavam de acordo com os

Princípios Éticos na Experimentação Animal estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas

com animais da Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP (CEP: 3253-1),

Brasil.

3.6.2 Acondicionamento dos animais

Os animais ficaram alojados em caixa de polietileno no biotério do Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de

Laboratório (CEMIB), temperatura entre 22ºC à 25ºC, umidade relativa entre 40% a

60%, com foto período com ciclos de 12 horas claro-escuro, acesso irrestrito à ração

peletizada e água ad libitum.

Foram utilizados três grupos: PDLLA como controle, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e

PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Todas as amostras foram esterilizadas durante 24 h sob

radiação UV.

1. Grupo B- PDLLA (n=3);

2. Grupo C-PDLLA/VACNT-O:nHAp1 obtida pelo método de

eletrodeposição (n=3);

3. Grupo D-PDLLA/VACNT-O:nHAp2 obtida pelo método de imersão em

SBF (n=3);

3.6.4 Anestesia e Defeito ósseo

Os animais foram anestesiados pela injeção intraperitoneal Avertin (2,2,2-

tribromoetanol) com 2,5% (225-240mg/kg) e realizou-se a tricotomia, seguida de

antissepsia com Povidine® tópico e incisão circular de 1mm de diâmetro com lâmina

de bisturi nº 15, na região da fontanela posterior (região interparietal). O defeito

ósseo foi confeccionado com um equipamento de ultra-som CVDent1000® equipado

com uma ponta de diamante estéril CVDentus® sob irrigação com solução salina

estéril para evitar aquecimento ao osso. O tecido muscular e tegumentar foi suturado

com fio catgut nº 4 e foi realizado o curativo local com Rifamicina tópico (10mg/ml).

Detalhes da região do implante pode ser visto na figura 29.

74

Figura 29 - Ilustração de região de implante de PDLLA/VACNT-O:nHAp em osso interparietal de camundongos.

Fonte: Adaptado de Mouse Genome Informatics, 2015.

Os animais dos grupos A, B, C receberam implante de minirolos poliméricos

estéreis sob ligeira pressão no local exato do defeito ósseo e o tecido muscular foi

suturado.

O analgésico Cloridrato de tramadol, via intraperitoneal foi administrado, na dose

10mg/kg (MCKEON et al., 2011), 2x ao dia, durante duas semanas após a cirurgia.

3.6.5 Eutanásia

Após 4 meses da cirurgia, os animais foram sacrificados. A indução anestésica foi

realizada em uma câmara de vidro transparente (15 cm x 25 cm x 15 cm) dotada de

orifícios para entrada e saída de gases (oxigênio, agente anestésico, gás carbônico).

O agente anestésico halogenado utilizado foi o Halotano (Laboratorio Cristalia) na

concentração de 3% em fração inspirada de oxigênio de 100%, sendo administrado

por vaporizador calibrado automático durante 3 minutos, tempo necessário para que

o animal apresente perda dos reflexos posturais e incapacidade de se deslocar na

câmara.

75

Ao termino do procedimento anestésico os animais foram sacrificados ainda sob

anestesia, por meio de injeção intracardíaca de cloreto de potássio (KCL) a 20%

(LEITE, 2011).

3.6.6 Retirada do tecido ósseo

Após 4 meses, os animais foram sacrificados, os ossos foram retirados, seguido

pela remoção dos tecidos moles dos ossos. Os ossos foram congelados a -89ºC.

3.6.7 Análise espectroscópica

A espectroscopia Raman é uma técnica utilizada para estudo da interação dos

fótons com o material analisado, visando obter as bandas de vibrações moleculares

(SALA, 1996), sendo uma técnica rápida e não destrutiva para diagnóstico e estudo

de tecidos biológicos (SCHRADER; DIPPEL, 1999). Com a microscopia Raman

confocal, é possível analisar pontualmente a amostra e adquirir uma amostragem

controlada nos eixos X, Y e Z, com resolução espacial de 5 µm e espectral de 5 cm1.



Dr. Airton Abrahao Martin. Secções de bloco da calvária contendo os defeitos foram colhidas a partir dos

locais de cirurgia, a região do defeito ósseo foram seccionadas com uma lâmina de

diamante e os tecidos moles foram removidos anteriormente.

As medidas Raman confocal foram realizadas sobre as secções de blocos da

calvaria onde realizou-se os defeitos utilizando um laser de 785 nm para excitação

focado com uma lente de 40X, por 10 segundos de tempo de integração e 20 mW na

amostra. Os dados foram obtidos pelo Rivers Diagnostics (Model 3510) com detector

CCD. Os dados Raman foram dispersos por um Rivers Diagnóstico (modelo 3510) e

recolhidos por um detector CCD. Analisou-se a região de impressão digital espectral

(400-1800 cm-1) em três locais diferentes de cada amostra.

76

3.6.8 Análise histológica

Para a microscopia óptica, as amostras foram fixadas em solução contendo

formaldeído a 10%, por 48 horas, a seguir as amostras foram lavadas para remoção

do fixador e submetidas à descalcificação com solução de EDTA em tampão fosfato

0,1M por duas a três semanas. As amostras foram lavadas por 2 horas em água

destilada e se procederá à desidratação seriada (álcool 30%- 1h, 50%-1h, 70%-1h,

90%-1h, 100%-1h, 100%-1h e 100 %-1h). Após este processo, as amostras foram

imersas em solução contendo xilol e álcool 100% por 1 hora, posteriormente as

amostras foram imersas em xilol puro por 1 hora e depois três vezes em xilol puro 30

min cada. As amostras foram imersas em Paraplast® a 60ºC por 30 minutos, após o

primeiro banho, as amostras foram trocadas de Paraplast®. Os cortes microscópicos

foram realizados em micrótomo, com 5µm de espessura, foram feitas 3 lâminas para

cada osso. A técnica de coloração foi realizada com três imersões em xilol de 3 min

cada, seguindo a sequência de imersões (3 x de 3min em etanol 100%, 1 x de 3min

em etanol 95%, 1x de 3min em etanol 80%, 1x de 5min em água deionizada, 1x de

3min em hematoxilina, enxague com água deionizada, 1x de 5min em água de

torneira, 8-12x imersões em etanol ácido, enxague com água de torneira, enxague

com água deionizada, 1x de 30seg eosina, 3x de 5min em etanol 95%, 3x de 5min

em etanol 95% e 3x de 5min em etanol 100% e 3x de 15min em xilol) (CAPUTO;

GITIRANA; MANSO, 2010).

