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Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

A contribuição de sistemas de associação de adjuvantes no

aumento da eficácia vacinal de dois novos imunobiológicos

contra a infecção experimental por Leishmania infantum em

camundongos Balb/c

Fernando Augusto Siqueira Mathias

OURO PRETO, MG

2018

Fernando Augusto Siqueira Mathias

A contribuição de sistemas de associação de adjuvantes no

aumento da eficácia vacinal de dois novos imunobiológicos

contra a infecção experimental por Leishmania infantum em

camundongos Balb/c

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas como parte das exigências para obtenção do grau

de Doutor na área de Imunobiologia de Protozoários pela

Universidade Federal de Ouro Preto

Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis

Co-Orientadora: Dra. Paula Melo de Abreu Vieira

OURO PRETO, MG

2018

MATHIAS, F. A. S. Colaboradores

Laboratório de Imunopatologia – NUPEB/UFOP

Drª Cláudia Martins Carneiro

Dr. Bruno Mendes Roatt

Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar-Soares

Drª Jamille de Oliveira Cardoso

Dr. Rory Cristiane Fortes de Brito

Dr. Levi Eduardo Soares Reis

Thais Lopes Valentim Di Paschoale Ostolin

MATHIAS, F. A. S. Dedicatória

À minha Família, meu porto seguro, que

me apoiou em todos os momentos de

minha caminhada e me deu força para

cumprir mais uma etapa da minha vida.

MATHIAS, F. A. S. Epígrafe

Agradeço a Deus, pela força, perseverança, paciência e iluminar meus passos durante toda minha

caminhada.

A meus pais, inabaláveis, vocês foram minha força nessa caminhada, muito obrigado pelas orações,

apoio, conselhos, segurança e incentivo para seguir sempre em frente. Obrigado por sempre

acreditarem em mim, sem vocês isso jamais teria ocorrido, amo incondicionalmente vocês.

A minha irmã, Maria Augusta, minha segunda mãe, por todo carinho e amor dedicados todos esses

anos. Obrigado por me dar o presente de ser tio da Catarina, a coisa mais linda que me aconteceu no

último ano. Ao meu irmão, Luiz Augusto, por ser esse companheiro fiel e meu melhor amigo. Amo

vocês.

Aos meus familiares por todo carinho, amor, conselhos e força durante minha caminhada. Muito

obrigado.

A Thais, minha namorada, que nesses últimos anos tornou minha vida muito mais leve e feliz.

Sem você tudo teria sido mais cinza e difícil de superar. Te amo lindinha, minha jovem padawan.

Ao meu orientador professor Alexandre Barbosa Reis, que desde 2007 abriu não só as portas do

laboratório de Imunopatologia para mim, mas também um horizonte de infinitas possibilidades.

Sua orientação, paciência e amizade foram fundamentais no meu caminhar até aqui. Gostaria de

expressar minha eterna gratidão.

A minha co-orientadora Paula Melo de Abreu Vieira, que sempre me tratou com carinho,

paciência, me ajudando sempre com muita delicadeza nas horas difíceis desse trabalho. Muito

obrigado por todos esses anos de amizade e dedicação. Também sou eternamente grato a você

por tudo.

A professora Cláudia Martins Carneiro por todo auxilio, exemplo de seriedade, dedicação, amor à

pesquisa e profissionalismo desempenhado no laboratório, fazendo com que esse grupo seja o

que é. Muito obrigado, por todos os conselhos que foram fundamentais para minha formação.

Aos irmãos que a vida me deu de presente, Jamille, Levi, Rory, sem vocês esse trabalho jamais

teria sido possível de se concretizar. Estamos juntos há tanto tempo que às vezes deixamos de

falar algo essencial que nos mantém unidos até hoje. Amo vocês e espero sempre estar presente

de alguma forma na vida de cada um.

Aos colaboradores desse trabalho, em especial ao Rodrigo, Bruno, Nádia e Juliana por toda ajuda

desde o delineamento, execução dos experimentos até a discussão dos dados. Não existem

palavras para agradecer toda ajuda e ensinamentos passados ao longo de todos esses anos. São

exemplos de profissionais a serem seguidos. Muito Obrigado.

Aos meus grandes amigos Thais Carvalho, João, Lívia, Luísa (Bengs), Aninha, Kátia, Carolzinha,

Carlos, Fran, Lorena, Leonardo, Wendel, Sheler, Henrique, Gleise, Lucilene, Renata, Tânia,

Maria e a todos os demais integrantes da família LIMP por compartilhar as alegrias e as tristezas,

tornando os dias mais leves.


A todos os alunos de IC que ajudaram nesse trabalho: João, Marcelo, Diogo, Narjara, Valéria,

Daíse, Yumi-Chan, Yukari-Chan, Talita, Bárbara, Breno, Letícia, Alzira, Carol, Thais, Júlia,

Yano. Muito obrigado, a ajuda de vocês é parte fundamental em nosso laboratório.

A todo corpo técnico do LIMP, Rosália, João, Josefa, Lúcia e especialmente Lu por sempre

darem o suporte necessário para execução de todos os experimentos desse projeto. Muito

obrigado por tudo.

A incrível e única Republica Vira Saia, que mais que uma casa, se tornou minha família em Ouro

Preto, com a qual sempre pude contar nos momentos mais difíceis e felizes nessa cidade. Não há

como expressar toda força e ajuda que me deram para tornar essa caminhada muito mais fácil.

Meu obrigado aos irmãos virassaianos.

Ao Kambito, meu “Migão”, por nossas conversas, treinos e rocks. Sua amizade foi e é

fundamental para mim. Muito obrigado por me ajudar a atravessar as dificuldades do dia a dia.

As minhas amigas de Guaratinguetá, que mesmo com a distância torceram por mim, e de certo

modo estão sempre presentes.

A UFOP e ao NUPEB, pela oportunidade de realizar uma pós-graduação de qualidade.

Ao CCA e todos os seus funcionários pela disposição e alegria sempre, no cuidado e manutenção

dos animais fundamentais para a realização da pesquisa científica.

As agências de fomento CAPES, CNPq, PPSUS, FAPEMIG

Aos camundongos utilizados nesse projeto, pequenos soldados da ciência, sem eles nada seria

possível.


“Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no livro do tempo. Aquilo que

colocarmos nela, corre por nossa conta” (Chico Xavier)

MATHIAS, F. A. S. Resumo

A leishmaniose visceral humana (LVH) e a leishmaniose visceral canina (LVC) são as mais relevantes

doenças emergentes com alta prevalência na América Latina, sobretudo no Brasil. Apesar disso, ainda são

limitados os avanços obtidos tanto no tratamento da doença quanto no desenvolvimento de vacinas com

intuito de conter sua expansão. Em se tratando da busca por vacinas mais eficazes, os adjuvantes vacinais

surgem como aditivos importantes, capazes de aumentar a imunogenicidade do antígeno ao induzir uma

resposta imune intensa e prolongada. Novas abordagens têm testado sistemas de duas ou mais associações

de adjuvantes na busca por uma resposta mais rápida e efetiva em comparação ao emprego dos adjuvantes

isolados. Dessa forma, o objetivo desta tese foi avaliar a contribuição de sistemas de associação de

adjuvantes no aumento da eficácia vacinal de novos imunobiológicos contra a infecção experimental por

L.infantum em camundongos Balb/c. Para tanto, o estudo foi dividido em duas estapas. Primeiro,

avaliamos os adjuvantes Saponina (SAP), Resiquimod (R-848) e Monofosforil Lipídio A (MPL)

combinados em sistemas de associação duplas e tripla, nas doses de 25%, 33% e 50% referente a dose

total de cada adjuvante, a fim de estabelecer o melhor sistema bem como sua dose ideal. Animais

inoculados com solução salina foram utilizados como grupo controle e todos experimentos foram

conduzidos em duplicata. Os animais foram divididos em 16 grupos experimentais (n=6/grupo), Controle

Salina (CS), Saponina (SAP), Monofosforil Lipídio A (MPL), Resquimod (R-848), e as associações

SAP+MPL (SM), SAP+R-848 (SR), MPL+R-848 (MR) e SAP+MPL+R-848 (SMR), nas doses

supracitadas. Os animais receberam uma dose única pela via intradérmica e passadas 48 horas foram

eutanasiados para obtenção do fragmento de pele do local do inóculo. Metade do fragmento foi destinado

para dosagem de quimiocinas (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL1) e citocinas (IL-2, IFN-, TNF-,

IL-4 e IL-10) por Cytometric Bead Array (CBA) e a outra metade para avaliações histológicas. Dentre

todos os sistemas avaliados, SM50 levou ao aumento da produção de todas as quimiocinas e da citocina

TNF-, enquanto SMR50 aumentou os níveis das quimiocinas CXCL1, CCL2 e CCL5 e citocinas TNF-

e IFN- quando comparadas ao grupo controle. Além disso, SM50 apresentou aumento do infiltrado

inflamatório, com aumento do percentual da população de macrófagos, enquanto que SMR50 também

apresentou aumento no percentual de macrófagos. Após estes resultados, ambos os sistemas foram

escolhidos para serem associados com o antígeno total de Leishmania braziliensis para compor duas novas

vacinas na etapa 2, nas quais foi avaliado o efeito do sistema de associação de adjuvantes sobre a

imunogenicidade e eficácia vacinal. Camundongos Balb/c foram divididos em 6 grupos experimentais

(n=5/grupo), Controle Salina (CS), grupo imunizado com antígeno total de L. braziliensis (LB), os

sistemas de associação dupla e tripla de adjuvantes, SAP+MPL e SAP+MPL+R-848, ambos nas doses de

50%, e outros dois grupos que combinavam o antígeno total de L. braziliensis com os sistemas de

associação de adjuvantes (LBSM50 e LBSMR50). Esses foram imunizados com três doses, com intervalo

de 15 dias entre as doses, e desafiados com 1 x 107 promastigotas de L. infantum. Após 28 dias, os animais

foram necropsiados, o baço foi coletado para avaliar a proliferação celular, produção de IL-2, TNF- e

INF-, formação de células T de memória efetora e central, além da avaliação da carga parasitária tanto no

baço quanto no fígado. Observou-se que o sistema LBSMR50 promoveu aumento na produção de TNF-

por células TCD4+, entretanto sua principal ação foi sobre células TCD8

+, promovendo aumento da

proliferação celular, produção de TNF- e formação de células de memória efetora. Todavia, ambas as

vacinas foram capazes de reduzir a carga parasitária no fígado. Diante do exposto, concluímos que o

emprego de sistemas de adjuvantes utilizando doses reduzidas induzem uma resposta eficaz, pois uma vez

que combinados com o antígeno promoveram não apenas ativação do sistema imune no baço como

também a redução da carga parasitária no fígado, sugerindo que o uso desses sistemas aumentaram a

eficácia vacinal no modelo murino.

Palavras-chave: Leishmaniose visceral, Leishmania infantum, sistemas de associação de adjuvantes,

vacinas, camundongos.

MATHIAS, F. A. S. Abstract

Human visceral leishmaniasis (VL) and canine visceral leishmaniasis (CVL) are the most relevant

emerging diseases with high prevalence in Latin America, especially in Brazil. Despite this, the advances

obtained both in the treatment of the disease and in the development of vaccines in order to contain its

expansion are still limited. In regard to the search for more effective vaccines, vaccine adjuvants appear as

important additives, capable of increasing the immunogenicity of the antigen by inducing an intense and

prolonged immune response. New approaches have tested systems of two or more adjuvant combinations

in the search for a faster and more effective response compared to the use of adjuvants alone. Thus, the

aim of this thesis was to evaluate the contribution of adjuvant combination systems in increasing the

vaccine efficacy of new immunobiologicals against experimental L.infantum infection in Balb/c mice.

Therefore, the study was divided into two stages. First, we evaluated the adjuvants Saponin (SAP),

Resiquimod (R-848) and Monophosphoryl Lipid A (MPL) combined in double and triple combination

systems at the doses of 25%, 33% and 50% relative to the total dose of each adjuvant , in order to establish

the best system as well as its optimal dose. Animals inoculated with saline solution were used as control

group and all experiments were conducted in duplicate. The animals were divided into 16 experimental

groups (n = 6 / group), Saline Control (CS), Saponin (SAP), Monophosphoryl Lipid A (MPL), Resquimod

(R-848) , SAP + R-848 (SR), MPL + R-848 (MR) and SAP + MPL + R-848 (SMR) at the above-

mentioned doses. The animals received a single dose via the intradermal route and after 48 hours were

euthanized to obtain the skin fragment from the inoculum site. Half of fragment was used to chemokines

evaluation (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL1) and cytokines (IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10) by

Cytometric Bead Array (CBA) and the other half for histological evaluations. Among all evaluated

systems, SM50 led to increased production of all chemokines and cytokine TNF-, while SMR50

increased levels of chemokines CXCL1, CCL2 and CCL5 and cytokines TNF- e IFN- when compared

to the control group. In addition, SM50 presented an increase in inflammatory infiltrate, with an increase

in the percentage of the macrophages population, while SMR50 also showed an increase in the percentage

of macrophages. After these results, both systems were chosen to be associated with the total Leishmania

braziliensis antigen to compose two new vaccines in step 2, in which the effect of the adjuvant association

system on immunogenicity and vaccine efficacy was evaluated. Balb / c mice were divided into 6

experimental groups (n=5 / group), Saline Control (CS), immunized with L. braziliensis total antigen

(LB), double and triple combination of adjuvants, SAP + MPL and SAP + MPL + R-848, both at 50%

doses, and two other groups that combined total L. braziliensis antigen with adjuvant combination systems

(LBSM50 and LBSMR50). These were immunized with three doses, at intervals of 15 days between

doses, and challenged with 1 x 107 promastigotes of L. infantum. After 28 days, the animals were

necropsied, the spleen was collected to evaluate cell proliferation, production of IL-2, TNF- e INF-,

effector and central T cell memory formation as well as evaluation of the parasite load both in the spleen

and in the liver. t was observed that the LBSMR50 system promoted an increase in the production of

TNF- by TCD4+ cells, but its main action was on TCD8

+ cells, T cells, promoting increased cell

proliferation, TNF- production and effector memory cells formation. However, both vaccines were able

to reduce the parasitic burden on the liver. In view of the above, we concluded that the use of adjuvant

systems using reduced doses induce an effective response, since, when combined with the antigen, they

promoted not only the activation of the immune system in the spleen but also the reduction of the parasite

load in the liver, suggesting that the use of these systems increased vaccine efficacy in the murine model.

Key words: Visceral leishmaniasis, Leishmania infantum, adjuvant association systems, vaccines, mice.

MATHIAS, F. A. S. Lista de Abreviaturas e Siglas

ACF – Adjuvante Completo de Freund

AIF – Adjuvante Incompleto de Freund

Al(OH)3 – Hidróxido de alumínio

AlPO4 – Fosfato de alumínio Alum – Sais de alumínio insolúveis

APCs – Células apresentadoras de antígenos

AS02 – emulsão contendo Monofosforil Lipídio A e a fração purificada QS-21 da Saponina

AS03 – emulsão contendo-tocoferol e esqualeno

AS04 – associação dos adjuvantes Hidróxido de alumínio e Monofosforil Lipídio A

ASLi – antígeno solúvel de Leishmania infantum

BCG – Bacillus Calmette-Guérin

CaniLeish® – vacina constituída por LiESAp associado ao adjuvante Saponina

CBA – Cytometric Bead Array

CCA – Centro de Ciência Animal

CCL2 – -quimiocina




CCR2 – receptor de -quimiocina

CXCL1 – -quimiocina

CXCL8 – -quimiocina

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais

CFDA-SE – Éster succinimidilico diacetato de carboxifluoresceína

CFSE – Éster succinimidílico de carboxifluoresceína

CIC – Células intracelulares

CMSP – Células mononucleares do sangue periférico

CO2 – Dióxido de carbono

ConA – mitógeno concanavalina A

CS – Controle Salina

CTAB – solução de Brometo de cetiltrimetilamônio

CTL – Linfócitos T citotóxicos

DCs – Células dendríticas

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucléico

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

FL – Canal de fluorescência

FML – Ligante fucose-manose

FSC – Parâmetro tamanho (Forward Scatter)

GLA – Glicopiranosil Lipídio A

GSK – Glaxosmithkline

HE – Hematoxilina/Eosina

HPV – Papiloma vírus humano

ID – Imunização intradérmica

IFN- – Interferon gamma

Ig – Imunoglobulina

IL-2 – Interleucina 2







ISCOMS – Complexo imunoestimulante constituído por Saponina Quil A, colesterol e

fosfolipídios

LB – antígeno bruto de Leishmania braziliensis

LBSM – vacina constituída por antígeno bruto de Leishmania braziliensis associado ao sistema

de associação de adjuvantes Saponina e Monofosforil Lipídio A

LBSMR – vacina constituída por antígeno bruto de Leishmania braziliensis associado ao sistema

de associação de adjuvantes Saponina, Monofosforil Lipídio A e Resiquimod

LBSap – vacina constituída por antígeno heterólogo de Leishmania braziliensis associado ao

adjuvante Saponina

LBSapSal – vacina constituída por extrato de antígenos bruto de Leishmania braziliensis

associado ao adjuvante Saponina acrescida de extrato de glândula salivar de Lutzomyia

longipalpis

LC – leishmaniose cutânea

LCM – leishmaniose cutâneo mucosa

LCR1 – antígeno de Leishmania donovani

Leish Tec® – vacina constituída de proteína recombinante (A2) específica de formas amastigostas

de Leishmania infantum associada ao adjuvante Saponina

Leishmune® – vacina constituída de antígeno fucose-manose de Leishmania donovani associado

ao adjuvante Saponina

LiESAp – antígeno secretado e excretado de Leishmania infantum

LPS – lipopolissacarídeo

LV – leishmaniose visceral

LVC – leishmaniose visceral canina

LVH – leishmaniose visceral humana

MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

mDCs – Células dendríticas mielóides

MDP – Muramil dipeptídeo

MF59 – Esqualeno

MFF – solução Macs Facs Fix

MHC – Complexo principal de histocompatibilidade

Mont – Montanide Pet Gel A

MPL – Monofosforil Lipídio A

MPL-A – Monofosforil Lipídio A

MR – sistema de associação de adjuvantes Monofosforil Lipídio A e Resiquimod

MS – Ministério da Saúde

NK – Células Natural Killer

NNN/LIT – Novy-MacNeal-Nicolle-liver infusion tryptose (Meio de Cultivo Celular)

NO – Óxido nítrico

OMS – Organização Mundial de Saúde

PBS – Tampão salina fosfato (Phosphate buffer saline)

pDCs – Células dendríticas plasmocitóides

PE – Ficoeritrina


PRRs – Receptores de Reconhecimento Padrão

PVCL – Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose

qPCR – Reação em cadeia da polimerase em tempo real

QS-21 – fração purificada da Saponina

Quil A – Saponina parcialmente purificada

R-837 – Imiquimod

R-848 – Resiquimod

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorfisms

RPMI – Roswell Park Memorial Institute médium (Meio de Cultivo Celular)

