Mitos y realidades de la técnica

de PCR para el diagnóstico de

enfermedades

en organismos acuáticos

I D&

Jorge Cáceres Martínez

Ensenada, B.C. Septiembre 2012

¿Qué es la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase

chain reaction) es una técnica de amplificación de

secuencias de ADN in vitro

ADN

Con el surgimiento de la técnica de la reacción en cadena

de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), sin duda

se ha dado un avance sin precedente en el encuentro del

ADN de patógenos; sin embargo, por sí misma, no

substituye al proceso de diagnóstico de enfermedades.

Cuando se detecta un episodio de mortalidad en

acuicultura, se desencadena una carrera contra el tiempo

para encontrar la causa

La presión por obtener resultados inmediatos puede

compararse con aquella que enfrenta la policía y los

políticos para encontrar a un culpable de un delito y se

toma como tal al primer sospechoso que aparece en la

escena.

¿Quién es el culpable?

PCR

¿Hay algo aquí?

Si encuentran ADN del sospechoso en la víctima, se puede

caer en el error de notificar que se tiene al culpable del

delito y condenarlo.

¿Qué?

La realidad puede ser bien diferente, el sospechoso pudiera

ser el cónyuge, hijo, pariente o cualquier otra persona que

pudo haber saludado o estornudado sobre la víctima antes

de que ocurriera el delito. Desde luego, habrá ADN de esas

personas en la víctima y no son para nada culpables.

El encontrar al culpable implica el estudio de la escena del

crimen, los antecedentes de la víctima, el perfil del

delincuente, los presuntos motivos del crimen, la existencia

de pruebas físicas, etc. Es decir, que se trata de un proceso

y no de una técnica.

Algunos casos en acuicultura

Ulrich et al. (2007) reportaron infección por

Haplosporidium nelsoni, agente causal de la enfermedad

conocida como MSX (por sus siglas en inglés,

Multinuclear Sphere X) en el ostión Americano

Crassostrea virginica y otras especies de ostión en el

Golfo de México, utilizando únicamente análisis de PCR.

Esta información amplía el rango de distribución del

patógeno y documenta nuevos hospederos; sin

embargo, el ensayo utilizado no fue validado para las

aguas del Golfo de México y si consideramos, que en los

estudios previos realizados en la zona durante más de

20 años por expertos patólogos, no se ha detectado a

este patógeno (Burreson 2008), es necesaria una

validación correcta de la información.

Respecto al virus de la mancha blanca del camarón, se

han publicado registros de falsos positivos en la

langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus

asociados con la escasa especificidad de los

iniciadores utilizados para la reacción de PCR (Claydon

et al. 2004).

Recientemente, en Canadá hubo un reporte

afirmando que la Anemia Infecciosa del Salmón

(ISA) se había encontrado en salmones de la

Columbia Británica. Esto causó un efecto inmediato

en el sector.

Canada Completes Infectious Salmon Anaemia Testing: NoConfirmed Cases in BC Salmon

December 2, 2011: The Government of Canada in collaboration with theProvince of British Columbia has completed testing all samples relatedto the suspected infectious salmon anaemia investigation in BC. Basedon the final results, there are no confirmed cases of the disease in wildor farmed salmon in BC.

Otro ejemplo interesante es el de Vazquez-Boucard et al. (2012),

quienes a través de hibridación in situ, muestran que el ostión

Japonés, Crassostrea gigas, puede acumular al virus de la mancha

blanca del camarón pero no es infectado por el mismo. Las

partículas virales se acumulan en los espacios inter-filamentos de

las branquias pero no se establecen en algún tipo de célula. Si

estos ostiones se hubieran analizado únicamente mediante PCR

podría haberse interpretado, erróneamente, que C. gigas estaba

infectado por WSSV.

Las pruebas de PCR que quieran usarse en el proceso

de diagnóstico de una enfermedad, deben ser

rigurosamente validadas con respecto a otras técnicas

y conocimientos específicos.

1.- No hay mortalidades

2.- No hay signos clínicos de alguna alteración

negativa.

3.- No hay evidencias de alteraciones fisiológicas.

4.- No hay evidencias visuales del patógeno.

5.- Nunca se ha reportado el patógeno para la zona o

la especie.

6.- Se sabe que el hospedero no es susceptible al

patógeno.

7.- Las técnicas convencionales no detectan al

patógeno.

Caso positivo por PCR, pero…

¿PRIMICIA CIENTÍFICA?

¿ESCÁNDALO SANITARIO?

ALTO!

Hay que confirmar esa

información

?