3.6.9 Microscopia Eletrônica de Varredura

Os espécimes foram fixados com glutaraldeído a um 2,5% (0,1 M) de tampão de

cacodilato de sódio durante 1h e desidratados numa série graduada de solução de

etanol (30, 50, 70, 95, e 100%) durante 10 minutos cada. Na fase de secagem

utilizou uma solução 1:1 de etanol com hexametildisilazano (HMDS) e as amostras

foram secas com HMDS puro à temperatura ambiente. Após a deposição de uma

fina camada de ouro, as amostras foram examinadas por microscopia eletrônica de

varredura. As micrografias foram obtidas pelo Microscópio Eletrônico de Varredura

de alta resolução, modelo EVO MA10 Carl Zeiss, localizado no Instituto de Pesquisa

e Desenvolvimento na Universidade do Vale do Paraíba.

77

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 30 mostra a análise por MEV e MET das nanopartículas antes da

dispersão na matriz polimérica de PDLLA. Figura 30a mostra micrografias coletadas

de nanopartículas de VACNT-O. Figura 30 a.1 mostra detalhes da esfoliação dos

VACNT-O e 30 a.2 mostra uma micrografia MET de estruturas de bambu típicas de

VACNT-O. A Figura 31 mostra nanopartículas nHAp1 obtidas pelo método de

eletrodeposição. Figura 31 b.1 e b.2 mostra detalhes do tipo placa nHAp obtidos por

eletrodeposição usando MEV e MET, respectivamente. A Figura 32 mostra

nanopartículas nHAp2 sobre VACNT-O obtidas depois da imersão em solução de

SBF por 21 dias. Figura 32 c.1 e c.2 mostra nHAp globulares com diâmetros de

tamanho nanométrico, micrografias coletadas de MEV e MET, respectivamente. A

diferença entre ambas nHAp é notável. A porosidade nHAp2 (Figura 32) produzidas

por SBF é maior do que nHAp1, obtidas por eletrodeposição.

78

Figura 30 - Micrografias coletadas, a partir de (a) VACNT-O, detalhes da esfoliação do VACNT-O (a.1) e VACNT-O, verticalmente alinhado (a.2); (a) micrografias coletadas por MEV. (a.1 e a.2) micrografias coletadas por MET.

Fonte: Autora.

79

Figura 31 - Micrografias coletadas a partir de (b) nHAp1 (eletrodepositadas), detalhes da morfologia de placas (b.1 e b.2). (b e b.1) micrografias coletadas por MEV. (b. 2) micrografias coletadas por MET.

Fonte: Autora.

80

Figura 32 - Micrografias coletadas a partir de (c) nHAp2 (imersão em SBF), detalhes da morfologia globular (c.1 e c.2). (c e c.1) micrografias coletadas por MEV. (c. 2) micrografias coletadas por MET.

Fonte: Autora.

81

A Figura 33 mostra micrografias de membranas porosas de PDLLA (Figura 33a),

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 33b.) e de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 33c).

Em geral, observou-se diferenças na morfologia da superfície entre os grupos após

a incorporação das nanopartículas. A Figura 31a mostra os poros menores sobre a

superfície de PDLLA (~ 227 poros por imagem, contados com Image J®). Após a

dispersão de nHAp1 em PDLLA, as membranas apresentaram poros maiores na

superfície com diâmetro entre 12-31μm (~ 87 poros por imagem, contados J®)

(Figura 33b). Após a incorporação de nHAp2, obteve-se valores entre 21-35μm (~

121 poros contados por imagem J®) (Figura 33c). A análise de perfilometria mostra

um aumento da rugosidade na PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (Figura 33 b.1) e

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 33 c.1), em comparação com as membranas de

PDLLA sem nanopartículas incorporadas (Fig. 31 a.1, controle). Portanto, observa-

se a formação de uma quantidade maior de vales nas membranas com

nanopartículas. As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 mostraram valores de porosidade de 84%, 60% e 84%,

respectivamente. As membranas de PDLLA controle, apresentaram poros em menor

diâmetro sobre a superfície (~ 227 poros) e 84% de porosidade. No entanto, o

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 apresentou a mesma porosidade de 84% com ~ 121 poros

na superfície, provavelmente devido à grande absorção da nHAp2. Podemos atribuir

isso a maior porosidade da nHAp2 ao comparada com a nHAp1 (Figura 33 c1).

A Tabela 3 mostra a rugosidade da superfície das membranas de PDLLA,

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Observou-se uma diferença

significativa entre as membranas de PDLLA (controle) em comparação com

PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Em comparação, as membranas de PDLLA/VACNT-

O:nHAp2 apresentou um aumento de rugosidade de 41,84%.

82

Tabela 3 - Análises da rugosidade de superfície das diferentes membranas porosas produzidas. Dados expressos em média de 3 membranas (n = 3)

Membranas porosas Ra (µm) DP

PDLLA 4,11 0,32

PDLLA/VACNT-O:nHAp1

4,88 0,45

PDLLA/VACNT-O:nHAp2

5,83 0,94

Fonte: Autora.

Figura 33 - Micrografias (MEV) e perfilometria das membranas antes e depois das nanopartículas incorporadas. (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que (1) perfilometria.

Fonte: Autora.

83

A Figura 34 mostra as análises da energia superficial de membranas de PDLLA,

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após tratamento com plasma

de oxigênio utilizando líquidos polares e dispersivos. Os dados mostram que as

membranas de PDLLA apresentavam um ângulo de contato de 112°. No entanto,

houve uma diferença menor em valores de AC depois da incorporação das

nanopartículas de nHAp (valores entre 89º). Portanto, os tratamentos foram

suficientes para melhorar a hidrofilicidade do biomaterial. Vários autores relataram

que uma superfície polimérica parcialmente hidrofílica com um ângulo de contato de

60-90º aumenta a adesão celular e que a energia de superfície pode estar

relacionada à adesão celular em superfícies poliméricas (VAN WACHEM, 1987;

HASSON; WIEBE; ABBOTT, 1987; TAMADA; IKADA, 1994; IKADA, 1994). As

membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 apresentaram menor diferença

na energia de superfície, com valores entre 21,27±5 mNm-1. No entanto, as

membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 mostraram uma energia de superfície

maior (27,35 ± 7 mNm-1). Esta diferença de energia superficial apresentada nas

membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 pode ser atribuída ao controle da

distribuição de poros, como mostrado na Figura 33c.

Figura 33 mostra os espectros ATR-FTIR coletados de membranas de PDLLA,

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Todos os grupos mostraram

uma banda de absorção forte a 1750 cm-1 que corresponde ao grupo carbonila (CO)

da estrutura química de PDLLA. Foram observadas bandas a 1450 cm-1 e 1380 cm-1,

atribuídas a uma absorção saturada a partir da ligação C-H, bem como uma forte

banda de absorção de CO em 1270-1045 cm-1. A banda em 750 cm-1 pode ser

atribuída ao modo rocking da ligação –CH2. A banda a 870 cm-1 corresponde a

deformação C-H e a banda a 960 cm-1 é atribuída a CH=CH (WILSON; DECIUS;

CROOSS, 1980; COLTHUP, DALY, WIBERLY,1990; LIU et al., 2006; ZHENG et al.,

2009).