RTS,S/AS01 – candidato vacinal contendo epítopos de células T associados ao antígeno de

superfície de hepatite B e os adjuvantes Monofosforil Lipídio A e QS-21

SAP – Saponina

Sap – Saponina

SFB – Soro Fetal Bovino

SM – sistema de associação de adjuvantes Saponina e Monofosforil Lipídio A

SMR – sistema de associação tripla de adjuvantes Saponina, Monofosforil Lipídio A e

Resiquimod

SR – sistema de associação de adjuvantes Saponina e Resiquimod

SSC – Parâmetro granulosidade (Side Scatter)

Th – Linfócitos T auxiliares

TLR 4 – Receptor Toll-Like 4

TLR 7 – Receptor Toll-Like 7

TLRs – Receptores Toll-Like

TNF- – Fator de necrose tumoral-alfa

W/O – emulsões água-óleo

MATHIAS, F. A. S. Lista de Figuras

Figura 1: Esquema representativo dos mecanismos de ação dos adjuvantes no recrutamento e

ativação de células de imunidade inata até sua participação em mecanismos mediadores da

imunidade inata. ............................................................................................................................ 14

Figura 2: Delineamento experimental Etapa 1. ............................................................................ 30

Figura 3: Delineamento experimental Etapa 2. ............................................................................ 35

Figura 4: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L. infantum em

amostras de baço de camundongos Balb/c.. .................................................................................. 44

Figura 5: Quantificação do recrutamento celular na pele de camundongos Balb/c sensibilizados

com os adjuvantes sozinhos ou com sistemas de associação de adjuvantes.. ............................... 47

Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele de

camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de associação de

adjuvantes: ..................................................................................................................................... 48

Figura 7: Gráficos de pizza com os valores percentuais da contagem diferencial do infiltrado

celular na pele de camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de

associação de adjuvantes ............................................................................................................... 50

Figura 8: Quantificação das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL1 na pele de

camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de associação de

adjuvantes. ..................................................................................................................................... 53

Figura 9: Quantificação das citocinas IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 na pele de camundongos

Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de associação de adjuvantes. ...... 55

Figura 10: Figura ilustrativa sintetizando os principais resultados que levaram a escolha dos

sistemas SM50 e SMR50 para serem utilizados na próxima etapa do trabalho. ........................... 57

Figura 11: Gráficos de índice (CC/CE) de proliferação celular e produção de citocinas

intracitoplasmáticas (IL-2, TNF-α, IFN-γ) em células T CD4+ e CD8

+ após cinco dias de cultivo

nos diferentes grupos experimentais: ............................................................................................ 59

Figura 12: Análise enotípica do percentual de células de memória central

(CD127+CD44

+CD45RA

lowCD62L

+CD197

+) e memória efetora (CD62L

-CD44

+CD127

high

CD197low

) de células T CD4+ e CD8

+ após cinco dias de cultivo nos diferentes grupos.............. 61

Figura 13: Dosagem da carga parasitária em número de amastigotas por mg de tecido no baço e

fígado nos diferentes grupos .......................................................................................................... 62

MATHIAS, F. A. S. Lista de Quadros

Quadro 1: Quimiocinas avaliadas e suas respectivas funções imunológicas. .............................. 32

Quadro 2: Lista de marcadores utilizados na avaliação de citocinas intracitoplasmáticas. ......... 39

Quadro 3: Lista de anticorpos utilizados para fenotipagem de células T nos experimentos

funcionais. ..................................................................................................................................... 40

MATHIAS, F. A. S. Sumário

1. Introdução ................................................................................................................................ 1

2. Revisão da literatura ................................................................................................................ 6

2.1. Histórico dos adjuvantes vacinais ........................................................................................ 7

2.2. Os adjuvantes e a resposta imune ....................................................................................... 10

2.3. Mecanismos de ação dos adjuvantes .................................................................................. 13

2.4 Adjuvantes em diferentes formulações vacinais para a LV ................................................ 15

2.5. A pele como via de imunização .......................................................................................... 18

3. Justificativa ............................................................................................................................ 21

4. Hipótese ..................................................................................................................................... 23

5. Objetivos .................................................................................................................................... 25

5.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 26

5.2. Objetivos Específicos ......................................................................................................... 26

6. Material e Métodos .................................................................................................................... 27

6.1. METODOLOGIAS EMPREGADAS NA ETAPA 1 ......................................................... 28

6.1.1 Animais e grupos experimentais .................................................................................. 28

6.1.2 Dosagem de citocinas por CBA (Cytometric Bead Array)........................................... 30

6.1.3 Dosagem de quimiocinas por CBA (Cytometric Bead Array) ..................................... 31

6.1.4 Processamento e avaliação histológica da pele ............................................................ 32

6.2. METODOLOGIAS EMPREGADAS NA ETAPA 2 ......................................................... 33

6.2.1 Animais e grupos experimentais .................................................................................. 33

6.2.2 Parasito e desafio experimental .................................................................................... 36

6.2.3 Obtenção de esplenócitos para avaliação multifuncional ............................................. 37

6.2.4 Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC ................................... 37

6.2.5 Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC ................................... 39

6.2.6 Quantificação da carga parasitária no fígado e baço por PCR em tempo real (qPCR) 41

6.2.7 Extração de DNA dos fragmentos de fígado e baço ..................................................... 41

6.2.8 Extração do DNA do parasito para construção da curva padrão e posterior detecção do

DNA do parasito nos tecidos ................................................................................................. 41

6.2.9 Quantificação da carga parasitária ................................................................................ 42

6.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ............................................................................................ 44

7. Resultados .................................................................................................................................. 45

7.1. RESULTADOS OBTIDOS NA ETAPA 1 ........................................................................ 46

7.1.1 Infiltrado inflamatório na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes

separados (SAP, MPL, R-848), e com suas respectivas associações nas diferentes doses

testadas .................................................................................................................................. 46

MATHIAS, F. A. S. Sumário

7.1.2 Produção de quimiocinas na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes

separados (SAP, MPL e R-848) e com as suas respectivas associações nas diferentes doses

testadas. ................................................................................................................................. 50

7.1.3 Produção de citocinas na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes


testadas. ................................................................................................................................. 54

7.1.4 Considerações gerais dos resultados obtidos na Etapa 1 .............................................. 56

7.2. RESULTADOS OBTIDOS NA ETAPA 2 ........................................................................ 58

7.2.1 Avaliação dos índices de proliferação celular e produção de citocinas

intracitoplasmáticas por células T CD4+ e CD8

+ in vitro ...................................................... 58

7.2.2. Avaliação fenotípica de células T CD4+ e T CD8

+ de memória central e efetora in

vitro ........................................................................................................................................ 60

7.2.3. Quantificação por PCR em tempo real da carga parasitária no baço e no fígado de

camundongos vacinados após o desafio experimental com promastigotas de Leishmania

infantum ................................................................................................................................. 61

7.2.4 Considerações gerais dos resultados obtidos na Etapa 2 .............................................. 62

8. Discussão ................................................................................................................................... 63

9. Conclusão .................................................................................................................................. 74

10. Perspectivas ............................................................................................................................. 76

11. Referências bibliográficas ....................................................................................................... 78

12. Anexos ..................................................................................................................................... 92

Anexo 1 ......................................................................................................................................... 93

Anexo 2 ......................................................................................................................................... 94

1

1. Introdução

MATHIAS, F. A. S. Introdução

2

As leishmanioses constituem um grupo de doenças causadas por parasitos da ordem

Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, que ocasionam um grave

problema de saúde pública em várias partes do mundo, principalmente em países menos

favorecidos (Ross, 1903; WHO, 2017). A transmissão desse conjunto de doenças entre os

hospedeiros vertebrados ocorre através da picada de fêmeas de insetos dípteros, pertencentes à

família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, sendo conhecidos dois gêneros: Lutzomyia,

presente no Novo Mundo, e Phlebotomus, no Velho Mundo (Lainson & Shaw, 1987).

Em se tratando dos aspectos clínicos, as leishmanioses apresentam uma ampla gama de

sinais e sintomas que podem se manifestar desde lesões cutâneas localizadas, com cura

espontânea, até uma doença sistêmica generalizada com elevado grau de morbidade e

mortalidade, quando não tratada (Desjeux, 2004; WHO, 2017). Dessa forma, a Organização

Mundial de Saúde (OMS) divide e reconhece as leishmanioses em três principais grupos

distintos: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose cutâneo mucosa (LCM) e leishmaniose

visceral (LV), considerada a mais grave, caracterizada por febre de longa duração,

hepatoesplenomegalia, perda de peso, sendo uma doença fatal em 95% dos casos quando não

tratada (Alvar et al., 2012; WHO, 2017).

Embora o espectro clínico da LV seja semelhante em várias regiões do mundo, dois ciclos

epidemiológicos têm sido bem caracterizados: o ciclo antroponótico, causado pela espécie

Leishmania donovani, de ocorrência em países do subcontinente Indiano e leste Africano, sendo

o homem o único hospedeiro vertebrado e o ciclo zoonótico com ocorrência na América do Sul,

Oriente Médio, Ásia Central, China e Mediterrâneo, onde a infecção se dá pela espécie

Leishmania infantum e a transmissão depende principalmente de um reservatório infectado (cão e

raposa) onde o homem não representa fonte primária de infecção para os flebotomíneos (Gautam

et al., 2014; Ready et al., 2014).

No Brasil, os cães são considerados os principais reservatórios domésticos do parasito e

mantenedores do ciclo zoonótico da doença tanto no ambiente rural quanto no urbano (Deane &

Deane, 1954; Deane, 1956; Reis et al., 2009). Estudos sobre a infecção por L. infantum em cães

sugerem que o controle da leishmaniose visceral humana (LVH) depende de uma profilaxia

efetiva da leishmaniose visceral canina (LVC) (Alvar et al., 2004; Dantas-Torres & Brandão-

Filho, 2006; Costa, 2008; Reis et al., 2009; Reis et al., 2010). Do ponto de vista epidemiológico,

a LVC é considerada mais importante do que a doença humana, visto que apresenta maior


3

prevalência, podendo acometer grande parte de uma população canina de uma área endêmica,

apesar de apenas uma pequena parcela desses cães apresentarem a doença clínica de forma

aparente (Solano-Gallego et al., 2001; Moreno & Alvar, 2002; Baneth et al., 2008). Outro fato

importante em relação a doença canina, é a inexistência de um tratamento eficaz de cães doentes,

de forma a impedir a transmissão do parasito a flebotomíneos, e que seja aprovado pelo

Ministério da Saúde do Brasil (Noli & Auxilia, 2005; MS/Brasil, 2006). O tratamento da LVC

pode possibilitar a seleção de cepas resistentes às drogas utilizadas para o tratamento humano e

por isto o emprego da terapêutica anti-LVC tem sido contra indicada e proibida quando se trata

da utilização de antimoniais pentavalentes ou de outras drogas leishmanicidas para o uso

humano (MS/Brasil, 2009).

No intuito de controlar a doença humana, o Ministério da Saúde do Brasil instituiu o

Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose (PVCL), que tem como diretrizes o

diagnóstico e tratamento rápido dos casos humanos, controle vetorial e eutanásia de cães

infectados, além de ações educativas de saúde (MS/Brasil, 2006). Todavia, essas ações são

questionadas, principalmente em relação à eutanásia dos animais e sua efetividade no controle da

doença, sendo o Brasil o único país no mundo a adotar essa medida (Palatinik-de-Sousa et al.,

2001, Costa, 2011).

Diante do exposto, fica claro a necessidade urgente para o desenvolvimento e adaptação

de novas estratégias que poderiam melhorar a prevenção e controle da doença (Costa, 2011;

Dantas-Torres et al., 2012; Travi, 2014). O desenvolvimento de uma vacina contra a LVC é

altamente desejável e representaria uma ferramenta mais prática e eficiente, uma vez que ao

impedir o ciclo da doença no cão, consequentemente interromperia a transmissão para humanos

(Dye, 1996; O'Hagan & Valiante, 2003).

No Brasil, até o ano de 2014 havia duas vacinas no mercado contra a LVC licenciadas

pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) para sua utilização em cães:

Leish-Tec®

(Hertape, Jatuba, Brasil) composta pela proteína recombinante de amastigota A2

associada ao adjuvante saponina (Coelho et al., 2003; Zanin et al., 2007; Fernandes et al., 2008) e

a vacina Leishmune®

(Zoetis, Campinas, Brasil) composta pelo antígeno glicoprotéico de

Leishmania donovani ligante fucose-manose (FML) também associado ao adjuvante saponina (da

Silva et al., 2000; Borja-Cabrera et al., 2002; Parra et al., 2007). Todavia, em novembro de 2014,


4

o MAPA suspendeu a licença provisória para a vacina Leishmune® por não atenderem aos

requerimentos de um estudo clínico de fase III (de Mendonça et al., 2016).

Nesse cenário, nosso grupo de pesquisa vem nas últimas duas décadas investindo esforços

na área da vacinologia onde desenvolveu duas vacinas de proteoma completo, constituídas de

antígenos heterólogos de Leishmania braziliensis, sendo a primeira associada ao adjuvante

saponina denominada LBSap, que recentemente teve sua tecnologia transferida para a empresa

Ourofino Agronegócios. A segunda apresenta, além da associação antígeno de L. braziliensis

com a saponina, a adição de proteínas da glândula salivar de Lutzomyia longipalpis, denominada

LBSapSal (Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Roatt et al., 2012; Aguiar-Soares et al.,

2014).

Uma “vacina ideal” contra a LV seria aquela capaz de induzir uma resposta imune

protetora que possibilite ativar tanto o compartimento da resposta celular através da produção de

óxido nítrico por macrófagos, aumento de linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8

+, com aumento

na produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, IL-12 e TNF-α), reduzindo em contrapartida a

produção de citocinas anti-inflamatórias (IL-4 e TGF-β), assim como a resposta humoral através

da produção de IgG1 e IgG2 (Reis et al., 2010). Contudo, há muitas dificuldades para alcançar

esta vacina dita ideal, reforçando a necessidade do desenvolvimento e aprimoramento de vacinas

anti-LVH ou anti-LVC, através da escolha de antígenos e adjuvantes efetivamente capazes de

ativarem o sistema imune e direcionar o estabelecimento a uma resposta de memória imunológica

desejada. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa iniciou a busca racional por novos possíveis

componentes vacinais capazes de proporcionar uma resposta mais rápida, efetiva, segura e

duradoura. Estes estudos iniciaram com Vitoriano-Souza (2012) avaliando a resposta imune local

e sistêmica induzida pelos adjuvantes Saponina (SAP), adjuvante incompleto de Freund (AIF) e

Monofosforil Lipídio A (MPL-A) isolados ou associados ao antígeno total de Leishmania

(Viannia) braziliensis.

Posteriormente, em estudos conduzidos por Mathias (2013), foi avaliado a cinética da

resposta imune desencadeada por adjuvantes clássicos, como o hidróxido de alumínio - Al(OH)3

e o Adjuvante Completo de Freund (ACF) além de adjuvantes mais recentes como o

Glicopiranosil Lipídio A (GLA), Montanide Pet Gel A (Mont) e Resiquimod (R-848). Os

resultados prévios de ambos os estudos permitiram fazer uma pré-seleção de futuros adjuvantes

(SAP, MPL e R-848) para serem utilizados em associação em novas composições vacinais anti-


5

Leishmania. Neste cenário, o objetivo central desta tese foi avaliar a resposta dos sistemas de

associação dupla e tripla dos adjuvantes Saponina, Monofosforil Lipídio A e Resiquimod na

potencialização da resposta imunológica do tipo 1, bem como avaliar seu efeito protetor em

associação com antígenos de L. braziliensis frente ao desafio heterólogo por L. infantum.

6

2. Revisão da literatura

MATHIAS, F. A. S. Revisão da Literatura

7

2.1. Histórico dos adjuvantes vacinais

A palavra adjuvante é derivada do termo latino adjuvare, que significa ajudar. Dessa

forma, os adjuvantes são geralmente definidos como compostos que aumentam e ou modulam a

imunogenicidade intrínseca de um antígeno comparado a aplicação do mesmo isoladamente,

refletindo no aumento da eficácia vacinal (Ramon, 1926; O’Hagan & Valiante, 2003; O’Hagan &

Gregorio, 2009). Para reduzir a reatividade frente aos complexos repertórios antigênicos vacinais,

as novas vacinas passaram a ter uma composição antigênica mais definida, o que pode acarretar

frequentemente em uma menor imunogenicidade em comparação com vacinas anteriores de

antígenos inteiros ou baseadas em vírus (O’Hagan & Gregorio, 2009). Por conseguinte, os

adjuvantes são necessários para auxiliar novas vacinas a induzir respostas imunes potentes e

persistentes, com os benefícios adicionais de que são necessárias doses menores de antígenos e

menos doses vacinais. Além disso, novos alvos vacinais frequentemente requerem a indução de

respostas celulares fortes, incluindo células T auxiliares bem como de linfócitos T citotóxicos

(CTL), além de anticorpos (Singh & O’Hagan, 1999; Guy, 2007; Tritto et al., 2009).

Durante muito tempo, houve muito pouco progresso na compreensão dos mecanismos de

ação dos adjuvantes, todavia, estudos envolvendo adjuvantes vacinais tem ganhado espaço

recentemente no campo da vacinologia (O’Hagan & De Gregório, 2009). Assim como a produção

de vacinas se tornou mais sofisticada, os adjuvantes também seguiram o mesmo caminho. Ficou

claro que as propriedades desejáveis para um adjuvante variam de vacina para vacina, mas tem

como necessidade principal a produção de uma imunidade mais precoce, elevada e/ou duradoura

bem como de utilizar menores doses de antígeno em sua composição (Tritto & Gregório, 2009).

Dessa forma, fica explícito que os adjuvantes são componentes-chave em vacinas. Outro ponto

chave é que a qualidade desejada de cada vacina particular reflete na necessidade da utilização de

adjuvantes com propriedades específicas. A seleção de antígenos vacinais deve levar em conta

também a seleção de um adjuvante(s) apropriado evitando assim a possível eliminação de

candidatos antigênicos potencialmente eficazes. Logo, é essencial que no processo de

desenvolvimento de um adjuvante e/ou uma vacina seja esclarecido, por completo, todas as

informações sobre os mesmos, como por exemplo: o modo de ação, evitando o uso de

componentes indefinidos em formulações de adjuvantes além de dados abrangentes sobre a

segurança, tolerabilidade e eficácia da vacina com adjuvante (Reed et al., 2013).


8

A primeira geração de adjuvantes iniciou-se por volta de 1920, representada pelos sais de

alumínio insolúveis, como o Al(OH)3 e o AlPO4, genericamente chamados de Alum (Glenny et

al., 1926). O papel primário do Alum é principalmente formar um sistema depósito de longa

duração do antígeno, promovendo uma melhor apresentação deste para células apresentadoras de

antígenos (APCs), entretanto, sabe-se agora que sua estimulação imune inata desempenha um

papel primário na atividade desse adjuvante (Lambrecht et al. 2009; Marrack, Mckee & Munks,

2009).