El diagnóstico de una enfermedad infecciosa es un

proceso y no una técnica; el proceso parte del

conocimiento de los conceptos básicos de la patología y su

aplicación a una situación biológica en particular. Para ello

deben de utilizarse diferentes técnicas, observaciones y

criterios que nos llevarán a la conclusión de si hay una

enfermedad infecciosa o no.

Los resultados de la aplicación de una técnica de PCR

para detectar la presencia o ausencia de un agente

patógeno en particular, deben ser evaluados e

interpretados por un patólogo especializado.

2. FTM

3. Histología

4. PCR-secuenciación

ITS, NTS

5. HIS

Caso confirmado

El objetivo sanitario, nos va a permitir definir qué técnicas o

técnica, en particular, debemos utilizar en el proceso de

diagnóstico. La propia OIE, sugiere el empleo de diferentes

técnicas de acuerdo con el objetivo buscado (OIE 2012).

1.- Vigilancia epidemiológica sobre la presencia o ausencia de

un agente patógeno confirmado en una especie susceptible

y dentro de zonas geográficas para las que se conoce la

distribución del agente patógeno y el hospedero.

+ O -

Se elegirá la técnica de mayor especificidad, sensibilidad ydisponibilidad. Típicamente, más no exclusivamente, la técnicade PCR.

Se define el tamaño de muestra, la temporalidad y frecuenciadel muestreo a partir del conocimiento del ciclo de vida delagente patógeno y del hospedero, ya sea en una producciónacuícola y/o población natural.

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~309 pb

2.- Vigilancia epidemiológica sobre el efecto del agente

patógeno confirmado en una especie susceptible y

dentro de zonas geográficas para las que se conoce la

distribución del agente patógeno y el hospedero.

Se utilizarán técnicas que permitan conocer el grado de

desarrollo de la enfermedad y el efecto en el hospedero.

Además de la técnica usada para determinar presencia o

ausencia, deberán emplearse otras que nos indiquen el

avance y efecto del proceso infeccioso. Típicamente, más no

exclusivamente, la técnica histológica. El tamaño de muestra y

su temporalidad es el mismo que en el caso anterior.

3.- Seguimiento de un brote epidemiológico de un agente

patógeno confirmado en particular en una especie

susceptible y dentro de zonas geográficas para las que se

conoce la distribución del agente patógeno y el

hospedero.

En estos casos se utilizan técnicas para determinar presenciao ausencia, técnicas para determinar su efecto en elhospedero y técnicas para determinar su efecto en lapoblación. Típicamente, más no exclusivamente, análisis enfresco y estimaciones de mortalidad.

Se dirige el muestreo de manera directa hacia la zona

afectada, se modifica el tamaño de muestra a las condiciones

prevalecientes, se aumenta la frecuencia del muestreo a

partir del conocimiento del ciclo del proceso infeccioso del

agente patógeno, ya sea en una producción acuícola o/y

población natural.

Estimación de la condición sanitaria de una especie nueva en

una localidad nueva.

Cuando no se sabe la condición sanitaria de una especie en

particular en una determinada localidad geográfica, y se requiere

iniciar una vigilancia sanitaria, lo recomendable es determinar la

carga parasitaria de la especie a vigilar y ver si alguno de sus

parásitos es potencialmente un patógeno.

Una vez correctamente identificado este presunto patógeno y su

efecto en el hospedero, desarrollar o utilizar las técnicas validadas

para establecer su vigilancia y el seguimiento de brotes.

Otro enfoque es el de aplicar la técnica de la PCR para detectar la

presencia de patógenos específicos sin considerar la distribución

conocida de tales patógenos ni la susceptibilidad del hospedero.

En este caso se va a ciegas y si se llega a detectar un patógeno

específico, su identidad y establecimiento en el hospedero

(verdadera infección) deben ser completamente demostradas.

Además, deben iniciarse estudios específicos sobre susceptibilidad

y efecto en el hospedero. La OIE define, en este sentido, lo que es

un caso sospechoso y lo que es un caso confirmado, en cualquiera

de las situaciones, se recomiendan técnicas específicas para la

comprobación del caso y la participación, en caso necesario, de

laboratorios de referencia de la propia OIE.

Interpretaciones erróneas de análisis por PCR son

especialmente controversiales en el caso de patógenos

de declaración obligatoria ante la OIE, por lo que sus

infecciones deben ser plenamente comprobadas.

Burreson (2008) hace un llamado a investigadores,

revisores y editores de revistas a ser particularmente

cautos respecto a la interpretación de este tipo de

resultados y, en su caso, mostrar las evidencias

completas y contundentes sobre el diagnóstico de

enfermedades infecciosas.

Nuevos patógenos del ostión

Confirmados por PCR

y secuenciación

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