Analisou-se a área do pico ATR-FTIR para provar as propriedades hidrófilas das

membranas após o tratamento com plasma de oxigênio. Para isso, utilizou-se a

banda mais intensa centrada a 1750 cm-1 atribuída a ligação CO. Observou-se um

aumento de 15% na área (p<0,05) para ambos, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/

VACNT-O:nHAp2 em comparação com PDLLA (controle). Este aumento foi atribuído

à incorporação de grupos de oxigênio, após o tratamento com plasma.

84

Figura 34 - Análise de ângulo de contato de todas as membranas produzidas com e sem nanopartículas incorporadas. O PDLLA sem nanopartículas foi utilizado como controle. Os dados foram coletados a partir de 3 amostras (n=3).

Fonte: Autora.

O aumento da rugosidade e porosidade da superfície dos biomateriais contribui

também para o aumento da molhabilidade e determina a adsorção de proteínas e a

adesão e proliferação celular (DUAN; WANG, 2006; MACHADO, 2008; THELEN;

BARTHELAT; BRINSON, 2004; VANDROVCOVÁ; BAČÁKOVÁ, 2011; BACAKOVA

et al., 2011; BAUER et al., 2013; WU et al., 2014).

Yang, Bei e Wang (2002), descreveram que a hidrofilicidade e a rugosidade de

superfície são características importantes na interação celular e que aumentam a

afinidade das células de fibroblastos pelo PDLLA. No estudo de Yang, Bei e Wang

(2002), a superfície do PDLLA foi modificada por um tratamento a plasma de

oxigênio e amônia, que agregou grupos polares e aumentou a adsorção e

ancoragem do colágeno na superfície do PDLLA (YANG; BEI; WANG, 2002).

Resultados semelhantes foram obtidos por Lin et al (2010), grupos funcionais

tornaram o PDLLA mais hidrofílico e melhorou adesão e proliferação celular na

superfície do PDLLA.

Nithya et al. (2011) estudaram o efeito do plasma e enzima celulase para

modificação de superfície. Os tratamentos de plasma e da enzima celulase foram

eficazes para melhorar a molhabilidade de tecidos de algodão. Esta hidrofilicidade

85

foi comprovada pelo aumento do grupo carbonila (C-O) pela técnica de FTIR

(NITHYA et al., 2011).

Neste contexto, os tratamentos com plasma são frequentemente usados para

modificar a superfície dos materiais e melhorar a resposta celular a uma superfície

(WADE; MAMMODE; BINDER, 1991; LOH, 1999; FAVIA; D´AGOSTINHO, 1998;

YANG; BEI; WANG, 2002). Nesta tese, utilizamos a técnica de ATR-FTIR para

confirmar a hidrofilicidade das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp obtida pelo

tratamento de plasma de oxigênio (NITHYA et al., 2011).

Resultados semelhantes foram obtidos por Alves et al. (2008), o tratamento de

plasma de oxigênio promoveu o aumento da hidrofilicidade e da energia de

superfície. Estas propriedades favoreceram a adsorção de proteínas e a afinidade

celular após a adsorção das proteínas na superfície do PDLLA (ALVES et al., 2008).

Figura 35 - Espectros FTIR-ATR de membranas PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/ VACNT-O:nHAp2. Todos os espectros foram coletados em três pontos diferentes.

Fonte: Autora.

86

Os componentes da energia de superfície foram obtidos com o método de Owens

(OWENS; WENDT, 1969) e estão listados na tabela 4. Calculou-se a energia de

superfície total da soma das componentes polar (γp) e (γd) dispersiva.

Para estimar as componentes dispersivas e polares foram utilizadas expressões

termodinâmicas, assim como para o cálculo da energia de adesão interfacial das

membranas. Foram utilizados os valores da energia de superfície de células de

fibroblastos de camundongos L929 (SCHAKENRAAD et al., 1998). Os dados

mostram que o PDLLA possui características hidrofóbicas com energia interfacial

positiva (ΔFadh) (tabela 4). No entanto, as membranas com nanopartículas

incorporadas apresentaram resultado termodinamicamente favorável à adesão

celular com valores negativos (ΔFadh).

Tabela 4 - Componentes de energia de superfície e livre interfacial de adesão das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2

Membranas

Energia livre de superfície (mN m-1) Energia interfacial de

adesão

(mJ m-2)

Dispersiva

(γd)

Polar

(γp) Total

PDLLA 10,47 1,38 11,85 20,37

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 30,42 2,7 33,12 -5,27

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 38,42 0,78 39,2 -10,20

Fonte: Autora.

A Figura 36 mostra termogramas de membranas PDLLA com e sem nanopartículas incorporadas e a tabela 5 mostra os parâmetros térmicos calculados a partir desses termogramas.

87

Figura 36 - Os termogramas obtidos por calorimetria diferencial exploratória das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.

Fonte: Autora.

Tabela 5 - Parâmetros Térmicos de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp

Material ∆Hv (J g-1) ∆Hcc (J g-1) ∆Hm (J g-1) Tcc (oC) Tm (oC) Xc (%)

PDLLA 6,7 12,4 13,6 112,2 148,7 13,5

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 9,2 18,2 23,4 111,3 150,2 23,2

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 6,5 15,3 18,3 111,3 150,1 18,1

Fonte: Autora.

O primeiro pico endotérmico, entre 55°C e 69°C, foi atribuído à evaporação do

solvente residual, sendo que a evaporação do clorofórmio ocorre em torno de 55-

60°C (ALLO et al., 2012), na mesma faixa de transição vítrea (Tg) do PDLLA. Todos

os grupos de membranas apresentaram uma pequena quantidade de solvente

residual. As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-

88

O:nHAp2 apresentaram uma quantidade de solvente residual de 4%, 3,4% e 2,5%

(m/m), respectivamente. Os solventes orgânicos são prejudiciais para o crescimento

celular, no entanto, esta quantidade residual pode ser evaporada deixando os

materiais em uma estufa a 60°C antes de sua utilização como arcabouços para

regeneração óssea. Observou-se nas membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 dois

picos endotérmicos a 58°C e 62ºC, atribuídos ao restante da evaporação de SBF e

clorofórmio que permaneceu na estrutura das membranas. O pico exotérmico foi

atribuído ao processo de cristalização a frio durante a corrida de aquecimento. A

adição de VACNT-O:nHAp (nHAp1 e nHAp2) diminuiu o tempo de cristalização (tc)

das membranas quando comparado com PDLLA controle, o que indica que nas

membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp provavelmente as partículas atuam como

agentes de nucleação e aumentam a taxa de cristalização do PDLLA. Os aumentos

na entalpia de fusão, em ambas as membranas, confirmam o papel de nucleação

das nanopartículas em processo de cristalização a frio, também observada por

outros pesquisadores (ARMENTANO et al., 2010; DADBIN; NAIMIAN, 2014). Um

tempo de cristalização (tc) com valores mais baixos, podem induzir uma maior

ocorrência de perfeição cristalina, aumentando a entalpia (ΔHm) e a temperatura de

fusão (Tm) e bem como a cristalinidade (Xc) (DI LORENZO, 2006) (Tabela 5).