Anos mais tarde, as emulsões foram introduzidas por Freund em 1937 (Tritto & Gregório,

2009). Os adjuvantes baseados em emulsões água-óleo (W/O) foram originalmente pensados para

trabalhar de forma semelhante ao Alum, liberando o antígeno por um período mais longo. Já na

década de 70, os adjuvantes de segunda geração foram iniciados, adicionando-se componentes

extras aos adjuvantes de primeira geração a fim de aumentar a sua potência. O desenvolvimento

de adjuvantes da 2ª geração foi seguido da descoberta de componentes sintéticos capazes de

ativaram o sistema imune como o Muramil dipeptídeo (MDP) (O’Hagan & Gregorio, 2009; Reed

et al., 2013).

Neste amplo cenário de adjuvantes vacinais, as saponinas são descritas como pertencentes

a um grupo de glicosídeos triterpenos obtidos da casca de árvores da espécie Quillaja saponaria,

utilizadas na indústria de cosméticos e como fitoterápicas (Cox & Coulter, 1997; Sparg et al.,

2004). Apresenta três formas: a forma bruta ou extrato cru, a forma Quil A (parcialmente

purificada) ou QS-21 (forma mais purificada). Independente da forma, sabe-se que esses

adjuvantes desencadeiam um perfil de resposta mista com indução de uma resposta do Tipo 1

(células TCD8+ e produção de IgG2a) além de uma resposta do Tipo 2 (Liu et al., 2002). As

saponinas também estão presentes nas partículas ISCOMS® (complexo imunoestimulante

constituído por saponina Quil A, colesterol e fosfolipídios) que vêm sendo empregadas em

ensaios contra doenças provocadas por vírus, bactérias, parasitos e em vacinas contra o câncer,

por via parenteral, nasal ou oral (Rajput et al., 2007). Este adjuvante induz forte resposta mediada

por células e atividade de linfócitos T CD8+ por várias semanas. Desta forma, tem sido proposta

sua utilização para imunoterapia contra o câncer e em doenças infecciosas de curso crônico.

Nos últimos anos, novos adjuvantes vêm sendo propostos em diferentes ensaios clínicos

vacinais. Nesse contexto, destaca-se o adjuvante sintético Monofosforil Lipídio A (MPL),

derivado da endotoxina LPS (lipopolissacarídeo) de Salmonella minesota e que atua como


9

agonista do receptor Toll-Like 4 (TLR 4), sendo potente estimulador de uma resposta

imunológica do tipo 1. Sabe-se que essa classe de adjuvante (agonistas de TLR) são importantes

ativadores da resposta imune inata através da indução da maturação de células dendríticas (DCs)

e secreção de citocinas inflamatórias (Vitoriano-Souza et al., 2012; Zhang & Matlashewski,

2008). Esse adjuvante está presente em vacinas contra o HPV (Fendrix) e malária (RTS,S) (Reed

et al., 2013; Kazmin et al., 2017). Recentemente, o MPL foi empregado em uma composição

vacinal com antígeno de Leishmania braziliensis visando o tratamento imunoterápico contra a

LV, utilizando o cão como modelo de estudo, apresentando melhora do quadro clínico dos

animais, restabelecimento dos parâmetros bioquímicos e hematológicos bem como recuperação,

ativação e polarização da resposta imune para um perfil protetor (Roatt et al., 2017).

Outro grupo de adjuvantes que vêm sendo estudados são os pertencentes a família

imidazoquinolina como o Imiquimod (R-837) e o Resiquimod (R-848), agonistas de Toll-Like 7

(TLR7). Dentre as células da linhagem hematopoiética, os receptores TLR7 são principalmente

expressos por células dendríticas plasmocitóides (pDCs) e mielóides (mDCs) bem como

linfócitos B, sendo que quando ativadas, via TLR7, essas células produzem citocinas pró-

inflamatórias como IFN (α, β), TNFα e IL-12 (Hornung et al., 2002; Ito et al., 2002).

Apesar dos valiosos avanços, desde a sua descoberta, os sais de alumínio foram utilizados

em vacinas humanas e até o momento são os únicos adjuvantes licenciados para uso nos Estados

Unidos, estando presentes na composição das vacinas humanas para tétano, difteria, poliomielite,

hepatite A e B entre outras (Lindblad, 2004). Por outro lado, na Europa, novos adjuvantes foram

licenciados para sua utilização em vacinas humanas na última década, como o MF59, AS03 e

mais recentemente uma associação entre Al(OH)3 e monofosforil lipídio A (MPL) denominado

de AS04 utilizado nas vacinas contra HBV (Fendrix® - GSK, Reino Unido) e HPV (Cervarix

® -

GSK, Reino Unido) (Tritto et al., 2009). É importante ressaltar que muitos adjuvantes vacinais

conhecidos e utilizados em diferentes composições vacinais foram descobertos empiricamente, o

que impossibilitou o progresso e compreensão dos seus mecanismos de ação, explicando em

parte, o baixo número de adjuvantes aprovados para uso humano (Calabro et al., 2011). Esses

fatos enfatizam a necessidade de prospecção e desenvolvimento de novos adjuvantes e/ou de uma

pesquisa mais completa sobre a segurança e a eficácia de adjuvantes disponíveis (Singh, 2007).

Atualmente, com o objetivo de aperfeiçoar a composição de novas vacinas, alguns grupos

de pesquisa estão concentrando esforços nos chamados sistemas de associação de adjuvantes,


10

quando dois ou mais adjuvantes estão presentes numa mesma composição vacinal. Destacam-se o

AS02 (emulsão contendo MPL e a fração purificada QS-21 da saponina), AS03 (emulsão

contendo α-tocoferol e esqualeno) e AS04 (Al(OH)3 e MPL). Vacinas contendo essas associações

já estão no mercado ou em processo final de teste, como é o caso da AS03 para o vírus da

influenza e da RTS,S/AS01 para a malária (Madan et al., 2017; Kazmin et al., 2017). Dessa

forma, movidos pelos resultados obtidos em nossos estudos prévios, decidimos expandir nossas

investigações em associação de adjuvantes, tendo como principal estratégia a utilização de

adjuvantes que potencializam a resposta imunológica do tipo 1 para compor vacinas mais seguras

e eficazes contra a LV.

Em suma, para o desenvolvimento de novas vacinas com adjuvantes é necessário primeiro

estabelecer um balanço entre os riscos e benefícios dessa associação. Ademais, é necessário

realizar testes rigorosos pré-clínicos, clínicos e pós-comercialização para identificar possíveis

problemas de segurança. A compreensão dos mecanismos de ação dos adjuvantes existentes deve

continuar a serem aperfeiçoados, todos estes aspectos são fundamentais a fim de alcançar todos

os benefícios potenciais que os adjuvantes oferecem (Reed et al., 2013).

2.2. Os adjuvantes e a resposta imune

Uma resposta imune precoce e efetiva a adjuvantes vacinais pode melhorar

significativamente a imunogenicidade e eficácia das vacinas através da ativação do sistema

imune inato e consequentemente, desenvolvimento da resposta imune adquirida (Singh, 2007;

Coler et al. 2011). Assim, a indução bem-sucedida de memória imunológica para antígenos

vacinais tem início através da ativação do sistema imune inato no local do inóculo. Em seguida,

células imunes residentes no tecido são ativadas e iniciam o processo de produção de citocinas

pró-inflamatórias e quimiocinas, resultando no recrutamento de células imunes inatas.

Consequentemente, serão recrutadas para o local do inóculo células apresentadoras de antígeno

(APCs) e os fagócitos que irão reter o antígeno e o transportaram para os linfonodos drenantes

dando início assim, a resposta adaptativa (Awate, Babiuk & Mutwiri, 2013). Nesse sentido,

adjuvantes vacinais são essenciais para potencializar a imunogenicidade através de inflamação

local, recrutamento e ativação de linfócitos não específicos e persistência do antígeno no local do

inóculo (Singh & O'Hagan, 1999). Além disso, estas substâncias aditivas realizam importante

papel no recrutamento de várias células do sistema imune, na taxa de captura de antígenos e na


11

produção de citocinas inflamatórias (Medzhitov & Janeway, 1997; Kensil, Mo & Truneh, 2004).

Tais aspectos constituem uma sinopse do que poderá acontecer logo após estes eventos iniciais

que sem dúvida orquestram e mantém todo o processo de imunogenicidade pós vacinal.

No contexto da imunidade inata, a resposta inflamatória merece atenção especial, uma vez

que é rapidamente iniciada e independe do antígeno, além de preceder o início da resposta

antígeno-específico (Korsholm et al., 2009). De forma geral, os adjuvantes têm seu papel

fundamental na ativação da resposta imune inata através de vários receptores de reconhecimento

padrão (PRRs) como os diversos receptores Toll-Like (TLRs). Todavia, podem criar um

microambiente celular adequado importante no direcionamento e diferenciação de uma resposta

imune adquirida tanto do tipo 1 através de células produtoras/secretoras de IFN-γ e IL-2, onde

estimulam a imunidade celular contra patógenos intracelulares, ou resposta do tipo 2 através de

células produtoras/secretoras de IL-4, IL-5 e IL-13 que medeiam resposta humoral contra

patógenos extracelulares (Mosmann & Coffman 1989; Mosmann & Sad 1996; Mosmann et al.

1997; Korsholm et al. 2009). Dessa forma, fica claro que dentre os mediadores imunológicos, as

citocinas produzidas por células da imunidade inata no local da imunização podem ser

comunicadores essenciais para a atividade adjuvante agindo de forma determinante no

desenvolvimento da resposta imune celular e humoral, pois elas regulam, de forma autócrina e

parácrina, a resposta imune, promovendo a migração de leucócitos a partir do sangue e a ativação

de outras células do tecido cutâneo (Schijins, 2000).

Os adjuvantes atuam de várias formas aumentando a resposta imune adaptativa e gerando

uma memória imunológica eficaz. Muitos de seus efeitos parecem ocorrer nas células

apresentadoras de antígeno (APCs), como as células dendríticas (DCs). Deste modo, os

adjuvantes podem afetar a migração, a maturação, a apresentação de antígenos e a expressão de

moléculas co-estimuladoras por DCs, e estes eventos, por sua vez, melhoram as respostas ao

antígeno pelas células T e B. Os adjuvantes, aparentemente via DC, podem também afetar a

natureza das respostas das células T auxiliares CD4+ (Th), das células citotóxicas T CD8

+ e das

células B, direcionando respostas do tipo 1 e/ou do tipo 2. Além disso, alguns adjuvantes

aumentam a apresentação cruzada entre DCs e antígenos, bem como atuam diretamente nas

células T ou B, melhorando a sua proliferação e/ou conversão em células de memória que são

essenciais para o sucesso das vacinas, sendo hábeis a responder de forma rápida a uma reinfecção

(McKee, Munks & Marrack, 2007).


12

Na avaliação de memória imunológica, é notório a dificuldade de caracterização de

linfócitos T de memória devido à grande heterogeneidade de suas moléculas, sendo necessária a

utilização simultânea de anticorpos monoclonais contra várias dessas moléculas expressas por

essas células. Sallusto et al. (1999) realizaram um dos estudos pioneiros sobre memória em

células T no sangue periférico de humanos, caracterizando esses linfócitos em dois fenótipos:

células de memória central e células de memória efetora. As células T de memória central

permanecem nos órgãos linfóides secundários devido à alta expressão de moléculas de adesão,

principalmente o CD62L. Elas são de longa duração e responsáveis pela proteção contra

infecções sistêmicas e acredita-se que estas células possam se diferenciar em células de memória

efetora (Sallusto et al., 1999; Seder et al., 2008; Jaigirdar & Macleod, 2015). Por outro lado, as

células de memória efetora já apresentam capacidade de circular entre os órgãos linfóides e os

tecidos periféricos. Dessa forma, apresentam ausência de moléculas de adesão ou expressam-nas

em baixa densidade. Além disso, essas células produzem rapidamente citocinas efetoras

protegendo contra infecções (Sallusto et al., 1999; Jaigirdar & Macleod, 2015). No entanto,

atualmente já são caracterizados outros fenótipos de memória como células T de memória

residente, células T reguladoras de memória, células T foliculares de memória e células T

multipotentes de memória (Jaigirdar & Macleod, 2015).

Diante desses fatos, um dos grandes desafios atuais dos imunologistas e vacinologistas é

como identificar adjuvantes e antígenos capazes de gerar memória imunológica mais duradoura

frente às imunizações vacinais. Assim sendo, várias abordagens de avaliação da memória

imunológica têm sido desenvolvidas e alguns trabalhos, empregando a citometria multifuncional,

visam identificar e avaliar as subpopulações de linfócitos T efetores e de memória a fim de

validar diferentes candidatos vacinais. Um dos trabalhos pioneiros em leishmanioses empregando

avaliação de células multifuncionais buscou uma correlação entre proteção gerada pela

imunização com o antígeno vacinal Leish-11f e o aparecimento de subpopulações de linfócitos T

de memória. Nesse estudo, camundongos C57BL/6 foram imunizados com a vacina Leish-111f

juntamente com o adjuvante CpG (agonista de Toll-Like 7), seguida do desafio com

promastigotas metacíclicas de L. major pela via intradérmica, com objetivo de avaliar e

classificar as diferentes subpopulações de linfócitos T CD4+ multifuncionais (Darrah et al.,

2007). Os resultados obtidos por estes autores demonstraram uma correlação entre proteção e a

presença de linfócitos T CD4+ de memória central e efetora secretando mais do que uma citocina


13

simultaneamente. Deste modo, os pesquisadores classificaram como linfócitos de memória

central as células Th1 que expressam a molécula CCR7 e foram capazes de produzir IL-2 e TNF-

α podendo, após ativação, produzir IFN-γ. Além disso, esse estudo classificou células Th1 com

baixa expressão de CCR7 produzindo IL-2, TNF-α e IFN-γ como células de memória efetora

(Darrah et al., 2007).

2.3. Mecanismos de ação dos adjuvantes

Recentes avanços no conhecimento imunológico dos adjuvantes revelaram vários

mecanismos de atuação dos mesmos. Como demonstrado na figura 1, evidências sugerem que os

adjuvantes atuam através de um ou mais dos seguintes mecanismos para induzir respostas

imunológicas: (i) liberação prolongada de antígeno no local de inóculo (sistema de depósito); (ii)

estímulo à produção de citocinas e quimiocinas; (iii) recrutamento no local do inóculo; (iv)

aumento da captação e apresentação de antígenos nas APCs; (v) ativação e maturação de APCs

(maior no complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e expressão de moléculas

co-estimuladoras) e migração para os linfonodos drenantes e (vi) ativação de inflamassomas (Cox

& Coulter, 1997; Hoebe et al., 2004; Fraser et al., 2007).


14

Figura 1: Esquema representativo dos mecanismos de ação dos adjuvantes no recrutamento e ativação de células de

imunidade inata até sua participação em mecanismos mediadores da imunidade inata.

A formação de um depósito no local da injeção é talvez o mecanismo de ação mais antigo

e mais amplamente reconhecido dos adjuvantes, baseado na proteção do antígeno de uma rápida

degradação, assim como da eliminação pelo hospedeiro, podendo resultar na produção de altos

níveis de anticorpos (Siskind & Benacerraf, 1969; Stills, 2005). Os principais exemplos de

adjuvantes que apresentam esse mecanismo de ação são os sais de alumínio, onde foi observada a

presença do antígeno após três semanas e outros adjuvantes a base de emulsões água-óleo como o

Adjuvante Completo de Freund (ACF) que direcionam uma alta e prolongada produção de

anticorpos (Herbert, 1968; Osebold, 1982).

Certos adjuvantes induzem o recrutamento de várias células para o local do inóculo onde

algumas delas são responsáveis pela condução do antígeno para os órgãos linfóides como baço e


15

linfonodos drenante para produzir e amplificar uma resposta específica. A função dos adjuvantes

na apresentação eficiente de antígenos por moléculas de MHC nas células APCs é fundamental

na indução da resposta imune adaptativa. Todavia, o papel exato desempenhado pelo adjuvante

no aumento da apresentação de antígenos ainda não está totalmente elucidado (Awate, Babiuk &

Mutwiri, 2013). Mosca et al. (2008) avaliando o mecanismo de ação dos adjuvantes no processo

de recrutamento de células para o local do inóculo, demonstraram, através da técnica de

microarray, que o cluster de genes codificadores de quimiocinas, citocinas, receptores da

imunidade inata, genes induzidos por interferon e moléculas de adesão são comumente

modulados por adjuvantes como os sais de alumínio, esqualeno (MF59) e CpG-ODN no local do

inóculo. Dentre esses, o MF59 demonstrou uma alta expressão de genes para quimiocinas como

CCR2, CCL2, CCL3, CXCL8 responsáveis tanto pelo recrutamento neutrófilos, células NK,

monócitos/macrófagos, como pela interação entre células dendríticas e linfócitos T (Seubert et

al., 2008).

2.4 Adjuvantes em diferentes formulações vacinais para a LV

A morbidade e a mortalidade por várias doenças infecciosas foram drasticamente

reduzidas pela efetividade da vacinação, que segundo Organização Mundial da Saúde (OMS) é a

medida de saúde pública mais eficaz em termos de custos para prevenir a propagação de doenças

(O'Hagan & Valiante, 2003; Lambert, 2005). Diante desse cenário, as pesquisas para o

desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose vêm ganhando cada vez mais destaque.

Em termos globais, a primeira geração de candidatos vacinais contra a leishmaniose,

preparados utilizando os parasitos inteiros inativados como principal componente, foram

consideradas promissoras devido à sua relativa facilidade de produção e baixo custo. Estas

vacinas têm sido objeto de muitas investigações desde a década de 40 e são as únicas candidatas a

vacinas contra a leishmaniose que foram submetidas à avaliação de ensaios clínicos de fase 3 em

humanos. Embora os estudos demonstrassem a segurança das vacinas, imunogenicidade razoável

e alguma indicação de proteção, ainda não foi identificada uma vacina profilática eficaz para

nenhuma das formas das leishmanioses. Apesar desta falha global, estes ensaios contribuíram

significativamente para aumentar o conhecimento sobre a imunologia da leishmaniose humana

(Noazin et al., 2008).


16

Os principais desafios no desenvolvimento da vacina contra a leishmaniose são a

complexidade associada à antigenicidade, resposta desigual pelo hospedeiro, variabilidade nas

diferentes espécies de Leishmania e custo associado ao desenvolvimento (Singh & Sundar,

2012).

Em se tratando da LV, a primeira vacina avaliada para essa forma da doença foi

desenvolvida por Mayrink et al. (1996), tendo como foco o cão. Essa vacina era composta por um

antígeno heterólogo proveniente de promastigotas de L. braziliensis associado ao adjuvante BCG.

Os resultados demonstram que a vacina apresentou uma taxa de proteção de 90% frente ao

desafio por L. infantum em um estudo de fase 2 controlado em canil fechado (Mayrink et al.,

1996). Desde então, diversas vacinas vêm sendo propostas na LV experimental. Streit et al.

