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Eletrocromatografia Capilar- CEC

Capillary electrochromatography

Híbrido da CE com HPLC���� oferece algumas características do melhor

das duas técnicas.

Vantagens CEC em comparação HPLC e CE:

Pode ser aplicada a separação de espécies não carregadas como

HPLC

Permite a separação altamente eficientes de micro-volumes de

solução, como CE, sem necessidade de sistema de bombeamento a

alta pressão .

Duas técnicas desenvolvidas a partir de 1980:

Eletrocromatografia Capilar em coluna empacotada, e

Eletrocromatografia Capilar eletrocinética micelar (MECC – MEKC)

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Eletrocromatografia Capilar- CEC

Capillary electrochromatography

Histórico:

1° expressão utilizando aplicação de Potencial elétrico em sistemas

cromatográficos � 1974 � Pretorios et.al. � uso do FEO

1° separação CEC � Jorgenson e Lukacs � 1981 � Eletrodo grafite ,

potencial 30 KV, capilar Ø int. 170 um, recheio de silica Partisil 10 ODS-2,

detecção fluorescência, separando 9 metil antraceno e perileno, eficiência

31000 e 23000 pratos teóricos.

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Eletrocromatografia Capilar- CEC

Capillary electrochromatography

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A CEC:

Difere da Cromatografia Eletrocinética Micelar pela utilização de uma fase

estacionária verdadeira.

O capilar [40-90 cm e Ø <= 100 um (efeito Joule↓)] é preenchido com uma

fase estacionária e o solvente que se movimenta devido a eletrosmose.

Fase Móvel ���� mistura de tampão aquoso e solvente orgânico (acetonitrila e

metanol)

A CEC apresenta o dobro de pratos teóricos comparado ao HPLC para o

mesmo tamanho de partícula e de coluna.

Como não se usa pressão não há queda de pressão associada a particulas

pequenas

Uma fase móvel é transportada através do bombeamento eletrosmótico do

fluxo ao invés do bombeamento mecânico ���� sistema mais simples.

O perfil do bombeamento é plano diferente do parabólico do HPLC ���� conduz

menor alargamento da banda ���� consequência maiores eficiências na separação.

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Eletrocromatografia em coluna empacotada:

•Menos amadurecida de todas as técnicas

Método ���� Solvente polar é dirigido pelo FEO através de um capilar

empacotado com uma fase estacionária, como HPLC Fluxo reverso.

As separações dependem da distribuição das espécies entre a fase

móvel e a fase estacionária líquida mantida no empacotamento.

Aplicações :

•Separação de Enatiômeros

•“troca iônica” � retenção se deve à atração entre os íons do

soluto e os sítios carregados, ligado quimicamente à fase

estacionária.

•Análise de traços

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Eletrocromatografia Capilar:

Cromatografia semelhante ao

HPLC, exceto que a fase móvel

se movimenta devido a

eletrosmose em vez de pressão

Cromatografia

Eletrocinética Capilar

MIcelar:

Eletroforese com as micelas

atuando como uma fase

pseudo estacionária

Desvantagens da MEKC sobre CEC:

�Difícil trabalho com solutos muito polares ���� retidos muito fortemente

nas micelas ���� não há separação

Limitada capacidade de separação ���� função do intervalo de tempo de

saída do soluto não retido até o completamente retido

Utilização de tensoativos que causam incompatibilidades com os

sistemas de acoplados ���� espectrometria de massa

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Eletrocromatografia Capilar utiliza o melhor da CE e da HPLC:

HPLC :

o Maior seletividade ( capacidade de se nalisar uma classe de

compostos de interesse sem efeito de interferências) e versatilidade

de separação de compostos neutros.

CE:

o Maior eficiência de separação,

oNão utiliza bombas de alta pressão, FEO ���� promove perfil plano de

fluxo ���� pode existir interferência da fase estacionária

CE���� Eletroferograma

CEC ���� Eletrocromatograma

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FE na Eletrocromatografia Capilar deve atender especificações :

�Interagir de maneira seletiva com varios tipos de moléculas de

soluto, neutros ou não, proporcionando, assim como HPLC,

diferentes taxas de migração através da coluna

� Apresentar porosidade, permitindo passagem do FEO e

dependendo do tipo de FE aumentado ou diminuindo cfme. o

desejado

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3 Tipos principais de colunas em CEC:

� Coluna Recheada ���� material particulado ���� geralmente poroso e

esférico���� preenchimento até a janela de detecção ���� FM passagem

somente pelos poros.