Portanto, observa-se que as nanopartículas VACNT-O:nHAp1 e VACNT-O:nHAp2

melhoraram a cristalinidade do PDLLA (Xc).

A cristalinidade é uma variável bem conhecida em ciências dos materiais e afeta

não apenas as propriedades físico-mecânicas, mas também biodegradabilidade. No

caso de polímeros, a cristalinidade proporciona uma maior estabilidade térmica, o

que pode ser útil para processos de esterilização térmica (LI; MCCARTHY, 1999).

Além disso, a taxa de biodegradação é mais lenta em polímeros cristalinos do que

nos polímeros semicristalinos ou amorfos, sendo assim a taxa de biodegradação

diminui com o aumento do índice de cristalinidade (TSUJI; MIYAUCHI, 2001;

SARASUA et al., 2005).

Com relação a ensaios biológicos, foi descrito na literatura que um aumento da

cristalinidade influencia a energia superficial, diante destes resultados, BIGGS et al.

(2003), investigaram a resposta celular frente a cristalinidade do PLLA. Os autores

relataram que as micropartículas de PLLA com maior cristalinidade induziu uma

89

menor resposta inflamatória in vitro em comparação com as partículas de

cristalinidade menores (BIGGS et al., 2003).

SARASUA et al. (2011) relataram que células de camundongos (L929) proliferam

melhor em substratos de PLLA do que PDLA, porém queratinócitos proliferam

melhor em PDLA. Células de linhagens diferentes apresentaram respostas

diferentes quando cultivadas em materiais com cristalinidade diferentes, portanto

investigações adicionais devem ser realizadas para determinar o uso clínico

adequado destes biomateriais (SARASUA et al., 2011).

Figura 37 mostra a análise termogravimétrica para caracterizar as perdas de

massa das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-

O:nHAp2. As três amostras apresentaram comportamento térmico muito semelhante

quando expostos às mesmas proporções de aquecimento. Todas as amostras,

quando expostas a uma taxa de aquecimento de 20°C min-1 mostraram perda de

massa a temperaturas equivalentes, o que não indica uma diferença significativa que

possa ser associada à presença das nanopartículas ou seja, a adição de

nanopartículas não alteram a resistência à decomposição térmica.

90

Figura 37 - Análise termogravimétrica das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.

Fonte: Autora.

Figura 38 (a-c) mostra as micrografias coletadas da superfície das membranas de

PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após a imersão em

SBF por 14 dias. No geral, as membranas apresentaram propriedades de

bioatividade. No entanto, observou-se diferenças entre os grupos de membranas.

Observa-se que os grupos de membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e

PDLLA/VACNT-O: nHAp2 apresentaram mais poros e rugosidade do que o grupo

PDLLA. A propriedade de bioatividade está diretamente relacionada às modificações

na superfície das membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2.

As membranas de PDLLA apresentaram uma camada de apatita globular não

homogênea (Figura 38a). Nitidamente, observa-se uma camada de nHAp globular

compacta nas membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 38b) e

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 (Figura 38c) após 14 dias de imersão em SBF.

91

Figura 38 - Micrografia de varredura eletrônica de estruturas de (a) PDLLA, (b) PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após o processo de biomineralização.

Fonte: Autora

A bioatividade e o processo de biomineralização foi comprovado em todas as

membranas utilizando a técnica de FTIR-ATR (Figura 39). Todos os grupos de

membranas apresentaram uma banda intensa de absorção em 1750 cm-1 que

corresponde ao grupo carbonila (C-O) do PDLLA (REHMAN; BONFIELD, 1997).

Dados mostram um pico em 960 cm-1, relativo ao modo de estiramento do fosfato

identificando a presença de nHAp e a banda de absorção do grupo fosfato são

encontradas entre 1200-1030 cm-1 (RADIN; DUCHEYNE, 1993; REHMAN et al.,

1994; REY et al., 2007; MAHAJAN et al., 2010). Além disso, as bandas da região de

1.650-1.300 cm-1 e o pico em 870 cm-1 são atribuídas ao carbonato na superfície

(RADIN; DUCHEYNE, 1993; REHMAN et al., 1994; REY et al., 2007; MAHAJAN et

al., 2010).

92

Figura 39 - Espectro de FTIR coletados de membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em solução que simula o fluído corporal (SBF) por 14 dias.

Fonte: Autora.

Além disso, os valores aproximados da razão de CO32-/PO4

3- comprovam a

bioatividade e biomineralização de todas as amostras (Tabela 6).

Tabela 6 - Relação carbonato/fosfato coletadas a partir de espectros FTIR em PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2

Amostra CO32-/PO4

3-

PDLLA 0,061

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 0,063

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 0,059

A Figura 40 mostra a caracterização por difração de raio X de membranas de

PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 imersas em SBF por

14 dias. É possível identificar os picos típicos para nHAp carbonatada, na referência

93

cristalográfica JCPDS 019-0272 em: 25,7º (002); 29,3º (210); 32,2º (112); 39,4º

(212); 47,1º (222); 49,5º (213) e 52,7º (004).

Figura 40 - Difratograma de Raios X da superfície de membranas (a) PDLLA e (b) PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e (c) PDLLA/VACNT-O: nHAp2 imersas em SBF durante 14 dias.

Fonte: Autora.

Comparando as membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 imersas em SBF 5x, a

reflexão mais estreita e mais intensa em 32,2° é atribuída à presença de cristais de

HAp. Este resultado comprova a bioatividade muito superior das amostras de

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 em relação as membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e

PDLLA, refere-se a maior densificação da camada de HAp em relação aos demais

grupos, após o processo de dissolução precipitação em SBF 5x por 14 dias.

A tabela 7 mostra o aumento do tamanho dos cristalitos de PDLLA/VACNT-O:

nHAp2. O aumento do tamanho médio dos cristalitos formados na superfície de

amostras PDLLA/VACNT-O:nHAp2 indica a incorporação do carbonato formando a

hidroxiapatita carbonatada e a formação de sítios de nucleação ativos durante a

reação de precipitação-dissolução (LEGEROS, 1991; KOKUBO; TAKADAMA, 2006).