(2000) avaliaram uma vacina também composta pelo adjuvante BCG associado ao antígeno

LCR1 de L. donovani observando um aumento na produção de IFN-γ e redução de IL-10. Ainda

utilizando o mesmo adjuvante, Molano et al. (2003) avaliando uma vacina quimérica composta

por proteínas de ácido ribossomal (Lip2a, Lip2b, P0 e histona H2A), observam uma taxa de

proteção de 50% nos cães imunizados.

Seguindo o mesmo raciocínio, o antígeno LiESAp, secretado e excretado de

promastigotas de L. infantum, foi utilizado em associação com o adjuvante muramil dipeptídeo

(MDP) para compor uma vacina desenvolvida na França, que foi capaz de aumentar os níveis de

óxido nítrico e consequentemente aumento do efeito leishmanicida (Holzmuller et al., 2005).

Posteriormente, o antígeno LiESAp foi conjugado à saponina dando origem a vacina que se

encontra no mercado europeu sob o nome comercial de CaniLeish® sendo produzida pela

empresa Virbac na França (Moreno et al., 2012). Em um estudo de fase III, duplo-cego

randomizado, Oliva et al. (2014) observaram uma redução da incidência da infecção ativa, tanto

em animais sintomáticos quanto assintomáticos frente a exposição natural ao vetor. A vacina foi

bem tolerada, apresentando uma redução no risco de progressão da doença com uma eficácia de

68,4% e taxa de proteção de 92,7% (Oliva et al., 2014). Ainda na Europa tem-se a

comercialização de uma segunda vacina recombinante (Carcelen et al., 2009) denominada

Letifend® que foi aprovada em 2016. Os estudos dessa vacina começaram em 2003 com Molano

et al. (2003). Esses autores utilizaram preparações de uma proteína recombinante quimérica

multicomponente, denominada Q, formulada com BCG, e demonstraram que o antígeno foi capaz


17

de induzir 90% de proteção em cães imunizados submetidos à infecção experimental (Molano et

al., 2003).

Atualmente no Brasil há apenas uma vacina disponível no mercado para a LVC licenciada

no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e comercializada com o nome

de Leish-Tec® (Hertape Calier Saúde Animal S/A). Em estudo realizado por Fernandes et al.

(2008), essa vacina que contém o antígeno recombinante A2 específico para amastigotas de

Leishmania juntamente com o adjuvante saponina, demonstrou que os cães vacinados produziram

altos níveis de IgG total e IgG2 anti-A2, aumento significativo na produção de IFN-γ após

incubação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) com antígeno de Leishmania e

que 4/7 animais imunizados apresentaram resultados de isolamento positivos de medula óssea 9

meses após o desafio experimental com L. infantum (Fernandes et al., 2008). Recentemente, a

LeishTec® foi avaliada em um estudo de fase 3, duplo cego randomizado, apresentando 71% de

eficácia ao serem empregados os resultados parasitológicos isoladamente para fins de cálculos

epidemiológicos. Entretanto, sobrepondo o xenodiagnóstico e o parasitológico, a eficácia foi de

58% (Regina-Silva et al., 2016). Posteriormente, em outro minucioso estudo de fase 3 em uma

região altamente endêmica (Pancas, Espírito Santo, Brasil), foi observado 18 meses pós protocolo

vacinal, uma soroconversão alta nos animais imunizados de cerca de duas vezes mais em relação

ao grupo não imunizado. A incidência da infeção foi notada em 27% dos cães imunizados e em

42% dos cães que não receberam a vacina. Em relação à eficácia vacinal, foi confirmado que

43% dos animais vacinados desenvolveram a doença. Assim, a eficácia desta vacina não foi

evidente. De um modo geral, a LeishTec® precisa ser otimizada de forma a ter impacto na

diminuição da incidência da infecção canina em áreas de alta prevalência (Grimaldi et al., 2017).

Nosso grupo iniciou a linha de pesquisa em vacinas contra a LV a partir do trabalho

desenvolvido por Giunchetti et al. (2007), no qual foram avaliadas duas vacinas de primeira

geração. A primeira denominada LBSap, constituída por extrato de antígenos bruto de L.

braziliensis associado ao adjuvante saponina e a vacina LBSapSal, com mesma composição

acrescida de extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis. Resultados demonstraram que

essas vacinas foram capazes de induzir uma forte atividade imunogênica após o processo vacinal,

particularmente relacionada à expansão de linfócitos T CD8+ circulantes e de linfócitos T CD8

+

Leishmania-específicos acompanhado de intensa atividade linfoproliferativa e elevada produção

de óxido nítrico (NO) in vitro. No contexto da resposta imune humoral, foram observados


18

aumento nos níveis de anticorpos IgG e das subclasses (IgG1 e IgG2) anti-Leishmania

(Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008). As vacinas LBSap e LBSapSal apresentam-se

inócuas e seguras para a administração em cães sem causar lesões ulcerativas no local do inóculo

(Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Vitoriano-Souza et al., 2008; Moreira et al.,

2009; Roatt et al., 2012; Aguiar-Soares et al., 2014). Além disso, os cães imunizados com LBSap

apresentaram elevada expressão de IFN-γ e baixa expressão de IL-10 e TGF-β1 no baço, bem

como uma redução significativa da carga parasitária nesse tecido (Roatt et al., 2012). Esses

importantes resultados levaram a transferência de tecnologia e patente da vacina LBSap para a

empresa Ourofino Agronegócios no ano de 2013 que conduzirá um estudo de fase III em breve.

Contudo, apesar de inúmeros esforços e resultados, acreditamos que nossa tarefa em

buscar uma vacina segura e eficaz dependa, não só do antígeno, mas também da escolha de um

bom adjuvante vacinal para alcançarmos uma resposta imune desejada. Portanto, a pré-seleção de

adjuvantes isolados ou em associações, através da observação dos seus eventos imunológicos,

bem como avaliação da eficácia vacinal frente ao desafio experimental em camundongos é

fundamental no constante processo de descoberta e aprimoramento de vacinas mais eficazes e

seguras. Dessa forma, fica evidente a importância do desenvolvimento de vacinas empregando

novas formulações envolvendo a combinação de adjuvantes e antígenos capazes de gerar um

efeito sinérgico que potencialize a resposta imune.

2.5. A pele como via de imunização A pele constantemente entra em contato com uma série de toxinas, organismos

patogênicos e estresses físicos presentes no meio ambiente, funcionando mais do que como uma

barreira física, sendo um órgão imunológico importantemente ativo. Respostas imunes na pele

envolvem um arsenal de células imunocompetentes e modificadores de resposta imunobiológica,

incluindo as citocinas (Salmon et al., 1994). Além disso, a pele destaca-se por ser um local de

fácil acesso, que proporciona uma intensa conexão com os capilares linfáticos e veias até os

órgãos periféricos do sistema imune, como os linfonodos (Puri et al., 2000), apresentando a

vantagem de entregar o antígeno e fatores para a maturação das DCs no compartimento que elas

residem, tornando mais rápida a apresentação de antígenos e consequentemente migração para o

linfonodo drenante (Disis et al., 1996).


19

As células de Langerhans na epiderme e as DCs na derme são as principais células

imunológicas da pele, com o papel essencial na captura de antígenos e apresentação nos

linfonodos drenantes. Adicionalmente, os queratinócitos da pele além de outras células na

epiderme e na derme produzem citocinas e quimiocinas que podem estimular e controlar as

respostas imunes (Kim et al., 2012). As DCs imaturas patrulham os tecidos para detectar

patógenos. O reconhecimento de agentes patogênicos através de receptores inatos específicos

permite a captação de antígenos e processamento para apresentação em moléculas de classe I e II

de MHC, enquanto as DCs migram para órgãos linfóides secundários. Após a entrada nos

gânglios linfáticos, estas células exibem um fenótipo maduro, caracterizado por elevados níveis

de expressão de moléculas co-estimuladoras e a produção de citocinas pró-inflamatórias (Fehres

et al., 2013).

Estudos clínicos têm demonstrado que a via padrão de imunização intradérmica apresenta

resposta imunológica equivalente ou superior quando comparado a vacinas administradas por via

subcutânea ou intramuscular. Ensaios clínicos com influenza (Kenney et al., 2004; Leroux-Roels

et al., 2008; Holland et al., 2008) e vacinas contra a raiva (Bernard et al., 1987) demonstraram

que a vacinação intradérmica induz respostas imunes equivalentes à vacina administrada por via

intramuscular ou por via subcutânea, utilizando apenas 10 a 20% da dose de antígeno,

demonstrando o potencial dessa via de imunização na busca de protocolos vacinais mais efetivos

(Kis, Winter & Myschik, 2012).

No entanto, apesar da pele ser um órgão composto por diversas células importantes da

resposta imune, a derme em humanos é um tecido extremamente fino, localizado a uma

profundidade de menos de 1 mm da superfície da pele, dependendo do local do corpo. Dessa

forma, tanto o treinamento quanto a experiência são geralmente necessários para os profissionais

realizarem uma imunização intradérmica (ID) precisa e consistente usando agulha e seringa

padrão. A fim de oferecer uma vacinação de identificação fácil e confiável, vários tipos diferentes

de dispositivos de administração de ID estão sendo desenvolvidos (Laurant et al., 2007; Kaplan,

2010; Arakane et al., 2015). Recentemente, a vacinação ID foi simplificada através da introdução

de uma microagulha de fácil uso que foi aprovado para a imunização contra a influenza na

Europa (Atmar, Patel & Keitel, 2010; Arakane et al., 2015).

Devido as vantagens apresentadas por essa via de imunização e ao fato de ser ainda uma

via pouco estudada e utilizada em relação às outras, nosso trabalho optou por avaliar a eficácia da


20

ID na sensibilização de camundongos com os diferentes sistemas de associação propostos bem

como de novas vacinas compostas pela associação de dois destes sistemas com o antígeno

heterólogo de L. braziliensis contra a LV.

21

3. Justificativa

MATHIAS, F. A. S. Justificativa

22

Nas últimas décadas, diversas vacinas já existentes têm sido revisadas sob a luz do

conhecimento da vacinologia racional. Neste cenário, surge a necessidade não somente do

desenvolvimento de vacinas mais seguras, imunogênicas e eficazes, mas também da utilização de

vias de administração de acesso mais fácil e eficazes como a via intradémica. Assim, a busca por

adjuvantes capazes de ampliar a resposta imune torna-se cada vez mais necessária e estudos

visando à combinação de dois ou mais adjuvantes em composições vacinais vêm ganhando

grande destaque. Atualmente, esses estudos vêm demonstrando que tais combinações são capazes

de gerar efeitos importantes no sistema imune. Dessa forma, fica evidente a necessidade do

desenvolvimento de vacinas empregando novas formulações envolvendo os sistemas de

associação de adjuvantes e antígenos capazes de potencializar a resposta imune após a

imunização intradérmica.

23

4. Hipótese

MATHIAS, F. A. S. Hipótese

24

Os sistemas de associação de adjuvantes contribuem para o aumento da eficácia vacinal

em dois novos imunobiológicos frente a infecção experimental por L. infantum em camundongos

Balb/c.

25

5. Objetivos

MATHIAS, F. A. S. Objetivos

26

5.1. Objetivo Geral

Avaliar a contribuição de sistemas de associação de adjuvantes na eficácia vacinal de dois

novos imunobiológicos contra a infecção experimental por L. infantum em camundongos Balb/c.

5.2. Objetivos Específicos

● Quantificar o infiltrado inflamatório (linfócitos, macrófagos e neutrófilos segmentados) na

pele;

● Avaliar a resposta imuno no local da inoculação desencadeada pelas associações através

dos níveis de citocinas (IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10) e quimiocinas (CCL2, CCL3,

CCL4, CCL5 e CXCL1) em sobrenadante de macerado de pele;

● Avaliar se as propostas vacinais promovem a proliferação celular in vitro bem como a

produção das citocinas intracitoplasmáticas IL-2, TNF-α e INF-γ in vitro de células T

CD4+ e T CD8

+ após um segundo contato com o antígeno solúvel de Leishmania sp.;

● Avaliar a formação de células T (CD3+CD4+ ou CD3

+CD8

+) de memória central

(CD127+CD44

+CD45RA

lowCD62L

+CD197


-CD44

+CD127

hi

CD197low

) após imunização com as novas propostas vacinais;

● Quantificar a carga parasitária de L. infantum no baço e no fígado.

27

6. Material e Métodos

MATHIAS, F. A. S. Material e Métodos

28

O tópico material e métodos desta tese encontra-se dividido em duas etapas, onde na

primeira foram avaliadas as cinéticas dos diferentes adjuvantes, e suas associações quando

sensibilizados na pele de camundongos Balb/c. Os sistemas de associação de adjuvantes foram

desenhados com o objetivo de reduzir a dose total de cada adjuvante individualmente. Neste

sentido, foram pré-definidas as doses de 25%, 33%, e 50% da dose total geralmente preconizada

e empregada. Na segunda etapa, foram formuladas diferentes vacinas com antígeno bruto de L.

braziliensis e as associações de adjuvantes que apresentaram as melhores performances da etapa

1. Além disso, foram avaliadas a imunogenicidade, indução de memória imunológica, alterações

histológicas no fígado e a eficácia das vacinas em camundongos através da redução da carga

parasitária hepática e esplênica após o desafio experimental intravenoso com promastigotas

metacíclicas de L. infantum.

6.1. METODOLOGIAS EMPREGADAS NA ETAPA 1

6.1.1 Animais e grupos experimentais

As avaliações foram conduzidas de acordo com as normas da CEUA/UFOP e com

aprovação do protocolo de uso animal nº. 2014/11 (disponível no anexo 1). Foram utilizados

camundongos isogênicos da linhagem Balb/c, machos com idade entre quatro a seis semanas. Os

animais foram adquiridos do Centro de Ciência Animal (CCA) da UFOP e mantidos em gaiolas

isoladoras climatizadas com ração e água ad libitum no CCA. Os animais foram divididos em 16

grupos experimentais (total de 192 camundongos, n=6 em duplicata) conforme descrito a seguir:

1) Grupo CS (Controle Salina): animais que foram inoculados pela via intradérmica com

solução salina estéril, NaCl 0,9%; pH 7,2-7,4;

2) Grupo Sap (Saponina): animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50 μL do

adjuvante na concentração de 100 μg/dose (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);

3) Grupo MPL (Monofosforil Lipídio A): animais que foram inoculados pela via intradérmica

com 50 μL do adjuvante na concentração de 50 μg por dose (Sigma Chemical Co., St Louis,

USA);

4) Grupo Resiquimod (R-848): animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50 μL

do adjuvante na concentração de 25 μg por dose (Sigma Chemical Co., St Louis, USA).

5) Associação SAP+MPL 25%: animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50 μL

da mistura de 25 μg de saponina e 12,5 μg de MPL (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);


29


da mistura de 33 μg de saponina e 16,5 μg de MPL (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);


da mistura de 50 μg de saponina e 25 μg de MPL (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);

8) Associação SAP+R-848 25%: animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50

μL da mistura de 25 μg de saponina e 6,25 μg de R-848 (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);





11) Associação MPL+R-848 25%: animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50

μL da mistura de 12,5 μg de MPL e 6,25 μg de R-848 (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);


μL da mistura de 16,5 μg de MPL e 8,25 μg de R-848 (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);


μL da mistura de 25 μg de MPL e 12,5 μg de R-848 (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);

14) Associação SAP+MPL+R-848 25%: animais que foram inoculados pela via intradérmica

com 50 μL da mistura de 25 μg de saponina, 12,5 μg de MPL e 6,25 μg de R-848 (Sigma

Chemical Co., St Louis, USA);


com 50 μL da mistura de 33 μg de saponina, 16,5 μg de MPL e 8,25 μg de R-848 (Sigma

Chemical Co., St Louis, USA);


com 50 μL da mistura de 50 μg de saponina, 25 μg de MPL e 12,5 μg de R-848 (Sigma Chemical

Co., St Louis, USA);

Os animais foram inoculados com uma dose única dos diferentes adjuvantes e suas

associações pela via intradérmica (50 μL na região dorsal). As doses inoculadas de cada

adjuvante foram selecionadas em conformidade com o estabelecido pelo Guidelines for the

Research Use of Adjuvants of Animal Care na Use Staff

(http://oacu.od.nih.gov/ARAC/freunds.pdf) e de acordo com trabalhos da literatura. Os animais

http://oacu.od.nih.gov/ARAC/freunds.pdf


30

foram necropsiados 48 horas após o inóculo para obtenção dos fragmentos de pele do local do

inóculo. A pele foi dividida em dois fragmentos, uma destinada para as avaliações de

citocinas/quimiocinas e a outra para as avaliações histológicas.

6.1.2 Dosagem de citocinas por CBA (Cytometric Bead Array)

A quantificação dos níveis de citocinas foi realizada pela técnica de Cytometric Bead

Array (BD Biosciences, San Jose, USA), utilizando o kit mouse-Th1/Th2/Th17 cytokine que

permite a quantificação das citocinas IL-2, IL-4, IL-10, IL-17A, IFN-γ e TNF-α. Os

experimentos foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante. Os fragmentos de

pele previamente coletados no momento da necropsia e armazenados em freezer -80ºC foram

homogeneizados utilizando um homogeneizador de tecidos Tissuelyser (Qiagen, USA) em 500

μL de um coquetel inibidor de protease (Sigma Chemical Co., St Louis, USA). Os

homogeneizados foram centrifugados a 10.000 x g durante 10 min a 4ºC e os sobrenadantes

foram armazenados a -80ºC antes da análise. Assim, as amostras foram descongeladas,

previamente, em banho-maria a 37°C e, em seguida, centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos

para a coleta do sobrenadante. O padrão foi reconstituído em 2,0 ml de Reagente G uma solução

Figura 2: Delineamento experimental Etapa 1.


31

tampão usada como diluente, nas seguintes diluições 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e

1/256. Foi preparada uma mistura de Beads (A1-A7), contendo 3μL de cada suspensão de Beads,

a fim de se atingir um volume final de 21 μL para cada amostra. As Beads foram adicionadas a

25 μL dos padrões, em suas respectivas diluições, tal como a 25 μL de cada amostra em seu

respectivo tubo. Foram adicionados a todos os tubos 18μL do Reagente B, um reagente de

detecção marcado com ficoeritrina (PE) e incubados por um período de 2 horas a temperatura

ambiente e ao abrigo da luz. Terminado o período de incubação, foram adicionados 500 μL do

Reagente F, uma solução tamponada de lavagem, em cada tubo e centrifugados a 600 x g por 7

min a 18°C. O sobrenadante foi aspirado com auxílio de bomba de vácuo, deixando cerca de 100

μL do sobrenadante em cada tubo. Foi realizada uma nova adição de 100 μL de Reagente F

partindo para a leitura. Para aquisição e armazenamento dos dados foi empregado o citômetro de

fluxo (FACSCalibur™ BD Biosciences). As curvas padrão para cada citocina foram traçadas e

as concentrações de cada amostra de teste em picogramas por mililitro (pg/mL) foram calculadas

usando a matriz de software FCAP v.3 (BD Biosciences, San Jose, USA). Os dados foram

normalizados através da quantificação de proteína total nos homogeneizados pelo método

colorimétrico de Bradford (BioRad, California, USA). Sendo assim, a quantificação de cada

citocina foi expressa em pg/mg de proteína total.