�Colunas Tubulares abertas���� material cromatografico é apenas o

revestimento polimérico interno no capilar e é ligado quimicamente ao

mesmo.

�Coluna Monolítica ���� mesmo material de fabricação das colunas

tubulares abertas , porém presente radialmente em todo o comprimento

do capilar

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Coluna Recheada com partículas de silica

•Ø das partículas de sílica de 1,5 a 5 um � quimicamente

modificadas.

•Separação por interações hidrofílicas, hidrofóbicas, troca

iônica e bioafinidade.

Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009.

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Colunas capilares abertas:

•Recobrimento capilar com filme de Fase Estacionária (FE)

•FE 4 tipos:

�Quimicamente ligadas � Ligações orgânicas à superfície sílica �

reações silanização e hidrosililação ( adição de grupos silanos)

�Fisicamente adsorvidas � interações eletrostáticas superfície da sílica e

o ligante ( ex. surfactantes)

�A base de polimeros orgânicos ( polimerização in situ)

�Revestidas com processo sol-gel ( alcóxidos)

Vantagens:

Facilidade de preparação das colunas

↑ área superficial � camadas poliméricas

Utilização para verificação interações farmacos e proteínas

Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009.

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Coluna monolítica:

Recheadas com leito contínuo de FE, altamente poroso, contendo rede de

canais interconectados para passagem da Fase Móvel (FM)

2 Tamanhos de poros : macroporos (2-50 nm) e mesoporosos (< 2 nm)

1° aplicação 1970 Ross e Jefferson � 1989 ↑ interesse Hjerten et. Al. � geis

de poliacrilamida com ↓grau de intercruzamento para separação proteínas.

FE 2 categorias:

Monolitos de Sílica � fusão/sinterização, sol gel e polimierização

Monolitos à base de polimeros orgânicos � (base poliestireno, poliacrilamida,

polimetacrilato)

Utilização : + usados monolitos à base políemeros organicos� ↑ facil

preparação, + robusto e ↑ tempo de vida.

Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009.

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Fases estacionárias:

�Baseadas nas FE HPLC � fase reversa e iônica

�Fases reversas � protonação da sílica em pH abaixo de 3 � ↓ FEO �

análises mais lentas e analitos carregados podem ser fortemente retidos.

�Moléculas pequenas carregadas � ideal troca iônica

�Modo misto estão sendo mais utilizadas ( grupos iônicos e cadeias

hidrofóbicas) � ↑↑FEO em larga faixa de pH.

Segato M.P., Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Quimica Nova, vol.32, n°2, p. 431-440, 2009.

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Aplicações:

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Alimentos

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HPLC

CEC

Explique: ordem de eluição componente 1

Tempo de eluição?

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Ordem de eluição é em função das disferentes fases móveis, que geram

diferentes ordens de eluição, se as fases fossem iguais teríamos a mesma ordem

de eluição.

O tempo de eluição é em função do baixo FEO.

Se ajustarmos a fase móvel obtemos a seguinte eluição:

Capillary

Electrochromatography,

Smith N., Beckman

Coulter, Londres, Reino

Unido

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Análises de hidrocaronetos

poliaromáticos é realizada

por HPLC e CEC obtem

resolução de 180.000

pratos teóricos.

Capillary Electrochromatography, Smith N., Beckman Coulter, Londres, Reino Unido

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Separação de isômeros do antibiótico

Cefalosporin, foi requerida uma coluna

capilar de 40 cm, seria impraticável

esta separação por HPLC nesta coluna

em função da pressão que seria

necessária.

Capillary Electrochromatography, Smith N., Beckman Coulter, Londres, Reino Unido

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Eletrocromatografia Capilar (CEC)

Capillary Eletrochromatography é um híbrido da eletroforese capilar

com o HPLC e oferece algumas das melhores caracteristicas de

cada uma das técnicas:

•Como HPLC pode ser aplicada as espécies não carregadas,

•Como CE permite separações altamente eficientes de microvolumes

de solução de amostra sem necessidade de sistema de

bombeamento de amostra em alta pressão.

•Na eletrocromatograia, uma fase móvel é transportada através de

uma fase estacionária pelo bombeamento eletrosmóticodo fluxo ao

invés do sistema mecânico com perfil plano e não parabólico. A face

plana do fluxo leva a um menor alargamento de banda ���� Maior

eficiência na separação!!

•Pode ser realizada com colunas empacotadas e capilar.