94

Tabela 7 - O tamanho de cristalito de nHAp formados na superfície de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2 após imersão em SBF durante 14 dias

Amostra (2θ) Pico (Å) Cristalito

PDLLA 31,9° 177

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 32,2° 88

PDLLA/VACNT-O:nHAp2 32,0° 617

Fonte: Autora.

A biomineralização sobre a superfície do material é um indicador da bioatividade

do osso, consiste no primeiro método in vitro para testar a aplicabilidade do material

para regeneração óssea (KOKUBO; TAKADAMA, 2006). Por conseguinte, a

capacidade para formar apatita sobre a superfície é um resultado significativo na

determinação do grau de bioatividade do material como um implante ósseo.

O Ca+2 presente na estrutura da hidroxiapatita dispersa no polímero parece atuar

como sítio ativo para a formação de novos cristais. A liberação do cálcio é um dos

fatores responsáveis para a formação da camada bioativa de hidroxiapatita e a

formação do osso (CHEN et al., 2004). Estes cristais são formados como partículas

de diferentes tamanhos e formatos, formando uma camada de hidroxiapatita com

sítios ativos de nucleação durante o processo de dissolução precipitação

(LEGEROS, 1991; ABBONA; BARONNET, 1996). Poros nanométricos e grupos

carboxílicos polares na superfície também podem atuar como sítios iniciantes para

nucleação e crescimento de cristais de apatita (WILSON et al., 2005; MAHJOUBI et

al., 2014). Além disso, a rugosidade da superfície é essencial para o processo de

osseointegração, pois aumenta a ancoragem de fosfato de cálcio e a adesão e

proliferação celular na superfície do biomaterial (CITEAU et al., 2005).

Yang, Dennison e Ong (2005) estudaram a adsorção de proteínas e células em

discos de hidroxiapatitas com diferentes cristalinidades. No estudo de Yang,

Dennison e Ong (2005), a dissolução de hidroxiapatita teve relação com a

cristalinidade, mas a adsorção de proteínas e adesão celular foi menor na superfície

mais cristalina. A dispersão de nanopartículas de VACNTO:nHAp2 na matriz

polimérica promoveu o aumento da rugosidade da superfície e a exposição de

partículas de VACNTO:nHAp2 de maior solubilidade na superfície assim como a

hidrofilicidade adquirida com o tratamento a plasma, favoreceu a precipitação de

95

uma camada mais densa de hidroxiapatita e consequente uma melhor bioatividade

in vitro dessas membranas.

Como observado na Figura 41, todas as membranas produzidas não

apresentaram citotoxicidade, mantendo a viabilidade perto do observado para o

grupo controle (acima de 80%). A análise de variância indicou diferenças entre os

grupos (p = 0,04113) e o teste Tukey apontou diferenças entre o controle positivo

célula e o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1.

Figura 41 - Análise de viabilidade celular de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2, sendo que * indica p<0,05.

Fonte: Autora.

No ensaio de fosfatase alcalina, pode-se sugerir que todas as membranas

produzidas foram capazes de induzir efeito de mineralização detectável. No entanto,

diferenças estatisticamente significativas foram encontradas entre os grupos (p =

0,00007).

96

O teste de Tukey apontou diferenças entre PDLLA/VACNT-O:nHAp1 quando

comparado com SBF, e todas as membranas produzidas diferiram do controle

célula. Os dados são ilustrados na figura 42.

Figura 42 - Análise da fosfatase alcalina de osteoblastos cultivado por 5 dias sob membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O: nHAp2, sendo que *•□♦ indicam p< 0,05.

Fonte: Autora.

Em geral, a análise de cultura de células para as membranas produzidas

sugeriram um elevado nível de biocompatibilidade de todos os grupos, uma vez que

os níveis de viabilidade foram acima de 80% quando comparado com o controle

positivo de células. A avaliação da viabilidade com SRB está descrita na literatura

(ZEITLIN et al., 2006; KANEKO et al., 2007), com vantagens porque as células não

precisam metabolizar um sal. Na verdade, esta técnica baseia-se na coloração e

quantificação de proteínas celulares, de modo que fornece uma correlação direta

entre a quantidade de proteínas e o número de células. O grupo PDLLA/VACNT-O:

nHAp1 se mostrou menos biocompatível ou, pelo menos, induziu um menor

crescimento celular quando comparado com o grupo controle. Curiosamente, esses

97

dados poderiam ser diretamente correlacionados com a atividade da fosfatase

alcalina, onde o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1 teve um aumento significativo na

atividade enzimática. Os testes com o meio de mineralização, o mesmo padrão foi

observado: um aumento significativo na atividade de ALP foi também correlacionado

com uma diminuição na contagem de células com SRB (dados não mostrados). Esta

pode ser uma sugestão direta que o grupo PDLLA/VACNT-O:nHAp1 também induz

um nível mais elevado de diferenciação das células, favorecendo a mineralização e

diminuindo o crescimento das células durante o primeiro contato com o biomaterial.

As membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2

foram implantadas em defeitos na calvária de camundongos. A figura 41 mostra

seções típicas histológicas após 4 meses de implantação. Em geral, os dados

obtidos incentivam a aplicação das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp para a

regeneração óssea. A biocompatibilidade de PDLLA foi demonstrada, pois não

ocorreu processo inflamatório em nenhum dos grupos estudados. As membranas de

PDLLA mostraram uma baixa taxa de degradação e a presença de fibroblastos em

PDLLA. O tecido adjacente mostrou coloração bastante basofílica, com núcleo

prolongado próximos uns dos outros, como aspecto de fibrose, ainda mostrou um

tecido com recuperação incompleta (Fig.43a e 43a.1). Figura 43b mostra a região de

interface entre as membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e osso com células gigantes

multinucleadas fagocitando as membranas. Observou-se a presença de um tecido

adjacente acidófilo que caracteriza a matriz óssea e o processo de regeneração do

tecido. Além disso, observou-se uma degradação mais rápida das membranas de

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (Figura 43c) em comparação com o grupo controle. Os

melhores resultados foram com o grupo de membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp2

(Figura 43c) em que observou-se a regeneração completa do defeito. O osso recém-

formado foi precisamente organizado, incluindo o espaço de medula delimitado, sem

qualquer resíduo de biomaterial ou má formação óssea.