6.1.3 Dosagem de quimiocinas por CBA (Cytometric Bead Array)

O homogeneizado utilizado para a dosagem de citocinas foi o mesmo utilizado para as

dosagens de quimiocinas (descritas na Quadro 1) pela técnica de CBA Flex (BD Biosciences, San

Jose, USA) de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente, as amostras foram

descongeladas em banho-maria a 37°C e, em seguida, centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos

para a coleta do sobrenadante. Os padrões liofilizados de cada quimiocina foram adicionados a

um tubo de poliestireno de 15 mL e reconstituídos em 4 ml de uma solução tampão diluente

(Assay Diluent). Este tudo foi identificado como “Top Standart” contendo a concentração

máxima da curva (2500 pg/mL) que também foi feita nas seguintes diluições de 1/2, 1/4, 1/8,

1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e 1/256. Posteriormente, foi preparada uma mistura de Beads, contendo

1μL de cada Bead diluídas no volume final de 50 μL para cada tubo. As Beads foram adicionadas

a 50 μL dos padrões, em suas respectivas diluições, tal como a 50 μL de cada amostra em seu

respectivo tubo e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Após esse tempo foi adicionado a


32

todos os tubos 50 μL do Reagente de detecção PE diluído através do mesmo cálculo para as

Beads e incubados por 1 hora a temperatura ambiente. Terminado o período de incubação, foram

adicionados 1 mL de uma solução tamponada de lavagem (Wash Buffer) em cada tubo e

centrifugados a 200 x g por 5 min a 18°C. O sobrenadante foi aspirado com auxílio de bomba de

vácuo, deixando cerca de 100 μL do sobrenadante em cada tubo. Foi realizada uma nova adição

de 300 μL de Wash Buffer. Posteriormente foi realizada a leitura em citômetro LSR Fortessa (BD

Biosciences, San Jose, USA) no Laboratório Multiusuário de citometria de fluxo do Núcleo de

Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP). Para compensação do citômetro foram

usadas Beads (CompBeads) específicas. As quimiocinas foram calculadas usando a matriz de

software FCAP v.3 (BD Biosciences, San Jose, USA). Os dados foram normalizados através da

quantificação de proteína total em cada homogeneizado pelo método colorimétrico de Bradford

(BioRad, California, USA). Sendo assim, a quantificação de cada quimiocina foi expressa em

pg/mg de proteína total.

Quadro 1: Quimiocinas avaliadas e suas respectivas funções imunológicas.

Nomenclatura atual Outras denominações Função imunológica

CCL2 MCP-1 Tráfego de monócitos

CCL3 MIP-1 Migração macrófagos, células NK e

interação linfócito T com células dendríticas (DC)

CCL4 MIP-1 Migração macrófagos, células NK e

interação linfócito T com DC

CCL5 RANTES Migração macrófagos, células NK e

interação linfócito T com DC

CXCL1 KC Tráfego de neutrófilos

6.1.4 Processamento e avaliação histológica da pele

O segundo fragmento de pele foi fixado em solução de metanol 80% + DMSO 20% e

posteriormente, processada no histotécnico (OM CM 69, Metal. OMA LTDA, São Paulo, Brasil)


33

e incluído em parafina. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de

Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (LIMP/NUPEB/UFOP).

Após o processamento histológico, o material foi cortado em micrótomo (5 μm) para a

obtenção de uma fita de tecido que foi depositada sobre uma lâmina de vidro e corada pelo

método de Hematoxilina/Eosina (HE) para avaliação das alterações histopatológicas

(quantificação do infiltrado inflamatório.)

As células inflamatórias presentes na derme/epiderme foram quantificadas em 20 imagens

aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 μm

2). As imagens visualizadas pela objetiva de

40x foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM5000B acoplada ao microscópio Leica

e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1 Leica Microsystems-Switzerland-Ltd).

Para a análise das imagens obtidas foi utilizado programa Leica QWin V3 (Leica Microsystems-

Switzerland-Ltd). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a um estudo prévio no

laboratório (Vitoriano-Souza., 2012) onde foi realizada uma curva de estabilidade avaliando o

número necessário de campos que deveriam ser obtidos para que assim pudesse ser representativo

do todo.

6.2. METODOLOGIAS EMPREGADAS NA ETAPA 2

6.2.1 Animais e grupos experimentais

As avaliações foram conduzidas de acordo com as recomendações da CEUA/UFOP e

com aprovação do protocolo de uso animal nº. 2017/09 (disponível no anexo 2). Para esta etapa,

também foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem Balb/c, machos com idade entre

quatro a seis semanas. Os animais foram adquiridos do Centro de Ciência Animal (CCA) da

UFOP e mantidos em gaiolas isoladoras climatizadas com ração e água ad libitum no CCA. Os

animais foram divididos em 6 grupos experimentais (total de 60 camundongos, n=5 em

duplicata):

1) Grupo CS (Controle Salina): animais que foram inoculados pela via intradérmica

com solução salina estéril, NaCl 0,9%; pH 7,2-7,4;

2) Grupo LB (Antígeno bruto vacinal de L. braziliensis): animais que foram pela via

intradérmica inoculados com 50 μL contendo 60 μg antígeno bruto de L. braziliensis;

3) Grupo SM50 (Associação SAP+MPL 50%): animais que foram inoculados pela via

intradérmica com 50 μL da mistura de 50 μg de saponina e 25 μg de MPL;


34

4) Grupo SMR50 (Associação SAP+MPL+R-848 50%): animais que foram inoculados

pela via intradérmica com 50 μL da mistura de 50 μg de saponina, 25 μg de MPL e 12,5 μg de R-

848(Sigma Chemical Co., St Louis, USA);

5) Grupo LBSM50 (Antígeno bruto vacinal de L. braziliensis acrescido da associação

SAP+MPL 50%): animais que foram inoculados pela via intradérmica com 50 μL contendo 60

μg antígeno bruto de L. braziliensis mais a mistura de 50 μg de saponina e 25 μg de MPL;

6) Grupo LBSMR50 (Antígeno bruto vacinal de L. braziliensis acrescido da

associação SAP+MPL+R-848 50%): animais que foram inoculados pela via intradérmica com

50 μL contendo 60 μg antígeno bruto de L. braziliensis mais a mistura de 50 μg de saponina, 25

μg de MPL e 12,5 μg de R-848 (Sigma Chemical Co., St Louis, USA);

Para o protocolo de imunização, três doses foram administradas, pela via intradérmica na

região dorsal, com um intervalo de duas semanas entre as doses. Duas semanas após a última

dose foi realizado o desafio com 1 x 107 promastigotas de L. infantum por via intravenosa na veia

caudal. Vinte e oito dias após o desafio, os camundongos foram eutanasiados para a coleta do

material biológico para análises subsequentes, conforme detalhado no fluxograma a seguir na

Figura 3.


35

Figura 3: Delineamento experimental Etapa 2.


36

6.2.2 Parasito e desafio experimental

O desafio experimental dos camundongos Balb/c foi realizado com 1 x 107 promastigotas

de L. infantum (cepa MCAN/BR/2008/OP46), em terceira passagem (P3) cultivadas em meio

NNN/LIT (Novy-MacNeal-Nicolle-liver infusion tryptose) e em fase estacionária de crescimento.

A cepa MCAN/BR/2008/OP46 foi isolada de um cão sintomático proveniente da cidade de

Governador Valadares, Minas Gerais, com a caracterização molecular compatível com o perfil de

enzimas de restrição de L. infantum pela da reação de PCR-RFLP (Volpine et al., 2004; de

Andrade et al., 2006). Essa cepa demonstrou-se altamente virulenta e patogênica em modelo

hamster e em camundongos (Moreira et al., 2012; Reis et al., 2017). Para a infecção foi realizado

o isolamento dos parasitos a partir do baço de hamsters previamente infectados os quais foram

utilizados na manutenção biológica da cepa. Os parasitos foram cultivados em meio LIT, em

Erlenmeyers de 250 mL, e armazenados em estufa biológica BOD (FANEM® modelo 347) à

temperatura de 23°C ± 1°C. Formas promastigotas em fase estacionária de crescimento,

destinadas ao desafio experimental, foram obtidas a partir da expansão de um inóculo inicial de

10 mL de meio LIT contendo entre 107 e 10

8 promastigotas/mL em crescimento logarítmico,

adicionadas a 40 mL de meio de cultura LIT. Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes

sendo que no último repique ao final de sete dias foram obtidos cerca de 40 mL de cultura

contendo promastigotas em fase estacionária (conforme curva de crescimento previamente

estabelecida para esta cepa em nosso laboratório), na concentração entre 107 e 10

8

promastigotas/mL. A cultura foi removida em capela de fluxo laminar e transferida para tubos

estéreis de polipropileno de 50 mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA), submetidos à

centrifugação a 3.000 rpm durante 10 minutos a 23°C. Após descartar o sobrenadante, o

sedimento de promastigotas foi homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,9%, pH= 7,2-

7,4), seguido de centrifugação nas mesmas condições. Este procedimento de lavagem foi repetido

por mais uma vez. Após o término das lavagens, as formas promastigotas foram contadas em

Câmara de Neubauer e ressuspendidas em solução salina estéril (NaCl 0,9%; pH= 7,2-7,4) em

uma concentração final de 1x107 promastigotas. A dose do inóculo para o desafio experimental

foi padronizada para o volume final de 100 μL e a administração foi realizada pela via

intravenosa caudal dos animais.


37

6.2.3 Obtenção de esplenócitos para avaliação multifuncional

Trinta dias após o desafio experimental, os camundongos foram necropsiados e o baço foi

retirado para obtenção de esplenócitos a serem submetidos às culturas in vitro. As suspensões de

células esplênicas foram preparadas de acordo com o método adaptado descrito por (Vieira et al.

2012). O órgão foi retirado sob condições estéreis em capela de fluxo laminar (Veco, Campinas,

São Paulo, Brasil) e colocado em um macerador de tecido de vidro com 2 mL de RPMI

acrescidos de 1% de soro fetal bovino (SFB). Posteriormente, após a retirada dos debris, a

suspensão celular foi transferida para um tubo de polipropileno de 15 mL e centrifugada a 1.700

rpm por 10 minutos. Subsequentemente, foi realizada a lise das hemácias com 2 mL da solução

de lise (Tris Base 17 mM e cloreto de amônio 144 mM pH 7,2-7,4) agitando-se por 2 minutos. A

reação foi bloqueada com 10 mL de RPMI suplementados com 10% de SFB. Os tubos foram

centrifugados a 1.700 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. As células foram

ressuspendidas e lavadas por duas vezes com RPMI e SFB 1%. Após a última lavagem, as células

foram ressuspendidas em 1 mL de RPMI ajustando-as para concentração de 1 x 107 células/mL.

A suspensão celular foi usada para duas abordagens diferentes visando a estudos imunológicos:

na primeira para avaliação da proliferação celular e produção de citocinas intracelulares (CIC);

enquanto a segunda abordagem contemplou a avaliação do fenótipo de memória.

Para a avaliação da proliferação celular e CIC as suspensões celulares foram marcadas

com CFDA-SE (Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester - Sigma Co.). As células

foram transferidas para placas de poliestireno de 96 poços com fundo em U (Costar®), contendo

meio de cultura suplementado CMBlast (SFB 20%, gentamicina 1%, L-glutamina 1%, β-

mercaptoetanol 0,1% e RPMI). Os esplenócitos de cada animal foram divididos em dois

tratamentos em duplicata sendo: (i) esplenócitos tratados com RPMI (controle); (ii) esplenócitos

estimulados com 25 μg/mL de antígeno solúvel de L. infantum (ASLi). Alguns poços foram

estimulados com o mitógeno concanavalina A (ConA) na concentração 1 µg/mL (controle

positivo de proliferação celular). Após a distribuição das células esplênicas nos poços controle,

estimulados com ASLi e estimulados com ConA, as amostras foram incubadas por 5 dias (120

horas) em estufa de com 5% CO2 a 37oC.

6.2.4 Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC

A caracterização fenotípica dos linfócitos foi realizada nos esplenócitos incubados

durante 5 dias e obtidos de acordo com a descrição anterior. Quatro horas antes do término do


38

período de 120 horas de cultura, as placas destinadas à avaliação da proliferação e CIC foram

tratadas com Brefeldina A (Sigma Co.) na concentração de uso (200 μg/mL). Quinze minutos

antes do término do período de cultura foi acrescentado EDTA (concentração final 2 mM) em

cada poço. Após o tempo de incubação, as placas foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5

minutos a 4ºC para a retirada do CMBlast. O sobrenadante foi descartado e as células

ressuspendidas com auxílio de um agitador do tipo vortex. Posteriormente, foram adicionados

200 µL de PBS 1X e a placa centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi

descartado e foram adicionados 100 µL de PBS 1X contendo o marcador de viabilidade celular,

Fixable Viability Stain 780 (FVS780), em cada poço, seguido de incubação por 15 minutos. Após

esse período de incubação, foram adicionados 100 µL de tampão PBS-Wash e, posteriormente,

todo o conteúdo foi centrifugado a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. Subsequentemente, o

sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em vortex. A suspensão celular foi

marcada com painéis contendo combinações distintas de anticorpos para a avaliação da

proliferação celular/CIC.

O painel para a avaliação da proliferação/CIC foi composto por anticorpos contra

moléculas de superfície e citocinas de camundongo, assim foi usado o seguinte painel de

anticorpos: anti-CD3 BV650, anti-CD4 BV605, anti-CD8 BV786, anti-IFN-γ ALEXA 700, anti-

TNF-α PE-CY7 e anti-IL-2 PE conforme descrito no Quadro 2. Foram utilizados controles de

isotipo e todos os anticorpos foram diluídos em solução tampão PBS contendo proteínas inertes.

A incubação com 50 µL do coquetel de anticorpos de superfície foi realizada por 30 minutos, ao

abrigo de luz. A seguir, as células foram fixadas adicionando-se 150 µL de solução de lise/poço

(citrato de sódio, formaldeído, dietilenoglicol e heparina). Após a fixação, as células foram

permeabilizadas com 200 µL de PBS-P (solução tampão de PBS-Wash acrescido de 5% de

saponina) por 10 minutos. A placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado, a placa agitada em vortex, e as células foram incubadas com os

anticorpos de CIC por 30 minutos. Após esse período, foram adicionados 200 µL de PBS-Wash e

a placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as

células ressuspendidas em 300 µL de solução fixadora - MFF (paraformaldeído 10 g/L,

cacodilato de sódio 1%, cloreto de sódio 6,67 g/L em pH 7,2). Após esse procedimento, as

células foram transferidas para tubos de 500 µL poliestireno (Sarstedt®). Os eventos foram

adquiridos no citômetro LSR Fortessa (BD Biosciences) no laboratório multiusuário de


39

citometria de fluxo do Núcleo de Pesquisas em Ciências biológicas NUPEB/UFOP. Foram

usadas Beads (CompBeads) específicas para a compensação do citômetro. Para análise dos dados

foi o empregado o programa FlowJo®.

Quadro 2: Lista de marcadores utilizados na avaliação de citocinas intracitoplasmáticas.

Marcador* Fluorocromo Clone Diluição Função

CD3 BV650 145.2C11 1:100 Define população de

linfócitos T

CD4 BV605 RM4-5 1:200 Define subpopulação de

linfócitos T auxiliares

CD8 BV786 53-6.7 1:400 Define subpopulação de

linfócitos T citotóxicos

IFN-γ AF700 XMG1.2 1:50 Citocina Th1

TNF-α PE-Cy7 LG.3A10 1:200 Citocina Th1

IL-2 PE JES6-5H4 1:100 Citocinas que induz

proliferação celular

* Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela empresa BD Biosciences.

6.2.5 Fenotipagem das células para avaliação da proliferação e CIC

A caracterização fenotípica dos linfócitos T de memória foi realizada ao término do

período de 120 horas do protocolo descrito anteriormente. Após o tempo de 5 dias, as placas

contendo os esplenócitos foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos a 4ºC para a retirada

do CMBlast. O sobrenadante foi coletado e as células ressuspendidas em vortex. Posteriormente,

foram adicionados 200 µL de PBS 1X e a placa centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos. O

sobrenadante foi descartado e em cada poço foram adicionados 100 µL de PBS 1X contendo o

marcador de viabilidade celular, Fixable Viability Stain 780 (FVS780, seguido de incubação por

15 minutos. Após esse período de incubação, foram adicionados 100 µL de tampão PBS-Wash

em cada e, posteriormente, a placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC.

Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em vortex. A

suspensão celular foi marcada com painéis contendo combinações distintas de anticorpos para a

avaliação de células T de memória. O painel multifuncional foi composto por anticorpos de

superfície contra moléculas de células T de camundongo: anti-CD3 FITC, anti-CD4 BV605, anti-

CD8 PERCP-Cy 5.5, anti-CD44 APC, anti-CD62L ALEXA 700, anti-CD127 BV510, anti-

CD45RA BV711 e anti-CD197 BV421. No Quadro 3 estão descritos os anticorpos


40

detalhadamente. Todos os anticorpos foram diluídos em solução tampão PBS 1X acrescido de

proteínas inertes.

A incubação com 50 µL do coquetel de anticorpos de superfície foi realizada por 30

minutos, ao abrigo de luz. Após a incubação, as células foram tratadas com 150 µL de solução de

lise/poço por 10 minutos. A placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado, a placa agitada em vortex e as células ressuspendidas em 200 µL de

PBS-Wash. A placa foi novamente centrifugada a 1.500 rpm por 5 minutos a 4ºC, o sobrenadante

descartado e as células ressuspendidas em vortex, cuidadosamente. O sobrenadante foi descartado

e as células ressuspendidas em 300 µL de solução fixadora - MFF (paraformaldeído 10 g/L,

cacodilato de sódio 1%, cloreto de sódio 6,67 g/L em pH 7,2). Após esse procedimento, as

células foram transferidas para tubos de 500 µL poliestireno (Sarstedt®). Os eventos foram

adquiridos no citômetro LSR Fortessa (BD Pharmingen). Foram usadas Beads (CompBeads)

específicas para a compensação do citômetro. Para análise dos dados foi o utilizado o programa

FlowJo®.

Quadro 3: Lista de anticorpos utilizados para fenotipagem de células T nos experimentos funcionais.

Marcador* Fluorocromo Clone Diluição Função

CD3 FITC 17A2 1:200 Define população de

linfócitos T

CD4 BV605 RM4-5 1:200 Define subpopulação de

linfócitos T auxiliares

CD8 PerCP Cy5.5 53-6.7 1:200 Define subpopulação de

linfócitos T citotóxicos

CD44 APC IM7 1:100 Define células de memória.