O tecido ósseo nativo compreende uma estrutura altamente especializada no

nível molecular, organizado por macromoléculas orgânicas e inorgânicas com

propriedades químicas importantes e necessárias para a função do tecido. O

biomimetismo faz com que as células reconheçam os materiais e melhorem as

funções alvo, tais como a adesão e proliferação celular (PÉREZ et al., 2013). A

presença de cristais nHAp em PDLLA certamente aumentou o processo de

98

regeneração óssea em ambos os biomateriais, PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e

PDLLA/VACNT-O:nHAp2. No entanto, a bioreabsorção completa do polímero e a

formação de osso estrutural foi obtida apenas no grupo de PDLLA/VACNT-O:nHAp2

implantado. Características intrínsecas do biomaterial: como a espessura da parede

de PDLLA, o tamanho dos poros e cristalinidade da nHAp carbonatada podem ser

as responsáveis pelo sucesso de regeneração óssea por este biomaterial. Estes

resultados estão em concordância com os nossos resultados prévios de

biocompatibilidade e osteoindução de nanopartículas globulares (MARSI et al.,

2012).

99

Figura 43 - Fotomicrografia de lâminas histológicas que identificam a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) A regeneração óssea após o implante das membranas de PDLLA como controle (H&E, 40x); (a.1) detalhes em círculos (H&E, 100x); região de interface entre o primeiro e o osso (*) e seta indica fibroblastos. (b) a regeneração de osso após o implante PDLLA/VACNT-O: nHAp1 (H&E, 40x); (b.1) região de interface entre o polímero e o osso (*), células gigantes fagocitárias em setas (H&E, 100x). (c) regeneração completa de defeito ósseo após a implantação de PDLLA/VANCT-O: nHAp1 (H&E, 40x). (c1) MB indica a formação de medula óssea (H&E, 100x).

Fonte: Autora.

A análise de MEV complementam os resultados histológicos (Figura 44). Pode-se

observar que o PDLLA não foi degradado (Figura 44a). Além disso, o

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 foi parcialmente degradado e uma camada de apatita

biológica foi formada sobre a superfície confirmando os resultados de bioatividade in

vitro (Figura 44b). A Figura 44c mostra a regeneração completa do osso e a

completa degradação do PDLLA/VACNT-O: nHAp2, a formação da camada de

apatita comprova os resultados da figura 42c e pode-se observar os osteoblastos em

detalhes (quadrados), no tecido ósseo.

100

Figura 44 - Micrografias do osso na região de estudo mostram a regeneração óssea após quatro meses de implante em grupos; (a) a regeneração óssea após a implantação das membranas de PDLLA como controle; (a.1) detalhes em círculos da região de interface entre o polímero e oso (*) e a seta indica fibroblastos. (b) a regeneração óssea após a implantação das membranas PDLLA/VACNT-O nHAp1; (b1) detalhes de polímero parcialmente degradado. (*) e camada de hidroxiapatita carbonatada em setas. (c) regeneração óssea completa após a implantação de PDLLA/VACNT-O: nHAp2. (c1) detalhes de osteoblastos nos quadrados e a camada de hidroxiapatita carbonada indicada pelas setas.

Fonte: Autora. Uma técnica óptica foi associada para analisar a interface entre o tecido ósseo e a

região com implantação de biomaterial. A Figura 45 mostra os resultados do Raman

confocal coletados na interface do defeito ósseo e as membranas de PDLLA,

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2. Foram observadas bandas

fosfato ʋ2 a 431 -433 cm-1; fosfato ʋ4 a 584 -589 cm-1; prolina a 855-857 cm-1; ʋ1 fosfato a 960 cm-1; fenilamina na 1005 cm-1; carbonato a 1071-1072 cm-1; amida III,

101

1247-1248 cm-1; CH2-wag a 1451-1452 cm-1 e amida I a 1666-1667 cm-1 (CARDEN;

MORRIS, 2000; HOFMANN et al., 2006; GASIOR-GLOGOWSKA et al., 2010; BI et

al., 2011).

Figura 45 - Um espectro representativo de Raman coletado de seção óssea após quatro meses da implantação das membranas de PDLLA, PDLLA/VACNT-O: nHAp1 e PDLLA/VACNT-O:nHAp2.

Fonte: Autora.

Neste estudo, a área do pico Raman correspondente ao carbonato e fosfato foram

calculados para quantificar a diferença de biomineralização na interface de

biomateriais com osso. Assim os valores da razão fosfato/prolina, Fosfato/amida III,

Fosfato/amida I e carbonato/Amida I foram relacionados com o grau de

mineralização, o qual é caracterizado pela relação entre mineral e matriz orgânico de

compósito (MORRIS, 2010; MORRIS; MANDAIR, 2011; NYMAN et al., 2011).

A Tabela 8 mostra um aumento da área dos componentes da matriz mineral com

membranas de PDLLA/VACNT-O: nHAp1, o cálcio e fosfato são responsáveis pela

rigidez e propriedades mecânicas.

102

Tabela 8 - Comparação de valores de picos FWHM de fosfato e carbonato com PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção osso extraído após quatro meses. Os grupos são significativamente diferentes, p <0,05 (One Way Anova)

Bioimplante Fosfato

(cm-1)

Carbonato

(cm-1)

CO32-/PO4

3-

PDLLA 24,34 19,48 0,80

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 34,03 21,00 0,61

Fonte: Autora.

No processo de formação do osso, a primeira mineralização é intrafibrilar e, em

seguida, a interfibrilar ocorre, minerais ocupam intrafibrilarmente cerca de 30-40%

do volume, um osso humano possui uma média mineral de cerca de 50-60% da fibra

de colágeno (LEES; DAVIDSON, 1998), a composição mineral óssea pode chegar a

60-70% do peso do osso seco (POSNER et al., 1984).

Com base nestes dados, os valores dispostos na Tabela 9 indicam um aumento

do processo de mineralização óssea na regeneração utilizando membranas de

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 em comparação com o grupo de controle.

Resumidamente, a membrana de PDLLA/VACNT-O:nHAp1 promove a

mineralização com uma maior proporção de minerais na matriz. Esta diferença na

composição química do osso formado na interface com o biomaterial pode ser uma

consequência de osteoindução devido a nHAp1 obtida por eletrodeposição. A

substituição de carbonato é um indicativo da qualidade do osso (MORRIS, 2010;

MORRIS; MANDAIR, 2011), observa-se uma proporção menor de precipitação de

carbonato de PDLLA/VACNT-O:nHAp1, bem como um aumento nos índices de

mineralização ao conteúdo orgânico da matriz, indicando uma melhor qualidade do

tecido ósseo.

103

Tabela 9 - Comparação da razão de fosfato/prolina; fosfato/amida III; fosfato/amida I e carbonato/amida I de membranas de PDLLA e PDLLA/VACNT-O:nHAp1 (FWHM; R-quadrado: 0,99) recolhidos de seção óssea extraída após quatro meses. Os grupos são significativamente

Bioimplante Fosfato/

Prolina

Fosfato/

Amida III

Fosfato/

Amida I

Carbonato/Amida I

PDLLA 1,49 0,65 0,79 0,63

PDLLA/VACNT-O:nHAp1 2,17 2,02 1,60 0,99

Fonte: Autora.

A análise de espectros de membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 não mostra

grupos funcionais relacionados com o componente de matriz mineralizada. O perfil

do espectro de matriz orgânica com bandas atribuídas ao colágeno (FRUSHOUR;

KOENING, 1975), sugere a formação de calo ósseo e da oclusão do defeito ósseo

(MURAO et al., 2013).

Nossos resultados apresentaram que a incorporação de nanopartículas na matriz

polimérica, assim como o tratamento de plasma de oxigênio promoveram uma

estrutura polimérica 3D, com maior porosidade e rugosidade. Estas propriedades de

superfície adquiridas foram responsáveis pelo sucesso nos ensaios preliminares in

vitro e in vivo.

Mikael et al. (2014), relataram a produção de membranas de PLGA porosas

tridimensionais com incorporação de CNT, essas nanopartículas favoreceram a

adesão e proliferação celular, além de melhorar as propriedades mecânicas do

PLGA. As membranas de estrutura 3D são promissores biomateriais para

regeneração óssea (MIKAEL et al., 2014).

Corroborando com estes resultados, a estrutura polimérica 3D das membranas de

PDLLA/VACNT-O:nHAp, assim como a porosidade e rugosidade foram essenciais

para os resultados de biocompatibilidade e mineralização vistos na figura 39 e 40.

Ren et al. (2008) avaliaram scaffolds de PDLLA/HAp produzidos pelo método de

polimerização in situ. As respostas iniciais mostraram a citotoxicidade grau I de

acordo com a norma ISO 109931. Não houve nenhum caso de morte dos animais,

apenas uma pequena resposta inflamatória nas 1-9 semanas (REN et al., 2008).

Nossos resultados in vitro mostraram nenhuma toxicidade e todos os animais

sobreviveram à exposição por 4 meses.

104

Nossos resultados evidenciaram a bioatividade in vitro e in vivo de membranas

PDLLA/VACNT-O:nHAp, a incorporação de nanopartículas e o tratamento de plasma

de O2 promoveram a osseointegração.

Resultados semelhantes foram obtidos por Deplaine et al. (2013), que

descreveram o tratamento com plasma e incorporação de HAp no polímero como

essenciais para melhora da nucleação em SBF, formando uma camada mais

espessa de apatitas biológicas. Este material, quando implantado em lesão

osteocondral de ovelhas, promoveu o aparecimento de osteóides muito semelhantes

ao osso maduro (DEPLAINE et al., 2013).

Além disso, Van der Zande et al. (2011), relataram a produção de scaffolds

poliméricos com a incorporação de CNT e HAp para melhorar as propriedades

mecânicas e osteocondutividade, assim como a retenção de proteína morfogenética

do osso-2 (BMP-2). Os autores avaliaram a liberação de BMP-2 de scaffolds de

PLLA-CNT-μHA durante 5 semanas em ratos, observou-se que a incorporação de

nanopartículas não alterou a bioatividade de BMP-2 (VAN DER ZANDE et al., 2011).

Os resultados de Van der Zande et al. (2011) mostram que é possível a

associação de BMP-2 com nanopartículas, as BMP-2 podem ser facilmente

dispersas em PDLLA amorfo, sendo assim as membranas de PDLLA/VACNT-

O:nHAp podem ser utilizadas para liberação controlada de BMP-2, esta associação

será investigada pelo nosso grupo de pesquisa em trabalhos futuros.

Mahjoubi et al. (2014) mostraram que a modificação da superfície de PDLLA para

hidrofílica pelo método de diazônio, introduz grupos funcionais e proporciona uma

biomineralização com aumento de nucleação de HAp e ainda melhorou o

crescimento e espalhamento celular em superfície do PDLLA modificado.

Nossos resultados são concordantes com os resultados de Mahjoubi et al. 2014, a

incorporação de grupos carboxílicos polares na superfície das membranas

poliméricas favorecem a nucleação de HAp e a interação com o meio biológico.

Hasegawa et al.(2005) implantaram scaffolds de PDLLA/HAp em região

intercondilar femoral, com um tempo de 26 semanas ocorreu um aumento na

formação óssea e os scaffolds de PDLLA/HAp apresentaram degradação mais

rápida do que o controle (HASEGAWA et al., 2005). O tempo de degradação do

PDLLA amorfo, ocorre em 72 semanas (HEIDEMANN et al., 2001). O biomaterial

apresentado nesta tese apresentou melhores resultados, a apatita biomimética

105

cristalina produzida após imersão de VACNT-O em SBF (grupo nHAp2) quando

incorporada no PDLLA contribui para acelerar a degradação do polímero;

PDLLA/VACNT-O: nHAp2 foi completamente degradado após 4 meses e promoveu

a completa e organizada osseointegração.

106

5 CONCLUSÕES Neste trabalho foram produzidas membranas porosas PDLLA/VACNT-O:nHAp de

estruturas honeycombs com incorporação de nanopartículas de VACNT-O:nHAp, o

tratamento de plasma de O2 foi essencial para a aplicabilidade destes

nanocompósitos na regeneração óssea. Desta forma foram comprovados que:

-O método de produção com umidade controlada favorece a formação de poros

na superfície das membranas poliméricas.

- A incorporação de nanopartículas promove o aumento do diâmetro dos poros e

da rugosidade superficial.

- Tratamento superficial utilizando plasma de oxigênio são eficientes para

modificar as características físicas das membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp,

tornando-as parcialmente hidrofílicas.

-A caracterização de materiais mostrou que as membranas porosas

PDLLA/VACNT-O:nHAp apresentaram propriedades de morfologia e porosidade

superiores em comparação com o PDLLA.

- Observaram-se que todas as membranas apresentam propriedade de bioatividade

pelo método de imersão em SBF por 14 dias.

- Os nossos resultados in vitro demonstraram que as membranas produzidas não

apresentam quaisquer efeitos citotóxicos. O ensaio de fosfatase alcalina demostrou

que todas as membranas são capazes de induzir a mineralização.

-Os testes iniciais in vivo, em modelo de defeito na calvária de camundongos, são

promissores, pelo fato dos nanocompósitos de PDLLA/VACNT-O:nHAp não

apresentarem rejeição e promoverem a formação óssea.

-Membranas PDLLA/VACNT-O:nHAp1 apresentaram degradação parcial observada

na histologia e no MEV, os promissores resultados destas membranas foram

apresentados na análise de qualidade óssea por Raman confocal.

- Membranas de PDLLA/VACNT-O:nHAp2 foram totalmente integradas in vivo após

4 meses de implante e promoveram a completa e organizada osseointegração, com

tempo mais rápido de degradação polimérica, mostrando-se como biomaterial

promissor para regeneração óssea.