CD45RA BV711 14.8 Define células naïve e de

memória

CD62L AF 700 MEL-14 1:400

Ligante de L-selectina.

Distingue células T naïve,

efetoras e de memória

CD127 BV510 SB/199 1:400 Receptor de IL-7

CD197 BV421 4B12 1:100 Receptor de CCR7

* Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela empresa BD Biosciences.


41

6.2.6 Quantificação da carga parasitária no fígado e baço por PCR em tempo real (qPCR)

A detecção e a quantificação do gene DNA polimerase (gene de cópia única de L.

infantum) foi utilizada para a avaliação da eficácia das vacinas. Para isso, foi empregada a técnica

de PCR em tempo real (qPCR) que será descrita nos tópicos subsequentes.

6.2.7 Extração de DNA dos fragmentos de fígado e baço

Após a necropsia, os tecidos foram cortados, com auxílio de lâmina de bisturi, pesados,

obtendo-se fragmentos de cerca de 15 a 30 mg. Essas amostras foram transferidas para tubos tipo

eppendorf previamente identificados e armazenadas a -80°C até o procedimento de extração. O

baço e o fígado foram macerados com esferas metálicas no Tissuelyzer (Qiagen Inc., EUA). Em

seguida, para a extração de DNA das amostras, foi utilizado o kit Wizard®

Genomic DNA

Purification (Promega, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, após a

maceração dos tecidos com o tampão de lise nuclear, foram adicionados 3 μL de RNAse e as

amostras foram incubadas por 30 minutos a 37ºC. Após essa etapa, foram adicionados a cada

tubo 200 μL de solução de precipitação proteica incubando as amostras no freezer por 5 minutos,

centrifugando depois a 14.000 x g por 4 minutos. O sobrenadante foi coletado e foram

adicionados 600 μL de isopropanol para a precipitação do DNA. Após a centrifugação a 14.000 x

g por 1 minuto, descartou-se o sobrenadante. O pellet foi ressuspendido em 600 μL de etanol

70% e os tubos foram centrifugados por 1 minuto a 14.000 x g. Após descartar o sobrenadante, o

pellet contendo o DNA foi ressuspendido em 100 μL da solução de reidratação e os tubos

mantidos em temperatura ambiente por 16 horas. Após a hidratação, 2 mL das amostras extraídas

foram utilizados para estimar a concentração e o grau de pureza do DNA. Esses parâmetros

foram avaliados pelas razões da absorbância de 260/280 nm no espectrofotômetro (NanoDrop

2000, Thermo Scientific, EUA).

6.2.8 Extração do DNA do parasito para construção da curva padrão e posterior detecção

do DNA do parasito nos tecidos

A extração do DNA genômico dos parasitos foi realizada pelo método CTAB, de acordo

com o procedimento a seguir: 1 x 108 parasitos (cepa MCAN/BR/2008/OP46) estocados em

tubos de 1,5 mL (Eppendorf, Eppendorf AG, Alemanha) foram retirados do freezer -80ºC. Após

o descongelamento, os parasitos foram ressuspendidos em 500 μL de solução de lise (SDS 1%, 5


42

mM EDTA, 400 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) e incubados por 1 hora em banho seco a

37ºC. Pela parede do tubo, foram adicionados 20 µL de Proteinase K (20 mg/mL, Sigma Co.),

seguido de homogeneização e incubação em banho seco a 55ºC por 16 horas. Após esse período

foram adicionados 100 μL de NaCl 5M e o tubo foi mantido por 10 minutos à 65ºC, adicionando-

se, em seguida, 50 μL de solução CTAB 10% (v/v). As amostras foram mantidas a 65ºC por 20

minutos e posteriormente foram adicionados 400 μL de clorofórmio (Sigma Co.), sob agitação

em vortex e subsequente centrifugação a 1.2000 x g em microcentrífuga (Eppendorf, Eppendorf

AG, Alemanha) por 10 minutos. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e adicionados

400 μL de isopropanol (Merck, Darmstad, Alemanha), seguido de incubação por cerca de 1 hora

no freezer. Após a precipitação do DNA, o tubo foi centrifugado novamente por 10 minutos a

12.000 x g descartando-se o sobrenadante. Em seguida, foi efetuada a lavagem do pellet com

etanol 70% (Merck, Darmstad, Alemanha) gelado e o tubo homogeneizado suavemente por

inversão do tubo, seguido de centrifugação por 5 minutos a 12.000 x g, e posterior descarte do

sobrenadante. O precipitado remanescente foi homogeneizado em 100 μL de água ultrapura

autoclavada para hidratação do DNA. Após um período de 16 horas, 2 μL foram utilizados para

estimar a concentração de DNA e o grau de pureza. Esses parâmetros foram avaliados pelas

razões das absorbâncias de 230/280 nm e 260/280 nm no espectrofotômetro (NanoDrop2000,

Thermo Scientific, EUA). Posteriormente, foram feitas diluições do DNA do parasito de forma

seriada (10x), com obtenção de sete pontos na curva variando de 106 a 1 parasito. Em todas as

placas foram colocadas alíquotas da curva padrão em triplicata.

6.2.9 Quantificação da carga parasitária

As reações de qPCR foram realizadas em placas de 96 poços - MicroAmp®

Optical 96 -

Well Reaction Plate with Barcode (Applied Biosystems by Life Technologies, EUA), cobertas

com adesivos ópticos- Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems by Life Technologies,

EUA) e processadas em termociclador ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied

Biosystems, EUA). Para a análise dos resultados foram consideradas as reações com eficiência

entre 90 - 110% e curva padrão com valores satisfatórios de coeficiente de linearidade (r2 = 0,95-

0,999) (Figura 4).

Os controles positivos de cada placa foram as amostras diluídas de L. infantum utilizadas

na curva padrão. Como controle negativo foi usado água livre de nucleases, ao invés de DNA. As


43

reações foram realizadas utilizando TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems,

EUA); DNA (100 ng); iniciadores (1μM), 0,25 μM de TaqMan Probe (VIC 5’ AGG AAA CCT

GTG GAG CC 3’ MGB NFQ) e água livre de nucleases em quantidade suficiente para o volume

final de 10 μL por poço. Para detecção e quantificação dos parasitos, foi utilizado o par de

iniciadores diretos que amplificam o gene de DNA polimerase de L. infantum: 5′ TGT CGC TTG

CAG ACC AGA TG 3′ e reverso: 5′ GCA TCG CAG GTG TGA GCA C 3’, que amplificam um

fragmento de 90 pb (acesso no GenBank: AF009147). Para a verificação da integridade do DNA

foi utilizado o gene constitutivo do fator alfa de necrose tumoral murino, o TNF-α. Assim, foi

utilizado o par de iniciadores: TNF-5241 5’ TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA 3’ e TNF-

5411 5’ CAGCA AGCATCTATGCACTTAGACCCC 3’ (Cummings & Tarleton, 2003), os

quais amplificam um produto de 170 pb. Foram consideradas íntegras as amostras que tiveram

amplificação na curva de dissociação (temperatura de melting) específica para o gene de TNF-α e

uma pequena variação do Ct.

A reação de cada amostra foi realizada em duplicata, nas seguintes condições: uma

incubação inicial a 50ºC por 2 minutos e desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguida de

40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15 segundos e anelamento e extensão dos iniciadores a 60ºC

por 1 minuto.

Para quantificar o número de moléculas de DNA de L. infantum nas amostras,

inicialmente foi determinado para cada poço o número de ciclos em que a fluorescência cruzou

uma linha limiar arbitrária, denominada threshold (Ct), calculada pelo programa 7500 Software

v.2.0.1 for 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems, EUA). A

quantidade de cópias de DNA em cada amostra foi determinada a partir de uma regressão linear

usando os valores do Ct das amostras utilizadas na curva padrão, gerada com quantidades

conhecidas das diluições prévias das massas de promastigotas de L. infantum (cepa

MCAN/BR/2008/OP46) da curva padrão. Os resultados foram expressos pelo número de

amastigotas por tecido.


44

Figura 4: Exemplo da curva padrão referente ao gene da DNA polimerase de L. infantuminfantum em

amostras de baço de camundongos Balb/c. No eixo estão demonstrados os valores de Log da

concentração de parasitos (106 a 10

0) e no eixo, os valores de Ct correspondentes a cada diluição.

Abaixo do gráfico estão representados: o alvo (target), DNA polimerase; o valor do slope (-3,32); o

coeficiente de linearidade (R2 =0,989); e a eficiência (99,9%).

6.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prisma 6.0

(Prism Software, Irvine, CA, USA). Para a confirmação da normalidade dos dados foi utilizado o

teste Kolmogorov-Smirnoff. Posteriormente foi realizada a análise pelo teste de Kruskal Wallis

seguido do teste de Dunn para determinar as diferenças específicas entre os grupos em relação ao

infiltrado celular e níveis de citocinas na pele. Em todas as análises estatísticas as diferenças

foram consideradas significativas quando o valor de p < 0,05.

45

7. Resultados

MATHIAS, F. A. S. Resultados

46

O tópico de resultados desta tese será apresentado em duas partes, onde na primeira

encontram-se os resultados obtidos nas avaliações realizadas na etapa 1 em que realizamos as

cinéticas dos diferentes adjuvantes, e suas associações em camundongos Balb/c. Posteriormente

serão apresentados os resultados obtidos na segunda etapa desta tese, onde foram formuladas

diferentes vacinas com antígeno bruto de L. braziliensis e as associações de adjuvantes que

apresentaram as melhores performance da etapa 1. Além disso, na etapa 2 foram avaliadas

também: a imunogenicidade, indução de memória imunológica, alterações histológicas no fígado

e a eficácia das vacinas em camundongos através da redução da carga parasitária hepática e

esplênica após o desafio experimental intravenoso com promastigotas de L. infantum.

7.1. RESULTADOS OBTIDOS NA ETAPA 1

Etapa 1- Seleção do melhor sistema de associação de Adjuvantes

Os resultados apresentados neste bloco são referentes a primeira etapa desta tese que

abordou a padronização e os estudos de avaliação da resposta imune inata dos diferentes sistemas

de associação de adjuvantes propostos.

7.1.1 Infiltrado inflamatório na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes

separados (SAP, MPL, R-848), e com suas respectivas associações nas diferentes doses

testadas

Devido à capacidade dos adjuvantes de estarem relacionados diretamente com as células

da imunidade inata, decidimos avaliar o impacto gerado por eles após a sensibilização. Para tal,

foi avaliado o infiltrado inflamatório na pele dos animais que receberam os adjuvantes

separadamente, bem como os diferentes sistemas de associação nas doses de 25, 33 e 50% da

dose original preconizada.

Dessa maneira, ao avaliarmos o recrutamento celular, observamos que o adjuvante MPL

na sua concentração padrão foi o único adjuvante que apresentou aumento significativo (p <

0,05) no recrutamento celular em comparação ao grupo controle e ao adjuvante R-848, como

demonstrado na figura 5.

Quando avaliamos os sistemas separadamente, observamos que no sistema SM, a

adjuvante MPL, utilizado separadamente, também apresentou maior recrutamento celular (p <

0,05) quando comparado aos sistemas nas doses de 25% e 33%. Ainda nesse sistema, a dose de


47

50% apresentou um aumento no recrutamento celular quando comparada a dose de 25%. Já no

sistema MR observamos que o adjuvante MPL também demonstrou aumento significativo (p <

0,05) no processo inflamatório quando comparado a associação na dose de 33%. Por fim, o

sistema de tripla associação demonstrou um aumento do infiltrado inflamatório (p < 0,05) do

adjuvante MPL na dose padrão quando comparado com as doses reduzidas de 25% e 33% da

associação.

Figura 5: Quantificação do recrutamento celular na pele de camundongos Balb/c sensibilizados com os adjuvantes

sozinhos ou com sistemas de associação de adjuvantes. Os valores foram expressos como média ± desvio padrão de

6 animais por grupo. As linhas conectoras representam diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos avaliados.

CS: Controle Salina; SAP: Saponina; MPL: Monofosforil Lipídio A; R-848: Resiquimod; “25%”, “33%” e “50%”:

sistema de associação de adjuvantes com dose 25%, 33% e 50% da dose total de cada adjuvante, respectivamente.


48

Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele de camundongos

Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de associação de adjuvantes: grupo Controle Salina

(A), Saponina (B), Resiquimod (C), Monofosforil Lipídio A (D), SM25 (E), SM33 (I), SM50 (M), SR25 (F), SR33

(J), SR50 (N), MR25 (G), MR33 (K), MR50 (O), SMR25 (H), SMR33 (L), SMR50 (P) após 48h de sensibilização.

Hematoxilina/Eosina. Barra=50μm.

Após quantificar o infiltrado inflamatório foi realizada a contagem diferencial em valores

percentuais, a fim de observar quais células estavam sendo recrutadas para o local do inóculo.

Diferenciamos essas células em três tipos principais, sendo eles: linfócitos, macrófagos e

neutrófilos segmentados.

SAP R-848 MPLCSC

ont

role

A B C D

25%

SAP + MPL SAP + R-848 MPL + R-848 SAP + MPL + R-

848HE F G

33%

LI J K

Hematoxilina-Eosina. Barra=50μm.

50%

PM N O


49

Com relação à população de neutrófilos segmentados, dentre os adjuvantes isoladamente,

o adjuvante saponina apresentou redução do número percentual de neutrófilos segmentados (p <

0,05) em relação ao grupo controle salina. O sistema MR25 apresentou uma redução (p < 0,05)

no valor percentual dessa população em relação aos grupos CS, MPL e R-848.

Em relação a população de linfócitos apenas o sistema SR33 apresentou redução no

percentual (p < 0,05) dessas células em relação aos grupos SAP, R-848 e SR25.

Já para a população de macrófagos, o sistema SM50 demonstrou um aumento

significativo (p < 0,05) no percentual de macrófagos quando comparado aos grupos controle

salina, saponina e os sistemas nas doses inferiores de 25 e 33%. O segundo sistema de associação

avaliado foi o sistema SR, onde foi observado um aumento no valor percentual de macrófagos (p

< 0,05) nas doses de 33 e 50% quando comparados tanto com o grupo controle quanto com os

adjuvantes separadamente que compõe o sistema. O último sistema de duplas associações

avaliado foi o sistema MR, que apresentou um aumento (p < 0,05) no valor percentual de

macrófagos na dose de 25% quando comparado aos grupos CS, MPL e R-848. Além disso, as

doses de 33% e 50% apresentaram diferença (p < 0,05) no percentual de macrófagos em relação

aos grupos CS e R-848. Por fim, o sistema de tripla associação apresentou em todas as doses

(25%, 33% e 50%) aumento (p < 0,05) no valor percentual de macrófagos quando comparados

aos grupos CS, SAP e R-848 (Figura 7).


50

Figura 7: Gráficos de pizza com os valores percentuais da contagem diferencial do infiltrado celular na pele de

camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas de associação de adjuvantes: grupo

Controle Salina, Saponina, Resiquimod, Monofoforil Lipídio A, SM25, SM33, SM50, SR25, SR33, SR50, MR25,

MR33, MR50, SMR25, SMR33, SMR50 após 48h de sensibilização.

Linfócitos Macrófagos Neutrófilos segmentados (n = 12 animais por grupo).

7.1.2 Produção de quimiocinas na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes


testadas.

Neste trabalho, também foi investigada a participação de quimiocinas, componentes

importantes na formação do infiltrado inflamatório no local da sensibilização, gerados pelos

diferentes sistemas de adjuvantes vacinais. Dessa forma, decidiu-se avaliar as quimiocinas

relacionadas com o recrutamento das principais células da imunidade inata (CCL2, CCL3, CCL4,

CCL5 e CXCL1).

De forma geral, os adjuvantes MPL e R-848 apresentaram aumento significativo quando

comparados ao grupo controle em todas as quimiocinas. Já o adjuvante SAP, com exceção da

quimiocina CCL5 na qual não se observou diferença em relação ao grupo controle salina,


51

também foi observado aumento significativo (p < 0,05) na produção das quimiocinas em relação

ao grupo CS.

Para a quimiocina CCL2, no sistema SM foi observado aumento (p < 0,05) de sua

produção nos grupos que receberam as doses de 33 e 50% quando comparados com o grupo

controle. Já no sistema SR todas as doses (25, 33 e 50%) apresentaram aumento significativo (p <

0,05) em relação ao grupo controle, bem como a dose de 50% quando comparada ao grupo R-

848. O sistema MR teve aumento (p < 0,05) dessa quimiocina no grupo com a dose de 33% e por

fim, o sistema de tripla associação SMR apresentou aumento (p < 0,05) de CCL2 nos grupos que

receberam as doses de 25 e 50% quando comparados ao grupo Controle Salina (Figura 8). Vale

ressaltar, que com exceção da dose de 50% do sistema SR, que apresentou aumento (p < 0,05) em

relação ao adjuvante Resiquimod separadamente, em nenhuma dose dos sistemas foi observado

alteração significativa na produção dessa quiomiocina em relação aos adjuvantes inoculados

isoladamente.

As quimiocinas CCL3, CCL4 e CCL5 têm como principal função imunológica a migração

de macrófagos, células NK e a interação de células dendríticas (DCs) com linfócitos T. Para a

primeira quimiocina, o sistema SM apresentou aumento (p < 0,05) nas três doses avaliadas em

relação ao grupo controle salina. Além disso, os sistemas MR e SMR apresentaram diferenças

significativas (p < 0,05) nas doses de 50% e 25%, respectivamente, em relação ao grupo controle.

A quimicina CCL4 também demonstrou aumento (p < 0,05) em todas as doses no sistema

SM quando comparadas ao grupo controle salina. O sistema SR teve aumento (p < 0,05) desta

quimiocina nas doses de 33 e 50% quando comparados ao controle, enquanto que os sistemas

MR e SMR também apresentaram diferenças (p < 0,05) em relação ao controle nas doses de 50%

e 25, respectivamente.

Por fim, para a quimiocina CCL5, todas as doses de todos os sistemas, com exceção da

dose de 25% no sistema MR, apresentaram aumento (p < 0,05) em relação ao grupo controle.

Além disso, a dose de 50% do sistema SM também apresentou aumento (p < 0,05) quando

comparada ao grupo que recebeu o adjuvante saponina isoladamente (Figura 8).

A última quimiocina avaliada, CXCL1, está correlacionada ao tráfego de neutrófilos. Para

esta quimiocina, observamos que o sistema SM, nas doses de 33 e 50%, apresentou aumento (p <

0,05) na produção em relação ao grupo controle, enquanto que os sistemas SR e SMR


52

apresentaram essa diferença (p < 0,05) apenas na dose de 50% dos respectivos sistemas quando

comparados ao grupo controle (Figura 8).