107

6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS A partir dos resultados obtidos por esta pesquisa fazem-se necessários as

seguintes investigações futuras:

- Controlar a porosidade das membranas;

-Pesquisar a morfologia, estrutura e propriedades mecânicas de membranas com

diferentes concentrações de nanopartículas;

-Estudo comparativo das diferentes concentrações e tamanhos de poros para a

osseointegração;

-Produção desses biomateriais em diferentes moldes ósseos (exemplo:

artroplastia de quadril);

-Estudo in vivo, para modelos de fratura de fêmur e intercôndilos femorais; com

intervalos de 1- 12 meses em animais saudáveis.

-Estudos fisiopatológicos de osseointegração com estes biomateriais (exemplo:

osteoporose, osteomielites e osteogênese imperfeita);

-Compreender os processos de osseointegração com nanocompósitos

poliméricos;

-Ensaios bactericidas e fungicidas;

- Analisar a interação dos biomateriais com a irradiação laser no infravermelho em

diferentes intervalos de dose para regeneração óssea;

- Analisar o efeito magnético dos biomateriais para promover a hipertermia por

meio de gerador de campo magnético externo ou corrente elétrica para tratamento

de tumores ósseos localizados após remoção cirúrgica;

-Estudo de genotoxicidade dos biomateriais.

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ZHAO, J. et al. Improving mechanical and biological properties of macroporous HA scaffolds through composite coatings. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 74, n. 1, p. 159-66, 2009. ZHENG, X. et al. Shape memory properties of poly (D,L-lactide)/hydroxyapatite composites. Biomaterials, v. 27, n. 24, p. 4288–4295, 2006. ZHENG, X. et al. In Situ Preparation and Characterization of a Novel Gelatin/Poly(D,L-lactide)/Hydroxyapatite Nanocomposite. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, v. 91, n. 1, p. 181-190, 2009. ZIV, V.; WEINER, S. Bone crystal size: a comparison of transmission electron microscopic and x-ray diffraction line-width-broadening techniques. Connective Tissue Research, v. 30, n. 3, p.165–175, 1994. ZOU, B. et al. Promoted healing of femoral defects with in situ grown fibrous composites of hydroxyapatite and poly(DL-lactide). Journal of Biomedical Materials Research Part A, v.100, n.6, p. 1407-1418, 2012.

130

ANEXO A –CARTA DE ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS

131

ANEXO B- ARTIGOS PUBLICADOS

132

ANEXO C- ARTIGO ACEITO

133

ANEXO D - ARTIGOS E RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS SOBRE O TEMA

1. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Bactericidal activity of PDLLA/Carbon Nanotubes/nHAp scaffolds for orthopaedic applications. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMÉDICA, 24., 2014, Uberlândia. Anais...Urbelândia: [S.n], 2014. v. 1. p. 328-330.

2. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Application of PDLLA/CARBON Nanotubes/nHAP scaffolds for bone regeneration. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMEDICA, 24., 2014, Uberlândia. Anais..., Urbelândia: [S.n], 2014. v. 1. p. 331-333.

3. SIQUEIRA, I. A. W. B.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Avaliação da bioatividade de nanocompósitos PDLLA/nHAp:VACNT-O pelo método de imersão em fluido corporal simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E PÓS-GRADUAÇÃO, 18., 2014, São José dos Campos. Anais..., São José dos Campos: Univap, 2014. p. 1-5.

4. LEITE, N. C. et al. Ensaio de Bioatividade in vitro de nanocompósitos de nHAp/MWCNT-UI utilizando Fluido Corporal Simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 17., 2013, São José dos Campos. Anais...São José dos Campos: Univap, 2013. v. 1. p. 1-1.

5. SIQUEIRA, I. A. W. B.et al. Biomineralização de arcabouços porosos de PDLLA/nanotubo de carbono/grafeno para aplicações biológicas. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE PÓS-GRADUAÇÃO, 13., 2013, São José dos Campos. Anais...São José dos Campos: Univap, 2013. v. 1. p. 1-6.

6. NEVES, M. F.; et al. Nanocompósitos de nanotubo de carbono com hidroxiapatita para aplicações no tecido ósseo. In: ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E MOSTRA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA, 16.. 2012, São José dos Campos. Anais..., São José dos Campos: Univap,, 2012. v. 1. p. 1-5.

7. SIQUEIRA, I. A. W. B.; et al. Pesquisas em regeneração óssea: nanotubos de carbono. In: - ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E MOSTRA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA, 16., 2012, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 2. p. 1-5.

8. SIQUEIRA, I. A. W. et al. Raman spectroscopy of bone tissue. In: BRAZILIAN WINTER SCHOOL - BIOPHOTONICS, 1., 2012, São José dos Campos. Proceedings... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 1. p. 37-37.

134

9. LEITE, N. C. et al. Produção e ensaios biológicos de um novo nanocompósito a base de nanohidroxiapatita e nanotubos de carbono para regeneração óssea. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CERÂMICA, 58., 2014, Bento Gonçalves. Anais... Bento Gonçalves: Associação Brasileira de Cerâmica , 2014. v. 1. p. 1-1.

10. MARQUES, M. A. et al. Produção e caracterização de membranas porosas de PLA/nHAp para aplicações biomédicas. In: CONGRESSO DE SAÚDE E QUALIDADE DE VIDA DO CONE LESTE PAULISTA, 12., 2014, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2014. v. 1. p. 1-1.

11. LEITE, N. C. et al. Biological studies of nanohydroxyapatite/superhydrophilic carbon nanotubbes composites. In: ENCONTRO DA SBPMAT, 12., 2013, Campos do Jordão. Proceedings..., Campos do Jordão: Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais, 2013. v. 1. p. 1-1.

12. SIQUEIRA, I. A. W. B. et al. Structure and properties of hydrophilic nHAp/carbon nanotubes/PDLLA scaffolds for osteocondral tissue engineering applications. In: ENCONTRO DA SBPMAT, 12., 2013, Campos do Jordão. Proceedings... Campos do Jordão: Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais, 2013. v. 1. p. 1-1.

13. SIQUEIRA, I. A. W. et. al. Uso do Laser de Baixa Potência na Regeneração Óssea. In: CONGRESSO SAUDE E QUALIDADE DE VIDA CONELESTE PAULISTA,10., 2012, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2012. v. 1. p. 1-1.

135

ANEXO E - ARTIGO PREMIADO EM CONGRESSO 1. SIQUEIRA, I. A. W. B.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Avaliação da

bioatividade de nanocompósitos PDLLA/nHAp:VACNT-O pelo método de imersão em fluido corporal simulado. In: ENCONTRO LATINO AMERICANO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E PÓS-GRADUAÇÃO, 18., 2014, São José dos Campos. Anais... São José dos Campos: Univap, 2014. p. 1-5.

aÇÃo do laser de baixa potÊncia na produÇÃo de...

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