53

Figura 8: Quantificação das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL1 na pele de camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e

sistemas de associação de adjuvantes. Os valores foram expressos como média ± desvio padrão de 12 animais por grupo. As linhas conectoras representam

diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos avaliados. CS: Controle Salina; SAP: Saponina; MPL: Monofosforil Lipídio A; R-848: Resiquimod; “25%”,

“33%” e “50%”: sistema de associação de adjuvantes nas doses de 25%, 33% e 50% da dose total de cada adjuvante, respectivamente.


54

7.1.3 Produção de citocinas na pele dos camundongos sensibilizados com os adjuvantes


testadas.

Devido à capacidade de adjuvantes ativarem a resposta imune inata, com consequente

produção de citocinas, decidiu-se avaliar o impacto gerado por eles em algumas destas citocinas

(IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-10) na pele de camundongos Balb/c após 48 horas da

sensibilização em uma única dose.

Com relação às citocinas do tipo 1, para a IL-2, não foi possível observar diferenças

significativas (p < 0,05) em nenhum dos grupos experimentais. Em relação à citocina TNF-α o

sistema SM apresentou aumento significativo (p < 0,05) em relação ao grupo Controle Salina em

todas as doses avaliadas. Todos os outros sistemas avaliados apresentaram elevação (p < 0,05) na

produção dessa citocina em relação controle salina na dose de 50%. Além disso, o sistema SR na

dose de 50% apresentou diferença (p < 0,05) também em relação aos animais sensibilizados com

a dose de 25% (Figura 9).

Duas outras citocinas do tipo 1 avaliadas foram TNF-α e IFN-γ. Todos adjuvantes

isoladamente na dose total de 100% apresentaram aumento (p < 0,05) dos níveis de TNF-α e

IFN-γ quando comparados ao grupo controle salina. Ao avaliar os sistemas de associação, foi

observado que o sistema SM na dose de 25% apresentou aumento (p < 0,05) desta em relação ao

grupo controle salina, enquanto que o sistema SR na dose de 33% apresentou diferença (p < 0,05)

em relação ao grupo controle. Por fim, o sistema SMR na dose de 50% também apresentou

aumento (p < 0,05) de IFN-γ em relação ao grupo controle salina.

Em relação a IL-4, principal citocina do tipo 2, não foi observado produção significativa

(p < 0,05) elevada dessa citocina em nenhum dos grupos avaliados, com exceção para o sistema

de tripla associação na dose de 33% quando comparado com os demais grupos (Figura 9).

A citocina imunomoduladora IL-10 também foi avaliada. Observou-se sua produção

elevada (p < 0,05) apenas nos grupos que receberam o adjuvante R-848 e o sistema de tripla

associação na dose de 33% (Figura 9).


55

Figura 9: Quantificação das citocinas IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 na pele de camundongos Balb/c sensibilizados com os diferentes adjuvantes e sistemas

de associação de adjuvantes. Os valores foram expressos como média ± desvio padrão de 12 animais por grupo. As linhas conectoras representam diferença

significativa (p < 0,05) entre os grupos avaliados. CS: Controle Salina; SAP: Saponina; MPL: Monofosforil Lipídio A; R-848: Resiquimod; “25%”, “33%” e

“50%”: sistema de associação de adjuvantes nas doses de 25%, 33% e 50% da dose total de cada adjuvante, respectivamente.


56

7.1.4 Considerações gerais dos resultados obtidos na Etapa 1

Após finalizar a análise dos resultados da primeira etapa foi possível escolher dois

sistemas de associação de adjuvantes para a próxima etapa, os quais irão compor juntamente com

o antígeno de Leishmania braziliensis duas propostas de vacinas a serem testadas frente ao

desafio experimental em modelo murino.

Desta forma, os dois sistemas escolhidos foram: o sistema SM50, por apresentar aumento

do infiltrado inflamatório, com aumento do percentual da população de macrófagos, aumento das

quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL1 e produção da citocina TNF-α; e o segundo

sistema foi o SMR50 que também apresentou aumento no percentual de macrófagos, aumento

das quimiocinas CCL2, CCL5 e CXCL1 e produção das citocinas TNF-α e IFN-γ (Figura 9).


57

Figura 10: Figura ilustrativa sintetizando os principais resultados que levaram a escolha dos sistemas SM50 e

SMR50 para serem utilizados na próxima etapa do trabalho.


58

7.2. RESULTADOS OBTIDOS NA ETAPA 2

Etapa 2- Avaliação da Eficácia Vacinal em Modelo Experimental Murino (Balb/c)

Os resultados apresentados neste bloco são referentes a segunda etapa da tese e remetem a

avaliação ao desempenho dos sistemas de adjuvantes SM50 e SMR50 associados ao antígeno de

LB em relação a resposta imune (citocinas intracitoplasmáticas e células de memória), bem como

a redução da carga parasitária após a imunização seguida por desafio experimental de

camundongos Balb/c.

7.2.1 Avaliação dos índices de proliferação celular e produção de citocinas

intracitoplasmáticas por células T CD4+ e CD8

+ in vitro

O primeiro resultado obtido na segunda etapa diz respeito a proliferação celular, que foi

medida através do marcador CFSE e a produção das citocinas intracitoplasmáticas (TNF-α, IFN-

γ e IL-2) mensuradas após cinco dias de cultivo, através do índice da razão da cultura de células

estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania sobre a cultura controle.

Os animais que foram imunizados com a vacina LBSMR50 apresentaram uma maior

proliferação celular de linfócitos T CD8+ (p < 0,05) quando comparados com os grupos controle

salina e os animais que receberam apenas o sistema de tripla associação (SMR50) isoladamente.

Além disso, esse mesmo grupo demonstrou aumento significativo (p < 0,05) na produção de

TNF-α por linfócitos T CD8+ (Figura 11).

De maneira diferente, com relação aos linfócitos T CD4+, não foi possível observar

diferenças significativas (p < 0,05) entre os grupos com relação à proliferação celular e apenas a

citocina TNF-α apresentou aumento (p < 0,05) no grupo de animais imunizados com a vacina

LBSMR50 em relação ao grupo controle salina (Figura 11).


59

Figura 11: Gráficos de índice (CC/CE) de proliferação celular e produção de citocinas intracitoplasmáticas (IL-2,

TNF-α, IFN-γ) em células T CD4+ e CD8

+ após cinco dias de cultivo nos diferentes grupos experimentais: Controle

Salina (CS), antígeno de Leishmania braziliensis (LB), Sap + MPL 50% (SM50), Sap + MPL + R-848 50%

(SMR50), LB + Sap + MPL 50% (LBSM50), LB + Sap + MPL + R-848 50% (LBSMR50). Os valores foram

expressos como média ± desvio padrão de 10 animais por grupo. As letras “a” e “d” representam diferenças em

relação ao grupo CS e ao grupo SMR50, respectivamente.


60

7.2.2. Avaliação fenotípica de células T CD4+ e T CD8

+ de memória central e efetora in vitro

Outro objetivo dessa etapa foi avaliar in vitro após cinco dias de cultivo a diferenciação

das células T em células de memória central e efetora, como um dos eventos importantes para

obtenção do sucesso vacinal. Os grupos experimentais foram os mesmos avaliados na abordagem

anterior.

Em relação aos linfócitos T CD4+, não se observou diferenças significativas (p < 0,05)

entre os grupos experimentais tanto para o fenótipo de células de memória central quanto para o

de efetoras.

Já para linfócitos T CD8+, houve uma redução significativa (p < 0,05) do valor percentual

de células de memória central no grupo LBSM50 quando comparado ao grupo SMR50. Além

disso, é possível observar um aumento no percentual (p < 0,05) de células expressam o fenótipo

de memória efetora nos animais imunizados com a vacina LBSMR50 quando comparado aos

animais do grupo que foram vacinados apenas com o antígeno LB (Figura 12).


61

Figura 12: Análise enotípica do percentual de células de memória central

(CD127+CD44

+CD45RA

lowCD62L

+CD197


-CD44

+CD127

high CD197

low) de células T

CD4+ e CD8

+ após cinco dias de cultivo nos diferentes grupos: Controle salina (CS), antígeno de Leishmania

braziliensis (LB), Sap + MPL 50% (SM50), Sap + MPL + R-848 50% (SMR50), LB + Sap + MPL 50% (LBSM50),

LB + Sap + MPL + R-848 50% (LBSMR50). Os valores foram expressos como média ± desvio padrão de 10

animais por grupo. As letras “b” e “d” representam diferenças em relação aos grupos LB e SMR50, respectivamente.

7.2.3. Quantificação por PCR em tempo real da carga parasitária no baço e no fígado de

camundongos vacinados após o desafio experimental com promastigotas de Leishmania

infantum

A última abordagem da segunda etapa foi quantificar a carga parasitária nos principais

órgãos afetados pela doença a fim de averiguar se as duas vacinas propostas neste trabalho

proporcionaram alguma proteção para esses animais.

No baço não foi possível observar diferenças entre os grupos experimentais. Por outro

lado, quando avaliamos a carga parasitária no compartimento esplênico importantes achados

foram observados. Os animais imunizados com as duas vacinas e o grupo de animais que

receberam o antígeno LB apresentaram redução significativa (p < 0,05) na carga parasitária

quando comparados com o grupo controle e o grupo SM50 (Figura 13).


62

Figura 13: Dosagem da carga parasitária em número de amastigotas por mg de tecido no baço e fígado nos

diferentes grupos: Controle Salina (CS), antígeno de Leishmania braziliensis (LB), Sap + MPL 50% (SM50), Sap +

MPL + R-848 50% (SMR50), LB + Sap + MPL 50% (LBSM50), LB + Sap + MPL + R-848 50% (LBSMR50). Os

valores foram expressos como média ± desvio padrão de 10 animais por grupo. As letras “a” e “c” representando

diferenças em relação aos grupos CS e SM50, respectivamente.

7.2.4 Considerações gerais dos resultados obtidos na Etapa 2

Após finalizar a análise dos resultados da segunda etapa foi possível observar que os dois

sistemas de associação de adjuvantes selecionados na etapa 1, juntamente com o antígeno de

Leishmania braziliensis, compuseram as duas propostas de vacinas que foram empregadas nos

testes da etapa 2 frente ao desafio experimental em modelo murino, demonstraram-se

promissores. O sistema LBSMR50 levou ao aumento na produção de TNF-α por células TCD4+,

entretanto sua principal ação foi sobre os linfócitos TCD8+, promovendo aumento da proliferação

celular, produção de TNF-α e formação de células de memória efetora. Todavia, ambas as

vacinas foram capazes de reduzir a carga parasitária no fígado.

Grupos

Nú

mer

o d

e am

asti

go

tas/

mg

Baço Fígado

CS

LB

SM

50

SM

R50

LB

SM

50

LB

SM

R50

0

1 0 0 0

2 0 0 0

CS

LB

SM

50

SM

R50

LB

SM

50

LB

SM

R50

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

a , ca , c

a , c

63

8. Discussão

64

Doenças infecciosas como malária, tuberculose, HIV, leishmanioses entre outras

representam um enorme problema para a saúde mundial, mostrando a necessidade de controle

dessas doenças e seus surtos. A leishmaniose foi eleita pela Organização Mundial de Saúde

(OMS) entre as principais doenças negligenciadas, emergentes e reemergentes não controladas,

principalmente devido a fatores como ampla diversidade e complexidade do parasito,

complexidade e gravidade da doença além do surgimento de cepas resistentes aos fármacos

utilizados, sem considerar que ainda não há vacinas para proteção da população humana e/ou

canina, sob área de risco de LVH e LVC (Hotez et al., 2004; Jain & Jain, 2015).

Uma das medidas de controle atuais baseia-se na quimioterapia, incluindo antimonial

pentavalente, miltefosina, paromomicina e anfotericina B, como drogas de primeira e/ou segunda

escolha para o tratamento, mas as desvantagens (toxicidade e efeitos colaterais além do elevado

custo) associadas ao seu consumo representam um sério problema na administração da

quimioterapia (Singh & Sundar, 2012). Nesse contexto, vários estudos reforçam que o emprego

de vacinas em campanhas governamentais de profilaxia seria uma importante ferramenta para o

controle da visceral humana (LVH) e leishmaniose visceral canina LVC (Aguiar-Soares et al.,

2014; Collin et al., 2009; Fernandes et al., 2008; Roatt et al., 2012), todavia, até o momento não

há nenhuma vacina disponível para ser utilizada em programas de controle e profilaxia contra a

leishmaniose visceral humana ou canina (Gillespie et al., 2016).

Até a presente data, vários antígenos vacinais já foram propostos como candidatos, mas

poucos são os estudos em relação aos adjuvantes que poderão ser utilizados para a composição

destas vacinas. Assim, a escolha de adjuvantes ou sistema de adjuvantes afim de melhorar e

ampliar a resposta imunogênica e o desempenho dos antígenos vacinais que são co-

administrados, estimulando a imunidade celular e humoral, mostra-se uma abordagem

fundamental no desenho das vacinas de última geração tanto para as leishmanioses como para

outra doenças (Singh & O’Hagan, 1999; Tritto et al., 2009).

Além da escolha do adjuvante, outras características como, a dosagem e a rota de

imunização também podem influenciar nos padrões de reconhecimento de epítopos bem como,

nos perfis de resposta imune inata e principalmente adquirida no âmbito dos compartimentos

celular e humoral (Hu, Yokoyama & Kitagawa, 1990). Nesse contexto, o perfil celular da pele

possui alta relevância em estudos de imunização vacinal, uma vez que esta pode atuar, além de

local de depósito do antígeno, como órgão imune. O tecido linfóide associado à pele contém

65

células especializadas capazes de aumentar a resposta imune como é o caso dos queratinócitos

que produzem imunomediadores como IL-1 e TNF-α hábeis para a ativação de linfócitos,

macrófagos e células dendríticas. O espaço intercelular no interstício da pele proporciona um

ambiente que favorece a ligação com o sistema linfático e vasos que terminam nos órgãos imunes

periféricos como os linfonodos e o baço (Kupper, 1990; Yokoyama et al., 1997; Puri et al., 2000).

Estas distintas subpopulações celulares que compõem a pele são ativadas pelos chamados

sinais de perigo e migram para os linfonodos drenantes onde interagem com linfócitos T e B,

resultando na indução de uma resposta imune adaptativa (Epaulard et al., 2014).

Dessa forma, esse trabalho avaliou inicialmente de forma descritiva e experimental

elementos que compõe a resposta imune na pele após a sensibilização com os adjuvantes

Saponina, Monofosforil Lipídio A e Resiquimod. Inicialmente, estes foram inoculados

isoladamente nas respectivas doses totais ou combinados em sistemas de duplas ou tripla

associação, com redução das doses de cada adjuvante que compõem o sistema em 25, 33 e 50 %

referente a dose total, através de uma única sensibilização pela via intradérmica em camundongos

Balb/c.

Nossos dados demonstraram que somente o adjuvante MPL em sua dose total foi capaz de

promover o aumento do recrutamento celular para o local de sensibilização 48 horas após o

inóculo. Estes achados corroboram com dados de trabalhos anteriores do grupo, no qual o

adjuvante MPL já promove um aumento do recrutamento celular no local do inóculo em 12 horas

e se mantém 24 e 48 horas após a sensibilização intradérmica (Vitoriano-Souza et al., 2012).

Com relação aos sistemas de adjuvantes, apesar de o sistema SM50 apresentar aumento no

número total de células em relação ao grupo SM25, não apresentou um aumento significativo no

número de células recrutadas na pele quando comparados ao grupo controle salina. Isso

provavelmente ocorreu devido ao fato de serem compostos de uma dose reduzida em relação aos

adjuvantes isoladamente, retardando o pico de recrutamento celular para mais de 48 horas após

sensibilização. Vale a pena ressaltar que nenhum sistema ou adjuvante isolado promoveu

ulcerações nos animais sensibilizados (dados não mostrados), fator essencial no licenciamento de

adjuvantes para vacinas humanas, onde os adjuvantes devem estimular a resposta imune

mantendo a segurança com o mínimo de efeitos colaterais (Garçon & Leo, 2010; Schijns, 2003).

Tão importante quanto o número de células recrutadas para o local de sensibilização é

saber qual tipo celular está compondo o infiltrado inflamatório. O repertório de células que

66

migram para compor o infiltrado inflamatório é um importante indicador diretamente relacionado

ao perfil das citocinas presentes nesse microambiente (Stewart, Holloway & Ibister, 1984). Além

disso, o número de células e a composição do infiltrado celular durante o estágio inicial após a

sensibilização influenciarão no direcionamento das futuras respostas e no desenvolvimento de

uma resposta imune adquirida (Teixeira et al., 2005).

Sendo assim, o aumento no percentual de macrófagos no local do inóculo após 48 horas

da sensibilização observado em todos os sistemas avaliados neste trabalho na dose de 50%

mostra a capacidade dos mesmos em moldar o perfil celular no local do inóculo, promovendo um

processo de transição do perfil celular, o que vai de encontro a outros trabalhos na literatura.

Brack e colaboradores (2004), em um estudo avaliando o efeito do Adjuvante Completo de

Freund (ACF) no processo inflamatório de camundongos também constataram que entre 48 e 96

horas houve um aumento da população de macrófagos no local do inóculo (Brack et al., 2004).

Monócitos e macrófagos desempenham papéis importantes na manutenção da saúde e

homeostasia do sistema imune. Eles têm um papel central na proteção do hospedeiro, eliminando

patógenos e modulam outras funções das células imunológicas através da produção de moléculas

reguladoras. Estas células se encarregam da vigilância imunológica, eliminação de bactérias,

remodelação e reparo de tecidos, além de remoção de detritos celulares e muito mais (Santoni et

al., 2018). Além disso, em nosso trabalho, observamos também a presença de outros tipos

celulares como neutrófilos e linfócitos. As células residentes e as células que chegam ao local do

inóculo tem papel importante na secreção de mediadores inflamatórios como quimiocinas e

citocinas (Turner et al., 2014; Su & Richmond, 2015). As células do infiltrado inflamatório

(neutrófilos, macrófagos, mastócitos e linfócitos) migram sequencialmente para o local de injúria

no tecido e funcionam como fonte de quimiocinas e citocinas que promovem inflamação e

crescimento/recuperação tecidual (Werner & Grose, 2003; Chang et al., 2018).

Na tentativa de elucidar melhor os mecanismos quimoatrativos que pudessem explicar a

migração diferencial de leucócitos, no presente estudo foram avaliadas as principais quimiocinas

responsáveis por esses mecanismos.

Quimiocinas são capazes de interagir com mais de um receptor, expressos

predominantemente nos leucócitos e as interações específicas entre quimiocinas e receptores são

os principais determinantes do tráfego leucocitário e localização dos subgrupos de leucócitos

dentro dos tecidos (Abbadie et al., 2003).

67

Todos os adjuvantes que compõem os sistemas testados são agonistas de receptores do

tipo Toll-Like (TLRs), potentes constituintes da resposta imune inata, responsáveis pela detecção

de antígenos e pelo aumento da inflamação (Golec et al., 2015). A ativação dos TLRs induz uma

cascata de sinalização que leva ao aumento da expressão de genes responsáveis pela produção e

liberação de quimiocinas, bem como recrutamento de células imunocompetentes, indução de

fagocitose e morte celular (Andrews et al., 2013). Está descrito na literatura que a produção de

quimiocinas como CCL2, CCL3 e CCL4 estão intrinsecamente dependentes de receptores do tipo

Toll-Like 2 conforme descrito recentemente (Ji et al., 2015).

Apesar dos adjuvantes isoladamente serem capazes de induzir a produção de quimiocinas,

observamos que em nosso estudo, os sistemas de associação de adjuvante utilizando doses

reduzidas, foram capazes de estimular a produção de quimiocinas importantes no estabelecimento

de uma resposta imune inicial. Dentre os sistemas, destaca-se o sistema SM50 pela sua

capacidade de induzir a produção de todas quimiocinas avaliadas neste estudo. A tripla

associação na dose de 50% (SMR50) também foi capaz de induzir a produção de importantes

quimiocinas relacionadas ao tráfego de neutrófilos (CXCL1), monócitos (CCL2) e macrófagos

(CCL5), respectivamente.

A produção de CXCL1 e o recrutamento de neutrófilos observados neste estudo

corroboram com trabalhos na literatura que destacam a importância dessas células na criação da

primeira linha de defesa contra invasão de microrganismos após alguma lesão ou injúria (Su &

Richmond, 2015).

Estudos realizados em camundongos Knockout tanto para CCL2, responsável pela

migração transendotelial de monócitos, quanto para seu receptor CCR2 demonstraram não

somente a redução drástica do recrutamento dessa população como a redução de processos

inflamatórios como um todo (Fife et al., 2000; Izikson et al., 2000). Já para a quimiocina CCL3,

além de ser responsável pelo recrutamento de macrófagos, ela também tem importante papel em

promover a proliferação celular (Li et al., 2015). Outro estudo avaliando o processo de cura após

uma injúria na pele de camundongos, demonstrou que a baixa produção de CCL3 e CCL4

exibiram um processo de cura mais lento devido a diminuição significativa do número de

macrófagos no local do inóculo (Kanno et al., 2017). O processo de cura na pele é feito através de

um processo inflamatório dinâmico envolvendo tanto a degradação tecidual quanto a formação de

um novo tecido (Eming, Krieg & Davidson, 2007). Durante a fase inflamatória os macrófagos

68

desempenham um papel fundamental reconhecendo e destruindo microorganismos invasores bem

como eliminando os restos celulares decorrentes do dano tecidual (Leibovich & Ross, 1975).

No presente estudo, a correlação positiva demonstrada entre o aumento percentual de

macrófagos e as quimiocinas responsáveis pelo seu recrutamento (CCL3, CCL4, CCL5), reforça

ainda mais que os sistemas testados são capazes de induzir as células locais e/ou recrutar outras

células imunes importantes para o estabelecimento de uma resposta imune efetora no local de

sensibilização.

O último componente da resposta imune na pele avaliado nessa primeira etapa foi a

capacidade das células produzirem citocinas que juntamente com as quimiocinas são importantes

reguladores moleculares do hospedeiro responsáveis pelo controle de diversos mecanismos

envolvidos no processo inflamatório (Turner et al., 2014). Sabe-se que o microambiente de

citocinas pode orientar uma resposta imune para a tolerância ou imunidade (Banchereau &

Steinman, 1998). Citocinas pró-inflamatórias, secretadas por células residentes e recrutadas,

estimulam diretamente as células que, em seguida, apresentam antígenos no linfonodo drenante

(Iwasaki & Medzhitov, 2004).

Nesse contexto, nosso trabalho demonstrou que a produção de citocinas na pele tanto para

os sistemas de associação quanto para os adjuvantes isolados apresentaram um quadro de

resposta composto principalmente por citocinas do tipo 1 (TNF-α e IFN-γ).

Após analisarmos os grupos separadamente observamos que o grupo SAP não

demonstrou uma produção significativa de IL-2 e completa ausência da produção de IL-4. Por

outro lado, observou-se uma produção significativa de TNF-α quando comparado ao grupo

controle. Em trabalhos anteriores do grupo, Vitoriano-Souza (2012) demonstrou que o adjuvante

SAP em camundongos Swiss foi capaz de induzir uma baixa produção de IL-2 e IL-4 na pele

após 12 até 48 horas. De forma semelhante nossos resultados para o adjuvante MPL também

divergem aos resultados encontrados por Vitoriano-Souza (2012) em relação a produção de IL-2,

todavia apresentam o mesmo comportamento em relação as citocinas TNF-α e IFN-γ. Estes

resultados podem ser explicados talvez por diferenças entre as linhagens de camundongos

utilizados em ambos os trabalhos (Swiss e Balb/c).

Por fim, o R-848 foi o único adjuvante sozinho capaz de induzir além de ambas citocinas

do tipo 1 (TNF-α e IFN-γ) a produção de IL-10. Peine e colaboradores (2014) demonstraram em

cultura de esplenócitos de camundongos infectados com Leishmania donovani e tratados com R-

69

848 lipossomal a capacidade desse adjuvante de estimular tanto a produção de IFN-γ como de IL-

10 concomitantemente (Peine et al., 2014). A produção de IL-10 após estímulo com R-848

também já foi relatada em outros trabalhos e acredita-se que sua principal fonte seja de células

dendríticas plasmocitóides (pDCs) (Lombardi et al., 2009).

Com relação aos sistemas de adjuvantes, o sistema SM destaca-se, pois foi capaz de

produzir TNF-α nas três doses avaliadas e IFN-γ na dose de 25% (SM25) em comparação ao

grupo controle salina. Além deste, outro sistema que apresentou produção de ambas citocinas foi

o sistema de tripla associação SMR50. Os demais sistemas nas diferentes doses apresentaram

apenas aumento de TNF-α ou de IFN-γ. De forma interessante o único sistema que apresentou

produção das citocinas IL-4 e IL-10 foi o sistema SMR33. Estes conjuntos de dados, confirmam

novamente que os sistemas de associação utilizando doses reduzidas de cada adjuvante podem

gerar a mesma resposta ou até mesmo uma melhor resposta frente aos adjuvantes quando

empregados isoladamente.

Estudos que avaliaram a sensibilização de camundongos com o sistema AS01 produzido

pela empresa Glaxosmithkline (GSK) que apresenta em sua constituição um sistema lipossomal

contendo o adjuvante MPL e a fração purificada de saponina QS-21, demonstraram uma ativação

rápida e passageira dos animais no local do inóculo. Estes estudos, mostraram ainda que esta

ativação rápida gerou ativação de células dendríticas, fundamentais para a apresentação de

antígenos para as células T, bem como o recrutamento de neutrófilos e monócitos para os

linfonodos drenantes (Didierlaurent et al., 2014). A vacina para malária RTS/S produzida pela

GSK que apresenta em sua constituição o sistema de adjuvantes AS01, demonstrou o potencial

desse sistema aumento na produção das citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-2 em camundongos (Coccia

et al., 2017). Estes resultados, se assemelham muito com os obtidos por nós com o sistema SM,

apesar de utilizarmos o adjuvante saponina bruto, ao invés de sua fração purificada e de não

utilizarmos lipossomos para compor o sistema, demonstrando assim um grande potencial desse

sistema em avaliações de futuras composições vacinais.

Nossos dados obtidos na primeira etapa vão de encontro a outros trabalhos que reforçam

que a utilização de sistemas baseados na combinação de adjuvantes promove uma potente

resposta imune capaz de auxiliar e propiciar o aumento do efeito protetor de uma possível vacina

(Mutwiri et al., 2011).

70

Diante do exposto, a segunda etapa deste trabalho visou avaliar a resposta imune

específica e eficácia vacinal dos dois sistemas de associação de adjuvantes mais promissores

obtidos da primeira etapa (SM50 e SMR50) quando associados ao antígeno bruto de Leishamania

brasiliensis (LB) em camundongos Balb/c. O objetivo dessa etapa foi ainda avaliar se essas duas

vacinas eram capazes de induzir nos animais submetidos a um protocolo vacinal e desafiados

com promastigotas de Leishmania infantum a formação de células responsivas capazes de

produzir citocinas e se proliferarem, além de induzir a formação de células de memória efetora e

central, levando a redução da carga parasitária em tecidos alvos da doença.

Nesse sentido, nós avaliamos primeiramente a população de células T CD4+, onde de

forma surpreendente não observamos proliferação celular em nenhum dos grupos avaliados. Por

outro lado, estas células apresentaram produção de TNF-α no grupo LBSMR50. Com relação a

subpopulação de linfócitos T CD8+, de forma interessante, observamos que os animais

imunizados com a vacina LBSMR50 apresentaram uma maior proliferação celular bem como

produção de TNF-α.

Trabalhos na literatura demonstram que TNF-α e IFN-γ atuam em sinergia aumentando

sua capacidade de mediar a morte de patógenos intracelulares, atuando principalmente através da

ativação de macrófagos, bem como o aumento da produção de óxido nítrico (Bogdan et al., 1990;

Liew, Li & Millott, 1990). Além disso, a IL-2 apesar de não ter papel importante no controle

direto do parasitismo, seu papel é fundamental na expansão clonal de linfócitos T CD4+ e T CD8

+

(Darrah et al., 2007).

Sabe-se que para infecções como a leishmaniose, a resposta celular desempenhada por

células T é fundamental na prevenção ou mesmo no retardamento da doença. Nossos dados

apontam que a vacina LBSMR50 atua induzindo uma resposta principalmente de células T CD8+

importantes para uma resposta T-efetora contra o parasito.

Em um estudo realizado por Tsagozis e colaboradores (2003), demonstraram que células

T CD8+ do baço de camundongos Balb/c apresentaram um aumento considerável na atividade

citotóxica contra células que expressavam antígenos de Leishmania, bem como o aumento da

expressão de mRNA para as citocinas (IFN-γ e TNF-α) pelas mesmas, caracterizando assim um

perfil de diferenciação do tipo 1 dessas células TCD8+

(Tsagozis, Karagouni & Dotsika, 2003).

71

Provavelmente, a baixa detecção das citocinas IL-2 e IFN-γ deve-se ao fato do protocolo

utilizado ser realizado após 5 dias de cultivo, onde as células que produziram estas citocinas

tenham liberado as mesmas para o sobrenadante.

Kaushal e colaboradores (2014) avaliando o papel de células TCD8+ em pacientes que

foram curados da leishmaniose visceral, observaram após 5 dias de cultivo uma alta produção

tanto de TNF-α quanto de INF-γ no sobrenadante quando comparados com indivíduos que nunca

tiveram contato com a doença ou os que a apresentavam. Além disso, detectou-se que os

pacientes curados apresentavam uma maior quantidade de células T CD8+ ativadas, com alta

produção de granzima B, importante indutor de morte celular por apoptose (Kaushal et al., 2014).

Esses trabalhos reforçam nossos resultados, demonstrando a importância desse tipo celular no

controle da infecção por parasitos do gênero Leishmania.

A abordagem seguinte foi avaliar se as duas vacinas propostas nesse trabalho eram

capazes de gerar células de memória central e efetora. Novamente, os animais que foram

vacinados com a vacina LBSMR50 apresentaram resultados promissores com aumento de

linfócitos T CD8+ de memória efetora, confirmando que que essa vacina leva a uma participação

fundamental dessa subpopulação celular na construção da resposta imune contra o antígeno de

Leishmania infantum.

Darrah e colaboradores (2007) demonstraram pela primeira vez, em um estudo vacinal

contra leishmaniose neste modelo, que o perfil de proteção está associado a indução de células T

de memória efetora do tipo 1, produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ (Darrah et al., 2007).

Trabalhos na literatura demonstram que linfócitos T CD8+ de memória proporcionam não

somente proteção contra reinfecções, mas também contribuem com o controle de infecções

prolongadas caso o patógeno não possa ser completamente eliminado (Böttcher et al., 2015).

Dentre as duas populações de linfócitos T CD8+ de memória (central e efetora), estudadas neste

trabalho, sabe-se que as células de memória efetora têm papel direto no efeito citotóxico em

tecidos periféricos (Sallusto et al., 1999). Sendo assim, podemos afirmar que o desenvolvimento

de células T CD8+ de memória efetora observada nos animais que foram imunizados pela vacina

LBSMR50 reforça o efeito protetor dessa vacina e consequentemente seu potencial como

candidata para testes futuros pré-clínicos em modelo hamster Mesocrisetus auratus e clínicos em

cães.

72

Por fim, a última avaliação desta etapa foi verificar se ambos candidatos vacinais eram

capazes de reduzir a carga parasitária no baço e no fígado dos animais imunizados e desafiados.

Nossos resultados demonstraram que no baço não houve diferenças na carga parasitária enquanto

que no fígado tanto o antígeno LB isolado quanto as duas vacinas testadas (LBSM50 e

LBSMR50) foram capazes de reduzir a carga neste órgão.

Um dos fatores que pode explicar a baixa carga parasitária encontrada no baço em todos

os grupos quando comparada ao fígado provavelmente deve-se ao fato da cinética dessa cepa

(MCAN/BR/2008/OP46) ser caracterizada por uma alta carga inicial no fígado já com duas

semanas após a infecção enquanto que baço permanece praticamente ausente ou muito baixa até a

quinta semana de infecção como demonstrado em trabalhos anteriores do grupo (Reis et al.,

2017). Além disso, o fato de não se observar diferenças na carga entre os grupos no baço pode ser

devido ao fato das células de memória efetora (TCD8+) que estão sendo produzidas não estarem

agindo no local de produção, mas sim sendo direcionadas para o fígado devido ao seu intenso

parasitismo.

Estudos na literatura já demonstraram que células T de memória efetora não expressam ou

expressam em menor quantidade o receptor de quimiocinas CCR7 (CCR7-), responsável pela

migração nos órgãos linfóides secundários. Essa subpopulação celular apresenta receptores de

migração que direcionam essas células para os tecidos com inflamação, onde desempenham

função efetora imediata (Sallusto et al., 1999). Sendo assim, o fígado por ter uma carga

parasitária maior, provavelmente deve estar desencadeando um processo inflamatório mais

intenso, que está recrutando essas células.

Considerando então o fígado, como melhor órgão alvo do parasito a ser avaliado neste

modelo para estudos de vacinas frente ao desafio experimental com a cepa

(MCAN/BR/2008/OP46), ao analisarmos a carga parasitária hepática, de forma surpreendente

observamos que os animais que foram imunizados apenas com o antígeno LB apresentaram

redução da carga parasitária quando comparados ao grupo controle. De alguma forma, o antígeno

vacinal heterólogo de L. braziliensis foi capaz de promover essa proteção parcial aos animais

após o desafio experimental, possivelmente, ativando as células do sistema imune, propiciando a

eliminação desses parasitos.

Trabalhos similares na literatura demonstraram que a vacinação de camundongos Balb/c

com antígeno bruto de L. amazonensis é capaz de promover proteção parcial contra infecções de

73

formas cutâneas da leishmaniose causadas pelas espécies de L. amazonensis, L. major e L.

braziliensis (da Silva-Couto et al., 2015; Pinto, de Mello Cortezia & Rossi-Bergmann, 2003).

Além disso, já está bem estabelecido na literatura e no modelo canino que o antígeno vacinal

heterólogo de L. braziliensis é capaz de promover proliferação celular com aumento da

subpopulação de linfócitos T CD8+, importante no controle do parasitismo (Giunchetti et al.,

2008).

A vacina LBSM50, apesar de não ter apresentado diferenças em relação ao grupo controle

nos ensaios in vitro anteriores, ela foi capaz de promover a redução da carga parasitária no

fígado. Talvez, essa vacina induz uma resposta rápida que não pode ser detectada cinco dias após

o estímulo in vitro e, assim como discutido anteriormente, essa resposta está sendo direcionada

para o órgão onde a infecção está mais acentuada.

Já a vacina LBSMR50 confirmou sua capacidade em promover não só a ativação do

sistema imune com formação de células de memória efetora (T CD8+), mas também de levar a

redução da carga parasitária no fígado dos animais imunizados. De fato, o desempenho

apresentado por essa vacina leva a crer que seu mecanismo de ação é baseado na proliferação de

células T CD8+ de memória efetora no baço que estão sendo direcionadas para foco da infecção

no fígado, atuando efetivamente no controle do parasitismo.

Estes resultados nos encorajam a dar continuidade nos estudos dessas vacinas compostas

com sistemas de adjuvantes, uma vez que a leishmaniose é uma doença que se encontra em

franca expansão, e a busca por vacinas mais eficazes tem sido um dos principais focos de nosso

grupo de pesquisa. Todavia, mais estudos são necessários a fim de compreender o mecanismo

completo de ação dessas vacinas. Além disso, avaliar formulações dessas vacinas com soluções

estabilizadoras ou formulação lipossomal. De toda forma, as formulações LBSM50 e LBSMR50

também são potenciais formulações a serem testadas e empregadas em outros modelos como o

hamster e o cão.

74

9. Conclusão

MATHIAS, F. A. S. Conclusão

75

O conjunto de dados obtidos na presente Tese intitulada “Influência da associação de

adjuvantes na eficácia vacinal após o desafio experimental por Leishmania infantum em

camundongos Balb/c” nos permite concluir que:

A associação de dois ou três adjuvantes com sua dose reduzida em relação a dose total de

cada adjuvante isoladamente em um sistema é capaz de promover uma resposta imune inata

eficaz com recrutamento celular e produção de quimiocinas e citocinas importantes no

direcionamento da resposta imune adaptativa. Nossos dados apontam que nas avaliações

utilizadas no trabalho, apesar da vacina LBSM50 promover a redução da carga parasitária no

fígado, a vacina LBSMR50 apresentou o melhor desempenho, uma vez que não só reduziu a

carga parasitária, mas também demonstrou formação de células de memória efetora capazes de

responder a um estímulo secundário.

De modo geral, observamos que a ação de ambas as vacinas se deu principalmente no

fígado, uma vez que a cinética da cepa utilizada afeta de forma mais agressiva esse órgão

inicialmente. Assim é possível que a resposta das células de memória efetora foi direcionada para

combater a infecção no local.

76

10. Perspectivas

77

Como perspectivas futuras:

● Avaliar o melhor sistema de estabilização que possa ser combinado com ambas as

vacinas;

● Avaliar a resposta imune desencadeada pela imunização com esses novos sistemas de

adjuvantes;

● Avaliar o efeito desses sistemas na redução da carga parasitária;

● Avaliar com auxílio da microscopia confocal a migração celular tanto da pele para os

órgãos linfóides drenantes como também essa migração das células de memória efetora

do baço para o fígado durante a infecção;

● Avaliar o mecanismo completo de ação tanto dos sistemas de associação como das

propostas vacinais;

● Propor a avaliação desses sistemas associados a outros antígenos vacinais.

78

11. Referências bibliográficas

MATHIAS, F. A. S. Referências Bibliográficas

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92

12. Anexos

MATHIAS, F. A. S. Anexos

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Anexo 1

MATHIAS, F. A. S. Anexos

94

Anexo 2

a contribuição de sistemas de associação de …...fernando augusto siqueira mathias a...

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